Удк 577.152.121 влияние шаперонина groel и пептида -амилоида1-42 на денатурацию и ренатурацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

На правах рукописи

НАЛЕТОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА УДК 577.152.121 ВЛИЯНИЕ ШАПЕРОНИНА GROEL И ПЕПТИДА -АМИЛОИДА1-42 НА ДЕНАТУРАЦИЮ И РЕНАТУРАЦИЮ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор В.И. Муронец

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Н. Чернов доктор биологических наук, А.Г. Катруха

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится “_30_” _октября_2006 г. в “_” часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназа (NAD – зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.12) катализирующая центральную стадию гликолиза – реакцию окисления глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата с образованием NADH, является одним из самых изучаемых ферментов гликолиза. Это связано не только с важностью изучения его основной гликолитической функции, но и с обнаружением многочисленных негликолитических активностей данного фермента в клетке. Важность разнообразных негликолитических функций ГАФД в регуляции функционирования клеток связана еще и с тем, что содержание этого фермента в тканях составляет 10-15% от общего количества растворимых белков. Очевидно, что из-за такой высокой концентрации ГАФД в клетке невозможно пренебрегать никакими сведениями об участии этого белка в тех или иных процессах. Особенно важно изучение роли ГАФД в агрегации белков, образовании амилоидных структур и функционировании системы шаперонов, так как в этих случаях первостепенное значение имеет именно концентрация белка в клетке. В нашей работе основное внимание было уделено исследованию денатурации, ренатурации и агрегации ГАФД и участию в этих процессах шаперонина и пептида -амилоида1-42. Мы полагаем, что именно благодаря очень высокой концентрации ГАФД в различных тканях этот белок является полноправным участником развития многих патологических процессов, обусловленных накоплением агрегированных белков и формированием амилоидных структур.

Правильность такого предположения подтверждается постоянным появлением все новых фактов участия ГАФД в возникновении различных «конформационных болезней», прежде всего нейродегенеративных заболеваний, при которых происходит накопление белковых агрегатов. К подобной патологии могут приводить нарушения функционирования шапероновой системы. В настоящей работе представлялось целесообразным изучить возможность блокирования шаперонов неправильно свернутыми формами (“misfolded forms”) белков, полученными при окислении полипептидных цепей ГАФД перекисью водорода.

В последние годы накопилось много данных по исследованию участия ГАФД в нейродегеративных заболеваниях, в том числе о взаимодействии ГАФД с предшественником амилоидного белка (Tamaoka et al., 1996). Однако ничего не известно о взаимодействии ГАФД с пептидом -амилоида1-42 – ключевым *Список сокращений: ГАФД – D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, ГАФДОх – D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа окисленная H2O2, ЛДГ – лактатдегидрогеназа, -амилоид1-42 – пептид -амилоида1-42, ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия, ДСН – додецилсульфат натрия, ПААГ – полиакриламидный гель, Тм – температура, при которой наблюдается максимальное теплопоглощение препарата белка, 3-ФГА – глицеральдегид-3 фосфат, NFTs – нейрофибриллярные клубки.

фактором болезни Альцгеймера. Это определило второй раздел настоящего исследования. Таким образом, исследование участия ГАФД в развитии нейродегенеративных заболеваний тесно переплетается с изучением систем, защищающих ГАФД от агрегации – это прежде всего система шаперонов, и с проблемой взаимодействия ГАФД с пептидом -амилоида1-42.

Цели и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, основной целью нашей работы явилось изучение блокирования шаперонина неправильно свернутыми формами ГАФД, а также возможного участия глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы в образовании амилоидных структур.

В соответствии с целями были сформулированы задачи:

1. Изучить особенности взаимодействия различных ненативных форм ГАФД (денатурированной, денатурированной и окисленной, а также термоинактивированной) с шаперонином GroEL.

2. Исследовать термодинамические параметры комплексов термоденатурированной ГАФД с шаперонином.

3. Изучить влияние ненативных форм ГАФД на шаперонин-зависимый фолдинг белков.

4. Изучить взаимодействие различных форм ГАФД с пептидом -амилоида1- и его агрегатами.

5. Исследовать связывание пептида -амилоида1-42 с шаперонином GroEL.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящей работе впервые было продемонстрировано необратимое связывание шаперонина GroEL с окисленной денатурированной формой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, приводящее к блокированию GroEL/GroES-зависимой реактивации неокисленной денатурированной ГАФД, но не лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Последнее свидетельствует о различных механизмах рефолдинга для ГАФД и ЛДГ. Предполагается, что денатурированные формы белков, неспособные достигнуть нативной конформации, могут взаимодействовать с шаперонами, блокировать их функционирование и приводить к развитию патологий сопровождающихся накоплением белковых агрегатов. Представлены данные по взаимодействию шаперонина GroEL и ГАФД с -амилоидом1-42. Они позволяют оценить действие последнего как на GroEL/GroES-зависимый рефолдинг фермента, так и на сам фермент, то есть на вовлечение шаперонов и ГАФД в развитие амилоидозов. Таким образом, установлена возможность непосредственного взаимодействия шаперонина, а также различных ненативных форм ГАФД с пептидом -амилоида1-42. Вероятно, в процессе формирования сенильных бляшек ненативные формы ГАФД, присутствующие в клетке, участвуют в этом процессе, а не связываются с уже сформированной бляшкой, то есть взаимодействие денатурированной формы ГАФД с пептидом -амилоида1- непосредственно вовлечено в образование амилоидных структур.

Следовательно, соединения предотвращающие денатурацию ГАФД и/или препятствующие взаимодействию этой формы с пептидом -амилоида1- могут влиять на развитие болезни Альцгеймера. Таким образом, видится целесообразным использование ГАФД в качестве новой молекулярной мишени для отбора факторов пригодных в перспективе для создания методов лечения нейродегенеративных заболеваний.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского МГУ (2006), а также на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, 2003, 2004, 2005), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Ukraine, Kyiv), International Conference "Chemistry, structure and function of biomolecules" (Byelorussia, Minsk), Third Moscow international congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development" (Russia, Moscow), Conference devoted to 70th anniversary of V.P.

Skulachev "Russian bioenergetics: from molecules to the cell" (Russia, Moscow), EMBO-FEBS WORKHOP on Biology of Molecular Chaperones. Heat Shock Proteins in Molecular Medicine Misfolding Disease and Cancer (Poland, Zakopane), International Conference "Biocatalysis-2005: Fundamentals and Application" (Russia, St. Peterburg-Kizhiy-Valaam), International alumni seminar on "Biotechnology and health" (Armenia, Erevan), Moscow international conference "Biotechnology and medicine" (Russia, Moscow).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, включая одну журнальную статью и статью в сборнике.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет 151 стр., содержит 32 рисунка и таблицы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из скелетных мышц кролика выделяли по методу Скоупса (Scopes and Stoter, 1982) с последующей гельфильтрацией на сефадексе G-100. Белок хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH4)2SO4.

Шаперонин GroEL и ко-шаперонин GroES выделяли по методике Корралеса и Фершта с некоторыми модификациями (Corrales and Fersht, 1996). GroEL и GroES хранили в 10 мМ калий фосфатном буфере, рН 7,5, при температуре 70°С.

Концентрацию белка определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976) и спектрофотометрически по поглощению при длине волны 280 нм (А 0,1% для ГАФД 1,0;

ЛДГ – 1,45;

GroEL – 0,18;

GroES – 0,14;

иммуноглобулинов – 1,5).

Определение концентрации антител и GroEL, иммобилизованных на сефарозе 4В проводили по модифицированному методу Бредфорд (Asryants et al, 1985).

Определение ферментативной активности ГАФД проводили спектрофотометрически при 25°С, измеряя скорость образования NADH при 340 нм в ходе реакции окисления 3-ФГА. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля NAD+ в минуту.

Денатурация и реактивация ГАФД или ЛДГ. Для денатурации ферменты инкубировали в 4 М гуанидин гидрохлориде в 10 мМ KH2PO4, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ меркаптоэтанол. Реактивацию инициировали 50- или 100 кратным разбавлением денатурированного фермента. В случае шаперонин зависимой реактивации добавляли 2 мМ ATP, 2 мМ Mg2+, 0,3-0,6 мкМ GroEL14 и 0,6-1,2 мкМ GroES7.

Окисление ГАФД перекисью водорода проводили в 4М гуанидин хлориде в присутствии 10-кратного молярного избытка перекиси водорода по отношению к содержанию сульфгидрильных групп, что приводило к окислению всех сульфгидрильных групп фермента.

Кинетику термоагрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы измеряли в термостатируемой кювете на спектрофотометре "SIM Aminco DW – 2000" (США). За ходом термоагрегации белка следили по увеличению мутности раствора при 320 нм. Полученные результаты кинетических кривых агрегации обрабатывали при помощи компьютерной программы "ORIGIN 7.5".

Анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрии проводили на адиабатическом микрокалориметре DASM – 4 (Биоприбор, Пущино, Россия) в кювете объемом 0,47 мл при скорости сканирования 1/мин.

Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). с использованием прибора для электрофореза “Mini-Protean 3” (BioRad).

Для иммобилизации антител и GroEL на сефарозе 4В вначале проводили активацию сефарозы 4В с помощью BrCN, а затем проводили иммобилизацию по разработанной в нашей лаборатории методике (Cherednikova et. al., 1981).

Исследование образования и диссоциации комплексов GroEL-ГАФД при помощи иммобилизованных антител 6С5. К сефарозе с иммобилизованными антителами добавляли раствор, содержавший денатурированную ГАФД (в присутствии или отсутствии GroEL). Пробы инкубировали, отмывали, добавляли концентрированный буфер с ДСН и меркаптоэтанолом и нагревали. При такой обработке происходило разрушение нековалентных связей между антителами и денатурированной ГАФД, а также частично ковалентных связей между антителами и сефарозой. Сефарозу осаждали центрифугированием и анализировали супернатант при помощи ДСН электрофореза в ПААГ.

Метод динамического светорассеяния (ДСР) использовали для определения среднего размера частиц, образующихся в процессе тепловой денатурации.

Опыты были проведены на приборе «Zetasizer Nano-ZS» (Malvern Instruments, Malvern, Великобритания), используемом для измерения размеров частиц в диапазоне от 1 до 10000 нм.

Взаимодействие пептида -амилоида1-42 и ГАФД изучалось при помощи метода поверхностного плазмонного резонанса с использованием установки Biacore X при 25оС. В работе использовали сенсорный чип СМ5. Обработка данных производилась при помощи программного пакета Biaevaluation v.3.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Основной задачей 1 части данной работы было изучение особенностей взаимодействия шаперонина GroEL с различными типами ненативных белков, которые могли бы присутствовать в клетке. Были изучены 3 типа ненативных белков – развернутые полипептидные цепи (аналог синтезирующейся полипептидной цепи), термоинактивированный белок и его агрегаты (аналоги продуктов, образующихся при тепловом шоке) и, наконец, развернутые полипептидные цепи, модифицированные путем окисления сульфгидрильных групп перекисью водорода. Мы предположили, что развернутые модифицированные полипептидные цепи сходны по своим свойствам с продуктами модификации синтезируемых на рибосоме полипептидов различными внутриклеточными реагентами. В тех случаях, когда модификация полипептидной цепи происходит до ее окончательного сворачивания, могут образовываться ненативные белковые структуры, так называемые “misfolded proteins”, которые в ряде случаев в принципе не могут свернуться в нативную конформацию. Именно развернутые модифицированные формы белка были основным объектом нашего исследования, так как главной нашей задачей был поиск таких форм ненативных ферментов, которые бы снижали эффективность функционирования шаперонина и, следовательно, могли бы быть их ингибиторами in vivo. Таким образом, мы изучали влияние шаперонина (свободного и в комплексе с модифицированными белкам) на сворачивание развернутых полипептидных цепей, на процессы термоденатурации и агрегации белков, а также исследовали свойства комплексов, образующихся при связывании шаперонина. В качестве главного объекта при оценке эффективности действия шаперонина GroEL мы использовали глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (ГАФД). Выбор этого белка был обусловлен, прежде всего, его высоким содержанием во всех типах клеток, а также сведениями об участии ГАФД в развитии целого ряда заболеваний, обусловленных накоплением в тканях белковых агрегатов. На основании этих сведений можно было предположить, что различные ненативные формы этого фермента (модифицированные, термоинактивированные и агрегированные) могут быть партнерами шаперонинов при их функционировании в клетке.

Влияние окисленной развернутой ГАФД на GroEL-зависимое сворачивание денатурированной формы этого фермента. Для получения развернутых полипептидных цепей фермента мы инкубировали ГАФД в присутствии 4 М гуанидин гидрохлорида. Было показано, что в течение 15-20 минут белок полностью теряет свою активность. При этом происходило полное разворачивание белковой глобулы, так как в спектрах кругового дихроизма при измерении в коротковолновой области (220 нм) исчезали пики, характерные для вторичной структуры нативного фермента (данные не приведены). Для инициации рефолдинга денатурированный Рис. 1. Шаперон-зависимая реактивация ГАФД, денатурированной в 4 М гуанидин гидрохлориде.

Активность, ед/мг 1. спонтанная реактивация ГАФД 2. реактивация ГАФД в присутствии 1 мкМ GroEL, 1 мкМ GroES 3. реактивация ГАФД в присутствии 1 мкМ GroEL, 2 мМ ATP, 2 мМ Mg2+ 4. реактивация ГАФД в присутствии 1 мкМ GroEL, 1 мкМ GroES, 2 мМ ATP, 2 мМ Mg2+.

2, 0 50 100 Время, мин.

фермент разводили буфером для реактивации и следили за восстановлением активности (рис. 1). Как видно из рисунка 1 (кривая 1), уровень спонтанной реактивации фермента составляет около 2%. Присутствие в среде только GroEL/GroES в отсутствие Mg-ATP (рис. 1, кривая 2) или же только шаперонина GroEL и Mg-ATP (рис. 1, кривая 3) полностью блокирует спонтанную реактивацию фермента. Такое блокирование свидетельствует, во первых, о связывании денатурированной ГАФД шаперонином и, во-вторых, о том, что для шаперонин-зависимого рефолдинга необходимо одновременное присутствие GroEL, GroES и Mg-ATP, которое позволяет увеличить уровень реактивации приблизительно в 10 раз. Как было отмечено выше, в основе этой работы лежала гипотеза о том, что одной из возможных причин нарушений в работе шаперонов может быть их блокирование ненативными формами белков-субстратов, которые из-за неспособности в принципе достигнуть своего нативного состояния, препятствуют шаперонам в выполнении их функций. На основе этих предположений мы попытались получить подобную форму ГАФД из развернутого в гуанидингидрохлориде фермента, Рис. 2. Шаперон-зависимая реактивация ГАФД денатурированной в 3 гуанидингидрохлориде в присутствии ГАФД, окисленной Н2О2 и Активность, ед/мг денатурированной.

1. спонтанная реактивация ГАФД 2. реактивация ГАФД в присутствии ГАФДox 3. реактивация ГАФД в присутствии мкМ GroEL, 1 мкМ GroES, 2 мМ ATP, 2 мМ Mg2+.

1 4. реактивация ГАФД в присутствии ГАФДox 1 мкМ GroEL, 1 мкМ GroES, 2 мМ ATP, 2 мМ Mg2+.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 Время, мин окисленного перекисью водорода по всем 4 сульфгидрильным группам полипептидной цепи (ГАФДox). Как следует из приведенных на рисунке результатов, присутствие ГАФДox не влияет на спонтанную ренатурацию ГАФД (рис. 2, кривые 1 и 2). Однако, при добавлении ГАФДox к полной системе, содержащей GroEL, GroES и Mg-ATP, в которой обычно эффективно происходит GroEL-зависимая ренатурация ГАФД (рис. 2, кривая 3), этот процесс полностью блокируется (рис. 2, кривая 4). Исходя из полученных результатов, можно было предположить, что окисление развернутой цепи ГАФД перекисью водорода приводит к образованию формы белка неспособной к формированию нативной структуры. При этом полученная форма ГАФДox, вероятно, может взаимодействовать с GroEL и ингибировать GroEL-GroES зависимый фолдинг белков. Для проверки этого предположения нами было исследовано связывание окисленной развернутой формы фермента с шаперонином и зависимость взаимодействия между двумя белками от присутствия Mg-ATP.

Выявление комплекса между разными формами денатурированной ГАФД и GroEL при помощи антител 6C5, иммобилизованных на сефарозе. Для изучения взаимодействия между GroEL и двумя формами денатурированной ГАФД (окисленной и немодифицированной) мы использовали иммобилизованные моноклональные антитела типа 6С5, которые специфически связывают только ненативные формы ГАФД, но не обладают сродством к нативным тетрамерам фермента. После инкубации иммобилизованных антител с растворами, содержащими ненативные формы ГАФД, можно легко извлекать и анализировать различные денатурированные или субъединичные формы фермента (Grigorieva et al., 1999). Мы предположили, что если при совместной инкубации эквимолярных количеств 1. Денатурированная GroEL ГАФД (образец №1) 2. Антитела 6С иммобилизованные на сефарозе после инкубации с Тяжелые образцом № цепи 3. Денатурированная ГАФД в присутствии антител ГАФД шаперонина (образец №3) 4. Антитела 6С иммобилизованные на сефарозе после инкубации с образцом № 5. Денатурированная Легкие ГАФД в присутствии цепи шаперонина и Mg-ATP антител (образец №5) 6. Антитела 6С 12 34 5 6 иммобилизованные на сефарозе после инкубации с образцом № Рис. 3. Выявление комплекса между денатурированной ГАФД и GroEL при помощи антител 6C5, иммобилизованных на сефарозе 4В.

денатурированной формы ГАФД с шаперонином GroEL между двумя этими белками будет образовываться прочный комплекс, то в растворе нельзя будет обнаружить свободный фермент. Следовательно, из такой смеси нельзя будет извлечь денатурированные формы ГАФД с помощью иммобилизованных антител 6С5. При распаде комплекса шаперонин-денатурированный фермент в растворе должны снова появляться полипептидные цепи, специфические связывающиеся с антителами. Полученные нами результаты представлены на рисунках 3 и 4. Прежде всего, мы изучили связывание с шаперонином развернутых в гуанидин гидрохлориде полипептидных цепей ГАФД, не подвергавшихся никакой модификации и способных к ренатурации в присутствии GroEL (рис. 3). Как видно из рисунка 3 (дорожка 2) после инкубации денатурированной ГАФД с антителами, иммобилизованными на сефарозе, на электрофореграмме присутствуют три белковых полосы: тяжелая и легкая цепи антител (соответственно 50 и 25 кДа) и полоса ГАФД (36 кДа).

Таким образом, происходит связывание денатурированной ГАФД с антителами. Совсем другая ситуация наблюдается после предварительной инкубации денатурированной ГАФД с шаперонином с последующим добавлением к этой смеси иммобилизованных на сефарозе антител. В этом случае полоса, соответствующая ГАФД, отсутствует (рис. 3, дорожка 4), что говорит об образовании комплекса между денатурированным ферментом и шаперонином, вследствие чего становится невозможным взаимодействие денатурированного фермента с антителами. Однако этот комплекс может быть разрушен добавлением в инкубационную среду Mg-ATP (рис. 3, дорожка 6).

1. ГАФДOx (образец №1) GroEL 2. Иммобилизованные антитела типа 6С5 после Тяжелые инкубации с образцом № цепи антител 3 ГАФДOx в присутствии шаперонина (образец №3) 4. Иммобилизованные ГАФД антитела типа 6С5 после инкубации с образцом № 5. ГАФДOx в Легкие присутствии шаперонина и цепи антител Mg-ATP (образец №5) 6. Имобилизованные антитела типа 6С5 после 1 2 3 4 5 6 инкубации с образцом № Рис. 4. Выявление комплекса между развернутой окисленной ГАФД и GroEL при помощи антител 6C5, иммобилизованных на сефарозе 4В.

Аналогичные эксперименты были поставлены для изучения взаимодействия с шаперонином развернутых полипептидных цепей ГАФД, окисленных по сульфгидрильным группам. Как видно из рисунка 4, после инкубации ГАФДox с антителами, также как и в случае с неокисленным ферментом, происходит ее связывание с антителами (рис. 4, дорожка 2). После предварительной инкубации ГАФДox с GroEL, а затем с антителами на электрофореграмме видны только полосы свободных антител (рис. 4, дорожка 4), что говорит о связывании ГАФДox шаперонином. В присутствии Mg2+и ATP наблюдается та же самая картина (рис. 4, дорожка 6). Отсутствие полосы ГАФД при добавлении в систему Mg2+ и ATP говорит о том, что ГАФДox не высвобождается в раствор и следовательно, необратимо связывается с шаперонином. Таким образом, окисление ГАФД, денатурированной в присутствие гуанидингидрохлорида, приводит к образованию белка, неспособного свернуться в нативную структуру, вследствие чего он не высвобождается из полости шаперонина в раствор даже в присутствии Mg2+ и ATP. Это наблюдение представляется нам весьма важным, так оно свидетельствует о необратимом характере связывания модифицированных развернутых форм белка с шаперонином, что, вероятно, и является причиной уменьшения эффективности их действия.

GroEL-зависимое сворачивание денатурированной лактатдегидрогеназы в присутствии окисленной развернутой ГАФД. Исходя из полученных выше данных, можно предположить, что увеличение содержания неправильно свернутых и денатурированных белков в клетке, ведет к блокированию ими шаперонов, т. е. к образованию прочных недиссоциирующих комплексов.

Возникает вопрос, насколько широким может быть влияние этого процесса на способность системы шаперонов реактивировать другие белки?

Рис. 5. Шаперон-зависимая реактивация ЛДГ денатурированной 3 в гуанидин гидрохлориде в присутствии окисленной ГАФД.

Активность, % 1. спонтанная реактивация ЛДГ 2. реактивация ЛДГ в присутствии GroEL 1 3. реактивация ЛДГ в присутствии GroEL, GroES, Mg-ATP 2 4. реактивация ЛДГ в присутствии ГАФДох GroEL, GroES, Mg-ATP 0 20 40 60 80 100 Время, мин В качестве первого шага в этом направлении мы предприняли попытку изучения процесса реактивации другого фермента – лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в системе с окисленной ГАФД. Как видно из рисунка 5, только в присутствии всех компонентов, необходимых для шаперонин-зависимого сворачивания ЛДГ, наблюдается значительное увеличение уровня реактивации (кривая 3). Однако добавление ГАФДох не оказывает на шаперонин-зависимое сворачивание такого эффекта, который мы наблюдали при изучении сворачивания ГАФД. Как следует из приведенных кривых, добавление развернутой окисленной ГАФД не препятствует реактивации ЛДГ (рис. 5, кривые 3 и 4). Этот факт может свидетельствовать о том, что шаперонин-зависимое сворачивание двух дегидрогеназ может осуществляться по разным механизмам. Действительно одна из них (ЛДГ) может сворачиваться при участии шаперонина, содержащего связанный неправильно свернутый белок. Однако такой блокированный шаперонин абсолютно не эффективен при сворачивании денатурированной ГАФД. В литературе существуют сведения о том, что шаперонин-зависимое сворачивание разных белков может осуществляться по разным механизмам. То есть, для сворачивания одних белков совершенно обязательной является стадия их проникновения в гидрофильную полость, формируемую GroEL и GroES, а для других вполне достаточным является связывание с апикальным доменом GroEL с последующим высвобождением в раствор. Такого рода наблюдения были сделаны при изучении механизма GroEL-зависимой реактивации аконитазы (Farr et al., 2003). Рефолдинг ЛДГ в данном случае происходит путем связывания развернутой молекулы ЛДГ с апикальным доменом GroEL и последующим высвобождением ЛДГ в раствор. Мы полагаем, что молекула ГАФДОх инкапсулирована в гидрофобную камеру, формируемую GroEL и GroES. Гидролиз ATP и переход цис-кольца в состояние GroEL–GroES– ADP позволяет связаться молекуле ЛДГ с противоположным (транс-) кольцом до того как ГАФДОх покинет цис-кольцо. Тем не менее, ГАФДОх не высвобождается из комплекса и, по-видимому, снова связывается с апикальным доменом в цис-кольце. Вследствие этого, развернутая молекула ЛДГ не может быть инкапсулирована и остается связанной с апикальным доменом в транс-кольце. В конечном счете, связывание ATP и GroES в цис кольце приводит к высвобождению ЛДГ из транс-кольца в раствор. Однако, как известно, ЛДГ является тетрамером, состоящим из четырех субъединиц по 35 кДа каждая. Следовательно, данный белок может сворачиваться по так называемому цис-механизму, однако в присутствии ГАФДОх, которая блокирует одно из колец, транс-механизм рефолдинга является единственным объяснением реактивации ЛДГ в подобных условиях. В то же время, как видно из рисунка 5, уровень шаперонин-зависимой реактивации ЛДГ практически не меняется как в отсутствие (рис. 5, кривая 3) так и в присутствии (рис. 5, кривая 4) ГАФДОх. Это означает, что ЛДГ может реактивироваться при помощи двух различных механизмов, в отличие от ГАФД так как для рефолдинга ГАФД необходимо ее инкапсулирование в камеру (рис. 1).

Термоинактивация и реактивация ГАФД в присутствии GroEL. В следующей части данной работы мы обратились к исследованию влияния шаперонинов на процессы термоинативации и термоагрегации, то есть на те процессы, в которых и должны играть первостепенную роль «heat-shock proteins». Влияние шаперонина на термоинактивацию и последующую реактивацию фермента мы исследовали, прежде всего, с целью изучения взаимодействия GroEL с разными формами белка. Кроме того, необходимо было выяснить может ли восстанавливаться активность термоденатурированых форм фермента в присутствии шаперонина, как это происходило в случае ГАФД, развернутой в гуанидингидрохлориде. Как видно из рисунка 6, присутствие GroEL незначительно влияет на процесс термоинактивации ГАФД. После термоденатурации раствор ГАФД, содержавший шаперонин GroEL (рис. 6, кривые 2 и 3), охлаждали до 25 С, после чего добавляли GroES и Mg-ATP. Восстановления активности в данной системе не наблюдалось. При добавлении GroEL, GroES и Mg-ATP к ферменту, инактивированному в отсутствие шаперонина (рис. 6, кривая 1), также не происходило никакой реактивации фермента. Следовательно, термоденатурация ГАФД даже при относительно низких температурах приводит к необратимой инактивации фермента.

Рис. 6. Термоинактивация ГАФД.

1. ГАФД Активность, % 2. ГАФД в присутствии GroEL (1:1) 3. ГАФД в присутствии GroEL (1:0,5) GroES+ 1 Mg2++ATP 0 20 40 60 80 100 Время, мин Исследование взаимодействия ГАФД и ЛДГ с GroEL методом дифференциальной сканирующей калориметрии. На рисунке представлены кривые теплопоглощения ГАФД и шаперонина GroEL, а также результаты экспериментов по совместному прогреванию этих двух белков.

Как видно из рисунка 7, величина Тм для ГАФД без добавления шаперонина 50 ГАФД-GroEL комплекс Мощность, мкВт GroEL ГАФД Рис. 7. Кривые теплопоглощения ГАФД и GroEL.

30 40 50 60 70 Температура, oC составляет 55оС (рис. 7, кривая 1). Свободный GroEL характеризуется величиной Тм 60,6о (рис. 7, кривая 2). В присутствии ГАФД наблюдаются существенные изменения термограммы шаперонина (рис. 7, кривые 2, 3).

Параметры термоденатурации GroEL (энтальпия HCAL, Tм и ширина пика) в отсутствие и в присутствии различных концентраций ГАФД представлены в таблице 1.

Таблица 1. Параметры термоденатурации GroEL в отсутствие и в присутствии разных концентраций ГАФД и ЛДГ.

HCAL Образец TM Ширина пика (кДж/моль) GroEL без добавок 2508 60,6 3, GroEL + ГАФД (1:1) 3613 63,6 2, GroEL + ГАФД (1:2) 3424 63,7 2, GroEL + ГАФД (1:3) 3238 63,7 2, GroEL+ЛДГ (1:4) 3167 64,0 2, Как видно из таблицы 1, похожие эффекты наблюдаются при прогревании шаперонина как в присутствие ГАФД, так и в присутствии ЛДГ. Это говорит о том, что при связывании двух разных термоденатурированных дегидрогеназ происходят сходные процессы при образовании комплекса между денатурированным ферментом и шаперонином. Эти наблюдения показывают, что первый этап взаимодействия денатурированных форм двух дегидрогеназ с шаперонином происходит сходным образом. Вероятно, на этом этапе происходит связывание денатурированных форм с апикальным доменом GroEL (в отсутствие GroES и Mg-ATP). Описанная ранее разная эффективность реактивации двух дегидрогеназ нативным и блокированным GroEL, вероятно, обусловлена особенностями их взаимодействия с шаперонином на более поздних стадиях цикла его функционирования.

Влияние GroEL на термоагрегацию ГАФД. В двух предыдущих разделах было доказано, что термоденатурированная ГАФД прочно связывается с шаперонином GroEL. Изучение роли такого связывания в процессе термоагрегации фермента было нашей следующей задачей. За ходом термоагрегации ГАФД в присутствии шаперонина и без его добавления следили по увеличению мутности раствора при 320 нм, а также по результатом динамического светорассеяния. На рисунке 8 (кривая 1) показана типичная кривая увеличения мутности раствора фермента во времени в ходе инкубации при 45 С. По данным светорассеяния до агрегации размеры белковых частиц тетрамеров ГАФД составляли 12-13 нм, а в ходе агрегации существенно увеличивались до 800-1000 нм. При этом число частиц, соответствующих размеру тетрамера ГАФД, за 13 минут нагревания снижается до нуля, а крупные частицы начинают образовываться уже в первые минуты инкубации. До 10-ой минуты инкубации включительно практически все частицы имеют размер, близкий к размеру отдельной GroEL 0, 0, Рис. 8. Влияние GroEL на A термоагрегацию ГАФД при 45 С.

0, 1. ГАФД 0, 2. ГАФД в присутствии GroEL 3. ГАФД, Через 70 минут 0,000 инкубации был добавлен GroEL 0 50 100 150 Время, мин молекулы тетрамера ГАФД, а затем начинается их быстрая агрегация.

Вероятно, именно этим обусловлен лаг-период на кривой увеличения мутности (рис. 8). Отсутствие изменения мутности раствора при нагревании ГАФД в присутствие GroEL свидетельствует о предотвращении агрегации фермента даже если на одну молекулу шаперонина приходится до двух мономеров ГАФД (рис. 8, кривая 2). Методом динамического светорассеяния при подобной постановке эксперимента не удается обнаружить в растворе крупных частиц (диаметром более 500 нм). В последующих экспериментах мы исследовали способность GroEL разрушать уже образовавшиеся агрегаты.

Таблица 2. Изменение размеров белковых частиц при разрушении агрегатов ГАФД в присутвии шаперонина, определенные по параметрам динамического светорассеяния (шаперонин был добавлен к агрегированной ГАФД после 70 мин ее инкубации при температуре 45 С).

№ Время Z-аverage, 1-ый 2-ой 3-ий Интенсивность нм № инкубации пик, нм пик, нм пик, нм светорассеяния c GroEL1 пиков, % 1-ый 2-ой 3-ий пик пик пик 1 66 979,7 516,8 0 0 100 0 без GroEL 2 8 1094 427,9 0 0 100 0 3 11 1053 381,8 0 0 100 0 4 14 1091 386,2 0 0 100 0 5 18 1151 425 0 0 100 0 6 21 1036 695,8 15,95 0 94,21 5,791 7 25 1066 655 34,6 0 90,12 9,876 8 28 660 689,7 59,67 0 83,89 16,11 9 31 432,1 748,3 94,06 0 75,59 24,41 10 35 574,3 632,1 92,57 0 75,79 24,21 11 38 505,6 697,8 129,5 0 70,86 29,14 12 41 410,6 556 112,7 0 78,83 21,17 13 45 538,9 562,8 114,6 0 81,94 18,06 14 48 508,8 555,9 111,7 5560 88,34 10,45 1, 15 71 696,8 683,2 85,09 0 93,66 6,345 16 116 1020 426,4 0 0 100 0 без GroEL Если в образец № 3 (рис. 8) после 70 минут инкубации при 45 С добавляли GroEL, то происходило понижение поглощения раствора вследствие разрушения уже имеющихся агрегатов при их взаимодействии с шаперонином (рис. 8, кривая 3). Снижение размера частиц происходило уже через 8 мин после добавления шаперонина (таблица 2). Через 20 мин инкубации в системе содержались в основном частицы размером менее 100 нм. Через 70 минут после начала инкубации с шаперонином система стабилизируется, и содержание частиц со средним диаметром 75 нм составляет 100%. Возможно, эти частицы представляют собой комплексы шаперонина с фрагментами агрегатов ГАФД. Таким образом, было показано, что добавление шаперонина к термоагрегированному ферменту вызывает разрушение крупных белковых агрегатов. После добавления Mg-ATP как в пробу, которая содержала исходно шаперонин (рисунок 17, кривая 2), так и в пробу №3 (рисунок 17, кривая 3) после разрушения агрегатов шаперонином без понижения температуры не происходило увеличения мутности раствора. Это говорит о том, что высвобождения фермента из комплекса с шаперонином при 45 С не происходит. Так же при инкубации данного образца в присутствии GroES и Mg-ATP ни восстановления активности фермента, ни изменения мутности раствора также не наблюдается (данные не представлены). Эти результаты еще раз свидетельствуют о том, что в случае ГАФД термоденатурированный белок связывается с шаперонином необратимо.

Взаимодействие пептида -амилоида1-42 с ГАФД и шаперонином GroEL.

Существует много наблюдений об участии глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы в развитии различных нейродегенеративных заболеваний. Хотя механизм вовлечения ГАФД в индукцию этих болезней практически неизвестен, однако уже используются специфические лиганды для ГАФД в качестве лекарственного препарата при лечении болезни Паркинсона. Особенно противоречивы наблюдения о роли ГАФД в развитии болезни Альцгеймера. В следующей части работы мы исследовали взаимодействие пептида -амилоида1-42 с различными формами ГАФД для того, чтобы выяснить, являются ли определенные формы фермента важным элементом при формировании амилоидных структур, или просто сорбируются на уже образованных белковых агрегатах. Второй аспект этой части работы посвящен изучению особенностей взаимодействия пептида -амилоида1-42 с шаперонином GroEL. Мы попытались сравнить его действие на шаперонин с блокирующим влиянием неправильно свернутых форм белков, которые были объектом описанных выше экспериментов.

Изучение взаимодействия ГАФД с пептидом -амилоида1-42 методом поверхностного плазмонного резонанса. Для изучения реакции связывания пептида -амилоида1-42 (-амилоида1-42) и глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы мы использовали метод поверхностного плазмонного резонанса, который при помощи установки Biacore позволяет оценить кинетические параметры взаимодействия макромолекул различной природы в режиме реального времени и без использования каких-либо меток для детектирования макромолекул. На первом этапе исследования на поверхности сенсорного чипа (ячейка FС2) иммобилизовали пептид -амилоида1-42. Ячейка FС1 была подвергнута идентичным процедурам, но раствор для иммобилизации не содержал белка. Затем обе ячейки промывали раствором, содержавшим денатурированную форму ГАФД. Оптический сигнал из ячейки FС1 автоматически вычитался из сигнала FС2. Как видно из кинетической кривой (сенсограммы) (рис. 9) при пропускании денатурированной ГАФД через обе ячейки (контрольную и с иммобилизованным амилоидом) происходит увеличение резонансного сигнала, что свидетельствует о взаимодействии двух белков.

Рис. 9. Взаимодействие промывание буфером HBS-EP денатурированной формы ГАФД с пропускание ГАФД Резонансный сигнал, RU -амилоидом1-42, иммобилизованном на чипе.

0 200 400 600 Время, сек Прочность иммобилизованного комплекса денатурированная ГАФД- амилоид1-42 оценивали, промывая его различными буферными растворами:

100 мМ глицин рН 1,5;

100 мМ глицин, рН 2,0, 150 мМ NaCl;

10 мМ Tris-HCl, pH 11,0 и pH 12,0, 150 мМ NaCl. Уровень сигнала существенно не изменялся, то есть разрушения комплекса не происходило.

Взаимодействие между ГАФД и амилоидным пептидом было также исследовано в другой постановке. Мы использовали чип с пришитыми к нему антителами, выработанными против суммарных антител мыши. Через такой чип пропускали мышиные моноклональные антитела 6С5 к ненативной форме ГАФД. Затем в систему вводили денатурированную форму ГАФД, после чего пропускали раствор -амилоида1-42. При использовании данной схемы мы вновь получили кривую характеризующую, специфическое взаимодействия ненативной ГАФД и -амилоида1-42 (данные не представлены). Данная схема эксперимента позволяет так же проверить наличие взаимодействия нативной формы ГАФД с пептидом -амилоида1-42. Для этого эксперимента вместо антител типа 6С5 мы использовали антитела типа 6С7, которые взаимодействуют с нативной формой ГАФД. При пропускании -амилоида1-42, через ячейку с иммобилизованным на антителах нативным ферментом, наблюдалось незначительное связывание около 1% от сигнала, который наблюдался в случае денатурированной ГАФД (данные не представлены).

Следовательно, только ненативная форма ГАФД взаимодействует с амилоидом1-42. Так же нам представлялось важным выяснить возможность взаимодействия между денатурированной формой ГАФД и агрегированным амилоидом1-42. Для этого мы использовали пептид -амилоида1-42, образовавший агрегаты, которые были видны невооруженным глазом. Как и в вышеописанном эксперименте с денатурированной ГАФД, иммобилизованной на антителах 6С5, мы пропускали агрегированный пептид -амилоида1-42 против денатурированной ГАФД (рис. 10).

Р е з о н а н с н ы й с и гн а л, R U п р о п ус ка н и е п р о м ы в а н и е б уф е р о м H B S -E P а н ти т е л типа 6С Рис. 10.

Взаимодействие агрегированного -амилоида1- с денатурированной формой ГАФД, 100 п р о п ус ка н и е п р о п ус ка н и е а м и л о и д а 1 -4 иммобилизованной ГАФ Д на антителах 6С5.

0 200 400 600 800 1000 Врем я, сек В данном случае при введении агрегированного -амилоида1-42 увеличения резонансного сигнала не происходило, что свидетельствует о невозможности связывания агрегированного -амилоида1-42 и предварительно инактивированной ГАФД.

Влияние пептида -амилоида1-42 на термоагрегацию ГАФД. Влияние амилоида1-42 на термоагрегацию ГАФД изучали с помощью метода динамического светорассеяния. Кинетику образования агрегатов изучали при инкубации ГАФД в присутствии -амилоида1-42 и без него в термостатируемой кювете при при температуре 45оС.

Рис. 11. Влияние пептида -амилоида1- ги д р о д и на м и ч е с ки й р а д и у с, н м на термоагрегацию ГАФД.

700 1. ГАФД 2. ГАФД в присутствии -амилоида1-42, 0 10 20 30 40 50 60 врем я, м ин На рисунке 11 представлены кривые характеризующие изменение гидродинамического радиуса частиц в процессе агрегации ГАФД (кривая 1), а также агрегации фермента при совместной инкубации с -амилоидом при 45оС (кривая 2). при температуре 45оС ГАФД агрегирует медленно с выраженным лаг-периодом. В течение первых 10 минут инкубации практически не образуется крупных агрегатов и почти все белковые частицы представляют собой индивидуальные тетрамеры размером около 10 нм (рис.

11, кривая 1). После добавления амилоида крупные белковые агрегаты появляются практически сразу, а затем размер белковых агрегатов остается более высоким в его присутствии практически в течение всего периода наблюдения. Можно предположить, что амилоид способен «сшивать» друг с другом инактивированные тетрамерные молекулы ГАФД еще до того, как они диссоциируют на мономеры. Именно этим можно объяснить исчезновение лаг-периода на кривой 2 (рис. 11).

Было также проверено влияние -амилоида1-42 на термоагрегацию предварительно полностью развернутых в 4 М гуанидин гидрохлориде молекул фермента. Как видно из рисунка 12, в присутствии -амилоида1- происходит существенное ускорение помутнения раствора, а также увеличение достигаемого уровня мутности в процессе термоагрегации ГАФД (кривая 3) по сравнению с контролем (кривая 1).

Рис. 12. Термоагрегация 0. амилоида1-42 и ГАФД, предварительно 0. денатурированной в 4 М гуанидин гидрохлориде.

0. A 0. 1 –ГАФД 2 – пептид -амилоида1- 0. 3 - ГАФД в присутствии -амилоида1- 0. 0. 0 5 10 15 20 Время, мин На рисунке 13 представлены кривые характеризующие изменение гидродинамического радиуса частиц в процессе агрегации ГАФД, предварительно денатурированной в гуанидин гидрохлориде (рис. 13, кривая 1), а также агрегации фермента при совместной инкубации -амилоида при 45оС (рис. 13, кривая 2). Как видно из приведенных кривых в течение первых десяти минут происходит быстрое увеличение размера частиц, причем в присутствии -амилоида размер частиц выше. Затем увеличение размера замедляется, достигая постоянных значений. Размер белковых частиц также остается более высоким в присутствии -амилоида. Если сравнить эти кривые с данными, приведенными на предыдущем рисунке, то следует обратить внимание на уменьшение мутности раствора после 10 минут инкубации.

Вероятно, это связано с тем, что в этот период происходит увеличение Рис. 13. Термоагрегация амилоида1-42 и ГАФД, предварительно денатурированной в 4 М гуанидин гидродинамический радиус, нм гидрохлориде.

1. ГАФД 2. ГАФД в присутствии амилоида1-42, 0 10 20 30 40 время, мин размера частиц не за счет присоединения к ним новых молекул белка, а за счет агрегации нескольких частиц друг с другом. Уменьшение общего числа частиц и приводит к уменьшению мутности, несмотря на увеличение их размера. Агрегация предварительно денатурированной ГАФД существенно отличается от денатурации исходно нативного фермента, для которого характерен лаг-период. Однако во обоих случаях в присутствии -амилоида увеличивается размер белковых агрегатов. Вероятно, -амилоид участвует в формировании белковых агрегатов в качестве дополнительного компонента, причем, как мы предполагаем, он может стимулировать слипание не только денатурированных субъединиц ГАФД, но и инактивированных тетрамеров фермента. Последнее заключение можно сделать на основании стимуляции амилоидом агрегации ГАФД даже в том случае, когда она еще не распадается на субъединицы.

Из представленных экспериментов видно, что -амилоид1-42 взаимодействует не только с термоденатурированным ферментом, но и с полностью развернутым ферментом, и способен влиять на процесс термоагрегации ГАФД.

Влияние пептида -амилоида1-42 на GroEL-зависимое сворачивание денатурированной формы ГАФД. Как было отмечено выше, второй аспект этой части работы посвящен изучению особенностей взаимодействия пептида -амилоида1-42 с шаперонином GroEL. Мы попытались сравнить его действие на шаперонин с блокирующим влиянием неправильно свернутых форм белков, которые были объектом описанных выше экспериментов. Как видно из рисунка 14, в случае спонтанной реактивации фермента в присутствии амилоида1-42 происходит ее уменьшение (кривые 1, 2). Это наблюдение соответствует приведенным выше данным о взаимодействии -амилоида1-42 с денатурированными формами ГАФД. Из данных представленных на рисунке 14 (кривые 1 и 2) следует, что образование достаточно прочного комплекса денатурированная ГАФД – -амилоид1-42 исключает спонтанную реактивацию фермента. Отсюда возникает предположение, что -амилоид1-42 может подавлять также и GroEL-зависимую реактивацию ГАФД, препятствуя взаимодействию с шаперонином связанных с ним полипептидных цепей фермента. Однако этого не происходит (рис. 14, кривые 3 и 4).

Рис. 14. Спонтанная и GroEL-зависимая А кти в н о сть, е д /м г реактивация ГАФД в присутствии амилоида1-42.

1. спонтанная реактивация ГАФД 2. в присутствии -амилоида1- 3. в присутствии GroEL, GroES, Mg ATP 4. в присутствии -амилоида1-42 GroEL, GroES, Mg-ATP 0 20 40 60 80 1 00 1 В р ем я, м и н Следовательно, в присутствии шаперонина не происходит образования комплекса ГАФД и -амилоида1-42. Наиболее вероятным представляется предположение, что -амилоид1-42, обладающий гидрофобными мотивами, характерными для ненативных белков, может связываться с шаперонином GroEL. Эксперимент, представленный на рисунке 15, подтверждает это предположение.

Взаимодействие пептида -амилоида1-42 с шаперонином GroEL. На рисунке 15 представлена кинетика связывания GroEL с -амилоидом1-42. Как видно из графика, -амилоид1-42 связывается с шаперонином (кривая 2) в соотношении 1,5 моль -амилоида1-42/ 1 моль GroEL. При инкубации амилоида1-42 с контрольной сефарозой связывания не происходит (рис. 15, кривая 1). При исходном соотношении 0,58 мкМ -амилоида1-42 и 0,24 мкМ GroEL, количество амилоида, образовавшего комплекс с шаперонином составляет около 64%.

1. Рис. 15. Взаимодействие -амилоида1 1. 42 с GroEL, иммобилизованным на -Амилоид1-42/ GroEL 1. сефарозе 4B 1. 1. -амилоид1-42 инкубировали в 0. присутствии контрольной сефарозы 0. 2. -амилоид1-42 инкубировали с GroEL, иммобилизованным на сефарозе 0. 0. 0. 0 5 10 15 Время, мин Таким образом, была проверена гипотеза о возможности взаимодействия амилоида1-42 с шаперонином GroEL. Продемонстрировано, что GroEL связывается с -амилоидом1-42, однако не препятствует шаперонин зависимому рефолдингу ГАФД. Возможно, что связывание ГАФД и амилоида1-42 происходит на различных сайтах шаперонина или небольшая молекула -амилоида1-42 не оказывает на его функционирование заметного эффекта.

Заключение Таким образом, нами было показано, что шаперонин GroEL по разному связывается с тремя типами денатурированных форм ГАФД – развернутой в присутствии детергента, развернутой и окисленной по сульфгидрильным группам и термоденатурированной. Только в первом случае (развернутая в присутствии детергента форма ГАФД) может происходить диссоциация полипептидных цепей ГАФД из комплекса с шаперонином после добавления к нему Mg-ATP, а другие формы не выходят из состава комплекса даже в таких условиях. Естественно, что реактивация денатурированных форм в полной системе шаперонина (GroEL, GroES и Mg-ATP) наблюдается только при их получении с помощью детергентов. Термоинактивация ГАФД является необратимой даже в присутствии GroEL, GroES и Mg-ATP.

Блокирование окисленной денатурированной ГАФДox шаперонина в полной системе, в которой наблюдается GroEL-зависимая ренатурация фермента, полностью предотвращает шаперон-зависимую ренатурацию последней. Следовательно, при недостаточности антиоксидантной защиты или при избытке активных форм кислорода в клетке может происходить окисление вновь синтезированных полипептидных цепей белков и образование таких белковых форм, которые не способны свернуться в нативную структуру и поэтому необратимо связываются с шаперонами, делая их недоступными для субстратов. Таким образом, мы полагаем, что исследованная нами модель наиболее близка к ситуации, когда шаперонины участвуют в котрансляционном сворачивании синтезируемых белков в присутствии тех или иных агентов, способных модифицировать вновь синтезируемые полипептиды.

Сделанные нами наблюдения о влиянии шаперонина на термоденатурацию и термоагрегацию ГАФД в сочетании с литературными данными позволяют под новым углом взглянуть на проблему «heat-shock-response». Вероятно, синтез дополнительных количеств шаперонинов нужен для преодоления последствий теплового шока, но не для ренатурарации термоденатурированных белков, а для предотвращения их агрегации.

Невысокая специфичность шаперонинов, связывающихся с разными типами ненативных белков делает их весьма уязвимым компонентом системы, осуществляющей поддержание клеточных белков в нативном состоянии, так как появление любых форм белков, необратимо блокирующих их функционирование, может оказывать разноплановое влияние на жизнедеятельность клетки.

Таким образом, можно предположить, что описанный выше механизм блокирования шаперонов может иметь значение в развитии тех патологий, которые сопровождаются накоплением неправильно свернутых форм белков с их последующей агрегацией (амилоидозы и другие «конформационные болезни»).

Вторая часть экспериментального исследования позволяет сделать следующее заключение. -Амилоид1-42 и денатурированная форма ГАФД образуют комплекс. При этом -амилоид1-42 не взаимодействует с нативным ферментом и не влияет на его термоинактивацию. Также продемонстрировано, что -амилоид1-42 взаимодействует с термоденатурированной ГАФД и с ГАФД, предварительно денатурированной в гуанидин гидрохлориде, увеличивая размеры образующихся белковых агрегатов. Мы предполагаем, что ГАФД участвует в формировании амилоидных включений в клетке. Поскольку при патологическом синтезе пептида -амилоида1-42, последний обогащается элементами -структуры и начинает формировать агрегаты, то на этой стадии, а не только на стадии образования пептида -амилоида1-42 происходит взаимодействие денатурированной ГАФД с образовавшимся амилоидным включением.

Продемонстрировано также, что GroEL связывается с -амилоидом1-42, однако не препятствует шаперонин-зависимому рефолдингу ГАФД. Возможно, что связывание ГАФД и -амилоида1-42 происходит на различных сайтах шаперонина или небольшая молекула -амилоида1-42 не оказывает на его функционирования заметного эффекта. Таким образом, представленные выше данные четко определяют спектр возможных взаимодействий -амилоида1-42, различных форм ГАФД и шаперонина и позволяют сделать новые предположения о роли ГАФД и шаперонов в развитии амилоидозов.

ВЫВОДЫ 1. Показано, что окисленная денатурированная форма глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы необратимо связывается с шаперонином GroEL и полностью блокирует GroEL/GroES-зависимую реактивацию неокисленного денатурированного фермента.

2. Показано, что окисленная денатурированная ГАФД, связанная с GroEL, не препятствует GroEL-зависимому сворачиванию лактатдегидрогеназы, что свидетельствует о различных механизмах шаперонин-зависимого рефолдинга для ГАФД и ЛДГ.

3. Показано, что GroEL не влияет на термоинактивацию глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы, но защищает фермент от термоагрегации, причем добавление GroEL к уже агрегированному ферменту приводит к разрушению образовавшихся агрегатов.

4. С помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии обнаружено, что при взаимодействии с денатурированной глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназой увеличивается термостабильность GroEL.

5. Показано, что пептид -амилоид1-42 взаимодействует как с термоденатурированной ГАФД, увеличивая размеры образующихся белковых агрегатов, так и с ГАФД, денатурированной в гуанидингидрохлориде, блокируя ее спонтанную реактивацию. При этом -амилоид1-42 не взаимодействует с нативным ферментом и не инактивирует его.

6. Показано, что пептид -амилоида1-42 связывается с иммобилизованным на сефарозе шаперонином GroEL.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Налетова И.Н., Муронец В.И. (2003) Специфичность действия бактериального шаперонина GroEL в процессе сворачивания белков различного происхождения. X Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2003», Секция Биология, Подсекция Биохимия, Россия, Москва, апрель 15-18, стр. 37.

2. Naletova I.N., Pleten' A.P., Muronetz V.I. (2003) The influence of bacterial chaperonin GroEL on the folding of homologous olygomeric proteins.

Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Ukraine, Kyiv, September 25-27, р. 108.

3. Налетова И.Н., Шмальгаузен Е.В. (2004) Влияние бактериального шаперонина GroEL на термоинактивацию и тепловую агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. XI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004», Секция Биология, Подсекция Биохимия, Россия, Москва, апрель 12-15, стр.

116-117.

4. V. I. Muronetz, A. P. Pleten’, I. N. Naletova, E. V. Schmalhausen. (2004) Changes in the structure and the thermodynamic parameters of the chaperonin GroEL on its interaction with non-native protein forms. International Conference "Chemistry, structure and function of biomolecules". Byelorussia, Minsk, June 28-30, p. 81.

5. Naletova I. N., Schmalhausen E. V., Muronetz V. I. (2005) Increase in the efficiency of reactivation of enzymes in the presence of the additional cochaperonin of GroEl, new peroxyredoxine X. Third Moscow international congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development". Russia, Moscow, March 14-18, p. 203.

6. Irina N. Naletova, Irina N. Shalova, Luciano Saso, Elena V. Schmalhausen, Vladimir I. Muronetz. (2005) The role of oxidation of glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase in the induction of apoptosis and in the formation of amyloid structures. Юбилейная конференция посвященная 70-летию основоположника российской школы биоэнергетики академика В.П.

Скулачева. «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» Москва, МГУ, февраль 21-23.

7. Налетова И.Н., Шмальгаузен Е.В. (2005) Влияние шаперонина GroEL на тепловую агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и на формирование амилоидных структур. XII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», Секция Биология, Подсекция Биохимия, Россия, Москва, апрель 12-15, стр.

156-157.

8. Irina N. Naletova, Regina A. Asryants, Vladimir I. Muronetz (2005) The role of oxidation of glyceraldehydes-3-phospate dehydrogenase in the induction of apoptosis. EMBO – FEBS WORKHOP on Biology of Molecular Chaperones.

Heat Shock Proteins in Molecular Medicine Misfolding Disease and Cancer, Poland, Zakopane, 28 May – 2 June, p. 109.

9. Muronetz V.I., Polyakova O.V., Naletova I.N., Shalova I.N., Asryants R.A., Pleten' A.P., Saso L., Izumrudov V.A., Schmalhausen E.V. (2005) Mechanisms of protein denaturation and design of new inhibitors of protein aggregation for the treatment of condensation diseases. International Conference Biocatalysis – 2005: Fundamentals and Application. Dedicated to 250th Anniversary of Moscow State University. St. Peterburg – Kizhiy – Valaam, Russian Federation, June 19 – 23, p. 58.

10. Vladimir I. Muronetz, Elena V. Schmalhausen, Oxana V. Poliakova, Irina N.

Naletova, Irina N. Shalova, Luciano Saso. (2005) Amyloidoses and oxidative stress. International alumni seminar on "Biotechnology and health", Armenia, Erevan, October 18-21, p. 131-132.

11. Naletova I.N., Schmalhausen E.V, Saso L., Pleten' A.P., Muronetz V.I (2006) GAPDH as a promising target for a drug screening against neurodegenerative diseases. Moscow international conference "Biotechnology and medicine". Russia, Moscow, March 14-17, p. 195-195.

12. Naletova I.N., Muronetz V.I., Schmalhausen E.V. (2006) Unfolded, oxidized, and thermoinactivated forms of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interact with the chaperonin GroEL in different ways. Biochim.

Biophys. Acta. 1764:831-838.

13. K.A. Markossian, B.I. Kurganov, D.I. Levitsky, H.A. Khanova, N.A.

Chebotareva, A.M. Samoilov, T.B. Eronina, N.V. Fedurkina, L.G. Mitskevich, A.V. Merem’yanin, S.Yu. Kleymenov, V.F. Makeeva, V.I. Muronetz, I.N.

Naletova, I.N. Shalova, R.A. Asryants, E.V. Shmalhausen, L. Saso, Yu.V.

Panyukov, E.N. Dobrov, I.K. Yudin, A.C. Timofeeva, K.O. Muranov and M.A.

Ostrovsky. (2006) Mechanism of the chaperone-like activity. Protein Folding:

New Research. Nova Science Publishers, Inc., New York, USA, 91-174.