Авторефераты диссертаций >> Авторефераты по Биологии

Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов р450

На правах рукописи

Москалева Наталья Евгеньевна МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ И СОДЕРЖАНИЯ ЦИТОХРОМОВ Р450 03.01.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук.

Научный консультант: кандидат биологических наук Згода Виктор Гаврилович

Официальные оппоненты: Шумянцева Виктория Васильевна доктор биологических наук, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав. лабораторией Ильина Елена Николаевна доктор биологических наук, ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России, зав. лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт питания» Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «17» октября 2013г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук по адресу: 119121 Москва, улица Погодинская, дом 10, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН Автореферат разослан «_» 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук Карпова Е. А.

Актуальность проблемы. Ключевая роль первой фазы метаболизма ксенобиотиков принадлежит ферментам суперсемейства цитохромов Р450, которые представляют собой гем-содержащие монооксигеназы и входят в состав микросомальной монооксигеназной системы. Активность монооксигеназной системы в направлении того или иного ксенобиотика определяется главным образом концентрацией и активностью специфичных для него изоформ цитохромов Р450. Поэтому для создания моделей лекарственного воздействия необходимо проведение селективного изоформспецифичного количественного анализа цитохромов Р450 в биологических объектах для выявления диапазонов изменения концентраций данных ферментов при воздействии различных факторов и определения взаимосвязей между концентрацией цитохромов Р450 и их активностью.

Мыши являются наиболее распространенными объектами для исследования монооксигеназной системы, так как они обеспечивают целостную, физиологически адекватную модель для изучения влияния различных факторов на активность цитохромов Р450 (Tingle et al., 2006, Environmental Toxicology and Pharmacology, 21, 184-190). В геноме мыши идентифицировано 36 ортологичных генов цитохромов Р450, которые потенциально могут иметь идентичные функции у человека и мыши (Nelson et al., 2004, Pharmacogenetics, Также отмечено сходство каталитических активностей и процессов 14, 1–18).

ингибирования CYP1А, CYP2E и CYP3А.

Развитие персонализированной медицины требует создания новых методов оценки концетраций и активностей цитохромов Р450 и их изменений в процессе индукции или ингибирования лекарственными препаратами. Исследование активности и количественных характеристик цитохромов Р450 представляет собой трудную задачу. Факторами, усложняющими разработку методики масс-спектрометрического анализа применительно к цитохромам Р450, являются высокая гомология между белками в одном семействе, а зачастую и между семействами, что приводит к тому, что большая часть пептидов отражают присутствие различных изоформ. Кроме того, цитохромы Р450 являются гидрофобными мембранными белками, которые трудно поддаются анализу. Исследования активности цитохромов Р450 ограничиваются трудностями подбора изоформспецифичных субстратов, ферментативную реакцию с которыми катализировала бы только одна изоформа, а также необходимостью разработки методики количественного анализа метаболитов с высокой чувствительностью и минимальным количеством требуемого биологического материала.

Цель исследования: разработка метода определения активности и концентрации основных изоформ цитохромов Р450 печени мыши с использованием масс-спектрометрии и валидация методики на пробах микросомальной фракции печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать цитохромы Р450 микросомальной фракции печени контрольных мышей и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном методом общего протеомного профилирования.

2. Создать хромато-масс-спектрометрический метод мониторинга множественных реакций для определения концентраций фармакологически значимых изоформ подсемейств 1А, 2С, 2D, 2Е и 3А цитохромов Р450 печени мыши.

3. Разработать хромато-масс-спектрометрическую методику определения активности фармакологически значимых подсемейств 1А, 2С, 2D, 2Е и 3А цитохромов Р печени мыши.

4. Апробировать и валидировать разработанные методики на примере микросомальной фракции печени мышей контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. Сопоставить изменения активности и концентрации исследуемых цитохромов Р450 вследствие индукции.

Научная новизна работы. Впервые разработан изоформспецифичный метод количественного анализа цитохромов Р450 печени мыши при помощи хромато-масс спектрометра с тройным квадруполем в режиме мониторинга множественных реакций без использования изотопных меток. Метод требует минимального количества биологического материала, чувствительность составляет до 0,1 фмоль/мкг микросомального белка, воспроизводимость результатов более 80%. Впервые исследованы диапазоны вариации концентраций и активности цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном, приведена активность в пересчете на молекулу фермента, а также показано, что изменение активности и концентрационных характеристик коррелирует между собой, что подтверждает правильность разработанных методов.

Практическая значимость работы. Разработанный метод позволяет проводить измерение концентрации и активности цитохромов Р450 печени мыши в биологическом материале с чувствительностью до 0,1 фмоль/мкг микросомального белка и воспроизводимостью результатов более 80% без использования изотопных меток. Оценка воздействия различных факторов на цитохромы Р450 необходима при использования мыши как биологической модели при разработке лекарственных препаратов, а также для создания моделей лекарственного воздействия. Описанная концепция и этапы разработки MRM метода применимы для разработки методик анализа цитохромов Р450 монооксигеназной системы человека, что требуется для развития персонализированной медицины.

Положения, выносимые на защиту.

Протеомное профилирование микросомальной фракции печени мыши для идентификации и оценки количественных характеристик цитохромов Р450.

Разработка методики количественного анализа изоформ цитохромов Р450 в микросомах печени мыши без использования изотопных меток с высокой чувствительностью и воспроизводимостью, а также методики определения активности подсемейств 1А, 2С, 2D, 2Е и 3А цитохромов Р450 печени мыши методом мониторинга множественных реакций на масс-спектрометре с тройным квадруполем.

Определение содержания основных изоформ цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши, а также их вариабельности в процессе индукции.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международной конференции HUPO-2012, Boston, USA;

VIII международной конференции «Bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology BGRS\SB'12» 2012, Новосибирск, Россия;

V Конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 2008, Москва, Россия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 6 статей – в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, и 4 публикации – в сборниках докладов научных конференций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, заключения, списка литературных источников, включающих 123 наименования, и приложения. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 22 рисунка и 1 приложение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Подготовка пробы к протеомному масс-спектрометрическому анализу.

Для исследования использовали микросомы печени мышей контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. Мыши (Albino mice, самцы) получали внутрибрюшинные инъекции индуктора в течение 5 дней в дозировке 80 мг/кг веса фенобарбитал (раствор натриевой соли) или 50 мг/кг веса 3-метилхолантрен (в кукурузном масле). Контрольным животным вводили изотонический раствор или масло, соответственно. Выделенную печень перфузировали холодным (4 0С) изотоническим KCl и готовили гомогенаты с использованием гомогенизатора Даунса в 2-х кратном объема калий фосфатного буфера 0.1 M, pH 7.4. Выделение микросом проводили методом, описанным в [Zgoda et. al., 2002, Toxicol in vitro, 16(1), 1-10]. Концентрацию общего белка измеряли методом ВСА (Pierce, США) согласно рекомендациям производителя.

Ферментативное расщепление микросомального белка проводили согласно методике, описанной в статье Kopylov с соавт. (Kopylov et al., 2013, Proteomics, 13, 727-742). В качестве матрицы для приготовления стандартов использовали 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде, гидролизованные трипсином микросомы печени человека и «небелковую матрицу» (буфер для проведения гидролиза).

Общее протеомное профилирование микросом печени мыши для идентификации и выявления протеотипических пептидов цитохромов Р450 при помощи ионной ловушки и Q-TOF проводили согласно методам, описанным в работах Москалева с соавт. и Zgoda с соавт. (Москалева Н.Е с соавт., 2011, Биоорганическая химия, 37, 1-16;

Zgoda et al., 2009, Proteomics, 9, 4102–4105).

Синтез пептидов осуществлялся по протоколу твердофазного пептидного синтеза на автоматическом пептидном синтезаторе Overture (Protein Technologies, Inc) исходя из 9 флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc)-защищенных по -аминогруппам производных аминокислот. При синтезе изотопно-меченых пептидов использовали вместо обычного лейцина (Fmoc-Leu-OH) изотопно-меченый (Fmoc-Leu-OH-13C6,15N). Содержание пептида в образце не менее 95%, измерено согласно "Методике измерения молярной концентрации маркерного пептида в растворе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (свидетельство об аттестации № 253.0100/01.00258/2012 от 30.04.2012) Таблица 1. Масс-спектрометрические параметры количественного анализа исследуемых пептидов Изоформа Пептид Родительск Дочерние ионы Напряжение ий ион диссоциации m/z заряд V 669,82+ 892,4(y8);

993,4(y9);

446,7(y82+) 1А1 VDMTPTYGLTLK 1А2 669,02+ NSIQDITSALFK 1022,6 (y9);

894,5 (y8);

315,2 (b3) 672,42+ NSIQDITSA*LFK 1028,8 (y9);

900,8 (y8);

315,2 (b3) 2С29 636,92+ NISQSFTNFSK 228,0 (b2);

1045,0 (y9);

830,4(y7) 2С29 549,13+ 587,3(y112+);

643,8(y122+);

GTTVITSLSSVLHDSK 743,9(y142+) 551,23+ 590,5(y112+);

647,4(y122+);

GTTVITSLSSV*LHDSK 747,0(y142+) 648,92+ 2C39 FINLVPNNIPR 710,5 (y6);

809,5 (y7);

375,3 (b3) 427,73+ 582,4(y102+-H2O);

518,3 (y92+ 2C50,54 VQEEIEHVIGK H2O);

204,1(y2) 614,02+ 2D9 FGDIVPVNLPR 695,5(y6);

320,1(b3);

794,3(y7) 607,02+ 2D10 FGDIAPLNLPR 709,3(y6);

780,1(y7);

319,9(b3) 676,02+ DLTDAFLAEVEK 2D26 575,2(y5);

835,5(y7);

906,6(y8) 844,12+ 2E1 DIDLSPVTIGFGSIPR 1143,4(y11);

344,1(b3);

733,1(y7) 563,13+ 2E1 DIDLSPVTIGFGSIPR 733,4(y7);

529,3(y5);

676,4 (y6) 612,13+ 729,4(y122+);

794,9(y132+);

2E1 MNMPYMDAVVHEIQR 682,4(y5) 561,52+ 3A11,41 ALLSPTFTSGK 737,4(y7);

824,4(y8);

937,2(y9) 564,92+ AL*LSPTFTSGK 737,4(y7);

824,4(y8);

944,4(y9) 584,83+ 3A11,16 GSIDPYVYLPFGNGPR 744,4(y7);

372,2(b4);

895,3(b8) 876,62+ 744,4(y7);

1020,5(y9);

690,4(y122+) 3A11,16 GSIDPYVYLPFGNGPR 427,82+ 3A11,16 FALMNMK 636,2(y5);

707,2(y6);

523,2(y4) *пептид синтезированный с включением изотопно-меченого L.

Количественный анализ выбранных изоформ цитохромов Р450 печени мыши с использованием хромато-масс-спектрометра с тройным квадруполем.

Количественный анализ протеотипических пептидов цитохромов Р450 осуществляли на тандемном масс-спектрометрическом детекторе “Agilent 6410” QQQ в режиме MRM с источником ионизации электроспрей. Хроматографическое разделение осуществляли при помощи микроаналитической колонки Zorbax SB-C 18, 150 x 0.5 mm, 5 um. Подвижная фаза А – 0,1% муравьиная кислота в воде, фаза В – 0,1% муравьиная кислота в 80% ацетонитриле, скорость потока 4 мкл/мин. Градиент подвижной фазы от 5% до 65% фазы В течение 32 мин, далее до 100% фазы В к 34 мин. Для источника ионизации электроспрей использованы следующие параметры: температура осушающего газа 300°С, давление в небулайзере 20 psi, поток осушающего газа 6 л/мин, напряжение на капилляре 3000 V. В таблице 1 приведены оптимизированные масс-спектрометрические параметры количественного анализа пептидов.

Определение активности изоформ цитохромов P450 к маркерным субстратам.

Линейность зависимости количества образующегося метаболита от времени исследовали инкубированием определенной концентрации субстрата (тестостерон 50 мкM, хлорзоксазон 50 мкM, фенацетин 50 мкM, дебризохин 50 мкM, диклофенак 10 мкM) с 0. мг\мл микросомального белка в течение различного периода времени (0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 60 мин). Зависимость скорости реакции окисления субстрата от концентрации микросомального белка или концентрации анализировали в диапазоне NADPH концентраций белка от 0,2 до 2 мг/мл и NADPH от 0,2 до 4 мМ при инкубации в течение 10 мин и фиксированной концентрации субстрата (тестостерон 50 мкM, хлорзоксазон мкM, фенацетин 50 мкM, дебризохин 50 мкM, диклофенак 10 мкM).

Для определения активности инкубировали 0,5 мг\мл микросомального белка с 1 мМ NADPH и субстратом в концентрации 1000 мкM для тестостерона, фенацетина, дебризохина и в концентрации 500 мкM для хлорзоксазона и диклофенака.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование цитохромов Р450 в рамках общего протеомного профилирования.

На первом этапе работы по исследованию цитохромов Р450 в микросомах печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном провели общее протеомное профилирование с использованием масс-спектрометров на основе ионной ловушки и QTOF. В процессе анализа на ионной ловушке было идентифицировано более 3700 белков.

Согласно результатам, полученным с помощью базы данных UniProt, в протеоме мыши обнаружено 60 цитохромов Р450, из них 42 экпрессируется в печени. В процессе общего протемного анализа изоформспецифичные пептиды были обнаружены для 32 изоформ цитохромов Р450 (1А1, 1А2, 2A4, 2A5, 2A12, 2B9, 2B10, 2Е1, 2F2, 2J5, 2J6, 4V2, 4А14, 4А10, 4А12А, 2D9, 2D10, 2D11, 2D26, 3A11, 3A13, 3A16, 3A25, 3A41, 2C29, 2C39, 2C38, 2C40, 2C54, 2C37, 2C55, 2C70). Присутствие изоформ CYP2C50, CYP2D55, CYP2A2, CYP2A25, CYP2B19 можно предположить по наличию пептидов общих для нескольких изоформ. Для дальнейшего исследования выбраны представители наиболее фармакологически значимых подсемейств цитохромов Р450, таких как 1А, 3А, 2Е, 2С и 2D.

По результатам общего протеомного профилирования количественная оценка может быть проведена путем непосредственного сравнения интенсивности масс спектрометрических сигналов (площадей под хроматографическими пиками), либо методом подсчета числа тандемных масс-спектров, полученных для различных образцов (метод подсчета спектров). Этот количественный анализ в протеомике получил название «определение концентрации без изотопной метки» (Lable free quantitation) (Walter T. et al, 2010, J. Cell Biol., 190, 491-500) На данном этапе для оценки изменения содержания цитохромов Р450 в печени мыши в результате индукции использовали метод сравнения суммарной интенсивности пептидов, рассчитанной при помощи программы Spectrum Mill. Содержание CYP1А1 увеличивается под влиянием метилхолантрена в 6,9, а CYP1А2 в 9,1 раз (по результатам анализа на ионной ловушке). Экспрессия подсемейства 2С цитохромов Р450 индуцируется фенобарбиталом, причем концентрации изоформ цитохромов Р450, принадлежащих данному посемейству увеличиваются в 3-4 раза. В микросомах печени мыши после индукции фенобарбиталом увеличивается содержание также цитохромов Р450, принадлежащих подсемейству 3А в 3-5 раз. CYP2Е1 не подвержен индуцирующему влиянию метилхолантрена и фенобарбитала.

Данные, полученные на QTOF, позволили использовать другой способ обработки хроматограмм общего протеомного профилирования. Так, для уточнения степени индукции цитохромов Р450, из хроматограмм общего протеомного профиля, полученных при помощи QTOF экстрагировали профили элюирования выбранных пептидов рассматриваемых изоформ цитохромов Р450. Далее по средней площади пиков на хроматограмме рассчитали степень индукции белков данного подсемейства относительно исходного.

а) б) Рис. 1. Изменение содержание цитохромов Р450 подсемейств 1А, 3А, 2Е, 2С и 2D в пробах после индукции фенобарбиталом (а) или метилхолантреном (б), рассчитанное на основании протеомного профилирования при помощи ионной ловушки () и QTOF () и программы Spectrum Mill и по профилям элюирования отдельных пептидов на QTOF ().

Изменение содержание цитохромов Р450 подсемейств 1А, 3А, 2Е, 2С и 2D в пробах после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном, рассчитанное на основании протеомного профилирования при помощи ионной ловушки и QTOF и программы Spectrum Mill и по профилям элюирования отдельных пептидов на QTOF, приведено на рис.1. Необходимо отметить, что изоформы CYP2С37, CYP2С38, CYP2С40, CYP2С70, CYP2D11 и CYP3А13 охарактеризовать по данным QTOF не удалось, вследствие более низкой чувствительности QTOF по сравнению с ионной ловушкой.

Результаты, полученные с использованием как ионной ловушки, так и QTOF позволяют оценить изменение содержания белков до и после индукции цитохромов Р фенобарбиталом или метилхолантреном. Однако при сравнении результатов обнаружили низкую воспроизводимость количественного анализа и некоторое расхождение в результатах, полученных на разных приборах или при разных методах расчета, причем в первую очередь это актуально для белков с низкой концентрацией.

2. Разработка метода масс-спектрометрического количественного анализа с использованием мониторинга множественных реакций и масс-спектрометра с тройным квадруполем.

Для установления точных концентраций выбранных изоформ цитохромов Р450 был разработан MRM метод и проведен количественный анализ микросом печени мыши с использованием масс-спектрометра с тройным квадруполем. Созданная методика нацелена на обнаружение выбранных пептидов цитохромов Р450, которые отслеживаются на протяжении широкого диапазона концентраций, что позволило повысить чувствительность и воспроизводимость измерений.

2.1 Выбор пептидов для целевого количественного анализа методом MRM.

При выборе пептидов, используемых для количественного определения белка, руководствовались параметрами получаемого масс-спектрометрического сигнала. Поэтому в первую очередь выбор проводили среди пептидов, которые обнаружены как на ионной ловушке, так и на Q-TOF. Также критериями выбора пептида для количественного анализа послужили: a) время удерживания пептида в использованных условиях должно быть в пределах от 15 до 40 мин, b) длина пептида – последовательность должна включать не менее 6 и не более 20 аминокислот и при этом не содержать пропущенных сайтов ферментативного гидролиза. Также, предпочтение отдавалось пептидам, не имеющих в последовательности химически лабильных аминокислот, таких как цистеин и метионин.

Аналогичные критерии выбора протеотипических пептидов используются в работах, посвященных анализу белка методом MRM (Langenfeld E. et al, 2009, Proteomics, 9, 2313 – 2323;

Kawakami H.et al, 2011, J. of Pharm. Sci., 100(1), 341-352).

Вследствие большой степени идентичности, наблюдаемой для цитохромов Р450 в пределах подсемейства, трудно, а иногда невозможно, выбрать специфичные пептиды для всех интересующих изоформ. Так, Kawakami с соавт. (Kawakami H.et al, 2011, J. of Pharm.

Sci., 100(1), 341-352) не обнаружили пептида, позволяющего количественно разделить изоформы 3A4 и 3A5 цитохромов Р450 человека.

В данной работе общее протеомное профилирование проводили как на ионной ловушке, так и на QTOF, что позволило расширить число обнаруженных протеотипических пептидов, определяющих отдельные изоформы цитохромов Р450 печени мыши. Так, для CYP1А1 и CYP1А2 идентифицировали по одному изоформспецифичному пептиду (VDMTPTYGLTLK для CYP1А1 и NSIQDITSALFK для CYP1А2), для CYP2С29 и CYP2Е выбрано по два пептида (NISQSFTNFSK и GTTVITSLSSVLHDSK для CYP2С29, DIDLSPVTIGFGSIPR и MNMPYMDAVVHEIQR для CYP2Е1), а также по одному пептиду обнаружено для изоформ 2С39, 2D9, 2D10, 2D26 цитохромов Р450 (FINLVPNNIPR, FGDIVPVNLPR, FGDIAPLNLPR и DLTDAFLAEVEK соответственно).

Для CYP3А11, 3А16, 3А41 а также CYP2С50 и CYP2С54 специфических пептидов, которые воспроизводимо идентифицируются как на ионной ловушке, так и на QTOF, и удовлетворяют всем требованиям обнаружить не удалось. Поэтому были выбраны пептиды для ALLSPTFTSGK для VQEEIEHVIGK CYP2С50,54, CYP3А11,41, GSIDPYVYLPFGNGPR и FALMNMK для CYP3А11,16.

2.2 Разработка MRM метода количественного анализа протеотипических пептидов выбранных белков при помощи масс-спектрометра с тройным квадруполем.

Разработка MRM метода состояла из двух этапов, первым из которых являлось определение родительского иона и оптимизация МС параметров которые влияют на его интенсивность (таких как оптимизация фрагментора, напряжение на капилляре). На втором этапе выбирали характеристические дочерние ионы и напряжение в ячейке соударений, при котором фрагментация оптимальна. Для выявления характеристических дочерних ионов провели анализ спектров фрагментации пептидов, полученных при помощи ионной ловушки, Q-TOF и QQQ. После анализа полученных данных стало очевидным, что основными фрагментными ионами, присутствующими на спектрах, являются одно и двухзарядные у- и b- ионы.

В качестве примера можно привести пептид GTTVITSLSSVLHDSK CYP2С29, при ионизации которого образуется преимущественно ион [M+3H]3+ m\z 549,13+Da, выбранный в качестве родительского иона. В ячейке соударений при напряжении фрагментации 15V пептид GTTVITSLSSVLHDSK образует пять характеристических осколков 587,3 (y112+), 643,8 (y122+), 743,9 (y142+), 872,9 (y8);

1072,2 (y10). Спектр фрагментации пептида приведен на рис 2(а). Три наиболее интенсивных фрагмента выбраны для создания MRM метода.

Основанием для количественного анализа служило сочетание родительского и не менее трех дочерних ионов, при этом ион с максимальным откликом использовали для расчета концентрации, а соотношение остальных дочерних ионов подтверждало идентификацию.

На рис 2(б) приведена хроматограмма пептида GTTVITSLSSVLHDSK по трем выбранным характеристическим ионам. Родительские и дочерние ионы для пептидов остальных исследованных цитохромов Р450 приведены в таблице 1 раздела "Материалы и методы".

Одной из проблем количественного анализа при помощи жидкостной хромато-масс спектрометрии является необходимость учета влияния компонентов пробы на интенсивность масс-спектрометрического сигнала пептида. Одним из способов решения данной проблемы является использование изотопно-меченых пептидов в качестве внутреннего стандарта. Однако необходимость синтеза для каждого пептида его изотопно-меченого аналога многократно увеличивает стоимость анализа и время на разработку методики.

а) б) Рис. 2. Пептид GTTVITSLSSVLHDSK (CYP2С29). а) спектр фрагментации, б) хроматограммы по выбранным дочерним ионам.

2.3 Исследование влияния матрицы на результат количественного определения.

В данной работе для подтверждения концентраций, полученных без изотопной метки, провели исследование влияния компонентов пробы на количественное определение. Для этого были синтезированы изотопно-меченые аналоги NSIQDITSAL*FK (CYP1А2), GTTVITSLSSVL*HDSK(CYP2С29) и ALL*SPTFTSGK (CYP3А11,41), для которых сравнили результаты количественного анализа, полученные при помощи внутренного стандарта и внешней калибровки. При этом для приготовления калибровочных растворов использовали 3% водный раствор муравьиной кислоты, микросомы печени человека после ферментативного расщепления и смесь буферных растворов и реактивов, использующихся для проведения пиридилэтилирования и ферментативного расщепления, без добавления трипсина и биологической пробы, названную «небелковой матрицей».

Рис 3. Соотношения между концентрациями CYP1А2, CYP2С29 и CYP3А11,41, определенными методом внутреннего стандарта (с добавлением пептидов NSIQDITSAL*FK, GTTVITSLSSVL*HDSK и ALL*SPTFTSGK) и методом абсолютной калибровки с использованием для приготовления стандартов () 3% водного раствора муравьиной кислоты, () «небелковой матрицы», ()микросом печени человека после ферментативного расщепления *пептид синтезированный с включением изотопно-меченого L.

Корреляции между концентрациями, рассчитанными методом внутреннего стандарта, и по калибровочным кривым с использованием для приготовления стандартов () 3% водного раствора муравьиной кислоты, () «небелковой матрицы», ()микросом печени человека после ферментативного расщепления представлены на рис.3. Полученные значения коррелируют между собой для всех изотопно-меченых пептидов во всех исследованных пробах (коэффициент корреляции 0,98-0,99), однако, при использовании для приготовления калибровочных растворов 3% водного раствора муравьиной кислоты коэффициент наклона кривой составил 0,43, что говорит о сильном влиянии компонентов пробы на результат количественного определения. Напротив, коэффициенты полученные при использовании микросом печени человека и «небелковой матрицы» для приготовления калибровочных стандартов составляют 0,89 и 0,86, Следовательно, для приготовления стандартных растворов для которых изотопно-меченный стандарт не был синтезирован, использовали «небелковую матрицу».

2.4 Калибровочные кривые исследуемых пептидов. Динамический диапазон и чувствительность методики.

Для калибровки анализировали растворы пептидов в «небелковой матрице» с концентрациями от 0,1 до 2000 фмоль/мкл и строили калибровочные кривые зависимости площади пика наиболее интенсивного фрагмента от концентрации пептида, которые использовали для расчета концентраций пептидов и соответствующих белков в исследуемых пробах. Калибровочные кривые пептидов GTTVITSLSSVLHDSK (CYP2С29), NISQSFTNFSK (CYP2С29), FINLVPNNIPR (CYP2С39) и VQEEIEHVIGK (2С50,54) приведены на рис. 4.

Рис. 4. Калибровочные кривые пептидов:

- GTTVITSLSSVLHDSK(CYP2С29);

-NISQSFTNFSK (CYP2С29);

- FINLVPNNIPR (CYP2С39);

- VQEEIEHVIGK(CYP2С50,54).

2.5 Определение концентраций исследуемых изоформ цитохромов Р450 методом MRM до после индукции фенобарбиталом (ФБ) и метилхолантреном (МХ).

На основе разработанных MRM методов и построенных для каждого пептида калибровочных кривых были определены концентрации исследуемых изоформ цитохромов Р450 в пробах микросом печени мыши, приведенные в таблице 2. Как видно из таблицы, концентрации отдельных изоформ цитохромов Р450 в контрольной пробе составляют от до 113 фмоль/мкг микросомального белка. Причем, наименьшую концентрацию имели CYP1А1, CYP1А2 и CYP2С39 (1,3, 1,8 и 3,1 фмоль/мкг микросомального белка), а наибольшую CYP2С29 и CYP2Е1 (113,7 и 38,1 фмоль/мкг микросомального белка).

Содержание остальных исследуемых изоформ колебалось в пределах 7-17 фмоль/мкг микросомального белка.

В таблице 2 также представлены результаты по изменению содержания основных изоформ цитохромов Р450 печени мыши в результате индукции. Как видно из таблицы, наибольшее индуцирующее воздействие для подсемейства 1А цитохромов Р наблюдалось после введения метилхолантрена. Так, концентрация изоформы CYP1А возрастала в 4,3 раза, а изоформы CYP1А2 в 4,9 раз. Интересно также рассмотреть влияние фенобарбитала на подсемейство 2С цитохромов Р450. В то время как содержание CYP2С50,54 увеличивалось в 2 раза, а CYP2С29 в 1,7 раз, концентрация CYP2С практически не изменилась. К сожалению, не удалось выявить изоформспецифичных пептидов для подсемейства 3А цитохромов P450, поэтому можно судить только об суммарном индуцирующем влиянии фенобарбитала на белки этого подсемейства, увеличение содержания которого в результате индукции составляет 3,3 раза. Подсемейства 2E и 2D цитохромов P450 не индуцируются фенобарбиталом и метилхолантреном.

Таблица 2. Концентрации исследованных цитохромов Р450 в контрольной пробе микросом и после индукции фенобарбиталом (ФБ) и метилхолантреном (МХ).

Изоформа Кол-во Контроль МХ МХ ФБ ФБ пептидов фмоль/мкг фмоль/мкг /контроль фмоль/мкг /контроль 1А1 2 1,3 ± 0,13 5,6 ± 0,44 4,3 ± 0,41 0,9 ± 0,1 0,7 ± 0, 1А2 2 1,8 ± 0,23 7,1 ± 0,51 4,9 ± 0,51 2,1 ± 0,24 1,2 ± 0, 2С29 2 113,8±10,7 33,8 ± 3,1 0,33 ± 0,07 185,1±16,0 1,7 ± 0, 2С39 1 3,1 ± 0,36 2,1 ± 0,25 0,7 ± 0,05 3,1 ±0,34 1,0 ± 0, 2С50,54 1 8,3 ± 0,72 5,9 ± 0,41 0,7 ± 0,10 16,6 ± 1,4 2,0 ± 0, 2D9 1 10,9 ± 1,1 6,4 ± 0,60 0,6 ± 0,07 8,8 ± 0,93 0,8 ± 0, 2D10 1 16,8 ± 1,55 9,9 ± 1,14 0,6 ± 0,07 14,8 ± 1,69 0,9 ± 0, 2D26 1 7,9 ± 0,61 7,9 ± 0,8 1,0 ± 0,09 9,5 ± 0,86 1,2 ± 0, 2E1 2 38,8 ± 4,51 33,2±3,98 0,9 ± 0,03 32,5± 3,81 0,9±0, 3A11,41 2 10,2 ± 1,01 4,4 ± 0,51 0,5 ± 0,12 41,9 ± 5,2 3,3 ± 0, 3A11,16 1 7,0 ± 0,55 2,4 ± 0,19 0,3±0,035 23,5 ± 2,69 3,3 ± 0, 2.5. Оценка содержания цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши по данным общего протеомного профилирования.

Cогласно исследованиям Копылова с соавт., для оценки содержания белка в пробе можно использовать суммарное значение интенсивности масс-спектрометрических сигналов трех пептидов, полученных в ходе общего протеомного профилировании (Копылов А.Т. с соавт., 2009, Биомедицинская химия, 2, 125-139). Несмотря на то, что каждый пептид характеризуется собственным коэффицентом зависимости интенсивности масс-спектрометрического сигнала от концентрации, суммарное значение от трех пептидов специфичных для белка, позволяет построить усредненную калибровочную зависимость для всех исследованных цитохромов Р450.

Рис. 5. График зависимости суммы площадей пиков трех наиболее интенсивных (и изоформспецифичных) пептидов исследованных цитохромов Р450 и концентрацией в пробах микросом печени мыши, полученной по результатам МРМ анализа.

Используя описанный выше подход, для построения зависимости интенсивности масс спектрометрического сигнала от концентрации выбирали три наиболее интенсивных протеотипических пептида изоформ 1А1, 1А2, 2С29, 2С39, 2С50,54, 2D9, 2D10, 2D26, 2E1, 3A11,41, 3A11,16 цитохромов Р450. Площади 3-х экстрагированных хроматографических пиков пептидов суммировали для каждой исследованной изоформы. Для оценки точности определения концентраций строили зависимость между концентрацией цитохромов Р измеренных с использованием МРМ и суммой площадей пиков трех наиболее интенсивных (и изоформспецифичных) пептидов соответствующих цитохромов Р450 (Рис. 5). Как видно из представленных на рисунке 5 данных, суммарная площадь пептидов проявляет линейную зависимость от концентрации белка в пробах. При этом, коэффициент линейной корреляции составляет 0,69. Полученные результаты дают возможность использовать полученное уравнение линейной регрессии для полуколичественной оценки содержания других белков, идентифицированных в ходе протеомных экспериментов и белков монооксигеназной системы, в частности.

Так, для изоформ 4А14, 4А12А, 2А4,5, 2В10, 2В9,19, 2F2, 2A12, 2J5 цитохромов Р450, цитохрома b5 и NADPH -цитохром-Р450-редуктазы было выбрано по три наиболее интенсивных изоформспецифичных пептида. Далее, хроматограммы пептидов были экстрагированы из общего профиля микросом, полученного на QTOF, по точной массе родительского иона. Исходя из суммы площадей пептидов и полученного уравнения линейной регрессии можно оценить концентрации данных белков в микросомах печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном без использования стандартов.

Концентрации цитохромов Р450, рассчитанные по результатам общего протеомного профилирования без использования стандартных образцов приведены в таблице 3. Данные получены на основании одного проведенного протеомного профилирования, поэтому трудно оценить ошибку значения концентрации. Кроме того, калибровочные коэффициенты для разных пептидов зависят от их степени ионизации и могут различаться до 10 раз, поэтому коэффициент корреляции полученной общей калибровочной кривой составляет 0,69. Поэтому проведенные в таблице 3 концентрации могут использоваться для оценки концентрации белка в пробе и (более точно) для сравнения количества данного белка в разных пробах. Однако, рассчитанные данным методом концентрации подсемейств 2В, 4А и 2F цитохромов Р450совпадают с приведенными в работе Jerkins с соавт. (Jerkins R. et al, 2006, Proteomics, 6, 1934 – 1947).

Таблица 3. Концентрации белков монооксигеназной системы, рассчитанные по результатам общего протеомного профилирования без использования стандартных образцов.

Контроль, ФБ, MX, фмоль/мкг фмоль/мкг фмоль/мкг микросомального микросомального микросомального белка белка белка NADPH -цитохром- 24 24 Р450-редуктаза 4А14 12 5 4А12А 23 15 2А4,5 7 14 2В10 9 9 2В9,19 31 29 2F2 24 21 Цитохром b5 266 264 2A12 18 18 2J5 7 3 Как видно из таблицы, рассчитанная концентрация NADPH -цитохром-Р450-редуктазы в контрольной пробе составляет 24 фмоль/мкг микросомального белка, причем индукция фенобарбиталом приводит к увеличению концентрации в 1,8 раз, а после введения метилхолантрена она остается неизменной. Индукция фенобарбиталом приводит также к увеличению концентрации CYP2В10 в 10 раз (в контроле 9 фмоль/мкг микросомального белка), CYP2В9,19 в 3 раза (в контроле 31 фмоль/мкг микросомального белка) и CYP2А4, в 3,7 раз (в контроле 7 фмоль/мкг микросомального белка).

Концентрация цитохрома b5 в контрольной пробе составляет 266 фмоль/мкг микросомального белка, причем она лишь незначительно изменяется при индукции фенобарбиталом и практически не изменяется после введение метилхолантрена (324 и фмоль/мкг микросомального белка). Также, по сравнению с контролем не индуцируются CYP4А14, CYP4А12А, CYP2F2, CYP2A12, CYP2J5.

Использованный подход оценки концентрации применим для всех белков, обнаруживаемых при совместном протеомном анализе с цитохромами Р450, концентрации которых точно измерены методом MRM. При этом необходимым условием является использование не менее трех уникальных пептидов белка для количественного расчета суммарной интенсивности.

3. Масс-спектрометрическое определение активности цитохромов P450.

Активность цитохромов P450 оценивали по скорости ферментативной реакции с маркерным субстратом, при этом скорость рассчитывали как количество образующегося метаболита в единицу времени на мг микросомального белка (пмоль/мин на мг микросомального белка). Согласно литературным данным, фенобарбитал и метилхолантрен являются индукторами цитохромов P450, причем метилхолантрен воздействует в основном на подсемейство 1A, а фенобарбитал на 2B и 3A. Увеличение содержания цитохромов Р450 должно сопровождаться увеличением скорости образования соответствующего метаболита при взаимодействии с изоформоспецифичными субстратами. Для этого были исследованы микросомы печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. В качестве изоформспецифичных субстратов были использованы фенацетин, как субстрат цитохромов Р450 подсемейства 1А (метаболит – ацетаминофен), тестострон (3А, 6-гидрокситестостерон), хлорзоксазон (2E, 6-гидроксихлорзоксазон), диклофенак (2С, 4-гидроксидиклофенак) и дебризохин (2D, 4 гидроксидебризохин). (Walsky R. et al, 2004, Drug Metab. Dispos.,32(6), 23–29;

Di L. et al, 2007, Intern. J. Pharm., 335, 1-11).

Необходимо отметить, что при микросомальном окислении тестостерона помимо 6 гидрокситестостерона образуются также 16- гидрокситестостерон, 16 гидрокситестостерон, 2-гидрокситестостерон и 2- гидрокситестостерон. При этом наиболее показательным для определения активности изоформы CYP3А4 является 6 гидрокситестостерон (Wang D. et al, 2007, J. Chr. B, 855, 290 – 294). Так как данные соединения являются изомерами и имеют одинаковый спектр фрагментации, а следовательно и MRM переходы, пик 6-гидрокситестостерона был идентифицировали по совпадению времени удерживания со временем стандарта.

Кроме ситуации с 6-гидрокситестостероном, при разработке хроматографического метода нет необходимости достижения полного разделения между аналитами, вследствие высокой селективности MRM метода, однако совместное элюирование субстрата и метаболита может привести к супрессии сигнала метаболита вследствие высокой остаточной концентрации субстрата, что учитывали при разработке условий хроматографического разделения (градиента ацетонитрила).

При построении калибровочных кривых для каждого из метаболитов учитывали влияние микросомального белка на степень экстракции соединения из смеси и интенсивность сигнала. Для этого калибровочные образцы готовили аналогично исследуемым пробам, это позволило минимизировать влияние эффектов матрицы на точность определения концентрации метаболита. Калибровочные кривые проявляли линейную зависимость с коэффициентами корреляции более 0.997 в диапазоне концентраций, обнаруживаемых в реальных пробах (до 10 мкM). Нижний предел количественного определения составляет для ацетаминофена – 5 нM, 6-гидрокситестостерона – 10 нM, 4-гидроксидиклофенака – нM, 4-гидроксидебризохина – 5 нM, 6-гидроксихлорзоксазона - 5 нM.

Таблица 4. Результаты определения активностей исследуемых цитохромов Р450 в контрольных и индуцированных фенобарбиталом (ФБ) и метилхолантреном (МХ) микросомах печени мыши.

Маркерный Контроль, ФБ, ФБ, МХ, МХ, субстрат пмоль/мин/мг пмоль/мин/мг /контроль пмоль/мин/мг /контроль микросомаль- микросомаль- микросомального ного белка ного белка белка Тестостерон (3А) 1135 ± 9,15 2749 ± 27,3 2,42 ±0,44 736± 8,7 0,64±0, Дебризохин (2D) 118,6 ± 8,2 121,0 ± 7,4 1,0± 0,26 101,3 ± 1,8 0,85±0, Диклофенак (2С) 687 ± 3,7 2811 ± 42,4 4,1± 0,4 728 ± 8,4 1,1± 0, Фенацетин (1А) 404,4 ±16,9 395,3 ± 68,5 0,98±0,21 1038,1± 115,4 2,6±0, Хлорзоксазон (2Е) 980 ± 4,3 1040± 130,1 1,1± 0,3 964 ±154,0 0,98± 0, Активности цитохромов Р450 определенные по скорости ферментативной реакции с маркерным субстратом приведены в таблице 4. Согласно полученным результатам индукция метилхолантреном приводит к увеличению скорости ферментативной реакции с фенацетином (маркерный субстрат подсемейства 1A цитохромов Р450) в 2,57 раза, а индукция фенобарбиталом увеличивает активность по отношению к тестостерону (маркерный субстрат подсемейства 3A цитохромов Р450) 2,42 раза, а по отношению в диклофенаку (маркерный субстрат подсемейства 2С цитохромов Р450) в 4,1 раз.

4. Cопоставление изменения активности и количества изоформ 1А, 2Е, 2С и 3А цитохромов Р450 в контрольных пробах и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном.

Исходя из анализа полученных результатов, представленных в таблицах 2 и 4 можно сделать вывод, что изменения активности и концентрации цитохромов Р450 вследствие индукции, в основном, коррелируют между собой, что отражено на рис.6.

Рис. 6. Изменение концентрации и активности исследуемых изоформ цитохромов Р450 по отношению к маркерным субстратам при индукции фенобарбиталом или метилхолантреном.

Так, наибольшее увеличение концентрации и активности наблюдается для подсемейства 1А цитохромов Р450 при индукции метилхолантреном. При этом скорость ферментативной реакции возрастает 2,57 раз, а концентрации изоформ CYP1А1 и CYP1А в 4,3 и 4,9 раз соответственно. Подобные изменения наблюдаются при индукции подсемейства 3А цитохромов Р450 фенобарбиталом, где увлечение концентрации в 3,3 раза для изоформ CYP3А11,16,41 сопровождаются увеличением скорости ферментативной реакции в 2,4 раза. Методом хромато-масс-спектрометрии измеряется сумма как каталитически активной формы белка (голофермента), так и апофермента, в то время как увеличение скорости ферментативной реакции является показателем изменения только голофермента. В индуцированных пробах соотношение между активной и неактивной формой цитохрома Р450 может отличаться от контрольной, так как часть дополнительно синтезированного фермента может находится в виде апофермента (Wang D. et al, 2007, J.

Chr. B, 855, 290 – 294, Yu A.M. et al, 2009, Drug Metab. Dispos., 37(1), 170-177).

Индукция фенобарбиталом приводила к увеличению скорости ферментативной реакции с диклофенаком в 4,1 раза, что можно объяснить суммарным эффектом повышения концентрации CYP2С29 (в 1,7 раз) и CYP2С50,54 (в 2 раза), а также влиянием CYP2С37,38,55,70, для которых не удалось обнаружить изоформспецифичных пептидов, удовлетворяющих условиям количественного анализа. Активности цитохромов Р относящиеся к подсемействам 2D и 2Е не изменяются после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном, что коррелирует с отсутствием увеличения концентраций данных белков.

Подобные результаты были получены Williamson с соавт. (Williamson B. et al, 2011, 33 – 41), которые провели относительный количественный анализ Proteomics, 11, CYP1А2, 2В6, 3А4 и 3A5 в культуре гепатоцитов человека после индукции метилхолантреном, рифампицином и фенобарбиталом по сравнению с контрольной группой. Наиболее сильная индукция была отмечена для изоформы CYP1A2 при обработке культуры гепатоцитов метилхолантреном, по активности белка увеличение составило раз и по масс-спектрометрическому количественному анализу наблюдали увеличение содержания в 45 раз. Концентрация CYP3A4 после индукции фенобарбиталом по масс спектрометрическим данным увеличивалась в 16 раз, а активности фермента в 23 раза.

Также в статье Wang с соавт. (Wang M. et al, 2008, Proteomics, 8, 4186 – 4196) проведено определение концентраций CYP3A4 и CYP3A5 в микросомах печени человека масс спектрометрически, методом Вестерн блот и активности ферментов по отношению к тестостерону (подсемейство 3A цитохромов Р450), мидазоламу (подсемейство 3A цитохромов Р450), интроконазолу (CYP3A4) и винкристину (CYP3A5) в образцах микросом печени человека. Авторами обнаружено, что значения скорости гидроксилирования интроконазола, которое осуществляется главным образом CYP3A5, имели коэффициент корреляции 0,97 с концентрацией фермента, определенной масс спектрометрически. При этом масс-спектрометрические концентрации и активности коррелировали между собой (коэффициент корреляции более 0,8) у всех исследованных ферментов, а значения, полученные с использованием иммуноферментных методов, не всегда соответствовали активности и масс-спектрометрическим данным, причиной этого, по мнению авторов, является качество используемых антител.

В таблице 5 приведены активности подсемейств цитохромов Р450 в пересчете на сумму молярных концентраций входящих в него изоформ. Согласно полученным данным, после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном не происходит значительного увеличения количества метаболита, производимого в минуту одной молекулой фермента, а следовательно, общее увеличение активности микросом в целом обусловлено увеличением концентрации специфических изоформ, а не изменением их ферментативной активности.

Таблица 5. Активности подсемейств цитохромов Р450 в пересчете на сумму молярных концентраций входящих в него изоформ.

Маркерный субстрат Контроль ФБ МХ Тестостерон (3А), 66,4 ± 6,3 42,5 ± 5,6 109,1 ± 12, пмоль продукта/пмоль CYP3A/мин Дебризохин (2D), 3,4 ± 0,5 4,2 ± 0,5 3,7 ± 0, пмоль продукта/пмоль CYP2D/мин Диклофенак (2С), 5,5 ± 0,5 13,8 ± 1,4 17,5 ± 1, пмоль продукта/пмоль CYP2C/мин Фенацетин (1А), 131,2 ± 15,2 134,2 ± 36,4 82,5 ± пмоль продукта/пмоль CYP1A/мин Хлорзоксазон (2Е), 25,5 ± 3,1 31,9 ± 7,8 30,3 ± 8, пмоль продукта/пмоль CYP3A/мин ВЫВОДЫ 1. В результате протеомного профилирования микросомальной фракции печени мышей идентифицировано около 3700 белков, из которых 32 относятся к суперсемейству цитохромов Р450 ( обнаружены изоформы 1А1, 1А2, 2A4, 2A5, 2A12, 2B9, 2B10, 2Е1, 2F2, 2J5, 2J6, 4V3, 4А14, 4А10, 4А12А, 2D9, 2D10, 2D11, 2D26, 3A11, 3A13, 3A16, 3A25, 3A41, 2C29, 2C39, 2C38, 2C40, 2C54, 2C37, 2C55, 2C70 цитохромов Р450). Общее протеомное профилирование позволило оценить изменения концентраций цитохромов р450 в процессе индукции.

2. Создана методика количественного анализа изоформ 1A1, 1A2, 2C29, 2C39, 2C50,54, 3A11,16,41, 2E1, 2D9, 2D10 и 2D26 цитохромов Р450 в микросомах печени мыши при помощи хромато-масс-спектрометра с тройным квадруполем в режиме мониторинга множественных реакций без использования изотопных меток.

Корреляция результатов измерения концентраций Р450 c данными полученными с использованием изотопно-меченных пептидов составляет 0,97.

3. Разработана масс-спектрометрическая методика определения активности подсемейств 1A, 1A2, 2C, 3A, 2E1, 2D цитохромов Р450 по скорости ферментативной реакции с маркерным субстратом. В качестве изоформспецифичных субстратов использовали фенацетин для CYP1А (метаболит – ацетаминофен), тестострон (CYP3А, 6-гидрокситестостерон), хлорзоксазон (CYP2E, 6-гидроксихлорзоксазон), диклофенак (CYP2С, 4-гидроксидиклофенак) и дебризохин (CYP2D, 4-гидроксидебризохин).

4. Установлено, что содержание цитохромов Р450 в микросомальной фракции в контрольной пробе составляло от 1 до 113 фмоль/мкг микросомального белка.

Индукция метилхолантреном приводит к увеличению содержания цитохромов Р подсемейства 1A 4,34 и 4,98 раза (для изоформ 1А1 и 1А2 соответственно), а индукция фенобарбиталом приводит к увеличению концентрации цитохромов Р подсемейств 3А в 3,4 раза, 2С в 1,7 и 2 раза (для изоформ 2С29 и 2С50, соответственно) и 2B 10 и 3 раза (для изоформ 2В10 и 2В9,19 соответственно), при этом изменения концентраций коррелировали с изменениями активности.

Список опубликованных работ 1. Москалева Н.Е., Згода В.Г. Современные методы анализа цитохромов Р450 // Биомедицинская химия. 2012. N58(6). C. 617-634.

2. Воскресенская А.А., Медведева Н.В., Прозоровский В.Н., Москалева Н.Е., Ипатова О.М.

Особенности всасывания глицирризиновой кислоты в составе лекарственного препарата "Фосфоглив"// Биомедицинская химия. 2012. N 58(5). C. 564-572.

2а. Voskresenskaya A.A., Medvedeva N.V., Prozorovskii V.N., Moskaleva N.E., Ipatova O.M.

The absorption features of glycyrrhizic acid in the drug formulation Phosphogliv // Biochemistry (Moscow) Supplement. Series B: Biomedical Chemistry. 2011. N5(4). С. 381-386.

3. Grigoryev A., Savchuk S., Melnik A., Moskaleva N., Dzurko J., Ershov M., Nosyrev A., Vedenin A., Izotov B., Zabirova I., Rozhanets V. Chromatography–mass spectrometry studies on the metabolism of synthetic cannabinoids JWH-018 and JWH-073, psychoactive components of smoking mixtures // J. of Chrom. B. 2011. N879. C. 1126-1136.

4. Москалева Н.Е., Згода В.Г., Арчаков А. И. Масс-спектрометрическое определение содержания цитохромов Р450 и их ферментативной активности // Биоорганическая химия.

2011. N 37(1). C. 1-16.

4a. Moskaleva N.E., Zgoda V.G., Archakov A.I. Mass-spectrometric determination of the quantity and enzyme activity of cytochromes P450 // Russian Journal of Bioorganic Chemistry.

2011. N37(2). C. 131-145.

5. Писарев В.В, Москалева Н.Е, Зверков Ю.Б., Смирнова Л.В., Тисейко Н.И., В.Г.

Белолипецкая В.Г., Суханов Я.В. Определение эналаприла и эналаприлата в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием // Химико фармацевтический журнал. 2005. N39(2). C. 49-52.

5a. Pisarev V.V., Moskaleva N.E., Zverkov Yu.B., Belolipetskaya V.G., Sukhanov Ya. V.

HPLC/MS determination of enalapril and enalaprilat in the blood plasma // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2005. N39(2). C.104-107.

6. Писарев В.В, Москалева Н.Е, Зверков Ю.Б., Смирнова Л.В., Белолипецкая В.Г., Суханов Я.В. Изучение сравнительной фармакокинетики препаратов азитромицина у здоровых добровольцев открытым рандомизированным перекрестным методом // Антибиотики и химиотерапия. 2003. N48(10). C. 7.

7. Zgoda V., Tikhonova O., Novikova S., Kurbatov L., Kopylov A., Moskaleva N., Archakov A.

System analysis of human cell line: Transcriptome, proteome // Abstr. 8th International Conference «Bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology BGRS\SB'12».

2012. Novosibirsk, Russia. Р. 342.

8. Tichonova O.V., Zgoda V.G., Archakov A.I., Moskaleva N.E. Mass spectrometry based approach for the Cytochrome P-450'S concentration and activity determination.// Abstr. 8th International Conference «Bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology BGRS\SB'12». 2012. Novosibirsk, Russia. Р. 214.

9. Zgoda V., Moskaleva N. Mass Spectrometric Determination of the Concentration and Enzyme Activity of Cytochromes P450.// Abstr. HUPO 11th Annual World Congress. Boston, Massachusetts, USA. 2012. С. 269.

10. Воскресенская А. А., Прозоровский В.Н., Медведева Н.В., Москалева Н.Е. Мониторинг глицирризиновой кислоты методом хромато – масс – спектрометрии при пероральном приеме лекарственного препарата «Фосфоглив». // Материалы докладов V Конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, Россия. 2008. С. 96.

Авторефераты диссертаций >> Авторефераты по Биологии

<< ГЛАВНАЯ | КОНТАКТЫ

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов р450