Изучение биодоступности и влияния органических форм селена и цинка на состояние слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс
На правах рукописи
ПЕНЕВА ВЕРА ВИТАЛЬЕВНА ИЗУЧЕНИЕ БИОДОСТУПНОСТИ И ВЛИЯНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ФОРМ СЕЛЕНА И ЦИНКА НА СОСТОЯНИЕ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОНКОЙ КИШКИ РАСТУЩИХ КРЫС 03.01.04. - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно исследовательский институт питания" Российской академии медицинских наук
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Мазо Владимир Кимович
Официальные оппоненты: Соколов Николай Николаевич, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук, заведующий лабораторией медицинской биотехнологии Плетень Анатолий Петрович, доктор биологических наук, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, старший преподаватель кафедры биохимии
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Защита состоится «20» мая 2013 г. в 14-00 на заседании Диссертационного Совета Д 001.002.01 в ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу: 119240, Москва, Устьинский проезд 2/
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ питания» РАМН
Автореферат разослан «_» _ 2013 г.
Учёный секретарь Диссертационного Совета, Коденцова В.М.
доктор биологических наук, профессор 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность проблемы Важнейшим в теоретическом и практическом отношении в концепции оптимального (здорового) питания является положение о необходимости адекватного снабжения организма макро- и микронутриентами, в том числе эссенциальными микроэлементами [Тутельян В.А., 2005;
Погожева А.В., 2010]. Глобальная проблема недостаточной микронутриентной обеспеченности населения различных регионов определяет необходимость научного обоснования, разработки и комплексной медико биологической оценки безопасности и эффективности использования в питании новых пищевых источников эссенциальных микроэлементов, получаемых с помощью инновационных биотехнологических подходов. С общебиологических позиций, учитывающих эволюционный фактор, очевидна целесообразность использования в питании человека органических форм микроэлементов [Мазо В.К. и др., 2009;
Serfass R.E., 2003]. Пищевые источники этих микроэлементов, жизненно необходимых организму человека, должны отвечать требованиям безопасного использования в питании и высокой эффективности для восполнения микроэлементной недостаточности. Это положение относится, в частности, к цинку и селену эссенциальным микроэлементам, обладающим выраженным антиоксидантным и иммуномодулирующим действием и широко используемым в составе специализированных пищевых продуктов и биологически активных добавках (БАД) [Коденцова В.М. и др., 2011;
Багрянцева О.В. и др., 2012;
Patrick L., 2004;
Prasad AS., 2008]. Специалистами разработано и осуществлено биотехнологическое получение новых пищевых органических форм селена и цинка, проведена в эксперименте оценка их острой токсичности [Зорин С.Н. и др., 2007;
Vegarud G.E., 2000;
Vanden Berghe D.A., 2002;
Costa J.A.V., 2004]. Однако крайне недостаточно исследовано влияние этих пищевых источников селена и цинка на состояние барьера желудочно кишечного тракта (ЖКТ), обеспечивающего защиту внутренней среды организма от потенциально возможного избыточного проникновения чужеродных антигенов, токсинов микрофлоры, вирусов и микроорганизмов [Ногаллер А. М. и др., 2008;
Finamore A, 2008;
Tran CD, 2009;
Zhong W, 2010]. Барьерная функция ЖКТ, как известно, реализуется за счет совокупного действия составляющих её компонентов:
пищеварительно-транспортного конвейера (желудочно-кишечной моторики, секреции пищеварительных соков, полостного и пристеночного пищеварения), активности ассоциированной с кишечником лимфоидной ткани и, самым существенным образом, эпителиального слоя слизистых оболочек [Daniel R Clayburgh, 2004]. Повышенное поступление белковых макромолекул во внутреннюю среду организма свидетельствует о нарушенной целостности барьера ЖКТ, в первую очередь, эпителия тонкой кишки как зоны преимущественного всасывания нутриентов.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «НИИ питания» РАМН по темам №069 «Экспериментально-клиническая оценка биодоступности новых источников органических соединений некоторых эссенциальных микроэлементов (цинк, селен, йод, медь, марганец)» и №080 «Разработка системы лабораторных тестов для выявления дифференциальной диагностики пищевой аллергии».
Цель работы - экспериментальная оценка биодоступности органических форм селена и цинка и их влияния на состояние слизистой оболочки тонкой кишки лабораторных животных (крыс).
1.2. Основные задачи исследования 1. Провести сравнительную физиолого-биохимическую оценку биодоступности органической (ферментолизат селенсодержащих пищевых дрожжей) и неорганической (селенит натрия) форм селена в эксперименте на растущих крысах самцах линии Вистар.
2. Количественно охарактеризовать всасывание модельного белкового антигена – куриного овальбумина в ЖКТ растущих крыс-самцов линии Вистар, получавших рацион с адекватным и десятикратно повышенным содержанием селена в составе ферментолизата селенсодержащих пищевых дрожжей.
3. Охарактеризовать состояние слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс-самцов линии Вистар в условиях различной обеспеченности селеном с использованием морфологических методов исследования.
4. Оценить сенсибилизирующее действие ферментолизата селенсодержащих пищевых дрожжей с использованием модели системной анафилаксии у взрослых крыс-самцов линии Вистар.
5. Оценить биодоступность комплекса цинка с ферментолизатом белка мяса мидий в эксперименте на растущих крысах-самцах линии Вистар.
6. Количественно охарактеризовать всасывание модельного белкового антигена – куриного овальбумина в ЖКТ растущих крыс-самцов линии Вистар в условиях различной обеспеченности животных цинком.
1.3. Научная новизна Впервые установлено, что проницаемость барьера ЖКТ лабораторных животных (растущих крыс) относительно модельного антигена - овальбумина не нарушается (не возрастает) при десятикратном превышении в корме адекватного содержания селена в органической форме - ферментолизате селенсодержащих пищевых дрожжей.
С использованием морфологических методов исследования показано, что как адекватное, так и десятикратно повышенное поступление с рационом селена в органической форме (ферментолизат селенсодержащих пищевых дрожжей) препятствует развитию неблагоприятных изменений в слизистой оболочке тонкой кишки, отмечаемых у крыс, потреблявших селендефицитный рацион.
Показано, что обогащение общевиварного рациона крыс ферментолизатом селенсодержащих пищевых дрожжей (дополнительно 5 мкг селена на крысу в сутки) не приводит к усилению тяжести реакции системной анафилаксии и степени сенсибилизации.
Впервые установлено, что потребление крысами цинка в форме комплекса с ферментолизатом мяса мидий снижает у этих животных проницаемость защитного барьера ЖКТ, характеризуемую всасыванием модельного антигена - овальбумина.
1.4. Практическая значимость работы Установленная экспериментально в опытах in vivo высокая биодоступность и безопасность органических форм селена и цинка определяют перспективность их дальнейшей клинической апробации для использования в широком спектре продуктов оздоровительного действия, в том числе БАД к пище и специализированных пищевых продуктов, предназначенных для восполнения микроэлементной недостаточности. Экспериментально доказанное для ферментолизата селенсодержащих пищевых дрожжей отсутствие неблагоприятного воздействия на состояние защитного барьера ЖКТ, а также сенсибилизацию и тяжесть анафилактических проявлений у лабораторных животных является дополнительным обоснованием безопасности его использования в составе БАД к пище и специализированных пищевых продуктов. Предложена комплексная экспериментальная оценка эффективности и безопасности использования в питании органических форм пищевых источников селена, включающая не только характеристику биодоступности, восполнения микроэлементной недостаточности, но и влияния на состояние защитного барьера ЖКТ и на анафилактическую чувствительность, которая может быть использована для аналогичной комплексной оценки новых пищевых источников других эссенциальных микроэлементов.
1.5. Внедрение результатов в практику Материалы диссертации использованы в специализированном курсе лекций «Биохимия эссенциальных микроэлементов» ФГБУ «НИИ питания» РАМН.
1.6. Апробация работы Материалы диссертационной работы были доложены на X Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 1-3 декабря 2008 г., на III съезде общероссийского союза общественных объединений «Российское общество медицинской элементологии», Москва, 11-13 мая 2012 г.
1.7. Публикации По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемом научном журнале, рекомендованном Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ, и 1 публикация в сборнике Материалов X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье».
1.8. Личный вклад соискателя Все изложенные в диссертации результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.
1.9. Объём и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов. Указатель литературы содержит 71 российский и 124 зарубежных источника. Объем работы составляет 121 страницу машинописного текста, содержит 5 рисунков, 2 фотографии, 1 схему и 17 таблиц.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Химические реактивы и оборудование В работе использованы химические реактивы квалификации ОСЧ, ХЧ или ЧДА, а также коммерческие специализированные наборы для биохимических и иммунологических исследований. При проведении исследований использовано отечественное и импортное оборудование: спектрофотометр однолучевой СФ- («ЛОМО», СССР);
анализатор иммуноферментный колориметрический «Эфос 9305» (Московский завод «Сапфир», Россия);
спектрофотометр атомно-абсорбционный («Hitachi 180-80», Япония) с Зеемановской поляризацией;
печь муфельная ПЛ-5 (ООО «Накал», Россия);
деионизатор воды «Водолей» (НПП «Химпромэлектроника», Россия), ультрафильтрационная установка «МИНИТАН» («Миллипор, США) с набором мембран от 100 до 10 кД, нанофильтрационная установка («Владисарт», Россия), измельчитель тканей лабораторный («Waring commercial blender 800S», США, 22000 об/мин), санный микротом («Рейхерт», Австрия).
2.2. Лабораторные животные Опыты in vivo проведены на лабораторных крысах-самцах линии Вистар, полученных из питомника «Столбовая», с исходной массой тела от 80 до 200 г. Всего в работе проведено 4 эксперимента, использовано 138 крыс. До начала экспериментов животные находились на стандартном общевиварном рационе (ОВР), используемом в ФГБУ «НИИ питания» РАМН. В зависимости от схемы проведения конкретного эксперимента животные получали сбалансированный ОВР ФГБУ «НИИ питания» РАМН, специально приготовленные селенобогащенный и цинкобогащенный рационы, а также коммерческий селендефицитный («Low Selenium Diet, Rat Modified», MP Biomedicals LLC, Франция, содержание селена 0,02 мг/кг) и цинкдефицитный («Zinc Deficient Diet, Egg White Base», MP Biomedicals LLC, Франция, содержание цинка 1,3 мг/кг) рационы.
2.3. Пищевые источники органических форм селена и цинка В качестве источника селена в органической форме использовали водорастворимую фракцию ферментолизата селенсодержащей биомассы пекарских дрожжей (ФСПД) «Se-Витасил» (ООО «Эней-ВИТА», Россия).
Ферментолизат мяса мидий (ФММ) и его комплекс с цинком (Zn-ФММ), полученные по методике [Зорин С.Н. и др., 2008] с использованием сырого мороженого мяса зеленой мидии Mytilus Perna viridus, предоставлены старшим научным сотрудником ФГБУ «НИИ питания» РАМН, к.б.н. Зориным С.Н.
2.4. Физико-химические методы исследования. Элементный анализ Содержание цинка в исследуемых кормах определяли с использованием метода атомно-абсорбционной спектрофотометрии [Скурихин И.М. и Тутельян В.А., 1998] совместно со старшим научным сотрудником ФГБУ «НИИ питания» РАМН, к.б.н.
Шевяковой Л.В.
Содержание селена в исследуемых материалах определяли микрофлуориметрическим методом с реактивом 2,3-диаминонафталином [Голубкина Н.А., 1995]. В качестве стандартов использованы раствор селенита натрия, навеска аттестованного стандарта селенсодержащих дрожжей с содержанием селена 450 мкг/г и стандарт сыворотки крови с известным содержанием селена.
2.5. Биохимические методы исследования in vitro Общую активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови крыс определяли с помощью набора производства фирмы «Ольвекс» (Россия) унифицированным методом «по конечной точке».
В крови определяли активность глутатионпероксидазы (ГПО) по методике [Мальцев Г.Ю., Тышко Н.В., 2002]. Исследование проведено с использованием гемолизатов эритроцитов, полученных из гепаризированной крови. Исходные гемолизаты готовили разведением осажденной при 1500 g в течение 10 мин эритроцитарной массы дистиллированной водой в соотношении 1:1 с последующим однократным перезамораживанием гемолизата при температуре минус 15 - 18°С.
Суммарная антиоксидантная активность (АОА) сыворотки крови (в относительных единицах) определена по методу [Ивахненко В.И. и др., 2007], совместно с врачом ФГБУ «НИИ питания» РАМН, к.б.н. Ивахненко В.И. Метод основан на оценке способности сыворотки крови к подавлению Fe2+-зависимого перекисного окисления липидов в желточных липопротеинах in vitro.
Концентрацию в сыворотке крови специфических IgG антител (суммы фракций IgG1 и IgG4) к белку куриного яйца - овальбумину (ОВА) и концентрацию ОВА [Голубкина Н.А., Гмошинский И.В. и др., 1998] определяли с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста (стандартного ELISA) на полистироле согласно [Stuart C.A., Twistelton R., 1984] с незначительными модификациями.
Иммуноферментные определения проведены совместно с ведущим научным сотрудником ФГБУ «НИИ питания» РАМН, доктором биологических наук Гмошинским И.В.
2.6. Морфометрические методы По окончании эксперимента животных подвергали патологоанатомическому вскрытию и брали кусочки дистального отдела тонкой кишки для гистологического исследования. Гистологический материал фиксировали в жидкости Карнуа и заливали в парафин, окрашивали гематоксилин-эозином, а также Шифф-реактивом по методу Шабадаша и муцикармином для выявления секрета (муцина) бокаловидных клеток.
При изучении полученных препаратов использовали морфометрические методы:
измеряли высоту ворсинок и глубину крипт, высоту эпителиального слоя на срезах ворсинок, в слое эпителия проводили подсчет эпителиальных и бокаловидных клеток, количество лимфоцитов и митотически делящихся клеток.
Морфологические исследования проведены совместно с научным сотрудником ФГБУ «НИИ питания» РАМН, к.б.н. Гаджиевой З.М.
2.7. Экспериментальные методы исследования in vivo 2.7.1. Оценка всасывания органической и неорганической форм селена, их влияния на ростовые показатели и селеновый статус лабораторных животных проведена в эксперименте №1 на 39 растущих крысах-самцах линии Вистар с начальной массой 92±2 г. Животные были разделены на 4 группы. Первая группа животных получала селендефицитный рацион. Животные второй группы получали тот же селендефицитный рацион, но с добавлением водного раствора селенита натрия до конечного содержания селена в диете 0,22 мг/кг. Селендефицитный рацион животных третьей и четвертой групп обогащался селеном в органической форме (ФСПД) до конечной концентрации селена 0,22 мг/кг и 2,02 мг/кг корма, соответственно. Продолжительность эксперимента составила 28 дней. Каждую неделю животных всех групп взвешивали. После выведения из эксперимента у животных всех групп отбирали кровь и внутренние органы (печень, почки, селезенку, семенники). В крови определяли активность ГПО, АОА. Все органы взвешивали, а содержание селена определяли в сыворотке крови и печени.
2.7.2. Для сравнительной оценки влияния неорганической и органической формы селена на всасывание ОВА в ЖКТ растущих крыс в последний день эксперимента №1 тестировали всасывание в кровь модельного пищевого антигена ОВА у животных трех групп: второй, третьей и четвертой. Содержание ОВА в сыворотке крови крыс определено (через 3 ч после его внутрижелудочного введения в дозе 2,0 г/кг массы животного) с использованием иммуноферментного метода определения.
2.7.3. Морфологическое (морфометрическое и гистологическое) исследование влияния селена на состояние слизистой оболочки тонкой кишки крыс проведено в эксперименте №2, продолжавшемся 28 суток. Эксперимент проводили на 24 крысах самцах линии Вистар с начальной массой 92±2 г. Животных разделили на 4 группы по 6 животных в каждой. Животные первой (контрольной) группы в течение всего эксперимента получали ОВР. Остальные три группы получали селендефицитный корм. Корм животных групп №3 и №4 обогащали селеном в органической форме (ФСПД) до конечной концентрации селена 0,22 мг/кг корма (адекватно обогащенный) и 2,02 мг/кг корма (десятикратно обогащенный). При выведении животных из эксперимента у них отбирали кусочки дистального отдела тонкой кишки для гистологического исследования.
2.7.4. Экспериментальная оценка влияния ФСПД на сенсибилизацию и протекание реакции анафилаксии проведена в эксперименте №3 на взрослых крысах самцах линии Вистар с исходной средней массой тела 170±10 г. После недели адаптации крысы первой (опытной) группы (25 животных) получали в течение дней ad libitum ОВР с добавлением органического источника селена (ФСПД), крысы второй (контрольной) группы (26 животных) получали только ОВР также ad libitum.
Расчетное количество ФСПД составило 4 мг на одну крысу в день, что соответствовало дополнительному количеству 5 мкг селена на одно животное в день.
Модель системной анафилаксии воспроизводили согласно [Stokes C.R., Miller B.G., 1987] с незначительными модификациями [Мазо В.К. и др., 2004]. По окончании эксперимента у животных опытной и контрольной групп отбирали кровь из хвостовой вены для определения ответа антител к ОВА, вводили внутривенно разрешающую дозу ОВА и наблюдали развитие симптомов активного анафилактического шока. Степень сенсибилизации животных оценивали, определяя концентрацию в сыворотке крови специфических IgG антител к ОВА.
2.7.5. Оценка влияния обеспеченности цинком на ростовые показатели и активность ЩФ проведена в эксперименте №4 с использованием 8 растущих крыс самцов линии Вистар с исходной средней массой тела 118±8 г (группа №1) и растущих крыс-самцов линии Вистар с исходной средней массой тела 138±3 г (группы №2 и №3). На протяжении всего эксперимента, продолжавшегося в течение трёх недель, животные первой (контрольной) группы получали ОВР, адекватно обеспечивающий животных макро- и микронутриентами, животные второй группы получали полусинтетический цинкдефицитный корм, животные третьей группы получали полусинтетический цинкдефицитный корм, обогащенный цинком в составе Zn-ФММ (содержание цинка составило 13 мг/кг корма). На протяжении всего эксперимента через каждые двое суток животных всех групп взвешивали. По окончании эксперимента у животных отбирали кровь и внутренние органы (печень, почки, селезенку, семенники). В сыворотке крови определяли активность щелочной фосфатазы, внутренние органы взвешивали.
2.7.6. В рамках эксперимента №4 (раздел 2.7.5) также проводили оценку влияния органической формы цинка на всасывание ОВА в ЖКТ растущих крыс второй (получающих цинкдефицитный корм) и третьей групп (получающих корм, обогащенный цинком в форме комплекса с ФММ). Барьерная функция ЖКТ этих животных охарактеризована путем определения содержания в крови внутрижелудочно введенного модельного белкового антигена - ОВА.
2.8. Статистическая обработка результатов исследований Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакетов программ MS Excel ХР и SPSS 11.5 для Windows.
Математическая обработка данных эксперимента включала расчет средних значений со стандартными ошибками и представленных как M±m. Достоверность различий значений средних уровней исследуемых показателей определяли с использованием двухстороннего t-теста Стьюдента. Различия принимали за достоверные при вероятности принятия нуль-гипотезы (уровне значимости) р0,05. Дополнительно проверяли гипотезу о различии распределений рассматриваемых показателей с помощью непараметрического рангового критерия Манна-Уитни. Различия признавались за достоверные на уровне значимости р0,05.
3. Результаты и их обсуждение 3.1. Сравнительная оценка биодоступности органической и неорганической форм селена в эксперименте на растущих крысах-самцах линии Вистар Данные об относительном приросте массы тела растущих крыс, потреблявших селенодефицитный рацион или рационы с добавлением селенита натрия или ФСПД (раздел 2.7.1, эксперимент №1), приведены в таблице 3.1.1.
Таблица 3.1. Относительный прирост массы тела животных (% к исходной массе) Количес № Содержание 8 сутки 15 сутки 22 сутки 28 сутки тво крыс селена в групп в группе рационе 1 Селен- 10 9,6 ±2,7 37,6 ±4,8 67,5 ±6,1 89,8 ±5, дефицитный 0,02 мг/кг 2 Селенит 9 13,7 ±4,3 38,9 ±5,4 71,9 ±6,2 86,2 ±6, натрия 0,22 мг/кг 3 ФСПД, 10 18,1±2,9* 43,4 ±3,5 73,5 ±3,9 91,8 ±4, 0,22 мг/кг 4 ФСПД, 10 19,7±5,1* 43,9 ±7,9 75,5±11,4 95,4 ±11, 2,02 мг/кг Примечание: * различие с группой №1 достоверно, р0,05;
непараметрический критерий Мана-Уитни За первую неделю нахождения на селендефицитном рационе животные (группа №1) статистически значимо отстали по относительному приросту массы тела в сравнении с животными, получавшими корм, обогащенный органической формой селена (группы №3, №4). Однако в дальнейшем для больших сроков наблюдения это различие было недостоверным, что может свидетельствовать об определенной адаптации животных к недостаточной селеновой обеспеченности в условиях данного эксперимента.
Относительные массы тимуса, почек, печени, селезёнки, сердца достоверно не различались у животных всех групп.
Уровень селена в сыворотке крови и печени животных статистически достоверно нарастал с увеличением его содержания в корме (таблица 3.1.2). При этом достоверно выше концентрация селена была (как в сыворотке крови, так и печени) у животных, потреблявших ФСПД по сравнению с животными, потреблявшими такое же количество селена в виде селенита натрия. Для этих же групп животных средние значения активности ГПО в крови были практически одинаковыми. По-видимому, большее всасывание органической формы селена вело к депонированию этого микроэлемента в отличие от селенита натрия, используемого организмом животных в основном для синтеза селенспецифических протеинов [Schrauzer G.N., 2001].
Полученные значения были минимальными при потреблении крысами селендефицитного корма (группа №1) и статистически достоверное повышение (р0,05, критерий Мана-Уитни) активности ГПО было установлено лишь у животных, получавших корм, содержание селена в котором составляло 2,02 мг/кг (группа №4).
Таблица 3.1. Содержание селена в сыворотке крови, печени, активность ГПО и АОА крови крыс № Содержание АОА, Селен в Селен в ГПО, групп селена в отн. Ед. сыворотке, печени, мкмоль/мин/мг рационе нг/мл нг/г (на белок) 1 Селен- 1,13 ± 0,07 31,0±2,2* 110,4±6,6* 1,06±0,22° дефицитный, 0,02 мг/кг 2 Селенит натрия 1,30 ± 0,12 150,1±5,3* 561,6±13,7* 1,61±0, 0,22 мг/кг 3 ФСПД, 1,36±0,09° 169,7±4,5* 662,8±17,7* 1,53±0, 0,22 мг/кг 4 ФСПД, 1,19 ± 0,06 303,2±12,4* 2274,0±108,1* 2,71± 0, 2,02 мг/кг Примечание: * различие между всеми группами достоверно (р0,05);
° различие с группами 1 и 4 достоверно (р0,05);
непараметрический критерий Мана-Уитни По сравнению с группой №3 достоверно (р0,05) наименьшее значение АОА было определено в крови животных групп №1 и №4, получавших селендефицитный корм и корм с аномально высоким содержанием селена, соответственно. Таким образом, и низкая, и избыточная селеновая обеспеченность животных приводили к достоверному снижению общей АОА крови.
3.2. Количественная характеристика всасывания макромолекулярного зонда куриного овальбумина в желудочно-кишечном тракте растущих крыс в условиях различной обеспеченности селеном В таблице 3.2.1 представлены результаты определения всасывания в кровь макромолекулярного зонда - ОВА из ЖКТ растущих крыс, получавших селенит натрия и ФСПД (раздел 2.7.2, эксперимент№1).
Таблица 3.2. Содержание ОВА в сыворотке крови экспериментальных животных (через 3 ч после внутрижелудочного введения ОВА) № Содержание селена в Количество Куриный ОВА, нг/мл групп рационе крыс в группе 2 Селенит натрия, 0,22 мг/кг 9 59,4 ± 30, 3 ФСПД, 0,22 мг/кг 10 18,0 ± 5, 4 ФСПД, 2,02 мг/кг 10 15,7 ± 2, Во всех случаях различия между группами недостоверны, р0,05, критерий Мана-Уитни Хотя увеличение проницаемости барьера ЖКТ для ОВА у растущих крыс, получавших селенит натрия, не было достоверным по сравнению с животными, получавшими ФСПД, однако, обращает на себя внимание тот факт, что у двух крыс из этой группы наблюдалась аномально высокое всасывание ОВА в сыворотке крови:
162 нг/мл и 267 нг/мл. У этих же животных оказалась самой большой и относительная масса селезенки (0,9% и 1,0% от массы тела). Использование органической формы селена в этой же дозировке не приводило к аномально высоким значениям всасывания ОВА ни у одного из животных. В условиях опыта не выявлено сколько нибудь существенного различия всасывания ОВА у крыс групп №3 и №4. Таким образом, даже десятикратное увеличение содержания органической формы селена в корме по сравнению с физиологической дозировкой, приводящее к его депонированию печенью, не вызывает при этом нарушения проницаемости барьера ЖКТ для макромолекул ОВА, характеризуемой всасыванием этого белка в кровь.
3.3. Морфологическая характеристика состояния слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс в условиях различной обеспеченности селеном В эксперименте №2 (раздел 2.7.3) с использованием метода морфометрии количественно и качественно охарактеризовано состояние структуры слизистой оболочки дистального отдела тонкой кишки растущих крыс линии Вистар. ОВР был принят в качестве некоего «физиологического эталона», в сравнении с которым использование полусинтетического рациона менее благоприятно влияет на состояние эпителия тонкой кишки. Действительно, такой показатель, как высота эпителия в криптах достоверно отличался от контрольного значения у всех трех групп животных, получавших полусинтетические рационы. Также у животных трёх опытных групп в эпителии ворсинок по сравнению с контролем было достоверно увеличено количество лимфоцитов, что может указывать на усиление функций местной защиты слизистой оболочки. Не выявлено достоверных различий в количественных показателях состояния эпителиального пласта для животных, адекватно обеспеченных органической формой селена, и животных, получавших десятикратно избыточную дозу этого микроэлемента также в органической форме.
Наиболее выражены неблагоприятные изменения в слизистой оболочке тонкой кишки крыс, получавших селендефицитный полусинтетический рацион (таблица 3.3.1). У животных этой группы уменьшена высота клеток эпителия на ворсинках и криптах, снижено количество муцинпродуцирующих клеток и клеток эпителия на продольном срезе ворсинок.
У животных получавших корм с добавлением адекватной их потребностям дозировки органической формы селена - ФСПД (0,22 мг/кг корма), изменения в структуре слизистой оболочки были менее выражены, чем у крыс, получавших селендефицитный корм.
У крыс, получавших с кормом десятикратно увеличенное количество селена в составе ФСПД (2,02 мг/кг корма), по ряду морфометрических показателей слизистая оболочка кишки была близка к таковой у животных, получавших ОВР: высота ворсинок, глубина крипт, высота клеток эпителия на ворсинках, количество клеток эпителия на продольном срезе ворсинок и крипт не различались достоверно (р0,05).
Таблица 3.3. Морфометрические показатели состояния слизистой оболочки кишки крыс с различной обеспеченностью селеном (условные единицы) Содержание селена в рационе/группа 0,02 мг/кг 0,22 мг/кг 2,02 мг/кг Морфо- Селен органический органический метрические ОВР, дефицитный, селен, селен, показатели группа №1 группа №2 группа №3 группа № Высота ворсинок 30,8±1,88 28,9±1,43 31,6±1,07 29,26±1, Глубина крипт 30,0±0,79 26,9±1,34 28,2±1,22 27,9±1, Высота клеток эпителия на ворсинках 5,16±0,27 4,1±0,18* 4,5±0,26* 4,67±0,18** Высота клеток эпителия в криптах 4,48±0,34 3,7±0,15* 3,6±0,35* 3,6±0,21* Количество клеток эпителия на продоль ном срезе ворсин 109,6±2,58 101,8±1,84* 109,0±2,42 109,1±2,59** Количество клеток эпителия на продоль ном срезе крипт 83,3±3,03 75,5±2,64 79,0±2,81 78,3±2, Количество бокаловидных клеток в эпителии ворсинок 17,96±0,62 14,58±0,68* 15,9±0,69* 14,7±0,61* Количество бокаловидных клеток в эпителии крипт 21,7±1,01 18,07±0,55* 20,9±1,88 18,8±0,56* Примечание: между группами №3 и №4 достоверных различий не выявлено (р0,05) * различие с группой №1 достоверно (р0,05);
** различия с группой №2 достоверны (р0,05) согласно t-критерия Стъюдента Таким образом, гистологическая оценка влияния обеспеченности селеном показала, что наиболее выражены были неблагоприятные изменения в слизистой оболочке кишечника крыс, получавших селендефицитный корм, а наименее - у животных, получавших корм, максимально обогащенный органической формой селена (2,02 мг/кг корма).
3.4. Влияние органической формы селена на сенсибилизацию и тяжесть проявлений анафилактического шока у взрослых крыс При использовании такой органической формы селена как ФСПД нельзя исключать априори проявления им сенсибилизирующих свойств [Зорин С.Н., Гмошинский И.В., 2006;
Гмошинский И.В., Зорин С.Н., 2007]. Вопрос о возможности проявления у пищевого источника селена иммуномодулирующих свойств, влияющих на чувствительность организма к другим антигенам (аллергенам), был изучен в эксперименте №3 с использованием модели пищевой анафилаксии у лабораторных животных (раздел 2.7.4). В таблице 3.4.1 представлены результаты определения тяжести реакции анафилаксии (анафилактический индекс, летальность) и данные по определению уровня антител к ОВА, (характеризующего степень сенсибилизации) для группы животных, получавших вместе с ОВР добавку ФСПД, в сравнении с животными, получавшими только ОВР.
Таблица 3.4. Результаты оценки тяжести активного анафилактического шока у крыс с различной обеспеченностью селеном и уровня специфических IgG антител к ОВА в сыворотке крови этих животных № группы Содержание селена в Уровень Анафилактический Летальность, % рационе антител, мг/мл Индекс 1 ОВР+ФСПД 1,36 8, 1,3±0, 2 Контроль (ОВР) 1,88 19, 1,9±0, во всех случаях различия между группами недостоверны, р0,05, критерий Мана-Уитни Полученные результаты свидетельствуют, что введение в рацион крыс ФСПД не приводит к усилению у них тяжести реакции системной анафилаксии и степени сенсибилизации.
3.5. Влияние обеспеченности растущих крыс органической формой цинка на их ростовые показатели и цинковый статус Результаты количественной оценки влияния органической формы цинка (Zn ФММ) на ростовые показатели и активность ЩФ (раздел 2.7.5, эксперимент №4) представлены в таблице 3.5.1 и на рисунке 1.
Прирост массы тела, % 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Дни эксперимента Zn-мидии ОВР Zn-дефицит;
Рисунок 1. Относительный прирост массы тела крыс в ходе эксперимента № По окончании эксперимента животные, получавшие ОВР и имевшие исходно меньшую массу тела, по сравнению с животными, получавшими цинкдефицитный рацион, обогнали их не только по относительному приросту, но и по абсолютному значению массы тела.
Масса тела животных, получавших Zn-ФММ увеличивалась на протяжении всего эксперимента и по его окончании относительный прирост массы тела был даже достоверно (р0,05) выше, чем таковой у животных контрольной группы, потреблявших ОВР.
О недостаточной обеспеченности цинком животных, получавших цинк дефицитный корм, то есть о снижении их цинкового статуса, свидетельствуют сравнительные данные по активности ЩФ. Активность ЩФ сыворотки крови крыс, получавших цинкдефицитный корм, была высоко достоверно (р0,001) в 2,4 раза ниже соответствующего показателя для крыс, корм которых был обогащен органической формой цинка.
Таблица 3.5. Прирост массы тела (% от исходной массы) и активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови экспериментальных животных Содержание Масса тела Масса тела № цинка первый день заключ. день Прирост группы рационе эксперимента эксперимента массы, % ЩФ, нм/с/л 1 ОВР 118,1±7,9 208,3±15,0 77±6,7 Zn-дефицит (1,3 мг/кг) 2 141,8±2,1 176,1±3,6 24,3±2,8 944± Zn-ФММ 3 (13 мг/кг) 134,1±5,1 247,4±7,1 85,5±5,9 2247± Достоверности различия (P), критерий Манна-Уитни Различия между группами №1-№3 0,05 Различия между группами №2-№3 0,01 0, Результаты, полученные на этом этапе исследований, свидетельствуют о высокой биодоступности нового пищевого источника органической формы цинка, эффективно обеспечивающего прирост массы тела у растущих лабораторных животных и поддерживающего высокий уровень активности цинкзависимого фермента ЩФ. Пептидные фракции различной молекулярной массы в составе ферментолизата мяса мидий, обладая собственной биологической активностью и образуя комплексы с цинком, способствуют, по-видимому, повышенному усвоению в организме этого микроэлемента.
3.6. Влияние органической формы цинка на всасывание куриного овальбумина в желудочно-кишечном тракте растущих крыс Определение всасывания антигенной формы ОВА проведено в эксперименте №4 (раздел 2.7.6) для двух групп растущих крыс: животных, получавших на протяжении всего эксперимента полусинтетический цинкдефицитный рацион (группа №2), и животных, получавших тот же рацион, но обогащенный Zn-ФММ (группа №3).
Средние значения концентрации ОВА в сыворотке крови крыс составили для групп № и №3, соответственно, 43,2±11,0 нг/мл и 26,0±13,3 нг/мл.
Несмотря на относительно небольшие количества животных в сравниваемых группах и значительный разброс экспериментальных данных для индивидуальных животных, всегда имеющий место при тестировании этого показателя, выявлено достоверное (р0,05, согласно критерия Манна-Уитни) снижение проницаемости барьера ЖКТ при нормальной обеспеченности крыс органической формой цинка по сравнению с дефицитом этого эссенциального микроэлемента. Таким образом, использование в качестве пищевого источника цинка комплекса этого микроэлемента с ФММ препятствует повышенному всасыванию макромолекул пищи.
Полученные данные, как и результаты предыдущего раздела, свидетельствуют о безопасности и эффективности использования органической формы цинка в питании лабораторных животных с целью коррекции недостаточной обеспеченности этим микроэлементом.
4. Выводы 1. Всасывание в кровь и депонирование селена в печени у животных, потреблявших его органическую форму (ферментолизат селеносодержащих пищевых дрожжей), было достоверно выше (169,7±4,5 нг/мл сыворотки крови и 662,8±17,7 нг/г печени, соответственно), чем у животных, получавших такое же количество селена в форме неорганического соединения (150,1±5,3 нг/мл сыворотки крови и 561,6±13,7 нг/г печени, соответственно).
2. Десятикратное превышение оптимальной дозы селена в органической форме не оказывало неблагоприятного воздействия на барьерную функцию ЖКТ растущих крыс: отсутствовали достоверные различия всасывания биомаркера макромолекулярной проницаемости- овальбумина у крыс, получавших в течение суток корм с адекватным и десятикратно повышенным содержанием ферментолизата селеносодержащих пищевых дрожжей (18,0±5,3 нг/мл и 15,7±2,5 нг/мл, соответственно).
3. У крыс, получавших на протяжении 28 суток полусинтетический корм с десятикратно превышенным содержанием селена, морфометрические показатели, характеризующие состояние слизистой оболочки тонкой кишки (высота клеток эпителия на ворсинках, количество клеток на продольном срезе ворсинок), были увеличены по сравнению с таковыми у крыс, получавших в течение этого же времени селенодефицитный рацион.
4. Обогащение общевиварного рациона ферментолизатом селеносодержащих дрожжей не повышало у взрослых крыс степени сенсибилизации к модельному анафилактогену и тяжести проявлений у этих животных системной анафилаксии.
5. Потребление растущими крысами в течение 21 суток цинка в органической форме (комплекс цинк-ферментолизат белка мяса мидий) в составе полусинтетического рациона свидетельствовало о высокой биодоступности этого микроэлемента.
Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови и прирост массы тела относительно исходной у этих животных (2247±139 нм/с/л и 85,5±5,9%, соответственно) были значительно и достоверно выше, чем у животных, потреблявших цинкдефицитный корм (944±139 нм/с/л и 24,3±2,8%, соответственно).
6. У растущих крыс, получавших в течение 21 суток в составе полусинтетического рациона комплекс цинка с ферментолизатом мяса мидий, всасывание в кровь модельного антигена – овальбумина достоверно ниже (26,0±13,3 нг/мл), чем у животных, получавших в течение этого же времени полусинтетический цинкдефицитный рацион (43,2±11,0 нг/мл).
Список опубликованных работ по теме диссертации Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки России:
1. Зорин С.Н., Пенева В.В., Бучанова А.В., Гмошинский И.В., Ивахненко В.И., Мазо В.К. Оценка биодостпности органической и неорганической форм селена в опытах на растущих крысах // Вопросы питания.-2008.-Т.77, № 6.- С. 72-74.
2. Мазо В.К., Гмошинский И.В., Саблина В.В. (Пенева В.В.), Зорин С.Н.
Проницаемость стенки тонкой кишки для белковых антигенов у человека и лабораторных животных // Вопросы питания.- 2008.- Т.77, N 2. - С. 10-22.
3. Зорин С.Н., Бучанова А.В., Матяш А.И., Пенева В.В., Гмошинский И.В., Мазо В.К. Влияние комплекса органического цинка с ферментативным гидролизатом мяса мидий на всасываемость в желудочно-кишечном тракте потенциально аллергенных пищевых белков // Вопросы питания.- 2010.- Т.79, № 2.-С.73-77.
4. Гаджиева З.М., Пенева В.В., Зорин С.Н., Мазо В.К. Морфометрическая характеристика состояния слизистой оболочки тонкой кишки растущих крыс в условиях различной обеспеченности их селеном // Вопросы питания. – 2012 – Т.81, №1.- С. 86-89.
Материалы научных конференций 5. Зорин С.Н., Бучанова А.В., Пенева В.В., Гмошинский И.В. Влияние различных источников селена на некоторые физиологические и биохимические показатели лабораторных животных // Материалы X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье».- М., 2008.- С.37.
Список сокращений Zn-ФММ – комплекс цинка с ферментативным гидролизатом мяса мидий АОА – антиоксидантная активность БАД – биологически активная добавка ГПО – глутатионпероксидаза ЖКТ – желудочно-кишечный тракт ОВА – овальбумин ОВР – общевиварный рацион ФММ – ферментативный гидролизат мяса мидий ФСПД – ферментативный гидролизат селенсодержащих пищевых дрожжей ЩФ – щелочная фосфатаза