Генотипическая характеристика штаммов vibrio parahaemolyticus, циркулирующих на территориях россии и сопредельных государств
На правах рукописи
ПОДОЙНИЦЫНА Оксана Андреевна ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ Vibrio parahaemolyticus, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИЯХ РОССИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ГОСУДАРСТВ 03.02.03 – микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону 2013
Работа выполнена в ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противо чумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научный консультант:
доктор биологических наук, старший научный сотрудник Монахова Елена Владимировна
Официальные оппоненты:
Ерошенко Галина Александровна – доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, главный научный сотрудник лаборатории молекулярной мик робиологии Пронина Елена Александровна – доктор медицинских наук, доцент, ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И.Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, доцент кафедры микробиоло гии, вирусологии и иммунологии
Ведущая организация:
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Феде ральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Защита состоится «18» июня 2013 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при ФКУЗ «Российский научно исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по над зору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский науч но-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.
Автореферат разослан «»_2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Среди патогенных для человека вибрионов (кроме Vibrio cholerae) наиболее распространенными и значимыми в этиологии острых ки шечных инфекций являются галофильные бактерии вида V. parahaemolyticus, обита тели эстуарных и прибрежных морских вод. Начиная с 1996 г. в мире наблюдается стремительный рост заболеваемости, сопровождающийся глобальным распростра нением клонов, за которыми в литературе закрепилось название «пандемичных», несмотря на то, что этот, уже вошедший во всеобщее употребление термин, непри меним к V. parahaemolyticus с точки зрения эпидемиологии [Nair G. B. et al., 2007].
Также встречаются такие обозначения, как «post-1995» и «new-O3:K6». К ним отно сят представителей серогрупп О3:К6, О4:К68, О1:К25, О1:KUT и О6:K18, как пра вило, содержащих в геноме семь островов патогенности (VPaI-1 – VPaI-7) [Hurley C.C. et al., 2008]. Штаммы, выделенные до 1996 г., не содержат всех VPaI и не обла дают таким патогенетическим потенциалом, как «пандемичные». Считают, что по следние произошли от авирулентных штаммов серогруппы О3:К6 путем постепен ного приобретения VPaI [Han H. et al., 2008]. Заболевания чаще всего регистрируют в приморских населенных пунктах и связаны с употреблением в пищу морепродук тов. В связи с их развитым импортом в России и странах СНГ существует риск воз никновения заболеваний, вызываемых V. parahaemolyticus, что требует серьезного внимания и постоянного мониторинга за данными возбудителями.
В 1997 г. в Приморском крае России была зарегистрирована крупная вспышка (63 больных) пищевой токсикоинфекции (ПТИ), вызванная штаммами серогруппы О3:К6 [Смоликова Л.М. c соавт., 2001]. Время ее возникновения и географическое положение региона наводят на мысль о том, что ее этиологическими агентами яви лись «пандемичные» клоны, распространившиеся и на территорию Российской Фе дерации, однако это предположение нуждалось в подтверждении. Согласно данным официального сайта Управления Роспотребнадзора по Приморскому краю (http://25.rospotrebnadzor.ru), в последующие годы на Дальнем Востоке отмечались вспышки заболеваний, вызванных галофильными вибрионами («галофилез»): в – 31 больной, в 2002 г. – 24, в 2007 г. – 22, в 2009 г. – 10, в 2012 г. – 30. Кроме того, периодически регистрировали спорадические случаи [Хоменко Т.В., Мурначев Г.П., 2004]. Ранее, в 1970е годы, в Новороссийске возникали многочисленные заболева ния, вызванные V. parahaemolyticus, причем в 87% случаев состояние больных было настолько тяжелым, что требовалась экстренная госпитализация. С 1973 по 1976 гг.
было выделено 80 клинических штаммов, подавляющее большинство которых отне сено к серогруппам О4:К12 и О4:К8 [Либинзон А.Е. с соавт., 1981], рассматривае мых рядом исследователей как сероварианты О3:К6 [Nair G. B. et al., 2007]. Локаль ные вспышки и спорадические заболевания имели место и на других территориях России (Ейск, Туапсе, Кабардинка), а также Украины (Мариуполь, Бердянск, Керчь, Ялта, Одесса, Николаев) и Туркменистана (Красноводск) [Карбышев Г.Л., 1988].
Патогенность парагемолитических вибрионов связывают главным образом с продукцией прямого термостабильного (TDH – thermostable direct hemolysin) и род ственного ему (TRH – TDH-related hemolysin) гемолизинов [Nitshibuchi M., Kaper J.B., 1995;
Park K.-S. et al., 2000]. Ген tdh в геноме представлен двумя почти (на 97%) идентичными копиями, tdh1 и tdh2, расположенными на малой хромосоме в разных участках VPaI-7, в состав которого входит также кластер генов системы сек реции третьего типа (T3SS2), ответственной за энтеротоксичность [Hiyoshi H. et al., 2010]. Ген trh также существует в двух вариантах, имеющих 84% идентичности [Kishishita M. et al., 1992], но в геноме представлен одной копией в составе малой хромосомы и тесно связан с кластерами генов уреазы (ure) [Nakaguchi Y. et al., 2003] и T3SS2, отличающейся от T3SS2 структурно, но не функционально [Okada N. et al., 2009]. Обычно вирулентные клинические штаммы содержат либо tdh, либо trh, но встречаются несущие оба этих гена [Iida T. et al., 1998], а штаммы из окружаю щей среды за редким исключением лишены того и другого [Nair G. B. et al., 2007].
Способность к экспрессии генов tdh определяют по лизису эритроцитов чело века или кролика на специальной среде Вагатсума, который называют феноменом Канагава (KP). TRH, имеющий другой спектр гемолитической активности, в этом тесте не выявляется [Nishibuchi M. et al., 1989]. Часть штаммов, содержащих tdh, либо и tdh, и trh, оцениваются как KP-негативные или KP-промежуточные, то есть экспрессирующие tdh слабо и непостоянно. Согласно предположению Okuda J., Nishibuchi M. (1998), такие штаммы могут содержать только одну копию гена tdh – tdh1, обладающего более слабым промотором по сравнению с tdh2. Однако посколь ку активность промотора зависит от замены всего одной пары нуклеотидов в сайте -35, авторы считают tdh+КP- штаммы потенциально опасными, т.к. точковая мутация в промоторе может привести к возникновению КP+ клонов. Что касается tdh+trh+ штаммов, то они, как правило, продуцируют TRH, тогда как экспрессия tdh у них репрессирована, и лишь в редких случаях наблюдается одновременная продукция обоих гемолизинов [Xu M. et al., 1994]. Является ли это следствием низкой активно сти промотора tdh, до конца не установлено. В литературе также отсутствуют дан ные о копийности гена tdh у таких штаммов.
Парагемолитические вибрионы интенсивно изучаются зарубежными автора ми, однако сообщения о генетической характеристике штаммов, циркулирующих в России и странах СНГ, в литературе практически отсутствуют;
до начала наших ис следований они были охарактеризованы только по фенотипу [Либинзон А.Е. с со авт., 1981;
Карбышев Г.Л., 1988;
Смоликова Л.М. c соавт., 2001]. В свете последних данных о формировании «пандемичных» клонов генотипическая характеристика могла бы способствовать объяснению причин возникновения столь тяжелых заболе ваний, а также дифференциации множественных спорадических случаев от локаль ных вспышек. Генотипирование штаммов, выделенных от больных и из объектов окружающей среды, необходимо для выявления источника инфекции, раскрытия ге неза вспышек и определения необходимого объема санитарно-эпидемиологических мероприятий. Поэтому оценка потенциальной опасности V.parahaemolyticus на со временном уровне приобретает особую актуальность.
Цель работы. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов V.
parahaemolyticus с различными фенотипическими свойствами, выделенных на тер ритории России и сопредельных государств.
Основные задачи исследования:
1. ПЦР-генотипирование музейных и свежевыделенных штаммов V.
parahaemolyticus по расширенному набору детерминант факторов патогенности.
Конструирование новых праймеров.
2. Сравнительный анализ генотипических признаков штаммов, вызвавших вспыш ки, спорадические случаи заболеваний, и выделенных из объектов окружающей среды (вода, гидробионты) на различных территориях.
3. Риботипирование штаммов V. parahaemolyticus, выделенных в двух географиче ски отдаленных регионах России (Приморский край и Новороссийск).
4. Выявление генов tdh и trh у других представителей рода Vibrio.
5. Блот-гибридизация рестриктов ДНК V. parahaemolyticus с зондами tdh и trh. Оп ределение копийности этих генов в геномах разных штаммов.
6. Секвенирование генов tdh1 и tdh2 Kанагава-позитивных, Kанагава-негативных и Канагава-промежуточных штаммов, биоинформационный анализ их промотор ных областей и продуктов трансляции.
Научная новизна и теоретическая значимость. На основе комплексного анализа генотипов получены приоритетные данные о генетическом разнообразии штаммов парагемолитических вибрионов, циркулирующих на территориях России, Украины и Туркменистана. Впервые создана база данных «Парагемолитические вибрионы России и сопредельных государств: ПЦР-генотипы», зарегистрированная в Реестре баз данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, па тентам и товарным знакам под № 2013620293 от 14.02.2013 г. Впервые идентифи цированы представители так называемой «пандемичной» группы, вызвавшие забо левания в России, установлено отсутствие родственных связей между возбудителя ми заболеваний и штаммами, выделенными из водоемов и гидробионтов в разных регионах. Показано, что образование серовариантов О3:К6 может происходить не только после приобретения всех островов патогенности (как описано в литературе), а параллельно с ним или даже предшествовать ему. С помощью секвенирования участков ДНК выяснены причины KP-негативного и KP-промежуточного фенотипа tdh-позитивных штаммов и впервые установлено, что эффективность экспрессии ге на зависит не от одной, как полагали ранее, а от двух точковых мутаций в его про моторной области. Оценена степень вероятности реверсии таких штаммов в KP позитивные варианты.
Практическая значимость работы. Сформирована коллекция штаммов V.
parahaemolyticus, охарактеризованных по генотипическим признакам, для проведе ния дальнейших научных исследований. Полученные данные использованы для паспортизации штаммов, хранящихся в Музее живых культур Ростовского противо чумного института (акт внедрения от 14.02.2013 г.). Сконструирован новый набор праймеров для детекции ряда генов. Одобрены Ученым советом и утверждены ди ректором Ростовского противочумного института методические рекомендации «Комплексная оценка вирулентности парагемолитических вибрионов» (протокол № 11 от 02.11.10) и «Генотипическая характеристика парагемолитических вибрионов по расширенному набору детерминант факторов патогенности (протокол № 9 от 30.10.12). Контрольные штаммы для постановки ПЦР и изучения экспрессии генов факторов патогенности депонированы в ГКПБ «Микроб» под номерами КМ204 и КМ208. В базе GenBank депонированы 22 нуклеотидные последовательности генов tdh, tdh1 и tdh2 тринадцати штаммов (включая промоторную область) и аминокис лотные последовательности их продуктов под номерами JQ029155 – JQ029159, JQ074089 – JQ74092, JQ0967016 – JQ967028;
AFD18727.1 – AFD18730.1, AFD54192.1 – AFD 54195.1, AFA85583.1 – AFA85595.1.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Штаммы V. parahaemolyticus, выделенные на различных территориях Российской Федерации, в Украине и Туркменистане от больных и из объектов окружающей среды, различаются по генотипам. Компьютерный анализ результатов ПЦР генотипирования позволил выявить среди них 4 отчетливых группы и опреде лить степень изменчивости в пределах каждой из них.
2. Клинические штаммы V. parahaemolyticus О3:К6, выделенные на Дальнем Вос токе после 1996 г., являются производными одного клона и по совокупности признаков могут быть отнесены к представителям «пандемичной» группы. Уста новлена клональная гетерогенность клинических штаммов, выделенных до г. в Новороссийске;
ни один из этих штаммов не содержал всех семи островов патогенности, но их полный набор был представлен в популяции.
3. Результаты блот-гибридизации рестриктов ДНК с зондом tdh не подтвердили вы сказанного в литературе предположения о присутствии в геноме tdh+ Канагава негативных штаммов V. parahaemolyticus единственной копии гена tdh1. С по мощью секвенирования генов и биоинформационного анализа впервые установ лено, что утрата Канагава-позитивного фенотипа зависит не от одной (как счита ли ранее), а от двух нуклеотидных замен в промоторной области гена tdh2.
Штаммы, содержащие одну из них, потенциально более опасны, чем содержащие обе замены, так как последним для восстановления Kанагава-позитивного фено типа необходимы сразу две мутации.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях про блемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» межведомствен ного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (2007 2012), на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и спе циалистов Роспотребнадзора (г. Пермь, 2012), представлены в материалах 13-й, 17-й и 18-й Российских гастроэнтерологических недель (Москва, 2007, 2011, 2012).
Исследования выполнены в рамках плановых научных тем «Фено- и геноти пическая характеристика парагемолитических вибрионов по признакам, связанным с проявлением вирулентности», № госрегистрации 0120.0 800416, и «Формирование коллекции патогенных для человека вибрионов», № госрегистрации 0120.1 002623.
Публикация результатов исследований. Материалы исследований отраже ны в 18 опубликованных работах, из них 6 – в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства об разования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 151 странице, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в том числе одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов, ил люстрирована 12 таблицами и 18 рисунками. Библиография содержит ссылки на публикацию (в т.ч. 17 работ отечественных и 164 – зарубежных авторов).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы. В работе использовано 278 штаммов V.
parahaemolyticus, выделенных на территориях России, Украины и Туркменистана от людей и из объектов окружающей среды (воды и гидробионтов) в период с 1973 по 2012 гг., 7 штаммов из дальнего зарубежья, а также 50 штаммов других видов рода Vibrio.
При ретроспективном анализе фенотипических свойств в основном были ис пользованы паспортные данные, которые выборочно проверяли у отдельных штам мов, а все свежевыделенные тестировали на наличие гемолитической активности в тесте Канагава и уреазной активности общепринятыми методами. Принадлежность штаммов, выделенных от больных в Приморском крае в 2008 и 2012 гг., к серогруп пе О3:К6 определяли в реакции слайд-агглютинации с сыворотками, полученными сотрудниками Музея живых культур в Ростовском противочумном институте.
ПЦР-генотипрование проводили по набору следующих детерминант: гены tdh и T3SS2 (pvcsN2, pvcsC2, espD, pvcsV2), входящие в состав VPaI-7;
ген фила ментозного профага orf8;
гены интегразы int1 и связанного с гемагглютинином бел ка hapVp (маркеры VPaI-1);
белка наружной мембраны ompA (VPaI-2);
фагоподоб ной интегразы int3 (VPaI-3);
интегразы порообразующего цитотоксина pfcI (VPaI-4);
фагоподобного белка php (VPaI-5);
ДНКазы exoV (VPaI-6);
гены trh, ure-кластера (ureR, ureC) и T3SS2 (pvcsN2, pvcsC2, espD);
термолабильного гемолизина tl;
предполагаемой металлопротеиназы pmp и предполагаемой липазы cefVp;
регуля торный ген toxR. Использовали праймеры, приведенные в литературе и сконструи рованные нами. Для блот-гибридицации с зондами tdh и trh осуществляли рестрик цию ДНК эндонуклеазой HindIII. Электрофорез рестриктов и перенос на нейлоно вые мембраны проводили общепринятыми методами [Maniatis T. et al., 1982]. Зон дами служили ПЦР-амплификаты фрагментов генов tdh и trh, полученные на матри цах ДНК V.parahaemolyticus и меченые дигоксигенином с использованием набора DIG DNA Labling and Detection Kit (Roche). Для риботипирования HindIII-рестрикты ДНК гибридизовали с неспецифическим фрагментом 16S-рДНК чумного микроба [Диханов Г.Г., 1990]. Секвенирование генов осуществляли на генетическом анализа торе ABI Prism 3130 с использованием набора The BigDye Terminator v3.1 Cycle Se quencing Kit согласно рекомендациям, изложенным в прилагаемом протоколе. Для штаммов, содержащих единственную копию tdh, ПЦР-амплификаты получали на матрице тотальной ДНК. Для получения амплификатов генов tdh1 и tdh2 предвари тельно проводили HindIII-рестрикцию ДНК, разделяли смесь электрофоретически, вырезали из агарозного геля участки, содержащие искомые гены, элюировали из них ДНК и использовали в качестве матриц по отдельности.
Для конструирования праймеров, сборки последовательностей секвенирован ных генов и биоинформационного анализа использовали пакеты программ Vector NTI Advance 11 (Contig Express, AlignX) и BioEdit, программу Phylip 3.6.
1. Генотипирование штаммов парагемолитических вибрионов. На первом этапе работы мы провели сравнительное изучение гемолитической активности в тесте Канагава, уреазной активности и наличия генов tdh и trh, термолабильного ге молизина (tl) и кластера уреазы (ureR, ureC). Полученные результаты в целом сов пали с литературными данными: подавляющее большинство штаммов, содержащих ген tdh, но не содержащих trh, были Канагава-позитивными (KP+), то есть образовы вали на среде Вагатсума отчетливые зоны полного гемолиза вокруг макроколонии, тогда как большинство tdh-trh- штаммы были Канагава-негативны (KP-). При этом данные признаки коррелировали с происхождением штаммов – tdh+trh-KP+ были выявлены только среди клинических культур и полностью отсутствовали у выде ленных из объектов окружающей среды. Вместе с тем, отдельные tdh+ штаммы ока зались KP-негативными, либо KP-промежуточными (KP+), то есть вызывающими гемолиз слабо и непостоянно.
Ген trh был выявлен всего у 9 клинических штаммов, 4 из которых одновре менно содержали tdh, но независимо от наличия последнего все trh+ штаммы содер жали гены кластера уреазы и гидролизовали мочевину на среде Кристенсена. Эти результаты совпадали с данными литературы о том, что наличие уреазной активно сти может служить маркером для идентификации trh+ штаммов V. parahaemolyticus [Osawa R. et al., 1996;
Park K.S. et al., 2000]. Из них 5 tdh-trh+ штаммов характеризо вались KP- фенотипом, тогда как 4 tdh+trh+ штамма были KP-промежуточными.
На следующем этапе работы штаммы V parahaemolyticus различного проис хождения были изучены по расширенному набору фено- и генотипических призна ков. Полученные данные были обработаны с помощью компьютерной программы Phylip, что позволило разделить исследуемые штаммы на 4 группы (рис.1).
В состав обособленной и наиболее удаленной от других ветвей группы «А» ( ПЦР-генотипов) вошли все 9 клинических trh+ уреазопозитивных штаммов, в т.ч. содержащих и ген tdh. Группа «B» (22 ПЦР-генотипа) включала только клинические tdh+ штаммы, выделенные в Новороссийске, Керчи, Николаеве, Бердянске, Мариу поле и Японии в 1970-80е годы, а также небольшое число выделенных во Владиво стоке в 1997 г. Остальные штаммы-возбудители вспышек (1997, 2012 гг.) и спора дических заболеваний (2008, 2012 гг.) в Приморском крае образовали отдельную ветвь с генотипами «C», куда также вошли 2 клинических штамма, выделенные в Новороссийске в 1973-74 гг. и 1 – в Мариуполе в 1984 г. Она была наиболее одно родной (среди 64 штаммов было обнаружено всего 10 ПЦР-генотипов) и филогене тически близкой к группе «B». Группа «D» объединила штаммы, лишенные генов tdh и trh. Более половины их были выделены из объектов окружающей среды, одна ко остальные явились возбудителями заболеваний людей, хотя и при спорадических случаях инфицирования. Эта ветвь довольно далеко отстояла от остальных, и из менчивость в ее пределах была особенно заметной (30 ПЦР-генотипов).
Такая расширенная характеристика «отечественных» штаммов была получена впервые и вошла в состав базы данных «Парагемолитические вибрионы России и сопредельных государств: ПЦР-генотипы».
Рисунок 1. Дендрограмма генотипов V. parahaemolyticus 2. «Пандемичные» и «непандемичные» штаммы V. parahaemolyticus в России, Украине и Таджикистане. Обнаружение среди исследуемых штаммов множества генотипов подтвердило известное положение о чрезвычайной пластич ности геномов V. parahaemolyticus [Boyd E.F. et al., 2008;
Han H. et al., 2008]. Осо бый интерес представляло наличие островов патогенности (VPaI), поскольку имен но с их приобретением и накоплением принято связывать формирование new-O3:K штаммов, как правило, содержащих все семь островов патогенности [Hurley С.С. et al., 2006]. До начала наших исследований в отечественной литературе отсутствовали сообщения о встречаемости таких штаммов как в России, так и в странах ближнего зарубежья. Поэтому мы провели более подробный сравнительный анализ данных ПЦР-генотипирования и дополнительных характеристик исследуемых штаммов в целях изучения возможности присутствия и формирования представителей «панде мичной» группы на территории нашей страны. Результаты его показали, что к этой группе с уверенностью могут быть отнесены только штаммы, вызвавшие заболева ния в Приморском крае РФ. Подавляющее большинство их составляли представите ли серогруппы О3:К6, содержащие маркерные гены семи VPaI и ген orf8, который также более характерен для штаммов new-O3:K6, хотя и не является для них строго специфичным [Nair G.B. et al., 2007]. Данные риботипирования в целом также ука зывают на клональный характер заболеваемости в этом регионе. Как видно из ри сунка 2, лишь два клинических штамма имели отличия в риботипах (R2, R3) от большинства (R1), тогда как штаммы из внешней среды были представлены разны ми риботипами (R4-R8).
Рисунок 2. Результаты блот-гибридизации HindIII-рестриктов ДНК штаммов V.parahaemolyticus, выделенных на Дальнем Востоке РФ, с 16S-рДНК зондом.
К – клинические штаммы;
ВС – штаммы из внешней среды, R – риботипы Не исключено, что здесь сформировался эндемичный очаг, о котором упоми налось и ранее [Хоменко Т.В., Мурначев Г.П., 2004]. Однако для подтверждения этого предположения необходим дальнейший мониторинг, поскольку имевшиеся в нашем распоряжении штаммы, выделенные в данном регионе из объектов окру жающей среды, не имели отношения к возбудителям заболеваний. Все они были лишены VPaI-7, однако у них присутствовали в различных сочетаниях маркерные гены шести остальных VPaI (особенно у штаммов 2012 г.). С другой стороны, забо леваемость могла быть следствием новых заносов из пограничных государств Азии, на территориях которых они укоренились. Так или иначе, результаты наших иссле дований позволяют считать, что ведущее место в приморской популяции V.
parahaemolyticus принадлежит именно «пандемичным» клонам.
Многочисленные случаи ПТИ, вызванные парагемолитическими вибрионами, были зарегистрированы в 1970-х гг. и в другом регионе России – в причерномор ском городе Новороссийске. Большинство их относилось к серогруппам О4:К12 и О4:К8 [Либинзон А.Е. с соавт., 1981] – серовариантам О3:К6 [Nair G.B. et al., 2007].
Хотя полным набором островов патогенности не обладал ни один из причерномор ских штаммов, этот набор был «распределен» по представителям группы и полно стью представлен в общей популяции вида на данной территории. У двух штаммов также присутствовал ген orf8 – «необязательный» маркер штаммов new-O3:K6. По этому мы сочли возможным предположить, что горизонтальный перенос VPaI меж ду вибрионами, циркулировавшими в этом регионе, мог привести к возникновению «пандемичных» штаммов уже в 1970е годы. В 2008 г. Han H. et al. была предложена гипотетическая модель их формирования, согласно которой вначале tdh-негативный клон О3:К6 приобрел часть генов VPaI-3, образовавшийся промежуточный вариант – сперва VPaI-1, 5 и 7, а затем VPaI-4 и 6. В результате делеций некоторых генов О/К-антигенов, от этого нового клона О3:К6 произошли другие сероварианты, кото рые принято объединять в «пандемичную» группу. Исходя из наших данных, про цесс приобретения VPaI необязательно соответствовал этому порядку, а формиро вание серовариантов О3:К6 могло происходить не после приобретения всех VPaI, а параллельно с ним или даже предшествовать ему. Согласно данным риботипирова ния (рис.3), заболеваемость в Новороссийске носила поликлональный характер, что неудивительно в отсутствие вспышек.
Рисунок 3. Результаты блот-гибридизации HindIII-рестриктов ДНК штаммов V.parahaemolyticus, выделенных в Новороссийске, с 16S-рДНК зондом Среди штаммов, выделенных в нескольких регионах Украины, полный набор маркерных генов семи VPaI был выявлен только в популяции возбудителей массо вых заболеваний в двух близко расположенных приазовских городах – Бердянске и Мариуполе в 1984-1988 гг. Поэтому на данных территориях в принципе могла сло житься ситуация, аналогичная описанной для Новороссийска. Однако встречаемость этих генов в бердянской и мариупольской популяциях была значительно ниже по сравнению с новороссийской.
Целый ряд клинических штаммов, выделенных в Украине, и почти все выде ленные в Туркменистане (г. Красноводск) не содержали даже VPaI-7. Достаточно большое число случаев заболеваний, вызванных такими штаммами, указывает на реализацию ими патогенных свойств за счет экспрессии дополнительных факторов.
Исходя из имеющихся на сегодняшний день данных литературы, к таким факторам относится продукты видоспецифичных генов tl [Sakurai Y. et al., 1973;
Taniguchi H.
et al., 1985] и T3SS1 [Zhou X. et al., 2008, 2010, 2012]. Мы также обратили внимание на 2 потенциальных фактора патогенности – предполагаемой металлопротеиназы и предполагаемой липазы, сходных соответственно с гемагглютинин/протеазой и ци тотоническим фактором Cef холерных вибрионов, у которых они являются факто рами патогенности/персистенции [Монахова Е.В., 2012]. Мы обозначили соответст вующие гены как pmp и cefVp и показали, что первый присутствовал у большинства, а второй – у всех изученных штаммов. Поэтому вполне возможно, что способность tdh-trh- штаммов вызывать заболевания отчасти обусловлена продуктами этих генов.
Однако для проверки этого предположения необходимы дальнейшие исследования.
У большинства штаммов (кроме выделенных на Дальнем Востоке), не наблю далось строгой корреляции между серогрупповой принадлежностью и ПЦР генотипом. По-видимому, изменчивость генетических детерминант, определяющих антигенную структуру V.parahaemolyticus, не зависит от горизонтального переноса генов островов патогенности.
Известно, что распространение генов tdh и trh не ограничивается пределами вида V.parahaemolyticus. С помощью дот-гибридизации гены, сходные с tdh, были ранее выявлены у единичных штаммов V.cholerae [Honda T. et al., 1986;
Монахова Е.В. с соавт., 2010], V.mimicus и V.hollisae [Nishibuchi M. et al., 1990;
Terai A. et al., 1991], а сходные с trh – у V.cholerae nonO1/nonO139 [Miller K.A. et al., 2012], V.alginolyticus [Gonzalez-Escalona N. et al., 2006], V. furnissii [Shirai H. et al., 1990], V.
anguillarum (GenBank GQ214529.1) и Aeromonas veronii [Raghunath P. et al., 2010].
Мы провели поиск генов tdh и trh у 20 штаммов V.cholerae О1 и неО1/неО139, штаммов V. alginolyticus, 4 V. mimicus, 2 V.hollisae, 17 V. fluvialis, 8 V.anguillarum, V.fisheri, 2 V.proteolyticus, 3 V.splendidus, 6 V.vulnificus, 5 V.harvei, 4 V.furnisii. По средством ПЦР ни у одного из штаммов перечисленных видов не было выявлено ге нов tdh и trh. Результаты дот-гибридизации подтвердили полное отсутствие генов, сходных с trh, а с зондом tdh положительный ответ был получен для одного штамма V.mimicus и 4 штаммов V.cholerae O1. Эти данные указывают на возможность при обретения гена tdh другими видами вибрионов, хотя это событие и происходит, во всей видимости, крайне редко. Тем не менее, парагемолитические вибрионы могут служить донорами генетического материала для повышения патогенетического по тенциала возбудителей кишечных инфекций.
5. Генетические особенности Канагава-негативных и Канагава промежуточных штаммов парагемолитических вибрионов. В процессе анализа результатов среди tdh+ штаммов были выявлены 8 KP-/+ штаммов, 4 из которых со держали также ген trh. Причины их дефектности по экспрессии tdh остались неиз вестными. Согласно предположению некоторых авторов [Terai A. et al., 1991;
Okuda J., Nishibuchi M., 1998], такие штаммы могут содержать только tdh1, обладающий более слабым промотором по сравнению с tdh2. Мы определили копийность этого гена у 63 tdh+trh- и 4 tdh+trh+ штаммов с помощью блот-гибридизации HindIII рестриктов их ДНК с зондом tdh и показали, что tdh+trh- штаммы, независимо от КР фенотипа, имели по 2 копии искомого гена, причем все профили гибридизации пол ностью совпали. Напротив, у tdh+trh+ штаммов было выявлено по одной копии tdh в составе фрагментов одинаковой длины, что могло указывать на то, что этот ген на ходится в виде аллеля tdh1 со слабым промотором. Ген trh у них был также пред ставлен одной копией, как и у использованных для сравнения tdh-trh+ штаммов.
Поскольку данные блот-гибридизации не подтвердили предположения выше упомянутых авторов, мы секвенировали 22 гена tdh 5 KP+ и 8 KP-/+ штаммов вклю чая их промоторные области и провели биоинформационный анализ полученных данных в сравнении с последовательностями, представленными в литературе и ба зах GenBank. Результаты сравнения 84-86-нуклеотидных последовательностей про моторных областей генов tdh, полученных нами и другими авторами [Xu M. et al., 1994;
Nagayama K. et al., 1995;
Makino K. et al., 2003;
Nishibuchi M., Kaper J. B., 1990;
Baba K. et al., 1991], показали их четкое разделение на 3 обособленные группы (рис. 4А). В первую и самую однородную вошли промоторы всех tdh2 и двух един ственных копий tdh. Вторая группа объединила промоторы двух генов tdh штаммов из нашей коллекции, а также генов tdh3, tdhX, tdh4, tdh5 и tdhII, представленных в GenBank. Все эти последовательности, кроме tdhX, принадлежали KP-/+ штаммам. В третью, наиболее удаленную, группу вошли все без исключения промоторы tdh1.
Рисунок 4. Дендрограммы, построенные по результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей промоторных областей (А) и аминокислотных последовательностей продуктов генов tdh (Б) штаммов V.parahaemolyticus При сравнительном анализе аминокислотных последовательностей продуктов генов tdh они также были разделены на три группы (рис. 4Б), причем для подав ляющего большинства штаммов это распределение совпало с данными анализа про моторных областей. При этом белки TDH2 были практически полностью идентич ны, а ветвь TDH1 была более однородной по сравнению с таковой промоторов.
Описанная картина во многом совпала с литературными данными, согласно которым KP+ фенотипом обладают только штаммы, имеющие tdh2 с мощным про мотором [Okuda J., Nishibuchi M., 1998], однако в эту схему не укладывались 6 KP-/+ штаммов первой ветви, из которых 4 содержали tdh1 и tdh2, а 2 – единственную ко пию tdh. У этих штаммов -35 область промотора tdh2 (либо tdh) имела вид TTTACT, как у KP+ штаммов, т.е. в ней отсутствовала замена A на G, снижающая силу промо тора. Однако KP-/± штаммы отличались от KP+ наличием в tdh2 другой замены, G на A, в позиции -17, которая характерна для промотора tdh1 (рис. 5). Ранее Okuda J., Nishibuchi M. (1998) не придали ей какой-либо весомой значимости в утрате KP+ фенотипа. Они отвели ведущую роль единственной нуклеотидной замене в области -35 и отмечали, что tdh+КP- штаммы потенциально опасны, поскольку точковая му тация в промоторе может привести к возникновению КP+ клонов. Нам же представ ляется, что вторая замена также ответственна за изменение KP-фенотипа и, более того, является достаточной в случае отсутствия первой. Подтверждением этому мо жет служить тот факт, что из 8 KP-/+ штаммов нашей коллекции 6 содержали только вторую замену. Поэтому реверсия таких штаммов в KP+ действительно зависит от одной точковой мутации в промоторной области, но в позиции -17, и их следует считать потенциально опасными. Штаммы, содержащие обе замены, могут реверси ровать с меньшей вероятностью, поскольку для этого необходимы сразу две мута ции.
Рисунок 5. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторных областей генов tdh исследуемых штаммов V.parahaemolyticus Интересно, что если все tdh+trh- штаммы содержат и кластер генов T3SS2, (что свидетельствует в пользу наличия у них интактного VPaI-7), то у tdh+trh+ штаммов присутствует только часть данного острова, и делетированный участок его включает один из генов tdh вместе с T3SS2. Согласно данным проведенного нами биоинформационного анализа, делеции подвергся именно tdh1, а оставшийся ген «приобрел» ряд нуклеотидных замен, которые сказались как на активности его про мотора, так и на первичной структуре продукта трансляции. Тем не менее, он сохра нил большее сходство с tdh2, чем с tdh1. Такой характер делеции вполне объясним тем, что в составе VPaI-7 кластер T3SS2 локализован между генами tdh1 и tdh2.
При этом справа и слева от обоих tdh (но не в пределах кластера T3SS2) присутст вуют несколько IS-подобных последовательностей [Makino K. et al., 2003], которые могут обеспечивать делеции различных участков VPaI-7, в том числе и выявленную нами. По-видимому, 4 штамма, содержащие единственную копию tdh, взамен утра ченных последовательностей приобрели ген trh и сцепленные с ним кластеры ure и T3SS, восстановив таким образом реализуемую V. parahaemolyticus общую страте гию вирулентности. Вероятно, ведущая роль в ней перешла к TRH, что сделало про дукцию TDH необязательной либо вообще излишней. Мы также не исключаем, что KP-фенотип зависит не только от активности промотора, но и от структуры самого белка. Кроме того, репрессия синтеза гемолизинов может происходить и на уровне трансляции [Nakaguchi Y. et al., 2004]. Тем не менее, полученные данные свидетель ствует в пользу того, что ведущая роль в продукции TDH принадлежит именно нук леотидной последовательности промоторной области кодирующего его гена.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что па рагемолитические вибрионы, циркулирующие на территориях России и стран ближ него зарубежья, характеризуются крайним генетическим разнообразием. Среди воз будителей заболеваний встречаются штаммы, обладающие основными генетиче скими детерминантами вирулентности, и штаммы, которые по совокупности фено- и генотипических свойств обычно считают авирулентными. Поэтому актуальными представляются дальнейшие исследования, направленные как на определение био логической активности известных факторов патогенности, так и на поиск еще не из вестных. Кроме того, в связи с развитым импортом морепродуктов существует ре альная угроза завоза и распространения на территории России новых штаммов воз будителя, которые пополнят имеющуюся популяцию вида и послужат источниками генетического материала. Все это указывает на необходимость повышенного вни мания санэпидслужб к своевременному выявлению больных и обнаружению V.
parahaemolyticus в гидробионтах, а также более углубленной характеристики выде ленных культур по расширенному набору генотипических признаков.
ВЫВОДЫ 1. Парагемолитические вибрионы, циркулирующие на различных территориях Рос сийской Федерации, Украины и Туркменистана, характеризуются разнообразием генотипов, которые образуют 4 отчетливые группы. Две из них филогенетически близки друг другу и включают исключительно клинические штаммы, содержа щие ген tdh;
третья – клинические штаммы, содержащие ген trh;
четвертая – штаммы, лишенные обоих этих генов, выделенные как от больных, так и из объ ектов окружающей среды.
2. Штаммы V. parahaemolyticus серогруппы О3:К6, вызывающие вспышки и спора дические случаи заболеваний в Приморском крае РФ, являются производными одного клона и по совокупности фенотипических и генотипических признаков могут быть отнесены к представителям «пандемичной» группы.
3. Возбудители заболеваний в Новороссийске в 1970-х гг. принадлежат к серогруп пам О4:К12 и О4:К8 – серовариантам О3:К6, и в их популяции в совокупности представлен полный набор маркерных генов семи островов патогенности, при сутствующих у разных штаммов в различных сочетаниях. Поэтому горизонталь ный перенос генов мог привести к формированию в этом регионе «пандемич ных» штаммов задолго до 1996 г.
4. В Украине и Туркменистане отмечено довольно большое число случаев заболе ваний, вызванных штаммами парагемолитических вибрионов, лишенных генов tdh, trh и кластеров T3SS2, что указывает на реализацию ими стратегии виру лентности за счет продукции дополнительных факторов патогенности.
5. Результаты блот-гибридизации рестриктов ДНК с зондом tdh показали, что все tdh+trh- штаммы V. parahaemolyticus независимо от Канагава-фенотипа содержа ли по две копии гена tdh – tdh1 и tdh2, а единственная копия этого гена в геноме tdh+trh+ штаммов по нуклеотидной последовательности соответствовала аллелю tdh2. Эти данные не подтвердили высказанного в литературе предположения о присутствии в геноме Канагава-негативных и Канагава-промежуточных штам мов единственной копии гена tdh, представленной аллелем tdh1.
С помощью секвенирования генов и биоинформационного анализа полученных 6.
данных установлено, что утрата Канагава-позитивного фенотипа зависит не от одной (как считали ранее), а от двух нуклеотидных замен в промоторной области гена tdh2 – A на G в последовательности -35 и/или G на A, в позиции -17.
7. Среди Канагава-негативных и Канагава-промежуточных штаммов парагемоли тических вибрионов выявлены содержащие в промоторной области как одну, так и обе нуклеотидные замены. Первые обладают большей потенциальной опасно стью, чем последние, которым для восстановления Kанагава-позитивного фено типа необходимы сразу две обратные точковые мутации.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Голенищева Е.Н., Монахова Е.В., Смоликова Л.М., Божко Н.В., Непомнящая Н.Б., Шалу О.А.* Оценка вирулентности парагемолитических вибрионов, выде ленных при вспышке пищевой токсикоинфекции // Рос. журн. гастроэнтерол., ге патол., колопроктол. – 2007. – Т. XVII, №5 (Прилож. №30, Матер. XIII РГЭН). – С.135.
2. Смоликова Л.М., Монахова Е.В., Голенищева Е.Н., Божко Н.В., Непомнящая Н.Б., Шалу О.А.*, Санамянц Е.М. Тестирование парагемолитических вибрионов по признакам, связанным с вирулентностью // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии. – Ростов н/Д, 2007. – Вып. 20. – С.91-94.
3. Ломов Ю.М., Смоликова Л.М., Мазрухо Б.Л., Монахова Е.В., Черепахина И.Я., Кудрякова Т.А., Божко Н.В., Алексеева Л.П., Голенищева Е.Н., Шалу О.А.*, Са намянц Е.М., Анисимова Г.Б., Чемисова О.С., Шестиалтынова И.С. Коллекция представителей рода Vibrio центра патогенных для человека вибрионов // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. совещания и пробл. комиссии. – Ростов н/Д, 2008. – Вып. 21. – С. 56-58.
4. Голенищева Е.Н., Шалу О.А.*, Смоликова Л.М., Монахова Е.В., Божко Н.В., Ду ванова О.В., Либинзон А.Е., Гальцева Г.В., Кудрякова Т.А., Санамянц Е.М., Са гакянц М.М. Характеристика парагемолитических вибрионов, выделенных от людей на территории России и сопредельных стран // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии. – Ростов н/Д, 2009. – Вып. 22.– С.122-125.
5. Голенищева Е.Н., Смоликова Л.М., Кудрякова Т.А., Либинзон А.Е., Божко Н.В., Шалу О.А.*, Монахова Е.В., Качкина Г.В., Чемисова О.С., Санамянц Е.М., Гаев ская Н.Е., Рыковская О.А., Сагакянц М.М., Македонова Л.В. Оценка чувстви тельности генетически охарактеризованных штаммов парагемолитических виб рионов к гомологичным бактериофагам // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии. – Ростов н/Д, 2010. – Вып. 23. – С.70-73.
6. Шалу О.А.*, Непомнящая Н.Б., Монахова Е.В., Смоликова Л.М., Божко Н.В., Алленов А.В., Мурначев Г.П., Хоменко Т.В., Голенищева Е.Н. ПЦР-генотипы штаммов Vibrio parahaemolyticus, выделенных от людей на территории СНГ // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии. – Ростов н/Д, 2010. – Вып. 23. – С. 99-105.
7. Шалу О.А.*, Голенищева Е.Н., Смоликова Л.М., Гальцева Г.В., Божко Н.В., Монахова Е.В. Оценка вирулентности штаммов Vibrio parahaemolyticus, вы деленных на территориях России и сопредельных государств // Эпидемиоло гия и инф. болезни. – 2010. – № 6. – С. 45-48. (из перечня ВАК) 8. Шалу О.А.*, Алленов А.В., Мурначев Г.П., Хоменко Т.В., Голенищева Е.Н.
«Пандемичные» штаммы Vibrio parahaemolyticus – этиологические агенты гастроэнтеритов на Дальнем Востоке Российской Федерации // Здоровье на селения и среда обитания. – 2010. – №12. – С. 42-45. (из перечня ВАК) 9. Смоликова Л.М., Голенищева Е.Н., Шалу О.А.*, Монахова Е.В., Чемисова О.С., Божко Н.В., Сагакянц М.М., Рыковская О.А., Непомнящая Н.Б., Санамянц Е.М., Даликова Р.Р., Наумова Д.О. Уреазопозитивные парагемолитические вибрионы и продукция ими гемолизина TRH in vitro // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл. комиссии. – Ростов н/Д, 2011. – Вып. 24.– С.125-129.
10. Смоликова Л.М., Монахова Е.В., Шалу О.А.*, Голенищева Е.Н., Алленов А.В., Мурначев Г.П., Хоменко Т.В., Жиров А.Я., Гальцева Г.В., Непомнящая Н.Б., Божко Н.В., Дуванова О.В., Чемисова О.С., Санамянц Е.М., Рыковская О.А., Са гакянц М.М. Биологические особенности парагемолитических вибрионов, выде ленных в Черноморском и Дальневосточном регионах Российской Федерации // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. совещания и пробл. комис сии. – Ростов н/Д, 2011. – Вып. 24. – С.129-135.
11. Шалу О.А.*, Монахова Е.В., Смоликова Л.М., Непомнящая Н.Б., Голенище ва Е.Н. Обнаружение высокопатогенных штаммов Vibrio parahaemolyticus на территории Дальнего Востока // Здравоохранение Российской Федерации. – 2011. – №5. – С.49. (из перечня ВАК) 12. Шалу О.А.*, Писанов Р.В., Водопьянов А.С. Необходимость мониторинга пара гемолитических вибрионов в связи с глобальным распространением новых высо коинфективных клонов // Фундаментальные и прикладные аспекты анализа рис ка здоровью населения: Матер. всерос. науч.–практ. конф. молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. – Пермь, 2012. – Т.2. – С.338-342.
13. Шалу О.А.*, Монахова Е.В., Смоликова Л.М., Непомнящая Н.Б., Божко Н.В., Го ленищева Е.Н. Гастроэнтериты, вызванные «пандемичным» клоном Vibrio parahaemolyticus на территории России // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., ко лопроктол. – 2011. – Т.І, №5 (Прилож. №38, Матер. VІІ РГЭН). – С.46.
14. Рыковская О.А., Шалу О.А.*, Монахова Е.В., Смоликова Л.М., Чемисова О.С., Даликова Р.Р., Санамянц Е.М., Наумова Д.О. Клинические штаммы Vibrio parahaemolyticus, выделенные в России и Украине в разные годы // Рос. журн. га строэнтерол., гепатол., колопроктол. – 2012. – Т.ІІ, №5 (Прилож. №40. Матер.
VІІІ РГЭН). – С.128.
15. Монахова Е.В., Шалу О.А.*, Мазрухо А.Б., Смоликова Л.М., Непомнящая Н.Б. Изучение возможности формирования «пандемичных» клонов Vibrio parahaemolyticus на основе ретроспективного ПЦР-скрининга клинических штаммов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2012. – № 5. – С.
28-32. (из перечня ВАК) 16. Шалу О.А.*, Писанов Р.В., Монахова Е.В. Эффективность экспрессии гена tdh Vibrio parahaemolyticus зависит от двух точковых мутаций в его промо торной области // Генетика. – 2012. – Т.48, №12. – С.1364-1371. (из перечня ВАК) 17. Шалу О.А.*, Писанов Р.В., Монахова Е.В. Сравнительный анализ промоторных областей генов Канагава-позитивных и Канагава-негативных tdh Vibrio parahaemolyticus // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. пробл.
комиссии. – Ростов н/Д, 2012. – Вып. 25. – С.142-143.
18. Рыковская О.А. Шалу О.А.*, Монахова Е.В., Смоликова Л.М., Чемисова О.С., Голенищева Е.Н., Санамянц Е.М., Гальцева Г.В., Алленов А.В., Мур начев Г.П., Хоменко Т.В. Разработка комплексного метода оценки виру лентности парагемолитических вибринов // Клин. лаб. диагностика. – 2013.
– №2. – С.38-41. (из перечня ВАК) * фамилия Шалу О.А. изменена на Подойницына О.А.