Горизонтальный перенос генов между agrobacterium spp. и высшими растениями
На правах рукописи
МАТВЕЕВА Татьяна Валерьевна Горизонтальный перенос генов между Agrobacterium spp. и высшими растениями Специальность: 03.02.07 - Генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учной степени доктора биологических наук
Санкт Петербург 2013 2
Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете на кафедре генетики и биотехнологии.
Научный консультант: доктор биологических наук Профессор Лутова Людмила Алексеевна Санкт-Петербургский государственный университет
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Дейнеко Елена Викторовна заведующая лабораторией биоинженерии растений Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.
доктор биологических наук Проворов Николай Александрович, Зам директора ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, г. Санкт-Петербург доктор биологических наук Родионов Александр Викентьевич, профессор, заведующий лабораторией биосистематики и цитологии Ботанического института РАН, г. Санкт-Петербург Ведущее учреждение: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Защита состоится в на заседании совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт Петербург, Университетская наб., 7/9. Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции, ауд. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета
Автореферат разослан Учный секретарь диссертационного совета д. б. н. Л. А. Мамон Введение Актуальность проблемы. Горизонтальный перенос генов (ГПГ) является предметом глубокого интереса широкого круга дисциплин, начиная с исследований устойчивости к антибиотикам, заканчивая генетически модифицированными организмами. ГПГ происходит экстенсивно в пределах прокариотических организмов, и его экологические и эволюционные эффекты хорошо документированы (Koonin et al. 2001). Сравнительный анализ геномов бактерий, архей и эукариот показывают, что значительная часть генов в прокариотических геномах подвержена горизонтальному переносу.
Фиксация и долгосрочное сохранение горизонтально перенесенных генов позволяет предположить, что они придают организмам селективные преимущества, такие как устойчивость к антибиотикам, вирулентность, или фиксация азота в организме реципиента (Koonin еt al., 2001;
Gogarten и др., 2002;
Richardson and Palmer, 2007). Практика показывает, что ГПГ между эукариотами является редким событием. ГПГ у высших растений включает в себя в первую очередь ДНК митохондрий или хлоропластов (Richardson и Palmer, 2007). Горизонтальный перенос ядерных генов между видами растений лишь слабо исследован. Редкие примеры переноса генов бактерий в ядерную ДНК многоклеточных эукариот касаются прежде всего грибов и животных, как реципиентов (Garcia-Vallve и др., 2000;
. Rosewich и Kistler 2000;
Screen, and St.
Leger, 2000;
Veronico и др., 2001;
. Кондо и др. др. 2002;
. Richards и др., 2006;
.
Акуна и др., 2012). Четко задокументированные примеры горизонтального переноса генов от прокариот к растениям долгое время были ограничены только Agrobacterium rhizogenes и видами Nicotiana (White et al., 1983;
. Intrieri и Buiatti 2001).
Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes переносят Т-ДНК (фрагменты большой плазмиды (Ti) или (Ri), соответственно) в хозяйские клетки (White et al. 1982;
Otten et al. 1992;
Veena et al. 2003;
Tzfira and Citovsky 2006;
Vain 2007).
Экспрессия генов, закодированных в Т-ДНК отвечает за развитие опухолей или косматых корней на растении. Эти новообразования представляют собой трансгенные ткани на нетрансгенных растениях. Однако, у представителей рода Nicotiana была обнаружена фиксации Т-ДНК вставки в геноме растения и ее последующая передача в ряду половых поколений. Эта Т-ДНК была названа клT-ДНК. Детальная характеристика клТ-ДНК показывает, что присутствующие в ней гены экспрессируются, а вставка Т-ДНК в геномы Nicotiana могла происходить неоднократно и независимо. Эти факты наводят на мысль о том, что клТ-ДНК придавала растениям селективные преимущества в ходе эволюции. Выявление и детальное изучение новых примеров горизонтального переноса генов между агробактериями и растениями позволило бы сделать обобщение относительно возможной роли Т-ДНК в растениях.
Целью данной работы было изучение последовательностей ДНК, гомологичных Т-ДНК агробактерий, приобретенных растениями в результате горизонтального переноса генов.
В конкретные задачи входило:
- разработка научно-методических подходов для эффективного скрининга видов растений на наличие в их геномах последовательностей, гомологичных описанным в литературе, на примере онкогенов агробактерий;
- скрининг видов двудольных растений на наличие Т-ДНК подобных последовательностей;
- детальная характеристика структуры клТ-ДНК у Linaria vulgaris;
- анализ распространения клТ-ДНК в различных видах рода Linariа;
- сравнительный анализ морфогенетических процессов in vitro у видов Linaria и Nicotiana, контрастных по наличию клТ-ДНК.
Научная новизна. Впервые в результате целенаправленного поиска в ходе анализа 200 видов двудольных растений выявлен новый пример горизонтального переноса генов между агробактериями и растениям: у видов в пределах рода Linaria обнаружены Т-ДНК-подобные последовательности. Этот факт свидетельствует о том, что горизонтальный перенос генов от агробактерий к растениям является редким событием, но не уникален для представителей рода Nicotiana, как считалось ранее. Данное открытие стало возможным благодаря предложенному нами новому подходу, позволяющему эффективно скринировать образцы ДНК различного происхождения (в том числе ДНК растений) на предмет присутствия в них последовательностей, сходных с описанными ранее в литературе для других объектов. Подход основан на применении ПЦР в реальном времени с вырожденными праймерами и вырожденными зондами и сочетает в себе положительные стороны ПЦР и гибридизации ДНК-ДНК по Саузерну.
Впервые охарактеризована структура и предприняты попытки исследования функций клТ-ДНК Linaria vulgaris. Показано, что клТ-ДНК организована как несовершенный прямой повтор. Каждая копия в составе повтора имеет протяженность более 10 тпо и содержит последовательности, гомологичные агробактериальным генам ORF2, ORF3, ORF8, rolA, rolB, rolC, ORF13, ORF14, mis, кроме того, левая копия содержит фрагмент гена acs. Консервативной является последовательность гена rolC, совпадающая на 93% с соответствующей последовательностью из штамма А4 A. rhizogenes (Acc. # X03433). Компьютерный анализ последовательности гена Lv rolC показывает, что он может кодировать полноразмерный белок.
Впервые проведено исследование распространения клТ-ДНК среди представителей рода Linaria. По гомологии с Т-ДНК L. vulgaris обнаружены последовательности Т-ДНК в следующих видах рода Linaria: L. acutiloba, L.
alpina, L. buriatica, L. debilis, L. hepatica, L.incompleta, L. melampyroides L.
ruthenica, относящихся к секции Linaria, а также L. dalmatica, L. genistifolia, L.
sabulosa, относящихся к cекции Speciosae. Показано, что виды рода Linaria, содержащие Т-ДНК и относящиеся к двум секциям представляют собой монофилетическую группу.
Впервые проведено исследованиея морфогенеза in vitro растений рода Linaria (у некоторых представителей которого нами показано наличие Т-ДНК в геномах) по сравнению с представителями рода Nicotiana, у которых согласно литературным данным присутствует Т-ДНК;
обнаружено, что все исследованные виды характеризуются высокой регенерационной способностью не зависимо от наличия Т-ДНК в геноме. Это свойство могло способствовать появлению трансгенных растений из трансформированных агробактерией тканей, в результате чего Т-ДНК получила возможность передаваться в ряду половых поколений.
Теоретическое и практическое значение работы.
Разработаны научно-методические подходы, позволяющие эффективно скринировать образцы ДНК различного происхождения на предмет присутствия в них последовательностей, сходных с описанными ранее (например, онкогенами агробактерий). На базе этих разработок могут быть созданы тест-системы для обнаружения патогенов, характеризующихся быстрым мутированием геномов (поскольку в этом случае также необходимо выявлять последовательности ДНК, гомологичные описанным ранее, но отличающиеся от них).
Разработан способ диагностики биоматериалов на наличие в них агробактерий (Патент на изобретение №: 2458142), который может быть применен в сельском хозяйстве, в частности, в плодоводстве и виноградарстве, для оценки заражения растений агробактериями).
Обнаружены новые доказательства в пользу горизонтального переноса генов между агробактериями и растениями, которые могут успокоить общественное мнение относительно биобезопасности трансгенных культур. Трансгенные растения природного происхождения имеют нормальную морфологию, за миллионы лет своего существования не оказали губительного действия на экосистемы, за тысячелетия использования людьми в качестве лекарственных трав (L. vulgaris) не оказывали негативного влияния на здоровье людей.
Результаты диссертации используются на биолого-почвенном факультете СПбГУ в курсах лекций «Генная инженерия и биотехнология», «Генетика развития растений».
Основные положения выносимые на защиту:
Благодаря предложенному нами новому подходу, основанному на применении ПЦР в реальном времени с вырожденными праймерами и вырожденными зондами и позволяющему эффективно скринировать образцы ДНК растений на предмет присутствия в них последовательностей, сходных с Т-ДНК агробактерий, в ходе анализа 200 видов двудольных растений выявлен новый пример горизонтального переноса генов между агробактериями и растениям: у 12 видов в пределах рода Linaria обнаружены Т-ДНК-подобные последовательности.
Показано, что Т-ДНК Linaria vulgaris является полноразмерной и организована как несовершенный прямой повтор, в отличии от Т-ДНК в геноме Nicotiana, где около половины последовательности оказалось утерянной.
По гомологии с L. vulgaris выявлены Т-ДНК-подобные последовательности в геномах L. acutiloba, L. alpina, L. buriatica, L. debilis, L. hepatica, L.incompleta, L.
melampyroides L. ruthenica, относящихся к секции Linaria, а также L. dalmatica, L. genistifolia, L. sabulosa относящихся к cекции Speciosae. Сайт интеграции Т ДНК в геном растения совпадает у исследованных видов, что свидетельствует о монофилетическом происхождении данных секций рода Linaria.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конгрессах, конференциях, симпозиумах, совещаниях и школах: Международный конгресс по молекулярной биологии растений (Барселона, Испания, июнь, 2003 г.), XI конгресс MPMI (Санкт-Петербург, июль, 2003 г.);
Биотехнология: состояние и перспективы развития (Москва, ноябрь, 2003);
III съезд ВОГиС (Москва, июн, 2004 г.);
Международная конференция «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, (Москва, 2006 г.);
Конференция «Современная биотехнология – защите окружающей среды» (Пущино, 2006 г.);
Четвертый съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006 г.);
Международная научная конференции «С.П. Костычев и современная сельскохозяйственная микробиология» (Ялта, Украина, 2007 г.);
AB-RMS симпозиум и PhD курс, (С-Петербург, 2007 г.) ;
V Съезд Общества Биотехнологов России (Москва, 2008 г.);
Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2009 г.);
Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, 5 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, июнь 2009 г.);
Международная конференция "Растительная генетика, геномика, и биотехнология, Новосибирск (июнь, г.) ;
XVIII Конгресс Федерации европейских обществ Биологии растений (FESPB) (Валенсия, Испания, июль, 2010 г.);
Международная конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, октябрь, 2012);
II(X) Международная Ботаническая Конференция молодых ученых в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, ноябрь 2012 г.);
Международная школа конференция «Растительно-микробные сообщества: молекулярные основы адаптивного потенциала» (Алушта, Украина, октябрь, 2012 г.);
33-я Международная конференция по корончатым галлам (Огайо, США, декабрь 2012 г.) Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 печатные работы, из них 17 в ведущих международных и отечественных научных журналах, рекомендованных перечнем ВАК, 1 патент, 2 книги.
Структура и объм работы. Диссертация изложена на 270 страницах, включая 48 рисунков, 13 таблиц, список литературы, содержащий 321 ссылку.
Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и выводов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования В качестве растительного материала в работе использованы линии редиса Raphanus sativus генетической коллекции СПбГУ, клоны березы повислой Betula pendula,любезно предоставленные ФГУП НИИ лесной генетики и селекции (Воронеж), растения различных видов рода Nicotiana, любезно предоставленные ГНУ ВНИИ табака, махорки и табачных изделий (Краснодар), растительный материал различных видов родов Solanum и Lycopersicon любезно предоставлен ГНУ ВИР Россельхозакадемии, гербарные материалы растений рода Linaria предоставлены Южно-Сибирским Ботаническим садом (Барнаул), растительный материал двудольных растений распространенных в умеренном климате был собран авторами в Ленинградской, Воронежской, Московской областях и Краснодарском Крае.
В работе использовали штаммы Agrobacterium tumefaciens: T37-3, C58, A6-2 и A281 и штаммы Agrobacterium rhizogenes: 15834-3, 8196, A-4. Штаммы агробактерий были любезно предоставлены профессором Нестрером Е. (Eugene W. Nester Department of Microbiology, University of Washington, Seattle, Washington, USA) и профессором Онджеем (Institut of Molecular Biology, Czech Republic).
Штаммы Е. coli DH5 8 DH10B использованы в экспериментах по клонированию генов.
Векторы pBlueskriptII KS+ (Stratagene) и pJET1.2 (Fermentas) использовали для клонирования фрагментов ДНК. Штаммы E.coli DH10B и DH5 использовали для экспериментов по трансформации. Штамм E.
coli DH5 с плазмидой PNW34-0-7-1 (Matveeva et al., 2003) использовали для получения зондов Т-ДНК A. tumefaciends для гибридизации по Саузерну.
Методы В работе был использован комплекс методов:
культивирование тканей и органов растений in vitro (получение 1) асептических растений, индукция каллусо-, побего-, корнеобразования на эксплантах под влиянием экзогенных фитогормонов, агробактериальная трансформация растений методом листовых дисков) (Дрейпер и др., 1991);
2) статистический анализ данных, полученных в экспериментах культивирования тканей и органов проводили, вычисляя процент эксплантов с каждой конкретной реакцией и его стандартную ошибку.
Абсолютные частоты альтернативныхпроявлений каждого из исследованных признаков сравнивали между разными вариантами опыта при помощи критерия 2 (Лакин, 1990) молекулярно-биологические методы (различные варианты 3) выделения тотальной ДНК растений и бактерий, блот-гибридизация по Саузерну, различные варианты ПЦР – классический, RAPD, semiRAPD, ПЦР в реальном времени с вырожденными праймерами и зондами, tail PCR, РТ-ПЦР, digital PCR, клонирование ДНК, секвенирование по Сенджеру (Sambrook et al., 2001;
Blair et al., 2002;
Matveeva et al, 2002, 2006);
анализ нуклеотидных последовательностей проводили для целей видоидентификации (в части видоидентификации фитопатогенов – совместно с Д.К. Бернером (D.K. Berner) Т.М. Коломиец и Ж.М. Мухиной), для целей построения филогенетического древа, для целей изучения структуры и предсказания функций фрагментов клТ-ДНК. Множественные выравнивания нуклеотидных последовательностей осуществляли с использованием алгоритма TCOFFEE, программа доступна на сайте European Bioinformatics Institute http://www.ebi.ac.uk. Филогенетические древа были построены с использованием 4) пакета программ MEGA 5. Автор приносит благодарность коллегам: Л.А. Лутовой, Ю. Нестеру (E.W.
Nester), Д.И. Богомазу, Д.К. Бернеру (D.K. Berner), Т.М. Коломиец, Ж.М.
Мухиной, О.С. Машкиной, Ю.Н. Исакову, И.С. Бузовкиной, И.Е. Додуевой, и ученикам: Н.В. Фроловой, А.В. Симоновой, О.А. Кулаевой, О.А. Павловой, Т.Ю. Пигичке, принимавшим участие в данной работе, что отражено в публикациях.
Результаты и обсуждение.
Разработка методических подходов для выявления в геномах растений Т-ДНК-подобных последовательностей.
Целью данного этапа работы был выбор наиболее эффективного и надежного метода для поиска новых примеров горизонтального переноса генов между агробактериями и растениями.
В своей работе мы рассмотрели методы, использованные до нас, с точки зрения надежности результатов, трудоемкости, стоимости эксперимента.
Поскольку впервые в табаке Т-ДНК обнаружили методом гибридизации по Саузерну, мы свою работы также начали с использования этого метода для выяснения, присутствуют ли последовательности, гомологичные Т-ДНК, в геноме редиса посевного. Этот выбор объекта был обусловлен тем, что некоторые линии редиса генетической коллекции СПбГУ способны к образованию спонтанных опухолей, напоминающих таковые у гибридов табака.
На первом этапе эксперимента мы ставили гибридизацию геномной ДНК редиса различных линий с зондами EcoRI - 7 и BamHI-8 фрагментов Т-ДНК A.
tumefaciens T-ДНК ;
HindIII-11 - HindIII-18 фрагментов Т-ДНК A. rhizogenes В ходе эксперимента с использованием фрагмента Eco RI -7 Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens в качестве зонда мы получили позитивный результат в случае всех исследованных линий редиса. Данный зонд содержит гены tmr, 6а, 6b, и часть локуса tms. В позитивном контроле размер гибридизовавшихся фрагментов соответствовал ожидаемому. В негативном контроле (табак) гибридизационного сигнала не наблюдали (Рисунок 1).
Рисунок 1.
Гибридизационный сигнал, наблюдаемый при гибридизации геномной ДНК линий редиса с зондом Т-ДНК (при A. tumefaciens низкой жесткости гибридизации) В результате гибридизации с использованием в качестве зонда фрагмента Bam HI - 8 Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens (включающего гены 5, tms1, tms2) был детектирован гибридизационный сигнал в ожидаемой области в позитивном контроле. С негативным контролем и ДНК линий редиса гибридизации не наблюдали. Сходная картина наблюдалась при гибридизации ДНК редиса с последовательностью ТЛ-ДНК Agrobacterium rhizogenes. Таким образом, последовательностей, гомологичных фрагменту Bam HI - 8 Т-ДНК Agrobacterium (содержащему гены 5 and tms1, tms 2) и ТЛ-ДНК Agrobacterium rhizogenes не обнаружено.
Для анализа природы гибридизационного сигнала была построена и скринирована на наличие Т-ДНК-подобной последовательности библиотека из 5000 клонов. Среди всех клонов были найдены только клоны с низким гибридизационным сигналом. Шесть из них были отсеквенированы. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей показало, что все они являются одинаковыми и имеют сходство 99 % с участком ДНК, кодирующим фрагмент 26S рибосомной РНК капусты. Сходство фрагмента с геном 6а составило 47%. При анализе паттерна сигналов в Саузерн-гибридизации ДНК редиса переваренной ферментами, BglI, EcoRI, EcoRVс 2-мя различными зондами: фрагмент Т-ДНК, XhoI-2 kb фрагмент кластера генов рРНК обнаружили одинаковую локализацию сигнала гибридизации для обоих зондов.
Базируясь на полученных данных мы пришли к выводу, что положительный результат в Саузерн-гибридизации низкой жесткости вызван высоко повторенными генами рибосомных РНК. Таким образом, гибридизация ДНК по Саузерну в условиях низкой жесткости показала себя как очень трудоемкий метод поиска Т-ДНК- подобных последовательностей, дающий в ряде случаев ложные положительные результаты.
Следующим подходом был поиск онкогеноподобных последовательностей Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes в геномах растений по схеме, предложенной Интриери и Буятти (2001), с использованием комплекса молекулярно-генетических методов (ПЦР с вырожденными и невырожденными праймерами к данным онкогенам, блот гибридизация по Саузерну).
В ходе анализа вначале нарабатывали продукты ПЦР с праймерами (нормальными или вырожденными) к онкогенам агробактерий при разных температурных условиях. Далее среди них выбирали один наиболее типичный набор для комбинации праймер – генотип. Этот набор продуктов использовали в блот-гибридизации по Саузерну с последовательнстью соответствующего онкогена.
В результате гибридизации по Саузерну в ряде вариантов был получен позитивный сигнал (Рисунок 2). Например, такую картину наблюдали при гибридизации продуктов ПЦР с использованием праймеров к генам rolC и ORF14 на матрице геномных ДНК различных видов Nicotiana.
Cеквенирование продуктов показало cоответствие нуклеотидных последовательностей депонированным в базу NCBI для N.glauca, N.tabacum и отсутствие обширных областей гомологии фрагментов ПЦР с соответствующими онкогенами для N. rustica, N. alata, N. langsdorffii. Область сходства исчерпывалась праймерной последовательностью и в ряде случаев несколькими прилегающими нуклеотидами. Вероятно, этих последовательностей было достаточно для успешного прохождения гибридизации ДНК-ДНК. На основе полученных артефактов мы предположили, что в блот-гибридизации по Саузерну необходимо использовать ДНК-зонд, соответствующий внутренней последовательности ПЦР-продукта соответствующего онкогена (не перекрывая праймерных последовательностей) (Рисунок 3). При использовании таких зондов гибридизации с ними описанных выше продуктов ПЦР не наблюдали.
Рисунок 2. Продукты ПЦР с праймерами к гену rol C на ДНК различных видов табака (слева) и рентгенограмма, полученная в результате гибридизации по Саузерну данных продуктов с зондом, содержащим ген rolC (PC – положительный контроль, NC – отрицательный контроль, Ng – N.glauca, Nt N.tabacum, Nr - N. rustica, Na - N. alata, Nl - N. langsdorffii.
Рисунок 3. Схема взаимного расположения праймеров и зондов для проверки специфичности прохождения ПЦР (1- неудачное, 2- удачное) Однако, ожидаемая длина продукта ПЦР в большинстве случаев была небольшой (по причине взаимного расположения консервативных доменов белка, на основе которых конструировались праймеры). В результате внутренняя по отношению к праймерам последовательность фрагмента онкогена была зачастую недостаточной для конструирования зонда, который можно было бы эффективно пометить с помощью стандартных наборов гексануклеотидного мечения, а более протяженные зонды негативно зарекомендовали себя в наших предыдущих экспериментах.
Вместе с тем развитие технологии ПЦР, связанное с методами контроля амплификации в реальном времени дало нам новые возможности планирования эксперимента. Используемые в ПЦР в реальном времени зонды полностью удовлетворяют требованиям, описанным нами выше (Рисунок 3). В своей работе мы предложили использовать ПЦР в реальном времени с вырожденными праймерами и зондами, гомологичными наиболее консервативным областям исследуемых генов. Следует отметить, что данный метод (как и предыдущие) способен выявить гены, если в их консервативных фрагментах не произошло сильных изменений ДНК (делеций, множественных точковых мутаций).
При успешно прошедшей реакции детектировался рост флуоресценции (рисунок 4А), который после математического обсчета мог быть представлен в виде кривой (рисунок 4Б).
Рисунок 4 Рост флуоресценции, детектируемый прибором АНК 32 в ходе успешной РВ-ПЦР (А) и результат математической обработки представленного роста флуоресценции по алгоритму программного обеспечения АНК 32 (Б).
В ходе экспериментов на матрице ДНК N. glauca и N. tabaccum, где ранее было показано наличие онкогенов A. rhizogenes, наблюдали стабильный воспроизводимый рост флуоресценции при использовании праймеров и зондов к единичным онкогенам, присутствующим в каждом из геномов. Было показано, что на ДНК N.glauca можно проводить до 4х реакций одновременно, в то время как на ДНК N.tabacum воспроизводимый легко детектируемый рост флуоресценции наблюдали только при проведении до двух реакций в одной пробирке. Данный факт можно объяснить тем, что первый вид является диплоидом, а второй тетраплоидом. При увеличении размера генома и увеличении количества праймеров в реакционной среде увеличивается вероятность неспецифического отжига праймеров, и как следствие, уменьшение доли целевых реакций.
Таким образом, было решено проводить четыре одновременные реакции только в случае, когда известно, что у исследуемого вида маленький геном (крестоцветные, рис, томаты). В остальных случаях в работе анализировали виды одновременно по двум генам.
Результаты проведенного нами анализа 17 видов (Nicotiana glauca, Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana rustica, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana longiflora, Petunia hybrida, Cestrum parqui, Capsicon annum, (2 сорта), Cucumis sativus (2 сорта), Raphanus saivus (в виде 4-х линий), Betula pendula (в виде 4-х клонов), Brassica oleraceae (6 сортов), Daucus carrota (2 сорта), Oryza sativa var japonica, Zeya mais, Triticale на наличие последовательностей подобных Т-ДНК A.rhizogenes методом ПЦР в реальном времени полностью согласуются с таковыми, проведенными традиционными методами. Кроме того, данный метод значительно превосходит традиционные по скорости;
а также сводится к минимуму вероятность загрязнения лаборатории и исследуемых образцов ДНК продуктами ПЦР, что важно при проведении многочисленных реакций в одном помещении.
Таким образом, нами был разработан метод для быстрого скринирования видов растений на наличие Т-ДНК.
Поскольку мы предполагали, что в большинстве случаев результат реакции будет негативным, для нас было важно выбрать метод, позволяющий надежно отличить истинный негативный результат от ложного, обусловленного отсутствием амплификации фрагмента в ходе ПЦР. Для решения данной методической проблемы были поставлены дополнительные эксперименты.
Выбор метода оценки пригодности ДНК различного происхождения для проведения ПЦР.
Для решения данной проблемы мы изначально остановились на оценке различных молекулярных маркеров, не требующих предварительной информации о последовательности ДНК исследуемых видов. К этим методам относятся варианты ПЦР со случайными или полуслучайными праймерами.
На материале, представленном растениями, относящимся к различным семействам и жизненным формам двудольных растений (а именно линиями редиса генетической коллекции кафедры генетики СПбГУ и клонами карельской березы коллекции ИЛГиС) мы оценивали универсальность праймеров (возможность амплифицировать фрагменты на всех генотипах), количество генерируемых молекулярных маркеров, долю полиморфных среди них, возможность проведения ПЦР при температурных условиях приближенных к условиям применения специфических праймеров.
Использовали:
- RAPD c одиночными 10-членными праймерами и их двупраймерными комбинациями;
• semi-RAPD c одиночными 12-членными праймерами и их двупраймерными комбинациями;
• semi-RAPD c одиночными 15-членными праймерами и их двупраймерными комбинациями;
На матрице ДНК редиса в случае использования 10-членных cлучайных праймеров и 12-членных полуслучайных праймеров, а также их двупраймерных комбинаций, нами было показано отсутствие достоверных различий (p=95%) по количеству молекулярных маркеров на реакцию. Средние количества ММ на реакцию составили для RAPD 2,69+0,14, для semi-RAPD 2,85+0,16. Среднее количество ММ на реакцию в случае 15-членных праймеров было достоверно (p=95%) выше и составило в среднем 3.93+0. Было показано, что среднее количество фрагментов ПЦР с 15-членными полуслучайными праймерами у редиса выше, чем данный показатель для 10 членных RAPD праймеров и 12-членных полуслучайных праймеров. Доли полиморфных ММ, полученных при ПЦР с 15-членными полуслучайными праймерами и 10-членными RAPD праймерами достоверно не различались, но были выше данного показателя для 12-членных полуслучайных праймеров. То есть, по комплексу проанализированных характеристик метод semi-RAPD с использованием 15-членных праймеров показал себя наилучшим образом для молекулярного маркирования линий редиса.
В ходе анализа клонов карельской березы с различными типами праймеров показано, что для 12-членных полуслучайных праймеров, среднее количество ММ на реакцию составило 3,8+0,36. Среднее количество ММ на реакцию в случае 15-членных праймеров было несколько выше и составило 4,5+0,45, а для двупраймерных комбинаций составило 4,1+0,16. Показано, что процент полиморфных ММ клонов берез при использовании коротких полуслучайных праймеров составляет 29+7,5%, для длинных полуслучайных праймеров этот показатель равняется 47+7,5 %, а для их двупраймерных комбинаций 39+5,2%.
Таким образом, было показано, что все типы праймеров могут быть использованы для оценки качества ДНК перед процедурой скрининга видов на наличие Т-ДНК. Однако, наиболее перспективными по комплексу признаков являются 15-членные полуслучайные праймеры. Эти праймеры имеют температуру отжига, близкую к специфическим праймерам, а значит, могут быть использованы в совместных реакциях с ними;
превосходят более короткие полуслучайные и случайные праймеры по количеству генерируемых фрагментов, а значит вероятность амплификации фрагмента на неизвестной матрице при их использовании выше, чем при использовании других анализируемых праймеров.
Скрининг видов двудольных растений на наличие онкогенов Agrobacterium.
Для обнаружения последовательностей, гомологичных генам Т-ДНК из Agrobacterium была использована модификация TaqMan ПЦР в реальном времени. Мы скрининировали каждый вид растений не менее, чем в трех повторностях, на наличие последовательностей, гомологичных Т-ДНК.
Первый набор праймеров и зондов состоял из последовательностей, комплементарных онкогенам А. rhizogenes (rolB, ROLC, ORF13, и ORF14), а во втором комплекте были олигонуклеотиды для выявления онкогенов A.
tumefaciens (tms1 и tmr). Для первого типа скрининга в качестве положительного контроля использовали геномную ДНК, Nicotiania glauca, где, как известно присутствует Т-ДНК (White et al., 1982, 1983). Поскольку гены из Т-ДНК A. tumefaciens не обнаружены в геноме ни одного растения, мы использовали ДНК A. tumefaciens в качестве положительного контроля для второй серии экспериментов. В реакции ПЦР без матричной ДНК роста флуоресцентного сигнала не наблюдали.
Образцы растений были собраны из различных экосистем в Ленинградской области, Краснодарском крае, а также предоставлены ГНУ ВИР.
Проанализировано более 200 видов двудольных видов растений, принадлежащих к 38 различным семействам.
Поскольку Т-ДНК подобные последовательности были впервые обнаружены в пределах сем. Solanaceae у растений рода Nicotiana, мы начали свои исследования с масштабного скринирования представителей данного семейства на наличие фрагмента Т-ДНК A. rhizogenes.
Для подтверждения возможности использования выделенной нами ДНК в ПЦР с праймерами к последовательностям агробактериальных онкогенов была проведена ПЦР с использованием полуслучайных праймеров SR11, SR16, SR 17.
Для обнаружения последовательностей подобных агробактериальным онкогенам были проведены ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров ORF13, ORF14, rolC, rolB, зондов, гомологичных части последовательности агробактериальных онкогенов, и ДНК исследуемых видов. При проведении реакций в качестве положительного контроля использовалась ДНК трансформированного N.tabacum, в качестве контроля на отсутствие контаминации - проба со всеми компонентами реакционной смеси, кроме ДНК.
При использовании праймеров ORF13, ORF14, rolC, rolB и ДНК трансформированного N.tabacum наблюдали прохождение реакции. При проведении ПЦР в реальном времени с праймерами ORF 13, ORF14, rolC и ДНК нетрансформированного N.tabacum наблюдалось прохождение реакции, что подтверждает факт наличия в геноме нетрансформированного табака последовательностей гомологичных онкогенам A. rhizogenes.
При проведении ПЦР в реальном времени на матрице ДНК N.langsdorffii не наблюдалось прохождение реакции с праймерами ORF13, ORF14, rolC, rolB, что соответствует данным литературы (Intrieri M.C. and Buiatti M., 2001).
При анализе исследуемых видов сем. Solanaceae: Lycopersicon.cheesmanii, L.сhilense, L. chmielewskii, L. esculentum var. cerasiforme, L. hirsutum, L.
glabratum, L.parviflorum, L. peruvianum, L. рimpinellifolium, Solanum demissum, S.pinnatisectum, S.rybinii, S.boyacense, S.canarense,, S.stenotomum, S.verrucosum, S.jamesii, S.acaule, S.albicans, S.canasence, S.phureja, S.ajanhuiri, S.goniocalyx, S.hougassi, S.chaucha, S.curtilobum, S.andigenum, S.tuberosum, S.tenuifilamentum, S.kurtzianum, S.hondelmanii, S.oplocense, S.spegazzinii, S.fendleri, S.hjertingii, S.sparsipilum, S.polytrichon, S.stoloniferum, S. chacoense, S. tarijense, S.
cardiophyllum, S.bertolti, S.doddsii, S. stenotomum, S. juzepczukii, S. vernei, S.chocclo, S.mamilliferum, S.macmillanii, S.riobambense, Ph.ixocarpa, C. аnnuum, S.dulcamara прохождение реакции с праймерами к агробактериальным онкогенам ORF13, ORF14, rolC, rolB не детектировалось, что может быть интерпретировано как отсутствие в геномах этих видов последовательностей, подобных онкогенам ORF13, ORF14, rolC, rolB A. rhizogenes.
По-видимому, присутствие в геноме нетрансформированных растений последовательностей, гомологичных онкогенам A. rhizogenes не является особенностью семейства Solanaceae но характерно для представителей рода Nicotiana.
Анализ представителей различных семейств двудольных растений на наличие Т-ДНК-подобных последовательностей В анализ были вовлечены виды растений, относящиеся к различным семействам двудольных растений и широко распространенные в европейской части России. В ходе сбора обзазцов в природе проводилось определение видов по определителю (Губанов и др, 2003, 2004). При возниконовении затруднений с видоидентификацией проводили анализ последовательности нуклеотидов ITS, далее сопоставляли их с базами данных нуклеотидных последовательностей. В ходе секвенирования ITS растений в ряде случаев было отмечено загрязнение растительной ДНК посредством ДНК фитопатогенных грибов. Клонирование фрагментов ПЦР и последующее секвенирование позволило идентифицировать случаи заражения Centaurea solstitialis патогенном Pericornia igniaria, а также заражение растения Salsola tragus патогенами Colletotrichum gloeosporioides и Diaporthe eres. Эти фитопатогены могут быть рекомендованы для разработки методов биологического контроля численности поражаемых сорных растений (Kolomiets et al., 2008a,b, Kolomiets et al., 2009).
При анализе на наличие Т-ДНК-подобных последовательностей образцов растений всех анализируемых видов за исключением одного выявить рост флуоресценции в РВ-ПЦР с праймерами и зондами к генам Т-ДНК ни A.
rhizogenes ни А. tumefaciens не удалось. Вместе с тем, на ДНК, выделенной из трех растений Linaria vulgaris, каждое из которых собрано в разных районах Ленинградской области, было отмечено прохождение реакции при использовании праймеров и зондов ко всем четырем анализируемым онкогенам A. rhizogenes.
L. vulgaris Mill. (льнянка обыкновенная, рисунок 5) является одним из видов произрастающих в большей части Европы и Северной Азии, и в настоящее время распространена в Северной Америке как инвазивный вид.
Рис 5. Linaria vulgaris Mill.
Многолетнее растение со стержневой корневой системой и с длинными ползучими побегами. Стебель 30— 60(90) см высотой, прямостоячий, простой или ветвистый, густо олиственный. Листья линейно ланцетные или линейные, заострнные, цветки собраны в густые длинные верхушечные кисти. Венчик жлтый, с ярко-оранжевой выпуклиной на нижней губе. Цветт в июне—августе. Плод - коробочка продолговато-эллиптическая,, содержит многочисленные мелкие, дисковидные, семена. (Губанов и др., 2004, 2005).
Характеристика кл Т-ДНК L. vulgaris Описание последовательностей, гомологичных rolB, rolC, ORF13, и ORF Фрагменты ДНК (размером около 500 пар оснований) гомологичные генам rolB, rolC, ORF13, и ORF14 A. rhizogenes (рисунок 6) были амплифицированы на матрице геномной ДНК, выделенной из одного растения L. vulgaris собранного в Ленинградской области.
Размеры амплифицированных фрагментов совпадают по размеру с фрагментами, соответствующих генов Agrobacterium. ПЦР-фрагменты гомологичны rolB, rolC, ORF13, и ORF14 были клонированы и секвенированы.
Последовательности ДНК были более чем на 85% сходны с последовательностями соответствующих онкогенов штамма А4 А. rhizogenes.
Данные последовательности Т-ДНК из L. vulgaris были названы Lv rolB, Lv rolC, Lv ORF13, и Lv ORF14. BLAST анализ относительно последовательностей, представленных в базах данных показал, что наибольшее сходство (93%) наблюдалась между Lv rolC и rolC из штамма A4 A. rhizogenes (согласно # X03433). Lv ORF14 имеет самое низкое сходство с соответствующим онкогеном Agrobacterium (85%) (Acc. # K03313).
Амплификации ДНК L. vulgaris с праймерами к онкогенам A. tumefaciens не наблюдали.
Рисунок 6. ПЦР анализ ДНК растений L. vulgaris с праймервами к онкогенам rolB (A, B, перекрывающиеся фрагменты), rolC (C), ORF13 (D), и ORF14 (E) из Agrobacterium rhizogenes. 1 – маркер молекулярного веса (MWM) ( bp+1.5 kb ladder, Sibenzyme);
стрелками указаны фрагменты 500 bp.
2 – отрицательный контроль. 3- штамм 8196 A. rhizogenes (положительный контроль). 4- L. vulgaris.
Дополнительные образцы L. vulgaris были собраны в Европейской части России в нескольких точках на расстоянии порядка 700 км друг от друга в Мурманской, Ленинградской, Московской, Воронежской областях и в Краснодарском крае. Кроме того, материал собран в Азиатской части России в Челябинской, Тюменской и Новосибирской областях. Из каждого региона оценивали по 2-3 растения. Всего проанализировано 30 растений. Расстояние от самой западной до самой восточной точки сбора было около 4000 км.
Расстояние от самой северной до самой южной точки сбора составило около 3000 км. Все образцы (100+3,2%) содержали последовательности, гомологичные Т-ДНК генам rolB, rolC, ORF13 и ORF14.
Для того, чтобы исключить возможность того, что наши данные являются результатом контаминации образцов посредством ДНК Agrobacterium, была проведена ПЦР с праймерами, специфичными к трем консервативным генам локуса vir A. rhizogenes (virB2, virD2, and virG). Эти vir гены являются частью Ti и Ri плазмид из A. tumefaciens и A. rhizogenes, соответственно, и они высоко консервативны (Рисунок 2 приложения), но не переносятся в растения. Таким образом, их присутствие в образцах ДНК показывало бы, что амплификация фрагментов онкогенов могла происходить также на ДНК агробактерий без интеграции в геном растения. Фрагмент ожидаемого размера для каждого из трех генов был детектирован только в контрольной ДНК, экстрагированной из A. rhizogenes, но не в случае ДНК, экстрагированной из L. vulgaris (Рисунок 7).
Эти результаты показывают, что ДНК L. vulgaris не была контаминирована ДНК A. rhizogenes.
Рисунок 7. ПЦР анализ ДНК независимых растений L. vulgaris с праймерами к некоторым генам vir из Agrobacterium: virB2 (A), virD2 (B), и virG (C)). 1- MWM (100 bp+1.5 kb ladder, Sibenzyme);
стрелки показывают фрагменты 200bp (A), 500 bp (B, C). 2- штамм 8196 A. rhizogenes (положительный контроль). 3-5 – независимые растения L. vulgaris.
Для последующих работ на базе последовательностей праймеров к vir генам были созданы тест-системы для выявления агробактерий в ПЦР в реальном времени в модификации TaqMan.Данная система защищена патентом РФ № 2458142 от 31.05. Характеристика структуры клТ-ДНК Linaria vulgaris.
Для дальнейшего определения штамма A. rhizogenes, который инфицировал L.vulgaris, мы проанализировали гены синтеза опинов клТ-ДНК.
В ходе ПЦР с праймерами к четырем различным генам опинсинтаз: ags, mis, nos, и cuc амплификацию фрагмента ожидаемой длины наблюдали только в случае использования праймеров к гену mis, который кодирует микимопинсинтазу. Секвенирование продукта ПЦР показало, что уровень сходства полученной последовательности ДНК с соответствующим геном из плазмиды pRi 1724 (Acc. # AP002086), и генами из правого и левого плеча клТ ДНК Nicotiana glauca: Ng misL и Ng misR (Acc. ##: AB071334.1, AB071335.1) был 89, 88 и 89%, соответственно.
Секвенирование межгенных спейсеров Lv T-ДНК показало, что уровень их сходства с соответствующими последовательностями из штамма А Agrobacterium rhizogenes ниже, чем этот показатель для кодирующих последовательностей. Наиболее высокое его значение (86%) было отмечено для спейсера rolC-ORF1. С другой стороны, этот показатель составил всего 79% для спейсера rolB-rolC. Среди 313 нуклеотидов спейсера ORF14-mis, только 68 демонстрировали сходство с соответствующей последовательностью pRi1724, а уровень сходства составил 78%. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что гены T-ДНК L. vulgaris мутировали медленнее, чем межгенные пространства. Наиболее консервативным фрагментом среди онкогеноподобных последовательностей L. vulgaris оказался rolC. Фрагменты, соответствующие кодирующим последовательностям Lv rolB, Lv ORF13, Lv ORF14, и mis содержат терминирующие кодоны и мутации, приводящие к сдвигам рамок считывания.
Для того, чтобы определить последовательность всей вставки Т-ДНК в геном Linaria, был применен метод «прогулка по хромосоме» (chromosome walking approach). Этот эксперимент показал присутствие в геноме L. vulgaris гомологов ORF2, ORF3, ORF8, и rolA. Дальнейшая «прогулка по хромосоме» показала, что за ORF2 у льнянки присутствует другой фрагмент, гомологичный гену mis. На основе этих данных мы предположили, что в геноме L. vulgaris присутствует по меньшей мере 2 копии T-ДНК, организованные, как прямой повтор. Секвенирование левой копии T-ДНК показало, что она содержит те же гены, что и правая, а также более протяженный фрагмент гомолога ORF2 и фрагмент гена агроцинопинсинтазы (acs).
Для того, чтобы более четко определить структуру двух копий Lv T-ДНК, была проведена ПЦР с «LONG PCR enzyme Mix» (Fermentas). Секвенирование правой и левой копии T-ДНК показало, что обе копии содержат последовательности, гомологичные ORF2, ORF3, ORF8, rolA, rolB, rolC, ORF13, ORF14, и гену mis. Схема организации T-ДНК L. vulgaris основанная на данных этого секвенирования показана на рисунке 8. Большие ПЦР фрагменты, полученные с использованием праймеров LF + LR и RF + RR, соответствуют левой и правой копиям Lv-TДНК. Расположение этих праймеров показано черными стрелками на рисунке 8A. Праймеры, сайтами отжига которых были последовательности в пределах правой копии ORF2 и левой копии mis, были использованы для амплификации ДНК в месте стыковки двух копий (Рисунок 8A и. 8B, серые стрелки). ПЦР-фрагменты амплифицированные на ДНК 3-х независимых растений L. vulgaris, включающие часть ORF2 правой копии T-ДНК и часть гена mis левой копии T ДНК, показаны на рисунке 8C. Они иллюстрируют одинаковую структуру повтора у всех из трех проанализированных растений. Сравнение правой и левой копии Lv T-ДНК показало, что нуклеотидные последовательности отличаютося мононуклеотидными полиморфизмами на всем протяжении фрагментов. Кроме того, были отмечены делеции в пределах спейсеров ORF8 rolA (52 bp), rolC-ORF13 (219 bp), и ORF13-ORF14 (123 bp) в правой копии T ДНК. Последовательность депонирована в Genbank под номером EU735069.2.
Рисунок 8. Схема клT-ДНК L. vulgaris. (A) Схема двух прямых повторов T-ДНК L. vulgaris. (B) Схема фрагмента ПЦР в месте стыковки правой и левой копий Т-ДНК. (C) Фотограция фрагментов ПЦР, полченных в 3-х независимых реакциях на матрице ДНК различных растений L. vulgaris.
Определение сайта интеграции клТ-ДНК в геномную ДНК льнянки.
На следующем этапе работы мы предприняли попытку детерминировать сайт интеграции Lv T-ДНК в геном L. vulgaris. Для этого мы стали анализировать район Lv T-ДНК вблизи правой границы методом TAIL-PCR с праймерами и зондами к гену mis. Был амплифицирован фрагмент, содержащий участок Т-ДНК вблизи правой границы и участок растительной ДНК.
Секвенирование показало, что фланкирующий район содержит часть гена mis, правую границу T-ДНК и 80 нуклеотидов фланкирующей растительной ДНК.
ДНК растения имела 78%-ное сходство с участком центромерного района хромосомы 4 (Acc# AB073162) Arabidopsis thaliana. Около 62 нуклеотидов растительной ДНК имели сходство на уровне 77% с Ty3/gypsy–подобным ретротранспозоном Vicia faba (Acc. # AJ851042.1) и около 40 нуклеотидов были более чем на 85% сходны с Ty3/gypsy–подобным ретротранспозоном Vicia sativa (Acc ## AJ851070.1, AJ851066.1).
Для того, чтобы понять, был ли одинаков сайт интеграции Т-ДНК у различных растений L. vulgaris, мы провели ПЦР с праймером mis4 и разработанным нами праймером к последовательности Ty3/gypsy-подобного ретротранспозона. Образцы геномной ДНК различных растений L. vulgaris различного географического происхождения (собранных в Ленинградской области, Краснодарском Крае, Воронежской, Челябинской и Новосибирской областях) были использованы в качестве матрицы. Амплификацию наблюдали во всех случаях, хотя размеры продуктов были различными. Два варианта продуктов ПЦР были выявлены и секвенированы (Рисунок 9). Первый тип последовательности был идентичен таковой, описанной выше (78% сходство с фрагментом Acc# AB073162). Во втором фрагменте была та же фланкирующая ДНК, но в пределах Lv T-ДНК выявлено 150 дополнительных нуклеотидов, которые располагаются на 13 позиций ниже по течению от гена mis и имеют сходство с фрагментом pRi1724 (AP002086.1), позиции 26137-26287. То есть изначально мы обнаружили форму с делецией фрагмента Т-ДНК вблизи правой границы, а новоотсеквенированный вариант последовательности был полноразмерным.
На основе полиморфизма данной последовательности было решено создать молекулярный маркер, который мог бы быть использован в филогенетических исследованиях рода Linaria. Присутствие Т-ДНК с общим сайтом интеграции свидетельствует о родстве видов, имеющих ее в геноме. В пределах Т-ДНК-содержащих видов родственными являются формы с делецией в пределах данного маркера. Более тонкие различия можно определить по SNP.
Анализ других видов льнянок на наличие последовательностей Т-ДНК.
После обнаружения Т-ДНК у L. vulgaris мы предприняли попытки охарактеризовать других представителей данного рода по признаку наличия клТ-ДНК. Изначально нами были проанализированы виды секций Supinae (L.
aeruginea, L. alpine), Repentes (L. purpurea), Versicolores (L. maroccana), Speciosae (L. dalmatica). Из данного списка Т-ДНК была обнаружена только у L. dalmatica. Далее в работе были исследованы виды секций Linaria (L.
acutiloba, L. altaica, L. buriatica, L. debilis, L. hepatica, L.incompleta, L.
melampyroides L. ruthenica), и Speciosae (L.genistifolia, L. sabulosa). В геномах всех исследованных видов этих секций обнаружена Т–ДНК (Таблица 1).
Рисунок 9 Полиморфизм последовательности Т-ДНК вблизи правой границы На основании данных о присутствии и общем сайте интеграции Т-ДНК в видах секций Linaria и Speciosae было сделано заключение о монофилетическом происхождении исследованных секций. На основании анализа нуклеотидной последовательности можно детализировать филогенетические отношения в пределах исследованных секций (Рисунок 10).
Таблица Характеристика видов Linaria по наличию клТ-ДНК Секция Вид Т-ДНК Linaria Linaria acutiloba Fisch. ex Rchb. + Linaria altaica Fisch. ex Kuprian. + Linaria buriatica Turcz. ex Ledeb. + Linaria debilis Kuprian. + Linaria hepatica Bunge + Linaria incompleta Kuprian. + Linaria melampyroides Kuprian. + Linaria ruthenica Blonski + Linaria vulgaris Mill. + Speciosae Linaria dalmatica (L.) Mill. + Linaria genistifolia (L.) Mill. + Linaria sabulosa Czern. ex Klokov + Supinae Linaria aeruginea (Gouan) Cav. Linaria alpina Mill. Repentes Linaria purpurea (L.) Mill. Versicolores Linaria maroccana Hook. Как видно из дендрограмм с использованием нового маркера удалось уточнить положение L. hepatica по отношению к другим видам.
К настоящему моменту помимо L. vulgaris из данного списка детально охарактеризована у которой отсеквенированы все L. dalmatica онкогеноподобные последовательности и показано, что по крайней мере rolС может кодировать функциональный пептид. Нуклеотидная последовательность LdrolC на 94% сходна с LvrolC L.vulgaris, на 94% с rolC A.rhizogenes штамма A4 и 80% с NgrolC N. glauca. В пределах rolB, mis,ORF13, ОRF 14 обнаружены мутации приводящие к сдвигам рамок считывания и преждевременным терминирующим кодонам. То есть, для L. dalmatica отмечены те же закономерности, что и для L. vulgaris.
Рис. 10 Филогенетические древа Linaria, построенные на основе сиквенсов ITS сверху, Т-ДНК-маркера снизу (анализ проведен методом максимального правдоподобия с использованием программы MEGA 5. Подчеркиванием указаны виды, сиквенсы ITS которых получены нами) Таким образом, нами был обнаружен и охарактеризован новый пример горизонтального переноса генов от агробактерий к растениям рода Linaria. То есть акты агробактериальной трансформации имели место в эволюции растений неоднократно. Для рода Nicotiana было показано, что привнесение и закрепление онкогеноподобных последовательностей происходило несколько раз. Сузуки с соавторами выявили, что сайты инсерции разные у различных видов табаков, т.к. отличаются районы растительной ДНК, граничащие с клТ ДНК. (Suzuki, 2002). Опираясь на полученные данные, авторы заключили, что во время эволюции рода Nicotiana было несколько независимых событий интеграции Т-ДНК в геном растения. В наших исследованиях было выявлено, что у нескольких видов льнянок совпадают сайты интеграции кл-Т-ДНК в геном и ген синтеза опинов. Основываясь на этих данных, можно заключить, что агротрансформации подвергался общий предок исследованных льнянок, еще до расхождения этих видов в эволюции. Поскольку горизонтальный перенос генов от агробактерий в эволюции растений успешно осуществлялся неоднократно, вероятно, закрепившиеся мотивы играли значительную роль в их жизни. В литературе обсуждается, что данные гены участвуют в контроле опухолеобразования у гибридов табака. (Ichikawa, 1990). Обнаруженные нами примеры переноса Т-ДНК растениям рода Linaria, семейства Plantaginaceae могли способствовать проявлению других физиологических признаков (например, способности к вегетативному размножению), которые позволили закрепиться агробактериальной Т-ДНК в геномах представителей этих родов.
В рамках изучения физиологических особенностей представителей родов Nicotiana и Linaria мы предприняли попытку охарактеризовать особенности морфогенеза данных растений in vitro.
Изучение морфогенетических реакций in vitro при регенерации и трансформации у видов, контрастных по наличию клТ-ДНК Agrobacterium может трансформировать огромное количество видов двудольных растений. Однако, Т-ДНК закрепилась в геномах немногих из них.
К настоящему времени она описана только у Nicotiana и Linaria. В ходе обсуждения возможной роли клТ-ДНК в числе других была выдвинута гипотеза о ее влиянии на эндогенный метаболизм гормонов, что может отразиться на особенностях регенерационных процессов (Ichikawa, Syono, 1991). Наф (Naf, 1958) с целью объяснения механизмов образования опухолей у гибридов табака предложил разделить все виды данного рода на две группы «+» и «-». Скрещивание видов из разных групп между собой приводит появлению опухолеобразующих гибридов. Скрещивания в пределах группы не влечет образования опухолей на гибридах. Ичикава и Сионо предложили гипотезу, согласно которой виды табака, содержащие Т-ДНК относятся к группе «-» и склонны к корнеобразованию, а виды группы «+» имеют повышенный цитокининовый статус и склонны к образованию побегов (Ichikawa, Syono, 1991). Для выяснения, является ли данная закономерность справедливой для льнянок и табака, мы стали анализировать регенерационную способность видов родов Linaria и Nicotiana Характеристика регенерационных процессов у различных представителей рода Linaria Всего в ходе работы оценены морфогенетические реакции эксплантов междоузлий и листьев 4-ех видов льнянок: L. vulgaris, L. maroccana, L.
aeruginea, L. purpurea на среде без гормонов и трех вариантах питательных сред, различающихся по соотношению основных фитогормонов – аналога цитокининов – бензиламинопурина (БАП) и аналога ауксинов – нафтилуксусной кислоты (НУК).
Было показано, что все исследованные виды обладают высокой способностью к регенерации. На средах с фитогормонами экспланты всех исследованных видов образовывали каллусы с эффективностью 100%, экспланты L. vulgaris, L. maroccana, L. aeruginea, формировали побеги.
Образование корней было отмечено только на эксплантах междоузлий L.
purpurea на среде с НУК с эффективностью 48+11%. Наиболее контрастно различия между видами проявлялись на среде без фитогормонов (рисунок 11).
Рисунок 11.
Процент эксплантов, образующих каллусы и побеги у различных видов льнянок на среде Мурасига-Скуга без гормонов.
Самая высокая способность к регенерации и склонность к образованию побегов отмечена у L. vulgaris. Возможно, именно это свойство помогло Т-ДНК закрепиться в геноме данного вида и передаваться следующим поколениям.
Интенсивное проявление морфогенетических процессов на среде без гормонов само по себе заслуживает внимания, поскольку не характерно для других видов.
Характеристика морфогенетических процессов in vitro у различных представителей рода Nicotiana Согласно литературным данным многие представители рода Nicotiana характеризуются высокой регенерационной способностью (Bogani et al., 1997).
Nicotiana tabacum, являясь модельным объектом для клеточных технологий, обладает высокой регенерационной способностью и типичными реакциями на экзогенные гормоны: каллусообразование в ответ на добавление ауусинов и цитокининов, корнеобразование в ответ на ауксины, побегообразование в ответ на цитокинины (Bogani et al., 1997). В рамках данного исследования мы охарактеризовали N. langsdorffii N. gossei, N. suaveolens, N. rustica по регенерационной способности. Показано, что эффективность каллусообразования для всех исследованных видов на среде с БАП и НУК составляла 100%, в то же время на среде без гормонов интенсивность морфогенетических процессов различалась между видами (рисунок 12).
Интересно отметить, что среди видов, содержащих Т-ДНК отмечены виды у которых преобладает побегообразование, что противоречит гипотезе Ичикава и Сионо (Ichikawa, Syono, 1991).
Рисунок 12. Морфогенетические реакции листовых эксплантов различных видов Nicotiana на среде Мурасига-Скуга без фитогормонов.
В ходе анализа способности к агротрансформации представителей рода Nicotiana показано, что среди видов, содержащих клТ-ДНК, отмечены как формы, обладающие высокой способностью к трансформации (N. tabacum), так и формы поддающиеся трансформации исследованными штаммами с низкой эффективностью (N. suaveolens, N. gossei) (Рисунок 13). Среди видов, не содержащих клТ-ДНК, также нет единообразия в отношении проявлений исследуемого признака. Отмечена низкая способность к трансформации N.
langsdorffii всеми штаммами за исключением C58, в то время как N.rustica эффективно трансформировался штаммами A. rhizogenes и штаммом A6 A.
tumefaciens.
.
Рисунок 13. Интенсивность морфогенетических процессов, наблюдаемых при трансформации видов Nicotiana штаммами Agrobacterium tumefaciens (A) и A. rhizogenes(Б) (обозначения на рисунке).
Следует особо отметить склонность к опухолеобразованию видов N.
suaveolens, N. gossei и без воздействия агробактерий. По этой причине в ходе агробактериальной трансформации для данных видов признак опухолеобразование мы оценивали не только, как процент эксплантов с реакцией, но и в баллах от 1 до 5, отражающих степень покрытия тканей экспланта опухолями. В таблице 2 отражены данные показатели для исследуемых видов. Показатели, превышающие контрольные значения выделены жирным шрифтом. Из таблицы видно, что N. gossei наиболее эффективно трансформируется штаммом С58, а N. suaveolens - штаммом А6.
Таблица 2.
Процент эксплантов с опухолями и средний балл опухолеобразования при трансформации N. gossei и N. suaveolens штаммами A. tumefaciens вид штамм Процент вид штамм Процент N N эксплантов с эксплантов с опухолями и опухолями и средний балл средний балл опухолеобра- опухолеобра зования зования 64,3%±9,2% 22,5%±6,6% T37-3 28 T37-3 1,54 балла 2 балла 57,5%±7,9% 96,2%±3,75% C58 26 C58 2 балла 3,85 балла 25,9%±8,4% 62,5%±7,7% A6-2 27 A6-2 N. suaveolens 0,63 балла 3 балла N. gossei.
контроль 88%±5,5% контроль 30 40 100%-2,4% 1,67 балла 2 балла Таким образом, нами показана высокая способность к регенерации видов рода Nicotiana, связи между наличием Т-ДНК и способностью к агротрансформации, или доминирующей морфогенетической реакцией in vitro не выявлено ЗАКЛЮЧЕНИЕ Наши результаты показывают, что примеры горизонтального переноса генов T-ДНК от Agrobacterium к растениям не ограничиваются только представителями Nicotiana. Данные представленные в данном исследовании показывают, что горизонтальный перенос генов от агробактерий имел место также в эволюции рода Linaria сем Plantaginaceae. интересно отметить, что горизонтальный перенос генов к растениям был отмечен только от A. rhizogenes но не A. tumefaciens. Это может быть объяснено сравнительно легким получением трансформантов из бородатых корней, индуцированных A.
rhizogenes в отличие от опухолей, индуцированных A. tumefaciens (Tepfer 1984).
Мы показали интеграцию Т-ДНК в район, похожий на центромерную последовательность A. thaliana и ретротранспозон Vicia spp., причем у группы льнянок, содержащих Т-ДНК этот район совпадает, что говорит о их монофилетическом происхождении. Высокая регенерационная способность льнянок сходна с высокой регенерационной способностью табаков. Т-ДНК могла сохраниться в геномах растений этих родов благодаря их высокой регенерационной способности. Это же свойство L. vulgaris может способствовать способности льнянок к вегетативному размножению и широкому распространению как инвазивный вид (Lehnhoff 2008).
Отсутствие гомологов Т-ДНК в большинстве проанализированных видов растений позволяет сделать вывод о том, что горизонтальный перенос генов от Agrobacterium является редким событием в эволюции растений. Однако, обнаружениеТ-ДНК-подобных последовательностей в видах отличных от Nicotiana показывает, что горизонтальный перенос генов от Agrobacterium к растениям распространен шире, чем считалось ранее. Существование нескольких независимых актов такой трансформации и сохранение клТ-ДНК в геномах растений в ходе эволюции предполагает наличие экологических преимуществ у таких растений.
Т-ДНК могла сохраниться в геномах растений Linaria и Nicotiana, поскольку они обладают высокой способностью к регенерации. С другой стороны, отмечена большая разница между растениями, которые содержат онкогены Agrobacterium: среди видов Nicotiana встречаются как склонные к корнеобразованию, так и побегообразованию, в то время как L. vulgaris склонна к образованию побегов. Интересно отметить, что гомолог rolC является наиболее консервативным геном среди генов Т-ДНК у видов Nicotiana (Intrieri and Buiatti 2001;
Mohajjel-Shoja et al. 2010). В некоторых видах Nicotiana только rolC кодирует функциональный продукт (Mohajjel-Shoja et al. 2010).
Аналогичная особенность отмечена нами и в отношении Т-ДНК-подобных последовательностей L. vulgaris и L. dalmatica.
Обнаружение гомолга гена mis показывает, что по происхождению Lv T ДНК связана с некоторой микимопиновой плазмидой pRi, сходной с таковой, трансформировавшей виды Nicotiana. Это свойство может быть не случайным и быть как-то связанным с растительно-микробными взаимодействиями. Если синтез опинов становится полезным свойством для некоторых растений (пусть даже на низком уровне, ткане- или стадиеспецифичным), то мы можем спекулировать о первых шагах установления растительно-микробных симбиозов. Растения, содержащие клТ-ДНК, могут потенциально поддерживать бактерий определенных видов в их ризосфере благодаря выделению опинов в прикорневую сферу. Возможно, именно таким способом паразитические отношения могут постепенно перерастать в мутуалистические.
Выводы Разработан подход, позволяющий эффективно скринировать образцы 1.
ДНК различного происхождения на предмет присутствия в них последовательностей, сходных с описанными ранее. Подход основан на применении ПЦР в реальном времени с вырожденными праймерами и вырожденными зондами к наиболее консервативным частям исследуемых генов.
В ходе скрининга среди 208 геномов видов двудольных растений 2.
присутствия Т-ДНК-подобных последовательностей обнаружен новый пример горизонтального переноса генов от агробактерий к растениям:
последовательности, гомологичные oнкогенам Agrobacterium rhizogenes обнаружены в геноме Linaria vulgaris.
Т-ДНК в геноме L. vulgaris представлена двумя копиями, 3.
организованными, как несовершенный прямой повтор, сайт интеграции Т-ДНК имеет сходство с последовательностью, гомологичной ретротранспозонам Ty3/gipsy.
По гомологии с выявлены Т-ДНК-подобные 4. L. vulgaris последовательности в геномах L. acutiloba, L. altaica, L. buriatica, L. debilis, L.
hepatica, L.incompleta, L. melampyroides L. ruthenica, относящихся к секции Linaria, а также L. dalmatica, L. genistifolia, L. sabulosa, относящихся к cекции Speciosae. Сайт интеграции Т-ДНК в геном растения совпадает у исследованных видов, что свидетельствует о монофилетическом происхождении данных секций рода Linaria.
Компьютерный анализ последовательностей генов Т-ДНК L. vulgaris и L.
5.
dalmatica показал, что ген rolC является наиболее консервативным, не имеет структурных изменений, приводящих к сдвигам рамки считывания или преждевременным стоп-кодонам, и может кодировать полноразмерный белок, в то время как в других генах обнаружены мутации, приводящие к появлению преждевременных терминирующих кодонов.
Все исследованные виды родов Linaria и Nicotiana характеризуются 6.
высокой регенерационной способностью in vitro, данное свойство могло способствовать появлению растений регенерантов из трансгенных тканей и закреплению в ходе эволюции форм, содержащих Т-ДНК в геномах.
У представителей рода Nicotiana взаимосвязи способности к 7.
агробактериальной трансформации, преобладающей морфогенетической реакции in vitro и наличием в геноме вставки Т-ДНК не обнаружено.
Список публикаций по материалам диссертации.
Публикации в журналах, рекомендованных ВАК.
Матвеева Т.В Опухолеобразование у растений/ Т.В Матвеева, Л.А 1.
Лутова, Ю.Нестер // Генетика. 2001. Т. 37. № 9. С. 1188- 2. Matveeva T.V. Molecular markers of inbred radish (Raphanus sativus var.
Radicola Pers.) lines/ T.V. Matveeva., A.V.Simonova, L.A.Lutova // Cellular and Molecular Biology Letters. 2002. Т. 7. № 3. С. 845-848.
3. Matveeva T.V. Hormonal control of tumor formation in radish/ T.V. Matveeva, N.V. Frolova, I.E. Dodueva, I.S. Buzovkina, L.A. Lutova, R. Smets, H.Van Onckelen // Journal of Plant Growth Regulation. 2004. Т. 23. № 1. С. 37-43.
Фролова Н.В. Использование метода агробактериальной трансформации 4.
in vivo для получения фенокопий опухолеобразования Т.В. у безопухолевой линии редиса Raphanus sativusL./ Н.В. Фролова, Т.В. Матвеева, Л.А. Лутова // Биотехнология. 2004. № 4. С. 3-7.
Кулаева О.А. Горизонтальный перенос генов от агробактерий к 5.
растениям/ О.А. Кулаева, Л.А. Матвеева, Лутова // Экологическая генетика.
2006. Т. IV. № 4. С. 10-19.
Матвеева Т.В.Сравнительная характеристика методов rapd и semi-rapd 6.
для молекулярного маркирования редиса (Raphanus sativus L.) /Матвеева Т.В.// Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А.
Овчинникова. 2006. Т. 2. № 1. С. 40-45.
Матвеева Т.В. Характеристика морфогенетических реакций Nicotiana 7.
langsdorffii при трансформации штаммами агробактерий дикого типа in vitro/ Т.В.Матвеева, Т.Ю. Пигичка, Л.А Лутова. //Экологическая генетика. 2007. Т.3.
С. 21-24.
Матвеева Т.В. Молекулярная паспортизация клонов карельской березы 8.
при помощи ПЦР с полуслучайными праймерами/ Т.В. Матвеева, О.С.
Машкина, Ю.Н. Исаков, Л.А. Лутова // Экологическая генетика. 2008. Т. VI. № 3. С. 18-23.
Kolomiets T., O. First report of anthracnose of Salsola tragus сaused by 9.
Colletotrichum gloeosporioides in Russia”/ T. Kolomiets, O. Skatenok, A.
Alexandrova, Z. Mukhina, T. Matveeva, D. Bogomaz, D.K. Berner and C.A. Cavin, // Plant Disease, 2008a. V. 92, № 9. p. 1366.
10. Kolomiets T. First report of leaf spot caused by Periconia igniaria on yellow starthistle in Russia /T. Kolomiets, L. Pankratova, Z. Mukhina, D. Kassanelly, T.
Matveeva, D. Bogomaz and D.Berner // Plant Disease, 2008b. V. 92, № 6, p. 983.
11. Kolomiets T. First report of stem canker of Salsola tragus caused by Diaporthe eres in Russia/ T. Kolomiets, Z.Mukhina, Т. Matveeva, D. Bogomaz, D. K. Berner, C. A. Cavin, and L. A. Castlebury // Plant Disease. 2009.V. 93, № 1, p.110.
12. Матвеева Т.В. Горизонтальный перенос генов от агробактерий к растениям рода Nicotiana: эволюционные предпосылки и последствия/ Т.В.
Матвеева, О.А. Павлова, К.И. Иваницкий, Л.А. Лутова // Вестник Санкт Петербургского университета. Серия 3: Биология. 2009. № 4. С. 58- 13. Матвеева Т.В. Молекулярные маркеры для видоидентификации и филогенетики растений / Т.В. Матвеева, О.А. Павлова, Д.И. Богомаз Л.А. // Экологическая генетика, 2011, Т.IX, вып.1. - С.32- 14. Matveeva T.V. Horizontal gene transfer from Agrobacterium to the plant Linaria in nature/ T.V. Matveeva, D.I. Bogomaz, O.A. Pavlova, E.W. Nester, L.A.
Lutova // Mol.Plant Microbe Interact, 2012. V. 25(12) P. 1542- 15. Павлова О.А. Rol-гены Agrobacterium rhizogenes/ О.А. Павлова, Т. В.
Матвеева, Л.А Лутова // Экологическая генетика. 2013. Т. XI. №1.С. 59-68.
16. Павлова О.А. Геном Linaria dalmatica содержит гомолог гена rolC Agrobacterium rhizogenes/ О.А. Павлова, Т.В. Матвеева. Л.А. Лутова // Экологическая генетика. 2013. Т. XI. №2. С. 10- 17. Кулаева О.А., Изучение возможного горизонтального переноса генов от агробактерий к некоторым представителям семейства Solanaceae/ О.А. Кулаева, Т.В. Матвеева, Л.А. Лутова //Экологическая генетика 2013. Т. XI. №2. С. 3- Патент 18. Матвеева Т.В., Богомаз Д.И, Лутова Л.А. Патент РФ номер 2458142 от 31.05.11 на изобретение "Способ диагностики биоматериалов на наличие в них агробактерий" (срок действия до 31.05.2031) Монографии 19. Ермилова Е.В. «Количественный анализ экспрессии генов» (учебное пособие)/ Е.В. Ермилова, Ж.М. Залуцкая, Т.В. Лапина, Т.В. Матвеева // СПб:
«ТЕССА», 2010. - 104с 20. Матвеева Т.В., Малый практикум по генной инженерии/ Т.В. Матвеева, Д.И. Богомаз Л.А.Лутова// СПб: "Реноме", 2011. - 52 с.
Публикации в других изданиях.
21. Matveeva T.V. Search for sequences homologous to Agrobacterium T-DNA in different plant genomes/ T.V. Matveeva, L.A. Lutova, D. Wood, E.W. Nester // Biology of Plant-Microbe Interactions. 2003. V.4. p.526- 22. Matveeva T.V. Horizontal gene transfer from agrobacteria to plants in the natural and laboratory conditions/ T.V. Matveeva, N.V. Frolova, Yu.N. Isakov, O.S.
Mashkina, L.A. Lutova // Biotechnology, agriculture and the food industry / G.E.
Zaikov, editor. New York : Nova Science Publishers, 2004 P. 109- 23. Matveeva T.V. Search for T-DNA-like sequences in plant genomes using Real Time PCR with Degenerate Primers and Probe/ T.V Matveeva., L.A. Lutova, D.I.
Bogomaz.// Biotechnology, agriculture and the food industry / G.E. Zaikov, editor.
New York : Nova Science Publishers, 2006 Chapter 17. - Р.101- 24. Матвеева Т.В. Cпособ диагностики биоматериалов на наличие в них агробактерий/ Т.В. Матвеева, Д.И Богомаз, Л.А Лутова// Бюллетень "Изобретения. Полезные модели" № 22/12 (10.08.12), изд. Роспатент РФ.
25. Berner D., T. Mutual benefits through formalized international collaboration on biological control of weeds with plant pathogens/ Berner D., T. Souissi, E.
Smallwood, C. Cavin, F. Eskandari, B. Tunali, O. Buyuk, A. Yildirim, Z. Mukhina, T. Kolomiets, T. Matveeva, D. Bogomaz, D. Kassanelli, D. Mejri, K. Latiri, J.
Kashefi, and A. Lagopodi //Tunisian Journal of Plant Protection. 2011. V.6 P. 49-74.
Подписано в печать 24.06.2013 г. Формат 60х84/ Бумага офсетная. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 2,. Тираж 100 экз. Заказ № 601 от 24.06. Отпечатано в типографии ООО «МИР» 197341, г. Санкт-Петербург, Аллея Поликарпова, д. 6/1, оф.