Татьяна юрьевна тест-система на основе мутантных форм цитохрома с для количественного определения супероксидного анион-радикала

Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

УДК 577.152 ПЕПЕЛИНА ТАТЬЯНА ЮРЬЕВНА ТЕСТ-СИСТЕМА НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ ЦИТОХРОМА С ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА 03.00.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010

Работа выполнена в Лаборатории инженерии белка Отдела биоинженерии Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Р.В. Черткова кандидат биологических наук ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

А.А. Константинов доктор биологических наук Г.В. Семисотнов доктор физико-математических наук ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН

Защита состоится « 12 » мая 2010 г. в 10-00 часов на заседании специализированного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул.

Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « » 2010 г.

Ученый секретарь специализированного совета В.А. Олейников доктор физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитохром с млекопитающих – низкомолекулярный гем содержащий белок, обладающий целым рядом биологических активностей. Основной функцией цитохрома с является перенос электрона от убихинол: цитохром с - редуктазы (комплекс III) на цитохром с - оксидазу (комплекс IV) дыхательной цепи митохондрий. В условиях высокой ионной силы цитохром с служит переносчиком электронов от цитохрома b5 наружной мембраны к комплексу IV внутренней мембраны митохондрий (Bernardi, Azzone, 1981). При этом происходит перенос электронов по дыхательной цепи в обход ее начальных участков (участков генерации активных форм кислорода (АФК)). Значительная часть цитохрома с находится в митохондриях в довольно прочной связи с кардиолипином, входящим в состав внутренней митохондриальной мембраны, и осуществляет пероксидазную функцию, которая может играть важную роль в инициировании выхода цитохрома с из митохондрий (Kagan et. al., 2005). После выхода в цитозоль цитохром с взаимодействует с фактором Apaf-1, что является ключевым этапом для образования апоптосом и запуска цитохром с - зависимого апоптоза (Zou et. al., 1999, Hu et. al., 1999). И, наконец, цитохром обладает специфической антиоксидантной активностью, с заключающейся в эффективном ингибировании продукции супероксидных радикалов (О2 ) (Skulachev, 1998, Korshunov et. al., 1997).

Супероксидные радикалы – нормальные метаболиты всех живых организмов, утилизирующих кислород в процессах обмена, но в избыточных концентрациях они токсичны, в первую очередь, как источник гидроксильных радикалов (ОН). Гидроксильные радикалы обладают очень высокой реакционной способностью, вызывают окислительное повреждение липидов, белков, ДНК и других компонентов клетки. Общепринято, что продукция супероксида является неотъемлемым свойством дыхательной цепи митохондрий эукариотических клеток. Образование активных форм кислорода, таких как супероксид, в митохондриях является главной причиной окислительного стресса, ведущего к различным патологическим состояниям: нейродегенеративным заболеваниям, атеросклерозу и старению (Balaban, 2005).

Цитохром с широко используется для измерения скоростей генерации супероксидного анион-радикала. Однако, восстановление цитохрома с неспецифично для супероксида.

Аскорбиновая кислота, глутатион и клеточные редуктазы могут восстанавливать цитохром с, который может быть реокислен цитохром с - оксидазой и пероксидазой. Эти неспецифичные реакции восстановления и окисления цитохрома с искажают истинные значения скоростей образования супероксида.

Чтобы увеличить специфичность измерения супероксида, цитохром с частично ацетилируют (~60% лизиновых остатков ацетилировано) (Azzi et. al., 1975). Ацетилирование лизиновых остатков цитохрома с снижает скорости его восстановления митохондриальной и микросомальной редуктазами и скорости его окисления цитохром с - оксидазой, при этом способность цитохрома с к восстановлению супероксидом сохраняется. При ацетилировании цитохрома с уксусным ангидридом образуется достаточно гетерогенная смесь молекул цитохрома с с различным числом модифицированных лизиновых остатков. При этом реакционная способность цитохрома с по отношению к природному восстановителю и окислителю (цитохром с - редуктазе и цитохром с - оксидазе) зависит от степени ацетилирования. При ацетилировании снижается общий положительный заряд цитохрома с, что ведет к снижению сродства к супероксиду. Неспецифическое взаимодействие ацетилированного цитохрома с (АсС) с компонентами дыхательной цепи уменьшают добавлением фосфата калия в сравнительно высоких концентрациях (до 100 мМ). С другой стороны, высокие концентрации фосфата калия вызывают частичное разобщение дыхательной цепи, что искажает картину генерации супероксида.

Все вышесказанное определяет актуальность задачи получения и подробного исследования рекомбинантных мутантных цитохромов с, несущих замены, направленные на снижение реакционной способности по отношению к компонентам дыхательной цепи, и разработки на их основе тест-системы для измерения скорости генерации супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах, представляющей прикладной биохимический интерес.

Цель исследования.

Целью настоящей диссертационной работы являлось: конструирование, получение и исследование ряда вариантов цитохрома с, содержащих замены лизиновых остатков в окружении гемовой впадины, направленные на снижение электрон-транспортной активности цитохрома с по отношению к белкам-партнерам дыхательной цепи, с последующей разработкой на их основе тест-системы для измерения скорости генерации супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах, обладающих цитохром с - редуктазной и цитохром с - оксидазной активностью.

Основные задачи

исследования.

1. Путем введения одиночных и двойных замен в ген цитохрома с лошади исследовать роль индивидуальных лизиновых остатков в формировании реакционноспособных комплексов с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи.

2. На основе полученных данных о роли индивидуальных лизиновых остатков осуществить конструирование мутантных вариантов цитохрома с, обладающих сниженной электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

3. Получить в препаративных количествах мутантные варианты цитохрома с, обладающие сниженной электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

4. Провести детальное исследование свойств мутантных вариантов цитохрома с лошади.

5. На основе отобранных на предыдущих этапах работы мутантных вариантов цитохрома с, обнаруживших наибольшее снижение электрон-транспортной активности, разработать тест-систему для детекции супероксидного анион-радикала в митохондриальном препарате (прочносопряженных инвертированных субмитохондриальных частицах (СМЧ) сердца быка). Cравнить скорости генерации супероксида комплексом I в СМЧ сердца быка, измеренные с помощью полученных мутантных вариантов цитохрома с, и скорости генерации перекиси водорода, измеренные с помощью Amplex Red.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

Путем специфического сайт-направленного мутагенеза получены мутантные 1.

варианты цитохрома с лошади с единичными и двойными заменами лизиновых остатков в окружении гемовой впадины, обеспечивающих взаимодействие цитохрома с с митохондриальными убихинол: цитохром с - редуктазой и цитохром с - оксидазой, на глутаминовую кислоту и незаряженные остатки.

С помощью методов генной инженерии показано, что преимущественный вклад в 2.

формирование реакционноспособного комплекса с убихинол: цитохром с - редуктазой дыхательной цепи вносят остатки Lys цитохрома с в положениях 8, 27, 72, 86, 87, а в формирование комплекса с цитохром с - оксидазой – остатки Lys в положениях 13, 79, 86, 87.

Получены мутантные варианты цитохрома с лошади, несущие разные комбинации 3.

замен K/E (в положениях 8, 27, 72, 86, 87) в окружении гемовой впадины и Е/K (в положениях 62, 69, 90) на противоположной гемовой впадине стороне молекулы, обладающие сниженной реакционной способностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

Показано, что мутантные варианты цитохрома лошади с шестью 4. с (K27Е/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K, K8Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E) и восемью заменами, обладают (K8Е/K27Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K) cниженной электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи по сравнению с АсС.

Разработана новая эффективная тест-система количественного определения 5.

супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах (в частности, СМЧ сердца быка), основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади.

C помощью разработанной тест-системы показано, что в комплексе I СМЧ сердца 6.

быка только ~50% перекиси водорода образуется в результате дисмутации супероксида.

Разработанная в ходе данной работы тест-система количественного определения супероксидного анион-радикала, основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади, может быть использована для измерения скорости генерации супероксида в митохондриальных препаратах, обладающих цитохром с - редуктазной и цитохром с - оксидазной активностью, как инструмент для дальнейшего изучения окислительных процессов в митохондриях.

Апробация работы.

Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: ХIX зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» студенческом симпозиуме по биоинженерии (Москва, 2007);

II (Москва, 2007);

Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007);

IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008);

12-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2008);

ХXI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009);

34th FEBS Congress (Prague, Czech Republic, 2009);

Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит _ таблиц и _ рисунков. Список литературы содержит _ источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование роли индивидуальных лизиновых остатков цитохрома с лошади в формировании реакционноспособных комплексов с компонентами дыхательной цепи Для исследования роли индивидуальных Lys остатков цитохрома с в формировании реационноспособных комплексов с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи на первом этапе работы получены мутантные варианты цитохрома с лошади, содержащие единичные и двойные замены ключевых для взаимодействия положительно заряженных остатков Lys 8, 13, 27, 72, 79, 86, 87 на отрицательно заряженные остатки Glu или нейтральные остатки.

Введение мутаций K8Е, K13Е, K27Е, Е69K/K72E, K79Е, K86Е/K87Е, K86W/K87C в ген цитохрома с лошади в составе плазмидного вектора pBP(CYCS), осуществляли методом сайт-направленного мутагенеза с помощью QuikChangeTM Mutagenesis Kit (Stratagene, США).

Для введения в ген цитохрома с мутаций K8Е, K13Е, K27Е, E69K/K72Е, K79Е, K86Е/K87Е, были синтезированы комплементарные олигонуклеотидные праймеры, K86W/K87C содержащие соответствующие мутации. После каждого этапа мутагенеза проводили секвенирование и переклонирование мутантных генов цитохрома с в высокоэкспрессионную плазмиду pBP(CYCS).

Препаративную экспрессию полученных мутантных генов проводили в клетках Е.сoli штамма JM-109 в течение 22-24 ч. В использованной нами системе продукты экспрессии генов цитохрома с были локализованы в цитоплазме клеток-продуцентов. По окончании экспрессии клетки-продуценты отделяли от культуральной жидкости центрифугированием, ресуспендировали в буфере А для MonoS и гомогенизировали с помощью установки “French Press” (Spectronic Instruments, Inc., США). Из общей клеточной фракции растворимых белков выделяли рекомбинантный цитохром с согласно схеме, состоящей из двух этапов жидкостной хроматографии: на катионообменной колонке MonoS и адсорбционной колонке с гидроксиапатитом. Фракции, обогащённые цитохромом с, имеющие соотношение Amax/A равное 4.5-5.0 (соотношение для коммерческого препарата цитохрома с c чистотой 95% (Sigma, США)), объединяли, окисляли феррицианидом калия, трижды диализовали против аммоний-бикарбонатного буфера и лиофилизовали.

Способность мутантных вариантов цитохрома с взаимодействовать с убихинол:

цитохром с - редуктазой и цитохром с - оксидазой изучали в системе митопластов печени крысы, лишенных эндогенного цитохрома с.

Сукцинат: цитохром с - редуктазную активность измеряли спектрофотометрически (при 550 нм) по восстановлению окисленного экзогенного цитохрома с. В этой реакции донором электронов служил сукцинат калия, передающий электроны в дыхательную цепь на сукцинатдегидрогеназу (комплекс II) и далее на убихинон, комплекс III и экзогенный цитохром с. Для того, чтобы исключить передачу электронов от цитохрома с на комплекс IV, последний ингибировали азидом натрия. Активность выражали в мкмоль восстановленного цитохрома с/мин на мг белка митопластов.

Цитохром с - оксидазную активность измеряли полярографическим методом.

Реакцию инициировали добавлением в реакционную среду аскорбиновой кислоты, которая служила донором электронов для тетраметил-n-фенилендиамина, в свою очередь передающего электроны окисленному цитохрому с. Затем восстановленный цитохром с передавал электроны на комплекс IV, восстанавливающий кислород до воды. За активностью цитохром с - оксидазы наблюдали по убыли кислорода в реакционной смеси. Активность выражали в мкг-атом поглощенного кислорода/мин на мг белка митопластов.

Наименьшее изменение сукцинат: цитохром с - редуктазной активности митопластов наблюдалось в присутствии мутантного варианта K13Е: она составляла 84% от активности, измеренной в присутствии цитохрома с дикого типа. Влияние остальных мутаций на характеристики сукцинат: цитохром с - редуктазной реакции оказалось более значительным:

в присутствии варианта K79Е активность снизилась в 2 раза;

в присутствии вариантов K8Е, K27Е – в 3 раза и в присутствии вариантов K86Е/K87Е, Е69K/K72E, K86W/K87C – в 4, в 4. и в 6.5 раз, соответственно, по сравнению с активностью в присутствии цитохрома с дикого типа (рис. 1, табл. 1).

WT Активность (мкмоль/мин на мг белка) 0, 0,07 K13E 0, 0, K79E 0, K8E 0, K86W/K87C K27E 0,02 K86E/K87E E69K/K72E 0, 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 Цитохром сокисл (мкМ) Рис. 1. Зависимость сукцинат: цитохром с - редуктазной активности митопластов, лишенных цитохрома с, от концентрации добавленных цитохрома с сердца лошади (WT) и его мутантных вариантов.

Таблица 1. Сравнение кинетических параметров сукцинат: цитохром с - редуктазной и цитохром с - оксидазной реакции в митопластах, лишенных цитохрома с, в присутствии добавленных вариантов цитохромов с.

Параметры сукцинат: цитохром с - редуктазной реакции Вариант К13Е К27Е Е69К/К72Е К79Е К86Е/К87Е К86W/К87C WT K8Е цитохрома с Km (мкM) 17 11,2 8 11,2 15,4 20,8 19,6 0, Аmax (мкмоль цитохрома с 0,086 0,028 0,072 0,026 0,019 0,039 0,023 0, /мин на мг белка) Параметры цитохром с - оксидазной реакции Вариант К8Е К13Е К27Е Е69К/К72Е К79Е К86Е/К87Е К86W/К87C WT цитохрома с Km (мкM) 4,8 7,2 5,8 7 6 12,6 50 4, Аmax (мкг атом 0,92 0,5 0,15 0,56 0,67 0,25 0,36 0, кислорода /мин на мг белка) Цитохром с - оксидазная активность, измеренная в присутствии мутантного варианта Е69K/K72Е, составляла 73% от активности, наблюдаемой в присутствии цитохрома с дикого типа, а в присутствии мутантного варианта K27Е – 61%. Более значительное снижение цитохром с - оксидазной активности в 2, 2.5, 4 и 6 раз наблюдалось в присутствии мутантных вариантов K8Е, K86Е/K87Е, K79Е, K13Е, соответственно. В случае мутантного варианта K86W/K87C активность цитохром с - оксидазы не отличалась от ее активности в присутствии цитохрома с дикого типа (рис. 2, табл. 1).

Таким образом, скорости сукцинат: цитохром с - редуктазной реакции митопластов в присутствии полученных нами мутантных вариантов цитохрома с лошади и, следовательно, их способность восстанавливаться дыхательной цепью уменьшались в ряду: WT K13E K79E K8E K27E K86E/K87E E69K/K72E K86W/K87C. Аналогично, уменьшение скорости цитохром с - оксидазной реакции в присутствии мутантных вариантов и их способность окисляться дыхательной цепью наблюдались в ряду WT K86W/K87C E69K/K72E K27E K8E K86E/K87E K79E K13E.

Необходимо отметить, что введение одиночных и двойных замен положительно заряженных остатков на отрицательно заряженные приводило к снижению скоростей как сукцинат: цитохром с - редуктазной, так и цитохром с - оксидазной реакций, в то время как Km для мутантных вариантов и для цитохрома с дикого типа имели близкие значения.

1, WT 0, (мкг-атом кислорода/мин на мг белка) K86W/K87C 0, 0, E69K/K72E 0, Активность K27E 0, K8E 0, K86E/K87E 0, K79E 0, K13E 0, 0, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Цитохром свосст (мкМ) Рис. 2. Зависимость цитохром с - оксидазной активности митопластов, лишенных цитохрома с, от концентрации добавленных цитохрома с сердца лошади (WT) и его мутантных вариантов.

Исключением являлось повышение на порядок Km для мутантного варианта K86Е/K87E в цитохром с - оксидазной реакции.

Замена положительно заряженных остатков на нейтральные (K86W/K87C) приводила к снижению скорости только сукцинат: цитохром с - редуктазной реакции, причем Km в этом случае снизилась на порядок по сравнению с диким типом. Такое снижение Km может свидетельствовать о том, что цитохром с с более гидрофобным в результате замен K86W/K87C сайтом взаимодействия способен образовывать больше продуктивных комплексов с убихинол: цитохром с - редуктазой, что может указывать на большую значимость для формирования такого комплекса именно гидрофобных взаимодействий.

Замена положительно заряженного остатка на отрицательный в положении 13 приводила к снижению скорости только цитохром с - оксидазной реакции, что может свидетельствовать о том, что K13 преимущественно вовлечен в образование комплекса с цитохром с - оксидазой.

Полученные на первом этапе работы экспериментальные данные позволяют разделить остатки Lys цитохрома с из сайта взаимодействия с редокс-партнерами на две группы по значимости для формирования реакционноспособных комплексов. Консервативные остатки Lys 86 и 87 важны для формирования обоих комплексов примерно в одинаковой степени и, по-видимому, являются “основой” универсального сайта взаимодействия цитохрома с с белковыми редокс-партнерами. Остатки Lys цитохрома с в положениях 8, 27, 72 вносят преимущественный вклад в формирование реакционноспособного комплекса с убихинол:

цитохром с - редуктазой, а остатки Lys в положениях 13, 79 – с цитохром с - оксидазой дыхательной цепи (рис. 3).

А Б 87 86 Рис. 3. Локализация на поверхности молекулы лошадиного цитохрома с остатков Lys (показаны положения -аминогрупп соответствующих остатков Lys), преимущественно вовлеченных во взаимодействие с комплексом III (А) и с комплексом IV (Б) дыхательной цепи. Молекула цитохрома с (pdb код 1HRC) показана со стороны гемовой впадины;

изображение получено с помощью программы PyMOL.

2. Конструирование и получение вариантов цитохрома с лошади, содержащих множественные мутации, направленные на сниженной электрон-транспортной активности по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи Скорость образования супероксид-радикала оценивают по скорости восстановления окисленного цитохрома с, поэтому при условии измерения начальных скоростей реакций главным источником возможных артефактов следует считать «естественные» цитохром с редуктазные, а не цитохром с - оксидазные активности. В наших экспериментах показано, что лизиновые остатки в положениях 8, 27, 72, 86, 87 вносят преимущественный вклад в формирование реакционноспособных комплексов цитохрома с с комплексом III дыхательной цепи. В связи с этим c целью устранения электростатических взаимодействий между цитохромом с и белками-партнерами на следующем этапе работы был сконструирован ряд мутантных генов цитохрома с с различными комбинациями замен положительно заряженных остатков Lys в положениях 8, 27, 72, 86, 87 (рис. 4, А) на отрицательно заряженные остатки Glu.

В ходе конструирования мутантных вариантов цитохрома с учитывали необходимость сохранения суммарного заряда молекулы, поскольку снижение суммарного положительного заряда может снижать скорость реакции белка с отрицательно заряженным анионом супероксид-радикала. Кроме того, как показал опыт, при введении только двух замен K/Е (т.е. при уменьшении суммарного заряда с +12 до +8) возникают технические сложности при очистке рекомбинантных белков, вследствие более слабого связывания с катионообменным сорбентом. Для компенсации избыточных отрицательных зарядов в последовательности мутантных вариантов цитохрома с были введены замены E/K в положениях 62, 69 и 90 (рис.

4, Б).

Б А В Г 62 Рис. 4. Электростатическая поверхность потенциалов цитохрома с лошади.

А - цитохром с дикого типа со стороны гемовой щели, Б - он же, при повороте на 180°, В – мутантный вариант цитохрома с К8Е/K27E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K со стороны гемовой щели, Г – он же, при повороте на 180°. Боковые цепи положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков окрашены в синий и красный цвета, соответственно.

Показаны положения -аминогрупп остатков Lys и -карбоксильных групп остатков Glu, которые заменяли путем сайт-направленного мутагенеза. Изображения получены с помощью программы PyMol.

Положения для введения заряд-компенсирующих мутаций были выбраны на противоположной гемовой впадине стороне молекулы цитохрома с, где преимущественно локализуются отрицательно заряженные остатки. При конструировании вариантов цитохрома с за основу был выбран вариант, содержащий мутации K86E/K87E, в присутствии которого наблюдалось существенное снижение как сукцинат: цитохром с - редуктазной, так и цитохром с - оксидазной активности митопластов. В ген цитохрома с, содержащий мутации K86E/K87E, поэтапно вводили мутации, стремясь получить конструкции с минимальным количеством мутаций. В результате нами были получены два варианта, содержащих по четыре аминокислотные замены (К27Е/K86E/K87E/E90K, E69K/К72Е/K86E/K87E), затем два варианта, содержащих по шесть аминокислотных замен (К27Е/E69K/К72Е/K86E/K87E/E90K, К8Е/E62K/E69K/К72Е/K86E/K87E) и один вариант, содержащий восемь аминокислотных замен (К8Е/К27Е/E62K/E69K/К72Е/K86E/K87E/E90K) (рис. 4, В и Г).

Нетрудно заметить, что в результате введения мутаций K/E в положениях 8, 27, 72, 86, 87 и противоположных мутаций E/K в положениях 62, 69, 90 произошли изменения электроститической поверхности цитохрома с лошади. Так, гемовая впадина в варианте цитохрома с с восемью заменами окружена преимущественно отрицательно заряженными остатками, тогда как положительные заряды «перемещены» на сторону молекулы, противоположную гемовой впадине. Предполагалось, что такое изменение локализации зарядов приведет к полному или частичному «перемещению» сайта связывания цитохрома с с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи. В таком случае, мутантный цитохром с либо вовсе не будет способен к формированию реакционноспособных комплексов с белками-партнерами, либо будет находиться в невыгодной для транспорта электронов ориентации.

Таким образом, нами были сконструированы мутантные варианты лошадиного цитохрома с, содержащие четыре (K27Е/K86E/K87E/E90K, E69K/K72Е/K86E/K87E), шесть и восемь (K27Е/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K, K8Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E) (K8Е/K27Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K) замен.

Введение мутаций K27Е/K86E/K87E/E90K, E69K/K72Е/K86E/K87E, K27Е/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K, K8Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E, K8Е/K27Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K в ген цитохрома с лошади, экспрессию полученных мутантных генов цитохрома с, выделение и очистку мутантных белков проводили аналогично введению мутаций, экспрессии, выделению и очистке мутантных вариантов с единичными и двойными аминокислотными заменами.

Исследование мутантных вариантов цитохрома лошади, содержащих 3. с множественные мутации 3.1. Спектральные свойства Для проверки спектральных характеристик полученных мутантных вариантов цитохрома K27Е/K86E/K87E/E90K, E69K/K72Е/K86E/K87E, с K27Е/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K, K8Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E, снимали спектр поглощения в K8Е/K27Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K соответствующей среде. Окисление цитохрома с проводили феррицианидом калия, восстановление – дитионитом натрия.

2 1 Рис. 5. Спектр поглощения цитохрома с дикого типа (А) и мутантного варианта К8Е/К27Е/E62K/E69K/К72Е/K86E/K87E/E90K (Б).

1 – окисленная, 2 – восстановленная формы цитохрома с.

Характер спектров свидетельствует о том, что введенные замены не привели к изменению спектра поглощения мутантного цитохрома с. Изменение молярного поглощения при восстановлении цитохрома с лошади дикого типа или мутантного цитохрома с с заменами K8Е/K27Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K в максимуме при 550 нм составляет 550 = 20000 М-1см-1 (рис. 5). Спектральные характеристики мутантных вариантов цитохрома K27Е/K86E/K87E/E90K, E69K/K72Е/K86E/K87E, K27Е/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K, с были идентичны спектральным характеристикам K8Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E цитохрома лошади дикого типа и мутантного цитохрома с с K8Е/K27Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K.

3.2. Окислительно-восстановительный потенциал Результаты получены совместно с В.В. Птушенко (лаборатория электрогенных фотопроцессов, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского). Для измерения окислительно-восстановительного потенциала использовали платиновый и хлор-серебряный электроды, изменения поглощения регистрировали на спектрофотометре при непрерывном перемешивании и деаэрации раствора аргоном. Соотношение окисленной и восстановленной форм цитохрома с определяли по спектру поглощения. Окисление цитохрома с проводили феррицианидом калия, восстановление – аскорбиновой кислотой (рис. 6).

Измеренное значение окислительно-восстановительного потенциала для цитохрома с дикого типа составило +286 mV, что согласуется с литературными данными для растворимого цитохрома Для мутантного варианта [Dutton et. al., 1970].

с измеренный окислительно K8E/K27E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K восстановительный потенциал имел значение +259 mV, что на 27 mV ниже значения для дикого типа. Таким образом, введение пяти отрицательно заряженных мутаций и трех положительно заряженных мутаций и изменение общего заряда белка с +12 до +8 привело к Восстановление гема цитохрома с, % 286 mV 259 mV 150 200 250 300 350 400 450 U (mV) Рис. 6. Кривые титрования цитохрома с дикого типа (•, ) и мутантного варианта ) аскорбиновой кислотой и K8E/K27E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K (•, феррицианидом калия.

небольшому сдвигу окислительно-восстановительных свойств цитохрома в с восстановительную сторону.

3.3. Сукцинат: цитохром с - редуктазная и цитохром с - оксидазная активность митопластов В ходе экспериментов изучали и сопоставляли сукцинат: цитохром с - редуктазную (рис. 7, А) и цитохром с - оксидазную (рис. 7, Б) активность митопластов печени крысы, лишенных эндогенного цитохрома с, в присутствии цитохрома с сердца лошади, АсС, а также мутантных вариантов цитохрома с.

Двойная замена в молекуле цитохрома с K86E/K87E привела к 5-кратному снижению сукцинат: цитохром с - редуктазной и к 3-кратному снижению цитохром с - оксидазной активности митопластов. Введение третьей замены K27E (в случае мутантного варианта K27E/K86E/K87E/E90K) или K72Е (в случае мутантного варианта E69K/K72E/K86E/K87E) привело к дальнейшему снижению сукцинат: цитохром с - редуктазной и цитохром с оксидазной активности митопластов, однако активности, измеренные в присутствии мутантных вариантов с четырьмя заменами, были выше активностей, измеренных в присутствии АсС. Введение четвертой замены K/E (в случае мутантного варианта K27E/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K и K8E/E62K/Е69К/K72E/K86E/K87E) привело к тому, что сукцинат: цитохром с - редуктазная активность митопластов в присутствии мутантных вариантов с шестью заменами была ниже, чем активности в присутствии АсС, а цитохром с оксидазная активность в их присутствии вообще не была выявлена. Введение пятой замены K/E (в случае мутантного варианта K8E/K27E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K) не привело к дальнейшему снижению сукцинат: цитохром с - редуктазной и цитохром с Активность (мкмоль/мин на мг белка) (мкг-атом кислорода/мин на мг белка) А Б 0, 0, 0,06 0, Активность 0,04 0, 0,02 0, 0,00 0, 0 20 40 60 0 20 40 60 Цитохром свосст (мкМ) Цитохром сокисл (мкМ) Рис. 7. Зависимость сукцинат: цитохром с - редуктазной (А) цитохром с - оксидазной (Б) активности митопластов, лишенных цитохрома с, от концентрации добавленных цитохромов с: цитохрома с сердца лошади ( ), АсС ( ), мутантного варианта K86E/K87E ( ), K27E/K86E/K87E/E90K ( ), E69K/K72E/K86E/K87E ( ), K27E/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K ( ), K8E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E ( ), K8E/K27E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K ( ).

оксидазной активности (рис. 7). Мутантные варианты K27E/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K, K8E/E62K/Е69К/K72E/K86E/K87E, K8E/K27E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K, обнаружившие наибольшее снижение электрон-транспортной активности, по сравнению с АсС, были выбраны в качестве основы для создания тест-системы количественного определения генерации супероксида в СМЧ сердца быка.

4. Тестирование мутантных вариантов цитохрома с, обладающих наиболее сниженной электрон-транспортной активностью, в качестве детектора супероксидного анион радикала в СМЧ сердца быка Результаты получены совместно с В.Г. Гривенниковой (кафедра биохимии, МГУ им.

М.В. Ломоносова). Основным местом генерации супероксида в митохондриях считают комплекс I дыхательной цепи (Brand et. al., 2004, Andreyev et. al., 2005, Hirst et. al., 2008).

Супероксид может образовываться как при окислении NADH (прямой перенос электронов), так и при обратном переносе электронов, который протекает при аэробном окислении сукцината, когда убихинон восстановлен, а на мембране митохондрий есть потенциал.

Измерение генерации супероксида на внутренней митохондриальной мембране проводили в системе прочносопряженных инвертированных субмитохондриальных частиц сердца быка (Lee, Ernster, 1967, Kotlyar, Vinogradov, 1990). Лишенные ферментов матрикса СМЧ являются оптимальной экспериментальной системой для изучения генерации супероксида митохондриальной дыхательной цепью. Образующийся супероксид в такой системе окислялся экзогенным цитохромом восстановление которого детектировали с, спектрофотометрически. По регистрируемой скорости восстановления цитохрома с оценивали скорость образования супероксидного анион-радикала. Необходимым условием измерения являлось использование супероксиддисмутазы (СОД), в присутствии которой подавляется восстановление цитохрома с супероксидом, при этом восстановление от компонентов дыхательной цепи сохраняется.

В ходе разработки тест-системы на основе мутантных вариантов цитохрома с измеряли общие сукцинат: цитохром с - редуктазные активности в отсутствие и в присутствии СОД. СОД-чувствительные активности (скорости генерации супероксида) получали вычитанием СОД-нечувствительных активностей из общих активностей.

4.1. Измерение скорости генерации супероксида в СМЧ в реакции обратного переноса электронов В реакции обратного переноса электронов субстратом окисления служит сукцинат калия. Сукцинат окисляется сукцинатдегидрогеназой (комплексом II), освобождающиеся при этом электроны передаются через убихинон на комплекс I (и идут на образование супероксида) и на комплекс III, эндогенный цитохром с и комплекс IV. Важным условием обратного переноса электронов от комплекса II на комплекс I является наличие трансмембранной разности электрохимических потенциалов, возникающей только на замкнутых мембранах, не проницаемых для ионов водорода. При добавлении экзогенного цитохрома он взаимодействует только с супероксидом и, вследствие этого, с, восстанавливается.

В препарате СМЧ всегда присутствуют незамкнутые фрагменты мембран. В таких фрагментах не возможен обратный перенос электронов, однако перенос электронов в цепи сукцинат комплекс II комплекс III цитохром с комплекс IV сохраняется. С такими фрагментами может взаимодействовать экзогенный цитохром с, при этом происходит его восстановление от компонентов дыхательной цепи (комплекса III или эндогенного цитохрома с). Именно эта реакция мешает точному количественному определению генерации супероксида.

На рис. 8 приведены зависимости наблюдаемых скоростей сукцинат: цитохром с редуктазной реакции от концентрации АсС и мутантных вариантов, содержащих шесть и восемь замен. Реакция восстановления цитохрома с анионом супероксид-радикала – бимолекулярная реакция, скорость которой в одинаковой мере зависит от концентрации обоих реагентов. В связи с этим, регистрируемая скорость восстановления цитохрома количественно соответствует скорости генерации супероксида только при его (скорость генерации супероксида) СОД-чувствительная активность (нмоль/мин на мг белка СМЧ) А Б (нмоль/мин на мг белка СМЧ) 1, Активность 1, 0, 0 0, 0 3 6 9 12 15 18 21 0 3 6 9 12 15 18 АсС (мкM) АcC (мкM) (скорость генерации супероксида) СОД-чувствительная активность (нмоль / мин на мг белка СМЧ) Г (нмоль / мин на мг белка СМЧ) B 2, 1, 2, Активность 2 1, 1, 1, 0, 0, 0, 0, 0 5 10 15 20 0 5 10 15 K27E/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K (мкM) K27E/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K (мкM) (скорость генерации супероксида) СОД-чувствительная активность (нмоль / мин на мг белка СМЧ) 2, (нмоль / мин на мг белка СМЧ) 1 Е Д 1, 1, Активность 1, 1, 0, 0, 0, 0, 0 5 10 15 20 0 5 10 15 K8E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E (мкM) K8E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E (мкM) (скорость генерации супероксида) СОД-чувствительная активность (нмоль/мин на мг белка СМЧ) Ж З (нмоль/мин на мг белка СМЧ) 1, 1, Активность 1, 1, 0,5 0, 0,0 0, 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 K8E/K27E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K (мкM) K8E/K27E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K (мкM) Рис. 8. Зависимость скорости восстановления АсС и мутантных вариантов цитохрома с от их концентрации.

А, В, Д, Ж - Общая сукцинат: цитохром с - редуктазная активность СМЧ при окислении сукцината калия в отсутствие (1 и 3) и в присутствии фосфата калия (2 и 4). СОД нечувствительные составляющие этих реакций – 3 и 4, соответственно. Б, Г, Е, З - СОД чувствительная сукцинат: цитохром с - редуктазная активность СМЧ (скорость генерации супероксида) в отсутствие (1) и в присутствии фосфата калия (2).

Г Б В А Рис. 9. Регистрация образования супероксид-радикала в СМЧ сердца быка при окислении сукцината калия с помощью 20 мкМ АсС в отсутствие (А) и в присутствии (Б) 100 мМ фосфата калия;

с помощью мкМ мутантного варианта К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К в отсутствие (В) и в присутствии (Г) 100мМ фосфата калия.

«насыщающих» концентрациях. Нетрудно заметить (рис. 8, Б, Г, Е, З), что для АсС и мутантных вариантов насыщающей является концентрация 20 мкМ.

На рис. 9 показана регистрация образования супероксида в СМЧ сердца быка при сопряженном окислении сукцината калия с помощью 20 мкМ АсС. Суммарная скорость образования продукта (супероксидного анион-радикала) при этом определяется, главным образом, комплексом I за счет энергозависимой, ротенон-чувствительной убихинол:

кислород оксидоредуктазной реакции (обратный перенос электронов) (Виноградов, Гривенникова, 2005, Lee, Ernster,1967) и, в существенно меньшей степени, комплексом III (Sun, Trumpower, 2003, Chen et. al., 2003, Ksenzenko et. al., 1983).

В отсутствие фосфата калия около 80% наблюдаемой скорости восстановления мкМ АсС не обусловлено генерацией супероксида, т.е реакция подавляется СОД на 20%.

При высокой ионной силе реакция подавляется СОД на 40%. Следует отметить, что дифференцировать нечувствительную к СОД составляющую реакции на комплекс III зависимое восстановление цитохрома с и его прямое взаимодействие с каким-либо компонентом комплекса в качестве искусственного акцептора электронов не I представляется возможным (табл. 2).

Присутствие фосфата калия в среде измерения снижает регистрируемую скорость генерации супероксида практически в 2 раза. СОД-чувствительная активность (скорость генерации супероксида) в среде без фосфата в присутствии 20 мкМ мутантного варианта цитохрома с K27E/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K составляет 65% от общей регистрируемой сукцинат: цитохром с - редуктазной активности СМЧ, в среде с фосфатом – 80%. СОД чувствительная активность (скорость генерации супероксида) в присутствии 20 мкМ мутантного варианта цитохрома с K8E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E в среде без фосфата составляет 70% от общей регистрируемой сукцинат: цитохром с - редуктазной активности СМЧ, в среде с фосфатом – 85% (табл. 2).

Таблица 2. Измерение генерации супероксид-радикала и перекиси водорода в СМЧ сердца быка. В скобках указан вклад СОД-чувствительной составляющей (генерации супероксида) в общую сукцинат: цитохром с - редуктазную активность.

Генерация супероксида (нмоль/мин на мг белка СМЧ) 5 мМ сукцинат 50 мкМ NADH, (обратный перенос 5 мкМ ротенон Цитохром с, 20 мкМ электронов) (прямой перенос электронов) + 100 мМ - K-Pi - K-Pi + мМ K-Pi K-Pi АсС 1,5 (20%) 0,9 (40%) 2,0 (55%) 1,8 (65%) K27E/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K 1,4 (65%) 0,8 (80%) 2,0 (45%) 1,9 (70%) K8E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E 1,4 (70%) 0,8 (85%) 2,3 (40%) 2,0 (55%) K8E/K27E/E62K/E69K/K72E/K86E/K87E/E90K 1,4 (85%) 0,9 (90%) 2,0 (50%) 1,8 (75%) Генерация перекиси водорода (нмоль/мин на мг белка СМЧ) Amplex Red, 10мкМ - 1,1 - 1, В отсутствие фосфата около 15% наблюдаемой скорости восстановления мутантного варианта не обусловлено генерацией K8Е/K27Е/Е62K/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е/Е90K супероксида, тогда как при высокой ионной силе реакция почти полностью подавляется СОД. СОД-чувствительная активность (скорость генерации супероксида) в присутствии мкМ мутантного варианта цитохрома с K8Е/K27Е/Е62K/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е/Е90K в среде без фосфата составляет 85% от общей регистрируемой сукцинат: цитохром с редуктазной активности СМЧ, в среде с фосфатом – 90% (табл. 2).

4.2. Измерение скорости генерации супероксида в СМЧ в реакции прямого переноса электронов Комплекс I способен генерировать супероксид в реакции прямого переноса электронов только в присутствии ингибитора ротенона. В реакции прямого переноса электронов субстратом окисления служит NADH. Генерация супероксида комплексом I, чувствительная к СОД, происходит как в замкнутых СМЧ, так и в незамкнутах фрагментах.

Перенос электронов в дыхательной цепи блокирован ротеноном, однако экзогенный цитохром с может принимать электроны не только от супероксида, но и непосредственно от комплекса I и/или NADH (Виноградов, Гривенникова, 2005).

Скорости генерации супероксида с NADH в качестве субстрата окисления при его низких концентрациях (50 мкМ) существенно (примерно в полтора раза) выше, чем при окислении сукцината (табл. 2). Эта разница, скорее всего, обусловлена разной степенью восстановленности FMN при прямом (NADH в присутствии ротенона) и обратном (энергозависимое восстановление FMN убихинолом) переносе электронов. Существенно меньшее влияние фосфата калия на NADH-зависимую реакцию по сравнению с сукцинат зависимой реакцией согласуется с предположением о разобщающем действии фосфатов калия. Для генерации супероксида в реакции обратного переноса электронов необходимо наличие разности потенциалов на мембране, поэтому присутствие фосфатов приводит к снижению скоростей генерации супероксида.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, мутантные варианты цитохрома лошади, содержащие шесть аминокислотных замен с (K27Е/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е/Е90K, K8Е/Е62K/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е) являются более специфичными детекторами супероксида, генерируемого комплексом I в реакции обратного переноса электронов, по сравнению с АсС, поскольку СОД-чувствительная сукцинат:

цитохром с - редуктазная активность СМЧ в присутствии этих мутантных вариантов составляет от 65% в среде без фосфата до 85% в среде с фосфатом, в то время как в присутствии АсС: только 20% в среде без фосфата и 40% в среде с фосфатом. Наиболее специфичным детектором супероксида является мутантный вариант цитохрома с, содержащий восемь замен СОД (K8Е/K27Е/Е62K/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е/Е90K):

чувствительная сукцинат: цитохром с - редуктазная активность СМЧ в присутствии этого мутантного варианта составляет 85% в среде без фосфата и 90% в среде с фосфатом. При использовании как мутантных вариантов цитохрома с, так и АсС специфичность к супероксиду при измерении скорости генерации супероксида в реакции прямого переноса электронов примерно одинакова: СОД-чувствительные активности лежат в пределах 55-75%.

По-видимому, это связано с тем, что в реакции прямого переноса электронов имеется большее число доноров электронов для экзогенного цитохрома с: NADH, редокс компоненты комплекса I как в замкнутых СМЧ, так и во фрагментах СМЧ.

Таким образом, нами разработана тест-система количественного определения генерации супероксида в митохондриальных препаратах (в частности, СМЧ), основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома лошади с (K27Е/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е/Е90K, K8Е/Е62K/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е, Специфичность разработанной тест K8Е/K27Е/Е62K/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е/Е90K).

системы к супероксиду (при измерении скорости генерации супероксида в реакции обратного переноса электронов) в среде с фосфатом в 2 раза, а в среде без фосфата 4 раза превышает специфичность АсС.

5. Измерение скорости образования перекиси водорода в СМЧ сердца быка Результаты получены совместно с В.Г. Гривенниковой (кафедра биохимии, МГУ им.

М.В. Ломоносова). Поскольку супероксидный анион-радикал является короткоживущей молекулой и быстро дисмутирует в перекись, одной из задач работы было сравнение скоростей образования супероксида и перекиси водорода комплексом I дыхательной цепи митохондрий.

Скорость образования перекиси водорода определяли по окислению Amplex Red с образованием резоруфина. Реакцию начинали добавлением сукцината калия (обратный перенос электронов) или NADH (прямой перенос электронов). Супероксид, генерируемый комплексом I, превращался в перекись с помощью СОД. В присутствии пероксидазы перекись затем окисляла молекулу Amplex Red до резоруфина. Реакция полностью подавлялась в присутствии каталазы.

Видно, что существует количественное несоответствие данных о генерации супероксид-радикала и перекиси водорода (табл. 2). Если образование измеряемой с Amplex Red перекиси водорода вторично и происходит только в результате супероксиддисмутазной реакции, следует ожидать совпадения величин, измеренных как по восстановлению цитохрома, так и по образованию резоруфина. Другими словами, из двух молей супероксида под действием СОД образуется один моль перекиси.

2О2 + 2H+ O2 + H2O2 (реакция, катализируемая СОД) Результаты, приведенные в табл. 2 показывают, что как в реакции прямого (запускаемого NADH), так и в реакции обратного переноса электронов (запускаемого сукцинатом калия) перекиси образуется в 2 раза больше, чем в супероксиддисмутазной реакции. Простое объяснение, согласно которому при использовании цитохрома с в качестве индикатора часть супероксида спонтанно дисмутирует (цитохром с не полностью измеряет генерацию супероксида) противоречит результатам, приведенным на рис. 8: увеличение концентрации цитохрома с не увеличивает скорости его восстановления.

Существует, по крайней мере, два возможных объяснения количественного несоответствия. Если генерация супероксида (окисление FMNН кислородом) происходит в полости, недоступной для растворителя и, следовательно, для его свободной диффузии, спонтанная дисмутация в этой полости приведет к одновременному появлению и перекиси водорода и супероксид-радикала, который реагирует с цитохромом с. Другая возможность состоит в том, что первичный аддукт FMNH -кислород распадается двумя путями, образуя и перекись водорода, и супероксид-радикал (Massey et. al., 1973). Не исключено также, что комплекс I имеет два центра, прямо реагирующих с кислородом. В недавней работе других авторов было показано, что соотношение скорости образования перекиси и супероксида изолированным комплексом I сердца быка и E. coli существенно различаются (Esterhazy et.al., 2008). С другой стороны, наши данные (табл. 2), полученные для «нативного» связанного с мембраной комплекса I существенно отличаются от тех, что были измерены для изолированного комплекса I из того же объекта (Esterhazy et.al., 2008). Не исключено, что соотношение скоростей генерации Н2О2 и О2 комплексом I является параметром, чувствительным даже к незначительным изменениям структуры белка, происходящим при его солюбилизации.

Таким образом, сравнение скоростей генерации перекиси водорода и супероксид радикала свидетельствует о том, что в комплексе I дыхательной цепи только ~50% перекиси водорода образуется в результате дисмутации супероксида.

ВЫВОДЫ 1. Впервые сконструирован и получен ряд мутантных вариантов цитохрома с лошади, содержащих единичные и двойные замены положительно заряженных остатков лизина в окружении гемовой впадины, обеспечивающих взаимодействие цитохрома с с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи.

2. Показано, что консервативные остатки Lys 86 и 87 примерно в одинаковой степени важны для формирования комплексов цитохрома с с убихинол: цитохром с - редуктазой и цитохром с - оксидазой дыхательной цепи. Остатки Lys цитохрома с в положениях 8, 27, вносят преимущественный вклад в формирование реакционноспособного комплекса с комплексом III, а остатки Lys в положениях 13, 79 – с комплексом IV дыхательной цепи.

3. Впервые сконструирован и получен ряд мутантных вариантов цитохрома с лошади несущие разные комбинации замен K/E (в положениях 8, 27, 72, 86, 87) и Е/K (в положениях 62, 69, 90), обладающие сниженной реакционной способностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

Показано, что мутантные варианты цитохрома лошади с шестью 4. с и восемью (K27Е/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K, K8Е/E62K/E69K/К72Е/K86E/K87E) заменами обладают пониженной по (K8Е/K27Е/E62K/E69K/K72Е/K86E/K87E/E90K) сравнению с АсС электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.

5. Впервые разработана тест-система количественного определения генерации супероксида в митохондриальных препаратах, основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома лошади с шестью (K27Е/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е/Е90K, с и восемью K8Е/K27Е/Е62K/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е/Е90K) (K8Е/K27Е/Е62K/Е69K/K72Е/K86Е/K87Е/Е90K) заменами. Показано, что:

а) специфичность разработанной тест-системы к супероксиду в 2-4 раза превышает специфичность АсС (в реакции обратного переноса электронов).

б) при сравнении скоростей генерации супероксида комплексом I в СМЧ сердца быка, измеренных с помощью разработанной тест-системы, и скоростей генерации перекиси водорода, измеренных с помощью Amplex Red, только ~50% перекиси водорода образуется в результате дисмутации супероксида.

ОСНОВНЫЕ НАУЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

Пепелина Т.Ю., Черткова Р.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Роль индивидуальных 1.

лизиновых остатков цитохрома с лошади в формировании реакционноспособных комплексов с компонентами дыхательной цепи. Биоорганическая химия. 2010. Т. 36. № 1. С. 98-104.

Пепелина Т.Ю., Черткова Р.В., Островерхова Т.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., 2.

Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Направленный мутагенез цитохрома с: реакции с компонентами дыхательной цепи и супероксид-радикалом. Биохимия. 2009. Т. 74. № 6.

С. 768-778.

Черткова Р.В., Пепелина Т.Ю., Долгих Д.А., Виноградов А.Д., Гривенникова В.Г., 3.

Кирпичников М.П. Способ определения скорости генерации супероксида. Заявка на патент РФ. Регистрационный номер 2008128523, 15.07.2008. Решение о выдаче патента на изобретение от 10.08.2009.

Черткова Р.В., Пепелина Т.Ю., Островерхова Т.В., Долгих Д.А., Виноградов А.Д., 4.

Гривенникова В.Г., Кирпичников М.П. Способ получения рекомбинантного мутантного цитохрома с. Заявка на патент РФ. Регистрационный номер 2008128521, 15.07.2008.

Решение о выдаче патента на изобретение от 08.12.2009.

Пепелина Т.Ю., Черткова Р.В., Островерхова Т.В., Долгих Д.А., Гривенникова В.Г., 5.

Виноградов А.Д., Кирпичников М.П. Разработка тест-системы количественного определения супероксида в митохондриальных препаратах на основе мутантных вариантов цитохрома с. Тезисы докладов международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Москва-Пущино, сентября - 2 октября 2009. Том 2. Конкурс молодых ученых. c. 183-186.

6. Chertkova R., Pepelina T., Ostroverkhova T., Grivennikova V., Vinogradov A., Dolgikh D., Kirpichnikov M. Protein engineering of the horse cytochrome c: mutant proteins as an effective detector for quantitative measurement of superoxide radical generation. 34th FEBS Congress. Prague, Czech Republic, July 4-9, 2009. In FEBS J. 2009. Vol. 276. Supl.1. p.143.

Пепелина Т.Ю., Черткова Р.В., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Исследование роли 7.

отдельных аминокислотных остатков цитохрома с лошади во взаимодействии с белками-партнерами дыхательной цепи. Тезисы докладов ХXI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 9-11 февраля 2009, с. 40.

Пепелина Т.Ю., Островерхова Т.В., Черткова Р.В., Долгих Д.А., Гривенникова В.Г., 8.

Виноградов А.Д., Кирпичников М.П. Количественное определение генерации супероксида, основанное на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади.

Тезисы докладов 12-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 10-14 ноября 2008 года, с. 100.

Пепелина Т.Ю., Островерхова Т.В., Черткова Р.В., Долгих Д.А., Гривенникова В.Г., 9.

Виноградов А.Д., Кирпичников М.П. Использование мутантных вариантов цитохрома с лошади для количественного измерения генерации супероксида субмитохондриальными частицами сердца быка. Тезисы докладов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая 2008, с. 326.

Островерхова Т.В., Пепелина Т.Ю., Черткова Р.В. Получение вариантов цитохрома с с 10.

мутациями, направленными на уменьшение сродства к комплексам III и IV дыхательной цепи. Тезисы докладов II студенческого симпозиума по биоинженерии.

Москва, 21 октября 2007, с. 17-18.

Островерхова Т.В., Пепелина Т.Ю., Черткова Р.В. Изучение взаимодействия мутантных 11.

вариантов цитохрома с с окислительно-восстановительными партнёрами. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». Москва, 11-14 апреля 2007, с. 9-10.

Пепелина Т.Ю., Островерхова Т.В., Черткова Р.В., Долгих Д.А., Гривенникова В.Г., 12.

Виноградов А.Д. Взаимодействие мутантных форм цитохрома с лошади с окислительно-восстановительными партнёрами дыхательной цепи. Тезисы докладов ХIX зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии». Москва, 7-9 февраля 2007, с.32.