Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов

Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

на правах рукописи

Мишина Наталия Михайловна ИССЛЕДОВАНИЕ СИГНАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ИНДИКАТОРОВ специальность – 03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2011

Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научный консультант:

кандидат биологических наук Всеволод Вадимович Белоусов

Официальные оппоненты:

Зарайский Андрей Георгиевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Минин Александр Александрович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник группы клеточной биологии Института белка РАН.

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Защита состоится 26 октября 2011 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д.002.019. при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «23» сентября 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В. А. Олейников ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. За последние годы представления о роли активных форм кислорода (АФК) в регуляции внутриклеточных процессов существенно расширились.

Показано участие АФК в регуляции клеточной пролиферации, миграции, дифференцировки, а также экспрессии генов. АФК играют важную роль в таких процессах, как иммунные реакции, эмбриогенез, разнообразные патологии на организменном уровне.

Из всех АФК только пероксид водорода (H2O2) обладает всеми необходимыми свойствами для выполнения функции вторичного мессенджера, действуя путем специфичного обратимого окисления редокс-активных тиоловых групп в остатках цистеинов некоторых белков.

Предполагают, что внутриклеточные сигнальные эффекты H2O2 осуществляются в соответствии с моделью компартментализованной окислительно-восстановительной передачи сигнала, когда белок-мишень и источник Н2О2 находятся в непосредственной близости друг от друга. Однако до сих пор оставалось не известным, какие именно внутриклеточные мембранные компартменты ответственны за продукцию Н2О2 при активации сигнальных каскадов.

Благодаря появлению генетически кодируемых индикаторов на основе флуоресцентных белков стало возможным исследовать сигнальную роль H2O2 на уровне индивидуальных живых клеток. Особый научно-практический интерес представляет возможность использования таких индикаторов для изучения внутриклеточной локальной продукции и динамики изменения концентрации H2O2, что ранее представлялось невозможным из-за отсутствия адекватных методов.

Ввиду растущей значимости исследования сигнальных каскадов с участием H2O разработка новых подходов использования генетически кодируемых индикаторов представляется актуальной задачей. Не менее важным является изучение базовых принципов организации окислительно-восстановительной передачи сигнала в клетке.

Продукция H2O2 специализированными ферментативными системами является частью сложных сигнальных каскадов, в которых задействовано множество ферментов и вторичных мессенджеров. Так, например, окислительно-восстановительная передача сигнала тесно взаимосвязана с продукцией липидных мессенджеров – фосфорилированных форм фосфатидилинозитола. Поэтому важной задачей является разработка методов одновременной регистрации активностей нескольких сигнальных систем в одной клетке.

Нарушения нормальной внутриклеточной продукции H2O2 связаны с тяжелыми нейродегенеративными и сосудистыми заболеваниями, с патологиями иммунной системы.

Таким образом, понимание функций эндогенного H2O2 в клеточных процессах важно как для фундаментальных исследований процессов внутриклеточной передачи сигнала, так и для биомедицинских исследований.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение внутриклеточной локализации и динамики изменения концентрации Н2О2 в различных цитоплазматических субкомпартментах клетки при активации сигнальных каскадов. В рамках сформулированной цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать флуоресцентные индикаторы на основе биосенсора HyPer с локализацией в различных цитоплазматических субкомпартментах клетки.

2. Исследовать с помощью полученных индикаторов локализацию и динамику изменения уровня эндогенного H2O2 в ответ на активацию тирозинкиназных рецепторов.

3. Создать генетически кодируемый флуоресцентный индикатор для одновременной детекции H2O2 и активности фосфатидилинозитол-3’-киназы для использования в многопараметрической флуоресцентной микроскопии сигнальных процессов в живой клетке.

Научная новизна и практическая ценность работы. Предложен новый подход к исследованию распределения и динамики изменения концентрации H2O2 в различных цитоплазматических субкомпартментах живой клетки c помощью вариантов белка индикатора HyPer. Используя данный подход, удалось впервые визуализировать локальную продукцию H2O2 в индивидуальных живых клетках в ответ на физиологическую стимуляцию ростовыми факторами. Полученные данные подтверждают гипотезу компартментализованной окислительно-восстановительной сигнализации, а также позволяют лучше понять роль H2O2 в клетках в нормальном физиологическом состоянии. Разработан и оптимизирован генетически кодируемый флуоресцентный индикатор, позволяющий одновременно следить за изменением концентраций H2O2 и фосфатидилинозитол-3,4,5-фосфата. Показано, что полученный «двойной» индикатор BtkPH-E41K-HyPer можно использовать для прижизненной многопараметрической визуализации внутриклеточных процессов с помощью флуоресцентной микроскопии. С помощью BtkPH-E41K-HyPer удалось впервые зарегистрировать локальную продукцию Н2О2 и активацию фосфатидилинозитол-3’-киназы при формировании иммунологического синапса в CD4+ TH-лимфоцитах. Полученный индикатор может быть использован в качестве прототипа для разработки других многопараметрических биосенсоров, что в дальнейшем позволит расширить возможности использования флуоресцентных индикаторов в фундаментальных и прикладных биомедицинских исследованиях.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 110 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 225 ссылок. Диссертация содержит 32 рисунка и 3 таблицы.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на Международной Конференции в честь 75-летия со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009), на школе семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала (Санкт-Петербург, 2009), на XXIII Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011), а также на международном EMBO|EMBL Симпозиуме «Seeing is Believing – Imaging the Processes of Life» (Гейдельберг, Германия, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи в рецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Динамика продукции Н2О2 в отдельных внутриклеточных компартментах в процессе активации тирозинкиназных рецепторов Ростовые факторы стимулируют клеточный ответ через активацию тирозинкиназных рецепторов (ТКР), локализованных на плазматической мембране (ПМ). Связывание ростового фактора приводит к олигомеризации рецептора и активации его тирозинкиназного домена и последующей индукции каскадов фосфорилирования. ТКР, связанные с лигандом, как правило, интернализуются в составе эндосомы и далее либо деградируют, либо рециклизуются обратно на плазматическую мембрану. Протеиновые тирозинфосфатазы (РТР – от Protein Тyrosine Рhosphatase) ответственны за терминацию передачи сигнала путем дефосфорилирования активного ТКР. Так как большинство РТР конститутивно активны в клетке, для успешного прохождения каскадов фосфорилирования важным условием является ингибирование РТР. Эндогенный Н2О участвует в контроле активности РТР через реакцию обратимого окисления тиолатов в активных центрах этих ферментов. В результате, временная инактивация РТР смещает динамическое равновесие фосфорилирования/дефосфорилирования ТКР в сторону реакции фосфорилирования.

Тирозинфосфатаза РТР-1В отвечает за дефосфорилирование многих активированных ТКР, в том числе рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR – от Epidermal Growth Factor Receptor) и тромбоцитарного фактора роста (PDGFR – от Platelet-Derived Growth Factor Receptor). РТР-1В локализуется на цитоплазматической стороне эндоплазматического ретикулума (ЭПР) с помощью С-концевого домена, заякоренного в мембране ЭПР. РТР-1В дефосфорилирует EGFR и PDGFR в участках контакта ЭПР с мембранами, содержащими активированный рецептор, и таким образом терминирует сигнальный каскад. Несмотря на то, что инактивация РТР-1В пероксидом водорода была показана in vivo и in vitro, механизм окисления этого фермента и других РТР остается загадкой. Не ясно, как РТР, которые имеют константу скорости реакции с пероксидом водорода 10 – 103 M-1с-1, способны эффективно конкурировать с пулом пероксиредоксинов (Prx), белков-антиоксидантов, реагирующих c Н2О2 с константой скорости 107 M-1с-1.

В настоящий момент для решения этого парадокса предложена модель компартментализованной окислительно-восстановительной сигнализации. Эта модель предполагает, что тиолаты белка-мишени (например, РТР) окисляются Н2О2, продуцированным ферментами, находящимися в том же внутриклеточном компартменте, что и белок-мишень. В таком случае, локальная концентрация Н2О2 может быть настолько высока, что позволит полностью окислить окружающие Prx, а вслед за ними и остальные мишени. Однако предложенная модель требует экспериментального подтверждения. Для определения локализации активированных NADPH-оксидаз, продуцирующих Н2О2, существенным является наблюдение в реальном времени за динамикой Н2О2 в различных внутриклеточных компартментах в ходе активации ТКР каскадов в живой клетке.

Эндосомы, ПМ и мембрана ЭПР потенциально могут быть местом продукции Н2О2, так как известно, что каждый из этих субкомпартментов содержит NADPH-оксидазы.

До настоящего времени детекция продукции АФК в клетке осуществлялась с применением необратимо взаимодействующих с АФК красителей. Однако такие методы имеют ряд ограничений, не позволяющих наблюдать за динамикой продукции АФК в отдельной живой клетке. С другой стороны, продукция Н2О2 в клетке может быть эффективно детектирована с помощью генетически кодируемых флуоресцентных белков сенсоров. Преимуществами генетически кодируемых сенсоров на основе GFP являются обратимый ответ, низкая токсичность для клеток, возможность локализации в различных внутриклеточных компартментах. Так, биосенсор HyPer, созданный ранее в нашей лаборатории, позволяет с высокой специфичностью детектировать субмикромолярные концентрации H2O2 в клетке.

HyPer представляет собой химерный флуоресцентный белок, состоящий из чувствительного к H2O2 и флуоресцентного доменов. Входящий в состав HyPer регуляторный домен транскрипционного фактора E. coli OxyR (OxyR-RD) содержит в активном центре два цистеиновых остатка, образующих под действием H2O дисульфидную связь, приводящую к изменению конформации всего домена. OxyR-RD обладает высокой селективностью к H2O2, в отсутствии H2O2 дисульфидная связь быстро восстанавливается тиол-восстанавливающими системами клетки, происходит реактивация HyPer. Флуоресцентный домен HyPer представляет собой вариант жёлтого флуоресцентного белка cpYFP с двумя пиками поглощения (420 нм и 500 нм) и эмиссией при 510 нм. cpYFP интегрирован в OxyR-RD с помощью двух коротких полипептидных линкеров. Образование дисульфидной связи в OxyR-RD под действием H2O2 приводит к изменению соотношения двух пиков поглощения cpYFP: интенсивность поглощения хромофора cpYFP при 500 нм (F500) растёт пропорционально уменьшению поглощения при 420 нм (F420). Сигнал HyPer определяют как отношение двух величин F500/F420, поэтому он не зависит от уровня экспрессии сенсора в клетке.

Однако пространственное разрешение метода с использованием HyPer не позволяет детектировать локальные повышения концентрации Н2О2 в клетке, так как из-за быстрой диффузии биосенсора в цитоплазме происходит «размывание» сигнала (Рис.1).

Рис. 1. Продукция Н2О2 в клетках линии HeLa-Kyoto в ответ на стимуляцию EGF.

(А) Микрофотографии представляют распределение сигнала HyPer (F500/F420) в клетках линии HeLa-Kyoto, экспрессирующих pHyPer-cyto. Первое изображение соответствует нулевой точке до добавления EGF, второе изображение демонстрирует те же клетки через 15 мин после добавления EGF. Границы клеток на первом изображении обведены. Масштабная линейка: 15 мкм. Шкала цветов отражает отношение F500/F420 (чёрный-0;

белый-3).

(Б) Графики отражающие изменение концентрации H2O2 в отмеченных клетках на микрофотографии А. EGF добавлен через 1 мин.

В данной работе для увеличения пространственного разрешения сигнала биосенсора HyPer был локализован в пределах нескольких субкомпартментов цитоплазмы живой клетки. Мы предположили, что продукция Н2О2 в клетке должна колокализоваться либо с активированным рецептором, либо с PTP-1B, либо с обоими белками. Мы поставили перед собой задачу создать конструкции, позволяющие локализовать биосенсор HyPer на цитоплазматической стороне плазматической, ретикулярной и эндосомальной мембран, т.е. в тех же субкомпартментах, в которых локализованы основные участники ТКР сигнализации. В качестве экспериментальной модели в данной работе был использован процесс активации тирозинкиназных каскадов в клетках линий HeLa-Kyoto и NIH-3T3 в ответ на стимуляцию факторами роста EGF и PDGF, соответственно.

1.1. Динамика продукции Н2О2 вблизи плазматической мембраны и эндосом при активации тирозинкиназных рецепторов в живой клетке Создание сенсора EGFR-HyPer Для локализации биосенсора HyPer на ПМ и мембране эндосом была создана генетическая конструкция, кодирующая химерный белок, в котором С-конец EGFR через короткий линкерный полипептид связан с N-концом HyPer. Данная конструкция была создана на основе ранее опубликованной конструкции рEGFR-YFP. С помощью методов молекулярного клонирования в исходном векторе pEGFR-YFP нуклеотидная последовательность, кодирующая YFP, была заменена на нуклеотидную последовательность, кодирующую биосенсор HyPer (Рис. 2А).

Рис. 2. Схема белка EGFR-HyPer (А) и его внутриклеточная локализация (Б) в клетках линии HeLa-Kyoto после 3 часов инкубации в бессывороточной среде. Масштабная линейка – мкм.

Полученная генетическая рекомбинантная конструкция pEGFR-HyPer была экспрессирована в клетках линии HeLa-Kyoto. После продолжительной инкубации в бессывороточной среде в течение 2-4 часов флуоресцентный сигнал в клетках был локализован преимущественно на ПМ (Рис. 2Б). HyPer в составе химерного белка сохранял свойства биосенсора и реагировал на добавление экзогенного Н2О2 ростом соотношения F500/F420.

Исследование динамики продукции Н2О2 с помощью химерного белка EGFR-HyPer в клетках линии HeLa-Kyoto Клетки линии HeLa-Kyoto, экспрессирующие pEGFR-HyPer, перед экспериментом инкубировали в бессывороточной среде в течение 2-4 часов. При инкубации в бессывороточной среде в клетках приостанавливаются основные сигнальные процессы. В ходе микроскопии таких клеток в ответ на стимуляцию ростовым фактором EGF, в течение 10 минут наблюдали перераспределение флуоресцентного сигнала c ПМ в цитоплазмитические гранулы, что соответствует процессу интернализации активированного тирозинкиназного рецептора в составе эндосом (Рис. 3А). Необходимо отметить, что в то же время в этих клетках часть флуоресцентного сигнала оставалась на ПМ, что отражало фракцию неинтернализованного рецептора. При анализе полученных изображений мы обнаружили, что существенный рост уровня Н2О2 происходил в эндосомальной фракции и начинался через 7-10 минут после стимуляции клеток EGF. Рост концентрации Н2О2 выходил на плато в течение следующих 5-10 мин, после чего начиналась вторая волна продукции Н2О2 (Рис. 3В).

Однако, в то же время фракция биосенсора, которая осталась на ПМ, демонстрирует падение отношения F500/F420, то есть HyPer становится более восстановленным. Этот процесс может быть связан либо с терминацией продукции Н2О2 на ПМ, либо с транслокацией Н2О2-продуцирующей системы из ПМ в мембраны эндосом.

Рис. 3. Динамика изменения внутриклеточной концентрации Н2О2 в ответ на стимуляцию EGF.

(A) Серия конфокальных изображений клеток линии HeLa-Kyoto, экспрессирующих pEGFR-HyPer.

Клетки стимулированы EGF (50 нг/мл) в начальный момент серии (0 мин), соответствующие временные точки в минутах отмечены на каждом изображении. Верхний ряд серии изображений представляет внутриклеточное распределение отношения F500/F420. Нижний ряд серии изображений представляет внутриклеточное распределение флуоресцентного сигнала EGFR HyPer (в канале с возбуждением флуоресценции при 488 нм). Границы и ядро одной из клеток обведены. Масштабная линейка: 15 мкм. Шкала цветов отражает отношение F500/F420 (чёрный-0;

белый-3).

(Б) Конфокальное рациометрическое изображение выделенной внутриклеточной области, содержащей интернализованный EGFR-HyPer. Интенсивность сигнала вдоль линий показана на графике (Г). Масштабная линейка: 5 мкм.

(В) Графики, отражающие изменение концентрации H2O2 на ПМ (красный) и эндосомах (черный) клеток, изображенных на панели (А).

(Г) Распределение отношения F500/F420 сигналов HyPer вдоль верхней (красный) и нижней (черный) линий, отмеченных на изображении (Б).

Можно предположить, что эндосомы, содержащие интернализованный рецептор, являются компартментом, ответственным за генерацию Н2О2. Добавление дифенилениодониума (DPI), ингибитора NADPH-оксидазы, в концентрации 5 мкМ, приводило к быстрому снижению продукции Н2О2, что свидетельствует о NADPH оксидазе как о наиболее вероятном источнике АФК в эндосомах (Рис. 4).

Рис. 4. DPI ингибирует продукцию Н2О2 на мембране эндосом, содержащих интернализованный рецептор.

График, отражающий изменение концентрации Н2О вблизи мембран эндосом, содержащих интернализованный EGFR-HyPer в клетках линии HeLa-Kyoto после стимуляции 50 нг/мл EGF (начальная точка) и последующего добавления 5 мкМ DPI (отмечено стрелкой).

Отсутствие окисления EGFR-HyPer, ассоциированного с ПМ, свидетельствует о том, что, во-первых, в этом процессе нет активации NADPH-оксидазы и продукции АФК на ПМ, и, во-вторых, что диффузионное расстояние Н2О2 ограничено несколькими микрометрами. Действительно, если бы Н2О2 диффундировал в цитоплазме свободно, то EGFR-HyPer, ассоциированный с ПМ, был бы окислен Н2О2, продуцированным на эндосомах. Важно заметить, что значение F500/F420 для EGFR-HyPer отличается даже для соседних эндосом (Рис. 3Б, Г), что также свидетельствует о том, что диффузия Н2О2 в цитоплазме клетки строго ограничена. На основании полученных данных мы предполагаем, что клеточная антиоксидантная система нейтрализует Н2О2 до того, как Н2О2 диффундирует в другие компартменты за пределом места генерации.

Создание сенсора PDGFR-HyPer Пероксид водорода продуцируется в ответ на активацию многих ТКР, однако не известными остаются отличия в динамике и локализации продукции Н2О2 между типами клеток, экспрессирующими различные тирозинкиназные рецепторы. Мы исследовали динамику продукции Н2О2 при активации другого тирозинкиназного рецептора, PDGFR, в клетках линии NIH-3T3 при стимуляции их тромбоцитарным ростовым фактором (PDGF).

Известно, что мышиные фибробласты NIH-3T3 обладают выраженным физиологическим ответом на стимуляцию PDGF.

Для исследования продукции Н2О2 вблизи PDGFR мы создали генетическую конструкцию PDGFR-HyPer на базе опубликованной конструкции PDGFR-GFP. В результате, полученная конструкция pPDGFR-HyPer кодирует химерный белок (Рис. 5А), в котором С-конец PDGFR через короткий линкерный полипептид связан с N-концом HyPer.

Рис. 5. Схема химерного белка PDGFR-HyPer (А) и его внутриклеточная локализация (Б) в клетках линии NIH-3T после 2 часов голодания в бессывороточной среде. Масштабная линейка – 10 мкм.

При экспрессии pPDGFR-HyPer в фибробластах линии NIH-3T3 после продолжительного голодания в течение 2-4 часов флуоресцентный сигнал был преимущественно локализован на ПМ (Рис. 5Б). HyPer в составе химерного белка PDGFR HyPer сохранял свои сенсорные свойства и реагировал на добавление экзогенного Н2О ростом соотношения F500/F420.

Исследование динамики продукции Н2О2 с помощью химерного белка PDGFR-HyPer в клетках линии NIH-3T Мышиные фибробласты NIH-3T3, экспрессирующие pPDGFR-HyPer, перед экспериментом инкубировали в бессывороточной среде в течение 2-4 часов. После стимуляции клеток ростовым фактором PDGF мы наблюдали интенсивное формирование филоподий и изменение формы клеток. В отличие от аналогичного эксперимента на клетках линии HeLa-Kyoto, в клетках NIH-3T3, экспрессирующих pPDGFR-HyPer, основная продукция Н2О2 была ассоциирована с ПМ, особенно в филоподиях (Рис. 6А, Б).

Концентрация Н2О2 начинала расти через 1 мин после добавления PDGF (Рис. 6Г, Д) и достигала максимума через 10 минут. В течение следующих 10 минут происходило частичное восстановление сенсора, и начиналась вторая волна генерации Н2О2 (Рис. 6Г).

Флуоресценция PDGFR-HyPer, ассоциированного с эндомембранами (внутриклеточными мембранами, содержащими PDGFR-HyPer), в течение первых минут после стимуляции клеток оставалась практически без изменений, а затем начинала расти (Рис. 6Г). Таким образом, при стимуляции NIH-3T3 пул активных NADPH-оксидаз локализован в ПМ.

Отсутствие диффузии Н2О2 от ПМ к эндомембранам свидетельствует о быстрой деградации Н2О2 внутриклеточной антиоксидантной системой. При добавлении к пре стимулированным фибробластам NIH-3T3 ингибитора NADPH-оксидаз, DPI, происходило быстрое падение концентрации Н2О2, что подтверждает роль NADPH-оксидаз как главных источников АФК.

Рис. 6. Динамика изменения внутриклеточной концентрации Н2О2 в ответ на стимуляцию PDGF.

(А) Серия конфокальных изображений клеток линии NIH-3T3, экспрессирующих pPDGFR-HyPer.

Клетки стимулированы PDGF (10 нг/мл) в начальный момент серии (0 мин). Масштабная линейка:

15 мкм.

(Б) Продукция Н2О2 в филоподиях в клетке линии NIH-3T3, экспрессирующей pPDGFR-HyPer, в ответ на стимуляцию PDGF (10 нг/мл). Масштабная линейка: 15 мкм. Шкала цветов отражает отношение F500/F420 (чёрный-0;

белый-2,5).

(В) Иллюстрация событий, показанных в (Б): в ответ на добавление PDGF клетка начинает менять свою форму, что приводит к смещению клеточного ядра из конфокальной оптической плоскости и появление в ней «дорзальной» ПМ. Видно интенсивное формирование филоподий на ПМ, а также продукция Н2О2.

(Г) Графики, отражающие изменение концентрации H2O2 на ПМ (красный) и эндомембранах (черный) клетки, изображенной на панели (А).

(Д) График продукции H2O2 в филоподиях клетки, изображенной на панели (Б).

1.2. Динамика продукции Н2О2 вблизи мембраны ЭПР при активации тирозинкиназных рецепторов в живой клетке Известно, что в процессе активации ТКР фосфатаза РТР-1B окисляется пероксидом водорода. Ранее было показано, что мембраны, содержащие активированный EGFR и PDGFR контактируют с микродоменами мембраны ЭПР, которые содержат РТР-1В. В таких контактирующих участках происходит дефосфорилирование рецептора. Источником Н2О2, окисляющего РТР-1B могут служить NADPH-оксидазы, как колокализованные с активированным ТКР, так и локализованные на мембране ЭПР, вблизи РТР-1В. Мы предположили, что регистрация динамики изменения концентрации Н2О2 вблизи мембраны ЭПР даст информацию о том, являются ли NADPH-оксидазы, локализованные на ЭПР, источниками окислителя в процессе активации ТКР.

Создание сенсора HyPer-TA Для детекции Н2О2 на цитоплазматической стороне ЭПР мы создали генетическую конструкцию pHyPer-TA (TA = tail anchor), кодирующую белок-слияния сенсора с С концевой последовательностью РТР-1В, позволяющей заякорить белок в мембране ЭПР (Рис. 7А). При экспрессии pHyPer-TA в клетках HeLa-Kyoto и NIH-3T3 локализация флуоресцентного сигнала при сопоставлении с локализацией ранее описанного белка EYFP-PTP1B, соответствовала мембране ЭПР (Рис. 7Б).

Рис. 7. Схема белка HyPer-TA (А) и его внутриклеточная локализация (Б) в клетках линии HeLa-Kyoto после 3 часов в бессывороточной среде. Масштабная линейка – 10 мкм.

Исследование динамики продукции Н2О2 с помощью химерного белка pHyPer-TA в клетках линии HeLa-Kyoto и NIH-3T При добавлении EGF к клеткам HeLa-Kyoto, экспрессирующим pHyPer-TA, мы детектировали рост концентрации Н2О2 вблизи мембраны ЭПР (Рис. 8А). Однако динамика роста концентрации отличалась от той, которую мы наблюдали в эксперименте с EGFR HyPer.

Рис. 8. Динамика изменения концентрации Н2О2 у цитоплазматической поверхности мембраны ЭПР в ответ на стимуляцию клеток факторами роста.

(А) Серия флуоресцентных микрофотографий клеток HeLa-Kyoto, экспрессирующих pHyPer-TA.

Клетки стимулированы EGF (50 нг/мл) в начальный момент серии (0). Масштабная линейка: мкм.

(Б) Конфокальные изображения клетки линии NIH-3T3, экспрессирующей pHyPer-TA, при стимуляции PDGF (10 нг/мл). Масштабная линейка: 10 мкм.

(В) График изменения концентрации Н2О2 в клетках на панели (А).

(Г) График изменения концентрации Н2О2 в клетке на панели (Б).

Первая волна роста концентрации Н2О2 началась через минуту после стимуляции клеток и продолжалась в течение 10-15 минут до начала второй волны роста концентрации Н2О (Рис. 8В). Вероятно, вторая волна окисления HyPer-TA в клетках HeLa-Kyoto отражает либо прямую продукцию Н2О2 на ЭПР, либо пул Н2О2, продуцированного на мембранах эндосом. Первая волна роста концентрации Н2О2 на мембране ЭПР начиналась сразу после стимуляции клеток, еще до того, как пул эндосомального Н2О2 может быть зарегистрирован с помощью EGFR-HyPer. Это свидетельствует о том, что активация продукции Н2О2 на мембранах ЭПР происходит быстрее, чем появление Н2О2, который продуцируется на эндосомах.

В аналогичном эксперименте с клетками NIH-3T3, экспрессирующими pHyPer-TA, стимуляция PDGF приводила к значительному росту отношения F500/F420 биосенсора, что отражает интенсивную продукцию Н2О2 у мембраны ЭПР в фибробластах (Рис. 8Б).

При сопоставлении графиков, отражающих продукцию Н2О2 вблизи мембраны ЭПР (Рис.

8Г) и ПМ (Рис. 6Г), видно, что они сходны по форме и амплитуде.

Таким образом, в первые минуты после стимуляции клеток мы наблюдали отсутствие окисления HyPer в PDGFR-содержащих эндомембранах, но, вместе с тем, накопление окисленной формы HyPer-TA на ЭПР и PDGFR-HyPer на ПМ, что подкрепляет вывод об ограниченной диффузии H2O2 в цитоплазме.

Сопоставление динамики окисления HyPer-TA, EGFR-HyPer и PDGFR-HyPer позволяет предположить существование двух (эндосомальной и ретикулярной) независимо регулируемых систем продукции H2O2 в клетках HeLa-Kyoto и единой для ПМ и ЭПР системы в клетках NIH-3T3.

2. Создание индикатора для многопараметрической флуоресцентной микроскопии Разнообразие флуоресцентных белков, сенсоров и химических красок различных цветов позволяют визуализировать многие сигнальные процессы в живой клетке. Комбинация флуорофоров, имеющих различные спектры, в одной клетке позволяет осуществить многопараметрическое исследование, т.е. визуализацию несколько клеточных процессов одновременно.

Внутриклеточная передача сигнала с участием фосфорилированных форм фосфатидилинозитола (PI), фосфоинозитидов (PIP), запускается в ответ на активацию рецепторов на плазматической мембране, таких как тирозинкиназные рецепторы, рецепторы, сопряженные с G-белками, и интегрины. Различные формы PIP находятся во всех внутриклеточных мембранах и участвуют в регуляции многих сигнальных процессов, как правило, через привлечение белков с PIP-взаимодействующими доменами. Эти домены отличаются друг от друга по специфичности к разным формам PIP. PI и PIP могут быть фосфорилированы фосфатидилинозитолкиназами и дефосфорилированы липидными фосфатазами. Одним из наиболее изученных липидных вторичных мессенджеров является фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (PIP3). Фосфатидилинозитол-3-киназа (PI-3K) фосфорилирует фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат с образованием PIP3, который в дальнейшем может быть дефосфорилирован липидной фосфатазой PTEN.

Образование в мембране липидных мессенджеров может быть обнаружено с помощью химерных флуоресцентных белков, слитых с PIP-чувствительными белковыми доменами.

Такие флуоресцентные белки-слияния транслоцируются из цитоплазмы на мембрану в ответ на появление PIP. По распределению интенсивности флуоресценции между цитоплазмой и мембраной можно оценивать пространственно-временной характер действия липидных киназ и фосфатаз.

Существуют свидетельства того, что продукция пероксида водорода NADPH оксидазами и сигнализация с участием липидов являются кооперативными процессами.

Так, известно, что сборка компонентов комплекса NADPH-оксидазы на мембране и ее активация зависят от появления в мембране продуктов активности PI-3K. В свою очередь, Н2О2, продуцируемый NADPH-оксидазами, способен окислять тиолат в активном центре фосфатазы PTEN, временно ингибируя ее, что тем самым увеличивает время жизни продуктов PI-3K. Таким образом, исследование взаимосвязи липидной и окислительно восстановительной сигнализации требуют появления стратегии одновременного наблюдения за динамикой PIP3 и продукцией Н2О2.

2.1 Создание индикатора с комбинированными свойствами Для создания индикатора с комбинированными свойствами мы использовали РН-домен тирозинкиназы Btk (Bruton's tyrosine kinase). Данный РН-домен специфично взаимодействует с PIP3 и позволяет тирозинкиназе Btk в ответ на активацию PI-3K транслоцироваться из цитоплазмы к ПМ. На основе ранее опубликованного конструкта eGFP-BtkPH нами был создан генетический конструкт, кодирующий белок-слияния, в котором N-конец биосенсора HyPer через короткий полипептидный линкер связан с РН доменом Btk (BtkPH). Известно, что мутантный вариант протеинкиназы Btk с заменой в РН-домене Е41K имеет повышенное сродство к PIP3. Поэтому для увеличения аффинности биосенсора к PIP3 в последовательность, кодирующую BtkРН, с помощью направленного мутагенеза была внесена мутация Е41K (Рис. 9А). Полученный вектор pBtkPH-E41K-HyPer далее был экспрессирован в клетках линии NIH-3T3. В клетках флуоресцентный сигнал был равномерно распределен между цитоплазмой и ядром. При добавлении к клеткам Н2О2 (200 мкМ) наблюдался значительный рост отношения F500/F420, что свидетельствует о том, что биосенсор HyPer в составе химерного белка BtkPH-E41K-Hyper не потерял свои сенсорные свойства.

2.2 Многопараметрическое исследование с помощью биосенсора BtkPH-E41K-HyPer в живой клетке Активация PI-3K и продукция Н2О2 в клетках NIH-3T3 при активации PDGFR Работа биосенсора BtkPH-E41K-HyPer была протестирована в клетках линии NIH-3T3 в ответ на стимуляцию ростовым фактором PDGF. Добавление PDGF (10 нг/мл) к фибробластам NIH-3T3 инициировало транслокацию биосенсора на ПМ, и приводило к росту соотношения F500/F420, что отражает активацию PI-3K и рост концентрации Н2О2 в области ПМ (Рис. 9Б).

Рис. 9. Динамика изменения концентрации Н2О2 и PIP3 у цитоплазматической поверхности плазматической мембраны в ответ на стимуляцию клеток PDGF.

(А) Схема конструкта белка BtkPH-E41K-HyPer.

(Б) Серия флуоресцентных микрофотографий клеток NIH-3T3, экспрессирующих pBtkPH-E41K HyPer, сразу после стимуляции PDGF (10 нг/мл). Соответствующие временные точки в минутах отмечены на каждом изображении. Верхний ряд серии изображений является рациометрическим и представляет внутриклеточное распределение отношения F500/F420, отражающего изменения концентрации Н2О2. Средний и нижний ряды изображений демонстрирует внутриклеточное распределение BtkPH-E41K-HyPer. На первом изображении из верхнего ряда обведены отдельные клетки и пронумерованы 1-4. Масштабная линейка: 15 мкм.

(В) Графики отражающие активацию PI-3K и изменение концентрации Н2О2 в каждой отдельной клетке на панели (Б). Черным цветом показано изменение распределения PIP3, красным цветом – изменение концентрации Н2О2 в клетке.

Для количественной оценки продукции PIP3 и Н2О2 мы проанализировали динамику процессов в отдельных клетках (Рис. 9В). Степень транслокации была рассчитана по формуле T=(Fmem – Fcyto)/Fcyto (где Fmem – интенсивность флуоресценции на ПМ, Fcyto – интенсивность флуоресценции в цитоплазме).

Анализ динамики флуоресцентных сигналов обоих процессов в отдельных клетках показал, что оба сигнала изначально ведут себя высоко кооперативно, что является ожидаемым, т.к. активация PI-3K предшествует активации NADPH-оксидаз.

Однако, хотя появление PIP3 и Н2О2 регистрируются одновременно, в дальнейшем падение концентрации Н2О2 происходит независимо от накопления PIP3, который является более продолжительным во времени. Это может свидетельствовать о том, что оба процесса необязательно сопряжены друг с другом в течение длительного периода.

Следует заметить, что в процессе транслокации часть биосенсора всегда оставалась в цитоплазме, что позволяло сравнивать изменения соотношения F500/F420 между ПМ и цитоплазмой. Из Рис. 9Б. видно, что продукция Н2О2 в фибробластах NIH-3T3 происходит преимущественно на ПМ, а диффузия Н2О2 вглубь клетки ограничена, что согласуется с наблюдениям, полученным в первой части работы.

Так как активация PI-3K предшествует активации NADPH-оксидаз, мы проверили, приводит ли ингибирование PI-3K также к снижению продукции Н2О2. Преинкубация клеток с вортманнином в течение 20 минут приводила к ингибированию и PI-3K и продукции Н2О2 (Рис. 10А).

Рис. 10. Графики отражающие изменение распределения РIP3 (черный) и концентрации Н2О (красный) в клетках NIH-3T3 ответ на (А) пре-инкубацию клеток с вортманнином (500 мкМ) и последующую стимуляцию PDGF (0 мин) и (Б) стимуляцию PDGF и добавление DPI (60 мкМ).

Добавление к пре-стимулированным фибробластам ингибитора NADPH-оксидаз, дифенилениодониума (DPI) приводило к быстрому падению отношения F500/F индикатора BtkPH-E41K-HyPer, что отражает снижение продукции Н2О2 (Рис. 10Б).

Активация PI-3K и продукция Н2О2 в TH-лимфоцитах при активации TCR «Двойной» биосенсор BtkPH-E41K-HyPer был использован для изучения липидной и окислительно-восстановительной сигнализации в человеческих CD4+ Т-хэлперных лимфоцитах в процессе формирования иммунологического синапса. Т-лимфоциты становится активными в результате взаимодействия с антиген-презентирующими клетками (АПК). Т-клеточный рецептор (TCR – от T-Cell Receptor) взаимодействует со своим лигандом - процессированным антигеном, связанным с главным комплексом гистосовместимости на поверхности АПК. Во время активации Т-лимфоцит поляризуется и формирует плотный контакт, т. н. иммунологический синапс (ИС), с АПК. В исследованиях in vitro формирование ИС может быть смоделировано с помощью инкубации клеток с микросферами, покрытыми антителами анти-CD3/анти-СD28.

Известно, что формирование ИС приводит к активации PI-3K и, как следствие, повышению концентрации PIP3 и в области ИС, и в остальных частях ПМ. Также известно, что активация TCR способствует продукции АФК в клетке.

Однако динамика изменения концентрации в реальном времени и локализация продукции Н2О2 при формировании ИС не была изучена. Для одновременной визуализации PI-3K активации и продукции Н2О2 был использовали BtkPH-E41K-HyPer.

При экспрессии в ТН-лимфоцитах человека флуоресцентный сигнал был распределен между цитоплазмой и ядром. Однако во многих клетках еще до стимуляции рецептора часть флуоресцентного сигнала уже была локализована на ПМ, что свидетельствует о некотором базовом уровне активности PI-3K. Стимуляция ТН-лимфоцитов, экспрессирующих BtkPH-E41K-HyPer, с помощью микросфер, покрытыми анти-CD3/анти СD28 антителами, приводила к быстрому появлению контакта между ТН-лимфоцитами и микросферами (Рис. 11А).

Мы наблюдали мгновенное и значительное перераспределение флуоресцентного индикатора в область ИС на ранних этапах формирования контакта: большая часть индикатора локализовалась в области ИС и оставалась там в течение всего эксперимента (до 1 ч). Важно заметить, что активность PI-3K снизилась на остальных участках мембраны активированных клеток, что отражалось отсутствием выраженной локализации флуоресцентного сигнала на других участках ПМ (Рис. 11А).

Рис. 11. Динамика изменения концентрации Н2О2 и PIP3 у цитоплазматической поверхности плазматической мембраны ТН-лимфоцитов при формировании иммунологического синапса (ИС).

(А) Серия флуоресцентных микрофотографий ТН-лимфоцита, формирующего ИС с микросферой, покрытым анти-CD3/анти-CD28, (добавлен в начальное время). Верхний ряд изображений – клетка и две микросферы в канале проходящего света (микросферы черные), следующие два ряда демонстрируют распределение флуоресценции в двух каналах с возбуждением при 420 нм и нм, нижний ряд – отношение F505/F420, что отражает распределение Н2О2 в клетке. Масштабная линейка: 10 мкм.

(Б) График, отражающий активацию PI-3K и распределение Н2О2 в ТН-лимфоците. Черным цветом показано изменение распределения PIP3, красным цветом – изменение концентрации Н2О2 в клетке.

(В) Среднее значение активности PI-3K и продукции Н2О2 по 28 ТН-клеткам из трех экспериментов (стандартная ошибка среднего).

Эксперименты были проведены в университете Саарланда (Германия) на микроскопе Zeiss Cell Observer HS.

Мы исследовали продукцию Н2О2 ТН-лимфоцитами по изменению отношения F500/F в процессе активации клеток. Формирование ИС сопровождалось быстрым ростом концентрации Н2О2 через ~ 1 мин. после транслокации биосенсора в ИС (Рис.11 Б-В).

Часть цитоплазмы, ассоциированная с ПМ, демонстрировала более высокий уровень концентрации Н2О2. Добавление к стимулированным ТН-лимфоцитам DPI приводило к быстрому ингибированию продукции Н2О2 (Рис. 12А), что свидетельствует о наличии ассоциированной с ПМ NADPH-оксидазы в качестве источника Н2О2.

Рис. 12. Графики, отражающие изменение распределения РIP3 (черный) и концентрации Н2О2 (красный) в ТН-лимфоцитах в ответ на добавление ингибиторов.

(А) Дифенилениодониум (DPI) ингибирует продукцию Н2О2 в ТН-лимфоцитах после формирования иммунологического синапса. Анти-CD3/анти-СD28 микросферы добавлены в начальной точке.

(Б) Добавление к ТН-лимфоцитам вортманнина, ингибитора PI-3K, приводит к падению уровня PIP3 и Н2О2. Анти-CD3/анти-СD28 микросферы добавлены в начальной точке.

В случае ингибирования PI-3K добавлением вортманнина к пре-стимулированным ТН лимфоцитам с помощью BtkPH-E41K-HyPer регистрировали снижение активности и PI-3K, и продукции Н2О2 в области ИС (Рис. 12Б).

Заключение В настоящей работе были получены варианты биосенсора для детекции пероксида водорода, HyPer, локализованные на мембранах различных внутриклеточных компартментов. Использование данного подхода позволило визуализировать динамику концентраций Н2О2 с большим пространственным разрешением. С помощью полученных биосенсоров мы впервые продемонстрировали наличие микродоменов продукции Н2О2 в процессе ТКР сигнализации.

С помощью индикатора EGFR-HyPer в стимулированных ростовым фактором клетках HeLa-Kyoto впервые было показано, что значительная продукция Н2О2 происходит на эндосомах, а не на плазматической мембране. Можно предположить, что эндосомы, содержащие интернализованный EGFR и продуцирующие Н2О2, играют важную роль в поддержании каскада фосфорилирования: активный рецептор фосфорилирует субстраты, а продуцирующийся здесь же, Н2О2 ингибирует РТР, создавая, таким образом, петлю положительной обратной связи. Кроме того, использование EGFR-HyPer позволило определить, что в цитоплазме стимулированных клеток свободная диффузия Н2О2 в значительной степени ограничена (до 1-2 мкм).

В фибробластах линии NIH-3T3 с помощью PDGFR-HyPer была показана продукция Н2О2, локализованная преимущественно на ПМ. В отличие от клеток HeLa-Kyoto активация NADPH-оксидаз на ПМ в фибробластах свидетельствует о возможных внеклеточных мишенях Н2О2, продуцируемого в ответ на активацию PDGFR.

С помощью HyPer-TA в клетках линии HeLa-Kyoto и NIH-3T3 была показана независимая продукция Н2О2, быстро активирующаяся на ЭПР в ответ на активацию ТКР.

Такой быстрый рост концентрации Н2О2 на ЭПР сразу после стимуляции клеток может быть необходим для немедленного ингибирования фосфатазы РТР-1В на мембране ЭПР.

Окисление HyPer-TA после активации и EGFR и PDGFR может служить моделью для изучения роли ингибирования РТР-1В пероксидом водорода.

Для исследования взаимосвязи продукции Н2О2 и активации PI-3K был создан «двойной» индикатор BtkPH-E41K-HyPer. Тестирование работы индикатора в фибробластах NIH-3T3 в ответ на стимуляцию ТКР показало возможность одновременной детекции продукции Н2О2 и PIP3. В CD4+ TH-лимфоцитах с помощью BtkPH-E41K-HyPer удалось впервые показать локальную активность фосфатидилинозитол-3’-киназы и продукцию Н2О2 в области иммунологического синапса. Важно заметить, что преимуществом «двойного» индикатора является возможность использования всего одной экспрессионной конструкции для детекции двух параметров в клетке. Другим очевидным преимуществом является то, что спектральные свойства BtkPН-E41K-Hyper позволяют одновременно независимо наблюдать также за другими флуоресцентными белками, которые имеют спектр, неперекрывающийся со спектром белка HyPer. Таким образом, можно добавить еще один параметр для исследования в той же клетке, если его белком репортером будет, например, красный флуоресцентный белок. Полученный индикатор BtkPH-E41K-HyPer может быть использован как прототип для создания других подобных индикаторов с комбинированными свойствами. Подобные многопараметрические генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы могут быть востребованы в широком круге задач системной биологии.

ВЫВОДЫ 1. На основе биосенсора HyPer созданы локализованные флуоресцентные индикаторы PDGFR-HyPer, EGFR-HyPer и HyPer-TA для детекции Н2О2 в близком окружении рецепторов PDGFR и EGFR, а также на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума.

2. С помощью полученных индикаторов впервые визуализирована локальная продукция и динамика Н2О2 в клетке в ответ на активацию тирозинкиназных рецепторов.

Установлено, что в клетках эпителиальной линии HeLa-Kyoto продукция Н2О происходит на мембранах эндосом и эндоплазматического ретикулума. В фибробластах линии NIH-3T3 продукция Н2О2 локализована на плазматической мембране и мембране эндоплазматического ретикулума. Таким образом, активация тирозинкиназных рецепторов, характерных для клеток разного происхождения, стимулирует различающиеся между собой паттерны генерации Н2О2.

3. Диффузия Н2О2 в цитоплазме эукариотических клеток ограничена 1-2 мкм, то есть мишенью Н2О2 являются только те белки, которые находятся в непосредственной близости от места его генерации.

4. Создан генетически кодируемый флуоресцентный индикатор BtkPH-E41K-HyPer для одновременной детекции Н2О2 и активности фосфатидилинозитол-3’-киназы. На клетках линии NIH-3T3 продемонстрирована возможность использования полученного индикатора в многопараметрическом исследовании внутриклеточных сигнальных процессов. С использованием BtkPH-E41K-HyPer впервые показана локальная активность фосфатидилинозитол-3’-киназы и продукция Н2О2 в области иммунологического синапса в CD4+ TH-лимфоцитах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1. Mishina N.M., Tyurin-Kuzmin P.A., Markvicheva K.N., Vorotnikov A.V., Tkachuk V.A., Laketa V., Schultz C., Lukyanov S., Belousov V.V. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally?

Antioxid Redox Signal. 2011, 14 (1), 1-7.

2. Тюрин-Кузьмин П.А., Агаронян К.М., Морозов Я.И., Мишина Н.М., Белоусов В.В., Воротников А.В. НАД(Ф)Н оксидаза регулирует EGF-зависимую пролиферацию клеток по механизму, отличному от активации ERK1/2 МАР-киназ. Биофизика. 2010, 55 (6), 1048- 3. Markvicheva K.N., Bilan D.S., Mishina N.M., Gorokhovatsky A.Y., Vinokurov L.M., Lukyanov S., Belousov V.V. A genetically encoded sensor for H(2)O(2) with expanded dynamic range. Bioorg Med Chem. 2010, 19(3):1079-84.

4. Марквичева К.Н., Гороховатский А.Ю., Мишина Н.М., Мудрик Н.Н., Винокуров Л.М., Лукьянов С.А., Белоусов В.В. Сигнальная функция фагоцитарной NADPH-оксидазы: активация МАР-киназных каскадов при фагоцитозе. Биоорг.химия, 2010, 36 (1): 133-138.

Тезисы докладов на конференциях 1. Imaging of intracellular hydrogen peroxide localization following activation of tyrosine kinase receptors. Mishina N.M., Tyurin-Kuzmin P., Markvicheva K., Vorotnikov A., Schultz C., Lukyanov S., Belousov V. Abstracts of papers presented at EMBO|EMBL Symposium: “Seeing is Believing – Imaging the Processes of Life”. EMBL ATC, Heidelberg, Germany, 2011, page 126.

2. Локализация пероксида водорода в клетке при активации тирозинкиназных рецепторов.

Мишина Н.М., Тюрин-Кузьмин П.А., Воротников А.В., Белоусов В.В. Тезисы докладов и стендовых сообщений на XXIII Международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". ИБХ РАН, Москва, 2011, стр. 11.

3. Локализация пероксида водорода в клетке при активации сигнальных каскадов тирозинкиназных рецепторов. Мишина Н.М., Тюрин-Кузьмин П.А., Воротников А.В., Белоусов В.В. Школа-семинар по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала. (Санкт-Петербург, Институт цитологии РАН, 2009). Цитология. - 2010. Том 52, N 3. - С. 262-263.

4. Изучение локализации перекиси водорода в клетке при активации тирозинкиназных рецепторов. Тюрин-Кузьмин П.А., Сафронова Н.М., Воротников А.В., Белоусов В.В.

Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченная к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Конкурс молодых ученых). ИБХ РАН, Москва, 2009, стр. 247.

5. Создание внутриклеточных белковых биосенсоров нового поколения. Белоусов В.В., Марквичева К.Н., Сафронова Н.М., Воротников А.В., Тюрин-Кузьмин П.А., Калинина Н.И., Коптелова Н.В., Кудряшова Т.В., Макаревич П.И., Ребриков Д.В., Стамбольский Д.В.,. Шаронов Г.В. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы». ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, 2009, стр. 23.