Генетическая изменчивость цитоплазматических маркеров и биогеография лиственниц (larix mill., pinaceae) дальнего востока россии
На правах рукописи
Полежаева Мария Алексеевна ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ И БИОГЕОГРАФИЯ ЛИСТВЕННИЦ (LARIX MILL., PINACEAE) ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 03.00.05 – ботаника
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Екатеринбург – 2010
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии растений и животных Уральского отделения РАН
Научный консультант: доктор биологических наук Семериков Владимир Леонидович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Санников Станислав Николаевич доктор биологических наук, профессор Мухин Виктор Андреевич Ведущая организация Учреждение Российской академии наук Ин ститут общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Защита состоится « 6 » апреля 2010 г. В _ часов на заседании диссертационного совета Д 004.005.01 при Институте экологии растений животных УрО РАН по адре су: 620144, г. Екатеринбург, ул. 8 Марта, Факс: 8 (343) 260-82-56;
E-mail: [email protected] URL: http://www.ipae.uran.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии растений и животных УрО РАН.
Автореферат разослан « » марта 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Н.В. Золотарева ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Лиственница – одна из важнейших в экологическом и эко номическом отношениях бореальных хвойных пород нашей страны и основная лесооб разующая порода на территории Дальнего Востока России.
Род Larix считается относительно молодым. Для исследуемой территории описы вается большое число гибридных, окончательно несформировавшихся таксонов, чей видовой статус является спорным. Поэтому особенно актуально изучение истории формирования ареалов и генетического разнообразия видов этого региона.
Использование молекулярно-генетических маркеров в изучении лиственниц Си бири (Semerikov, Lascoux, 2003;
Семериков и др, 2007;
Phylogeography of Larix sukacze wii Dyl., 2008;
Phylogeography of Eurasian Larix, 2008) позволило выявить, что совре менное распределение генетической изменчивости таких видов, как L. sukaczewii Dyl., L. sibirica Ledeb. и L. gmelinii Rupr. сформировано событиями плейстоценовых вымираний и реколонизации северных частей таежной зоны из южных ледниковых ре фугиумов. Генетические исследования лиственниц Дальнего Востока также проводи лись как с помощью аллозимных маркеров (Потенко, Разумов, 1996;
Гончаренко, Си лин, 1997;
Semerikov et al., 1999;
Ларионова и др, 2004), так и ДНК маркеров (Conflict ing phylogenies…, 2003;
Semerikov, Lascoux, 2003;
Лёвина, Адрианова, 2003;
Генетиче ская изменчивость и взаимоотношения…, 2004;
Генетическая изменчивость и популя ционная…, 2004;
Изучение генетической изменчивости…,2008;
Васюткина, 2009;
Орешкова, Барченков, 2009;
и др.). Главным образом, данные работы были посвящены внутривидовой изменчивости и основывались на ограниченном материале, недостаточ ном для биогеографических заключений. Таким образом, большое значение имеет изу чение дальневосточных видов лиственниц на протяжении всего их ареала с привлече нием большого количества выборок и комплекса маркеров, позволяющих выявить ге незис популяций лиственниц в разных географических зонах, роль гибридизации в их видообразовании и генетическую изменчивость.
Цель и задачи исследования.
Цель работы – изучение биогеографии лиственниц, произрастающих на террито рии Дальнего Востока России, на основе структуры генетической изменчивости цито плазматических маркеров.
В задачи исследования входило:
1) исследование изменчивости митохондриальной и хлоропластной ДНК в попу ляциях дальневосточных лиственниц;
2) определение параметров внутри- и межпопуляционной изменчивости и гео графической структуры генетической дифференциации по двум типам генетических маркеров в популяциях дальневосточных лиственниц;
3) выявление позднеплейстоценовых областей сохранения древесной растительности и путей миграции лиственницы на территории Дальнего Востока.
Защищаемые положения:
1. Уровень изменчивости маркеров митохондриальной и хлоропластной ДНК ис следованных популяций лиственниц в основном обусловлен историческими событиями и находится в пределах изменчивости этих маркеров у видов сем. Pinaceae.
2. Географическая структура изменчивости маркеров хлоропластной и митохонд риальной ДНК указывают на обособленное генетическое положение лиственниц край него северо-востока Азии и, в частности, Камчатки, что обусловлено изоляцией их по пуляций в период последнего максимума оледенения в пределах современных ареалов.
3. Генетическое разнообразие лиственниц юга Дальнего Востока обусловлено относительно стабильными размерами их популяций даже в ледниковые фазы и воз можностью генетических потоков между континентальной частью и близлежащими островами.
Научная новизна. Впервые с использованием маркеров хлоропластной и мито хондриальной ДНК на обширном материале исследована генетическая изменчивость лиственницы континентального северо-востока Азии и о.Сахалина. Выявлена генетиче ская самостоятельность Larix cajanderi Mayr. и родственные связи лиственниц юга о.Сахалин с японской лиственницей L. kaempferi Lamb. Впервые исследована изменчи вость цитоплазматических генетических маркеров в популяциях лиственницы Камчат ки и Курильских островов (о.Шикотан и о.Итуруп). Проведено сравнительное исследо вание изменчивости цитоплазматических генетических маркеров на территории Вос точной Сибири и Дальнего Востока с привлечением большого числа выборок.
Практическая значимость. Полученные данные о внутрипопуляционном генети ческом разнообразии и географической дифференциации дальневосточных лиственниц могут быть использованы при разработке селекционных мероприятий и программ сохра нения биоразнообразия лесных генетических ресурсов, для дальнейших популяционно таксономических исследований лиственниц, для преподавания биологических в вузах.
Личный вклад соискателя. Автором выполнена работа по сбору полевого мате риала на территории Магаданской, Сахалинской, Камчатской областей и Хабаровского края. Работа по лабораторному анализу материала, в том числе предоставленного руко водителем, обобщению и интерпретации полученных данных выполнена автором само стоятельно.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на трёх конференци ях молодых ученых в ИЭРиЖ УрО РАН (Екатеринбург, 2007, 2008, 2009);
на меж дународном симпозиуме «Modern achievements in population, evolutionary and ecologi cal genetics» (Владивосток, 2007);
на Всероссийской конференции в рамках XII съезда Русского Ботанического Общества «Фундаментальные и прикладные проблемы бота ники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008);
международной конференции молодых ученых «Молодежь в науке – 2009» (Минск, Белоруссия, 2009);
на V съезде ВОГиС (Москва, 2009);
на 2-м международном совещании по сохранению лесных генетических ресурсов Сибири (Новосибирск, 2009).
Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в 9 работах, в том числе в 2 статьях в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 137 страницах, содержит 13 рисунков и 10 таблиц и 3 приложения. Список литературы включает 230 источников, 126 из которых на иностранном языке.
Благодарности. Автор благодарит научного руководителя д.б.н. В.Л. Семерикова за помощь в проведении экспериментальных работ и обсуждение результатов, а также С.А. Семерикову за ценные замечания в ходе подготовки диссертации. Автор выражает искреннюю благодарность А.Н. Беркутенко, администрации Института биологических проблем Севера ДВО РАН, а также сотрудникам лесхозов Сахалинской области за по мощь в организации сбора экспериментального материала.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В разделе рассматриваются биологические особенности рода Larix, различные точки зрения, касающиеся его эволюции, общие принципы систематического деления.
Дается краткая характеристика исследуемых видов. Отмечается, что у лиственниц дальневосточного региона широко распространены процессы естественной гибридиза ции. Приводится обзор зарубежных и отечественных работ по изучению разнообразия, дифференциации и родственных связей видов Larix. Особое внимание уделяется иссле дованиям дальневосточных видов с помощью молекулярно-генетических маркеров. От дельные разделы посвящены особенностям палеогеографии и характеристике типов рас тительности, распространенных на территории исследуемого региона в последний лед никовый максимум (ПЛМ, 18-20 тыс.л.н.). Также рассматривается влияние динамики численности популяций видов под действием климатических флуктуаций на величину и структуру их генетического разнообразия. Обосновываются преимущества использова ния унипарентально наследуемых маркеров в биогеографических исследованиях.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Видовой состав, характеристика и локализация выборок. Изучены выборки из популяций лиственниц Восточной Сибири и Дальнего Востока. Семь выбо рок с о.Сахалин и Курильских островов (о.Шикотан и о.Итуруп) собраны из области распространения L. kamtschatica (Rupr.) Carr. (=L. kurilensis Mayr.). Из мест произраста ния L. olgensis A.Henry – 4 популяции: три из Приморья и одна из Кореи. Из основной части ареала L. gmelinii (Rupr.) Rupr. – 11 популяций, включая центральную Якутию, Амурскую область, Хабаровский край, Читинскую область и Бурятию. Из мест описа ния гибридной L.czekanowskii Szaf. (L.gmelinii L.sibirica Ledeb.) – 5 популяций с се вера Красноярского края. Большую часть ареала L. cajanderi Mayr представляет 21 вы борка с северо-востока Азии, включая северо-восток Хабаровского края, восточную Якутию, Магаданскую область, Чукотский АО. Популяции лиственницы Камчатского края отнесены к подвиду L. kurilensis ssp. glabra Dylis. Выборка японской лиственницы L. kaempferi (Lamb.) Carriere (=L. leptolepis Siebold & Zucc.) взята из лесокультурных посадок Тамаринского лесхоза (южный Сахалин).
2.2 Материалы и методы, использованные в анализе генетической измен чивости хлоропластных микросателлитов и маркеров митохондриальной ДНК.
Геномную ДНК выделяли методом CTAБ из свежей хвои/камбия, высушенной в сили кагеле хвои или из проростков. Для анализа изменчивости хлоропластной ДНК (хпДНК) использовано пять микросателлитных маркеров (cpSSR): Pt26081 (A set of primers…, 1996) и четыре, разработанных нами (Полежаева, Семериков, 2009). Продук ты амплификации подвергались электрофорезу в 6% полиакриамидном денатурирую щем геле с последующим серебряным окрашиванием. Аллели обозначали по разнице в числе повторов: наиболее короткому из фрагментов присваивался номер 1, фрагменту длиннее на один нуклеотид – 2, и т.д. Комбинация аллелей всех локусов рассматрива лась как хлоротип (хлоропластный гаплотип).
Изменчивость митохондриальной ДНК (мтДНК) изучали по четырем поли морфным маркерам: интронам генов nad5(1-2r) и nad4(3c-4r) (Dumolin-Lapegue, 1997), некодирующему фрагменту UBC460 (RAPD-derived..., 2006) и фрагменту фланкирую щей области гена atpA (маркер разработан нами, не опубл.). Полиморфизм UBC460 вы являлся непосредственно после ПЦР электрофорезом в агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Изменчивость остальных фрагментов выявлялась после обработки ферментами (PCR-RFLP-маркеры) электрофорезом в 6% полиакрила мидном денатурирующем геле. Сочетание аллелей в четырех локусах митохондриаль ной ДНК определялось как митотип (митохондриальный гаплотип).
Для оценки уровня внутрипопуляционного генетического разнообразия рассчи тывали следующие показатели: общее число гаплотипов(No), эффективное число гапло типов (Nе), параметр внутрипопуляционной изменчивости (Н), стандартизированное разнообразие гаплотипов в популяции r(g), которое оценивает ожидаемое число гапло типов в популяции при заданном размере выборки, установленном в данном исследо вании как 7 (подсчитывали только для cpSSR маркеров). Иерархическое распределение генетической изменчивости внутри популяций, между ними и между группами популя ций, сформированными по таксономическому принципам, оценивалась анализом AMOVA с использованием программы Arlequine 3.1 (Excoffier et al., 2006). Генетиче ская подразделенность популяций определялась по величине индексов фиксации: GST, на основе частот гаплотипов в популяциях без учета информации о степени их сходст ва, и RST (cpSSR -маркеры) или NST (митохондриальные маркеры), которые вычисляют ся с учетом сходства между гаплотипами. Сравнение GST и RST (NST) (тест на филогео графическую структуру) проводили по алгоритму (Pons, Petit, 1995) в программе Permut. Парные RST и NST использовались в качестве межпопуляционных генетических дистанций. Для cpSSR-маркеров пространственная генетическая структура анализиро валась методом главных координат (РСА) в программе NTSYS-pc (Rohlf, 1988);
для митохондриальных маркеров группировка популяций, кроме как по таксономическому критерию, осуществлялась также методом SAMOVA (Dupanloup et al, 2002). Изоляция расстоянием для обоих типов маркеров анализировалась тестом Мантела (Mantel, 1967). Генетический поток для обоих гаплоидных маркеров оценивали на основе «ост ровной модели» по формуле Nm=[(1- FST) / 2 FST] (Takahata, Palumbi, 1985).
ГЛАВА 3. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ХЛОРОПЛАСТНЫХ МИКРОСАТЕЛЛИТОВ У ВИДОВ LARIX ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 3.1 Полиморфизм микросателлитных локусов хлоропластной ДНК. Внут рипопуляционная изменчивость. Суммарно найдено 29 аллелей. Семь аллелей обна ружено в локусе Pt26081, шесть – в локусах L-Pt30204 и L-Pt9393, L-Pt9891, и четыре – в микросателлите фрагмента L-trnLV. В каждом локусе преобладающими были 3-4 ал леля с унимодальным распределением их частот. Сочетание размерных вариантов в ло кусах у 1004 особей позволило выявить 115 хлоротипов, 51 из которых был уникаль ным (встретился однажды).
Таблица 1 - Средние по видам показатели полиморфизма маркеров хпДНК и мтДНК в исследованных популяциях Larix хпДНК мтДНК Виды No Ne r(7) No Ne n Н n Н 20 5 1.8 0.473 2.7 20 1 L. kurilensis ±0 ±0 ±0.1 ±0.045 ±0.1 ±0 ±0 ± ssp.glabra 22.58 9.05 5.7 0.824 4.7 20.84 1.16 1 0. L.cajanderi ±9.07 ±3.5 ±2.67 ±0.12 ±1.0 ±8.3 ±0.4 ±0.1 ±0. 17.31 9.06 5.5 0.864 5.0 16.69 2.06 1.5 0. L. gmelinii ±6.57 ±2.74 ±1.67 ±0.05 ±0.5 ±6.6 ±0.4 ±0.3 ±0. 10.6 7.6 5.4 0.888 5.6 10 1.4 1 0. L. czekanowskii ±3.0 ±0.9 ±1.9 ±0.085 ±0.8 ±1.9 ±0.5 ±0.5 ±0. 21.43 10.14 5.9 0.838 4.9 20.86 2.86 2 0. L. kamtschatica ±2.44 ±1.95 ±2.01 ±0.12 ±0.8 ±2.9 ±2.1 ±1.1 ±0. 11.75 8.5 5.71 0.848 3.2 12 2.25 2 0. L.olgensis ±1.89 ±1.29 ±2.96 ±0.16 ±1.4 ±2.2 ±1.5 ±1.2 ±0. 8 4 2.9 0.750 3.8 8 1 1 L.kaempferi Среднее по всем 18.6 8.8 5.4 0.831 4.8 18 1.7 1 0. популяциям ±7.8 ±2.88 ±2.26 ±0.123 ±0.96 ±7.3 ±1.07 ±0.62 ±0. Всего 1004 115 956 Примечание - n – средний размер популяционной выборки, No – среднее число хлороти пов/митотипов в популяции, Ne – среднее эффективное число хлоротипов/митотипов, Н – среднее значение параметра внутрипопуляционной изменчивости, r(7) – среднее стандартизированное раз нообразие хлоротипов в популяции (на выборку в 7 особей), ± – стандартное отклонение.
Средние оценки разнообразия по видам примерно одинаковы (табл.1), однако по всем изученным популяциям значительно варьируют. Почти во всех выборках присут ствуют уникальные и редкие хлоротипы. Показатель общего количества хлоротипов (No) варьировал от 3 до 18. Параметры оценки изменчивости, учитывающие размер вы борки: эффективное число хлоротипов (Ne) изменялось от 1.7 до 12.2;
H – от 0.441 до 0.977.
Число хлоротипов при стандартизированном размере выборки в 7 особей изменялось от 2.6 до 6.5, составляя в среднем 4.8. Большинство исследованных популяций характери зуется высокими значениями параметров внутрипопуляционной изменчивости (Ne 2.4;
H 0.645;
r(7) 3.4). Однако низкие показатели изменчивости (Ne = 1.7-2.4;
H = 0.441 - 0.645;
r(7) = 2.6-3.4) наблюдаются в некоторых популяциях с северного побере жья Охотского моря (№5), из Якутии (№ 19), Чукотки (№ 4), Камчатки (№ 1, 2), юга Приморья (№ 51), а также с о.Шикотан (№ 49) (расположение популяций см. на рис. 2 Б). Вероятнее всего это связано с дрейфом генов в результате резкого сокращения числен ности и длительной изоляции популяций, повлекшими за собой потерю генетической изменчивости в ходе неблагоприятных климатических фаз (например, в выборке из ок рестностей г. Магадан из шести обнаруженных хлоротипов один достигает частоты 70.8%, что указывает на событие «бутылочного горлышка» в истории этой популяции).
3.2 Межпопуляционная и пространственная дифференциация. Географиче ское распространение девяти наиболее частых хлоротипов отражает генетические связи между популяциями на изученной территории (рис. 1).
L. decidua L. decidua L. sukaczewii (западная L. sibirica) L. sukaczewii (западная L. sibirica) Ле Ле на o на o О бь О бь Охотское море Охотское мо ре 30o 3 0o хлоротип H хлоротип H 6 хлоротип H1 хлоротип H остальные хлоротипы остальные хлоротипы A Б L. sukaczewii (западная L. sibirica) Ле на О бь Охотское море Охотское мо ре хлоротип Н40 хлоротип Н45 хлоротип Н30 хлоротип Н остальные хлоротипы остальные хлоротипы хлоротип Н В Г Рисунок 1 - Географическое распределение избранных хлоротипов. А: хлоротипов Н6 и Н72;
Б: хлоротипов Н 1 и Н 2;
В: хлоротипов Н40 и Н45;
Г: хлоротипов Н30, Н32 и H36.
Так, хлоротип Н6 распространен только на северо-востоке изученного региона к востоку от Верхоянского хребта, в то время как хлоротип Н72, наоборот, встречается в выборках Восточной Сибири к западу от него, отсутствуя на юге Дальнего Востока (рис. 1-А). Хлоротипы Н1 и Н2 наиболее распространены и встречаются на всей изу ченной территории (рис. 1-Б). Хлоротипы Н40 и Н45 встречаются в основном на юге Дальнего Востока и вдоль западного побережья Охотского моря (рис. 1-В). Хлоротипы Н30, Н32 и Н36 специфичны для выборок с Сахалина, Курильских островов и выборки L. kaempferi (рис. 1-Г).
Индексы дифференциации изменчивости хпДНК составили: GST = 0.144;
RST = 0.432, причем RST значимо превышало GST (P 0.001), указывая на наличие филогео графической структуры. По результатам анализа молекулярной изменчивости AMOVA в доле общей изменчивости cpSSR локусов при учете родства хлоротипов 31.74% из менчивости распределено между семью таксонами, 11.48% соответствует межпопуля ционным различиям, большая же часть изменчивости – 56.79% распределена внутри популяций. Дополнительный анализ, проведенный для проверки самостоятельности таксона L. cajanderi, выявил его значительную дифференциацию как от всех остальных изученных видов (RCT = 20.3%), так и от L. gmelinii (RCT = 24.87%). Тест Мантела вы явил значимую корреляцию между парными генетическими (RST) и географическими дистанциями (r = 0.36, Р 0. 05).
0. 1 20 39 33 25 2 35 21 23 10 L. cajanderi 22 34 13 12 27 L. kurilensis 31 32 40 42 16 0. 11 51 24 ssp. glabra 5 38 19 40 18 13 8 17 28 36 Ле 30 42 19 на 26 6 №2 41 24 Охотское №1 L. x czekanowskii море №3 L. gmelinii 22 Dim-1 -0.2 53 54 32 гибриды L. kamtschatica 43 45 №5 34 46 52 L. sibirica -0. 47 №4 L. olgensis L. kaempferi -0.6 0.29 0.09 0.11 -0.31 -0. B A Dim- Рисунок 2 - Изменчивость хпДНК исследованных популяций Larix. А: Ординация популяций в плоскости главных координат (РСА), в качестве дистанций между популяциями использованы значения парных RST. Б: Географическое распределение групп популяций В плоскости главных координат популяции образовали четыре группы, выборка японской лиственницы расположилась отдельно (рис. 2). Первая ось четко отделила L.
kamtschatica и две выборки ольгинской лиственницы от всех остальных видов. Вторая ось выявила географическую структурированность в пределах ареала L. cajanderi, отде лив группу популяций непосредственно с северного побережья Охотского моря и более континентальной части. Следует отметить, что в ходе исследования установлено, чем большее количество выборок и изменчивых локусов включается в анализ, тем четче проявляется структура, отражающая исторические связи (Полежаева, Семериков, 2007;
2008;
2009).
ГЛАВА 4. ИЗМЕНЧИВОСТЬ МАРКЕРОВ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК У ВИДОВ LARIX ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 4.1 Полиморфизм маркеров митохондриальной ДНК. Внутрипопуляционная изменчивость. Выявлено 11 митотипов, в том числе предположительно рекомбинантной природы, которые обусловили ретикулярный характер дерева взаимоотношения митоти пов (рис. 3-А). Хотя в норме митохондриальная ДНК не рекомбинирует, наследуясь кло нально, все же такие довольно редкие примеры известны для растений, в том числе хвойных – в роде Picea (Jaramillo-Correa, Bousquet, 2005), а также Larix (Semerikov, Las coux, 2003).
Из исследованных популяций 26 оказались фиксированными по одному митотипу, остальные 28 – полиморфными (рис. 3-Б). Наиболее изменчивыми были выборки, взятые из зоны распространения L. kamtschatica и L. olgensis и их гибридов с L. gmelinii, 9 и 4 ми тотипов, соответственно. Наименее изменчивыми (табл. 1) оказались выборки L. kurilensis ssp. glabra с Камчатки и L. kaempferi, у которых было обнаружено по одному митотипу.
Выборки, относящиеся к L. cajanderi, также почти фиксированы по одному митотипу. В большинстве выборок L. gmelinii представлены два митотипа. Значения параметров внут рипопуляционной изменчивости в большинстве популяций невысокие: число митотипов No=1-2, эффективное число митотипов Ne = 1-1.2;
индекс разнообразия митотипов H = 0 0.556. Примечательны значительные различия показателей изменчивости в выборках с се веро-восточной части исследуемой территории (№ 1-20, рис. 3-Б) с низким индексом раз нообразия митотипов H = 0-0.184 и некоторых популяций с о.Сахалин и Приморья, кото рые, напротив, имеют довольно высокие его значения H = 0.546-0.812 (№ 43, 44, 46, 52, рис. 3-Б), что, как и в случае с изменчивостью хлоропластных маркеров, объясняется ис торией формирования северо-восточных популяций, претерпевших значительное сокра щение численности и стабильно большим эффективным размером популяций юга Дальне го Востока.
4.2 Межпопуляционная и пространственная дифференциация. Географиче ское распространение митотипов указано на рис. 3-Б. Несколько однородных в генети ческом отношении групп популяций представляют следующие виды: L. kurilensis ssp.
glabra (группа I: № 1-2), L. cajanderi (группа II: № 3-21), гибриды между L.sibirica и L.
gmelinii – L.czchekanowskii (группа III: № 38-41), L. gmelinii (группа IV: № 22-37), L.
olgensis (группа V: № 50-53), L. kurilensis (группа VI: № 43-49) и L. kaempferi (группа VII: № 54). Значение параметра межпопуляционной дифференциации, вычисленного на основе частот митотипов в популяции GST = 0.786 аналогичного ему параметра, учиты вающего также и родство митотипов (количество мутаций, на которое один митотип отличается от другого), NST = 0.823. Значимые различия этих коэффициентов (NST GST;
Р 0.05) указывают на наличие филогеографической структуры, т.е. разные, но филогенетически близкие митотипы имеют тенденцию сосуществовать совместно. Ие рархический анализ AMOVA показал, что при учете родства митотипов около 62% всей изменчивости приходится на различия между семью видами, в то время как 20.5% приходится на изменчивость между популяциями внутри видовых групп.
Между L. cajanderi и остальными исследованными таксонами c учетом родства митотипов дифференциация составила 42.6%, а между L. cajanderi и L.
gmelinii – 57.6%. Тест Мантела выявил корреляцию между матрицами парных генети ческих дистанций (NST) и географических расстояний (r = 0.19, P 0.05), подтверждая влияние изоляции расстоянием на дифференциацию данных популяций.
Тем не менее альтернативная группировка, которая была проведена анализом SAMOVA, сопоставляющим генетические дистанции между популяциями с географиче скими при заданном числе групп К (К = 2-10), выявила, что оптимальное число групп, когда более 77% всей изменчивости распределено между ними, и при этом отсутствуют группы, содержащие только одну популяцию, равно шести. Причем группы по составу заметно отличались от выделенных на основе таксономического критерия (рис. 4). Таким образом, анализ SAMOVA выявил, что структура генетической изменчивости митохонд риальных маркеров в большей степени отражает географическую структурированность изученных популяций, но не вполне совпадает с их таксономическим делением.
A 11 41 18 12 40 17 85 14 15 32 33 35 27 36 30 29 Б Группа Рисунок 3 (вверху) – Группа А: ареалы видов Larix, располо Группа жение проанализированных вы Группа борок и частоты митотипов;
Б:
Группа дерево минимальных расстояний Группа между митотипами Рисунок 4 (слева) – Распределе ние изученных популяций Larix по шести группам согласно ана лизу SAMOVA ГЛАВА 5. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ, ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ И БИОГЕОГРАФИЯ ЛИСТВЕННИЦ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ 5.1 Генетическая изменчивость и дифференциации изученных популяций лиственниц. Исследования видов Larix с использованием аллозимных маркеров (Се мериков, Матвеев, 1995;
Потенко, Разумов, 1996;
Гончаренко, Силин, 1997;
Semerikov et al., 1999;
Ларионова и др., 2004;
Орешкова, Барченков, 2008;
и др.) выявили, что уровень их ге нетического полиморфизма близок к другим видам хвойных (Путенихин и др, 2004). Те же тенденции прослеживаются и при использовании цитоплазматических маркеров:
значения параметров их изменчивости схожи с таковыми большинства широко распро страненных хвойных (Genetic diversity and population..., 2006;
Comparison of genetic diversity..., 2002;
Jaramillo-Correa et al, 2004;
Phylogeography of a northeast Asian spruce…, 2007;
Phylogeography of Pinus…, 2008;
и др.). По сравнению с оценками популяционной дифференциации, основанной на данных изменчивости аллозимных ядерных маркеров (FST = 0.202;
Semerikov et al. 1999) в популяциях, собранных из тех же регионов северо восточной Азии, оценки, основанные на изменчивости мтДНК маркеров (GST = 0.786;
NST = 0.823), были выше, а на основе изменчивости хпДНК маркеров (GST = 0.144;
RST = 0.432) примерно такие же. Подобная закономерность выявлена и у других видов вет роопыляемых хвойных (Decoupled mitochondrial and chloroplast …, 2006;
Phylogeography of a northeast Asian spruce…, 2007;
Du et al. 2009). Разница оценок, полученных по ядерным и цитоплазматическим маркерам, может объясняться различиями в потоках генов. По скольку мтДНК у лиственниц наследуется по материнской линии (DeVerno et al., 1993), поток генов (Nm = 0.141), обусловленный распространением семян, достаточно ограни чен. Напротив, поток генов наследуемой по отцовской линии хпДНК, обеспечиваемый как за счет распространения семян, так и за счет разносимой ветром пыльцы (Szmidt et al., 1987), на порядок больше (Nm = 1,8). Ядерные гены распространяются также через пыльцу и семена, а потому имеют сходные значения потока (Nm = 1.975). Таким образом, изменчивость митохондриального генома оказывается более структурированной по срав нению с хлоропластным и ядерным. Совместное использование двух типов цитоплазма тических маркеров позволяют получить полную картину истории расселения и таксоно мической дифференциации лиственниц в данном регионе.
5.2 Биогеография лиственниц Дальнего Востока России на основе структуры из менчивости мтДНК и хпДНК. Выявленная в данной работе структура изменчивости митохондриальной и хлоропластной ДНК видов Larix на Дальнем Востоке указывает на значительную роль плейстоценовых похолоданий в истории формирования древесной растительности на данной территории, а также на сложные процессы гибридизации и видообразования видов лиственниц, которое продолжается здесь и в настоящее время.
Larix cajanderi и рефугиум лесной растительности на побережье Охотского мо ря. Общепринятым является мнение, что на территории крайнего северо-востока Азии в период последнего ледникового максимума преобладала растительность открытых пространств (Adams & Faure 1997;
Edwards et al. 2000). Однако не исключается суще ствование позднеплейстоценовых рефугиумов древесной растительности в западной Берингии (Кременецкий, 1994;
Last glacial maximum biomes..., 2007), в том числе вдоль осушенного шельфа на побережье Охотского моря (Ложкин, 2002;
Beringia as a glacial refugium..., 2005). Преобладание на северо-востоке Азии (рис. 3-Б, группа II) митотипа G1 совпадает с областью распространения Larix cajanderi (Бобров, 1978, Seed collection..., 2002), не всегда признаваемой в ранге самостоятельного вида (Дылис, 1961;
Farjon, 1990). Несмотря на это, анализ SAMOVA (рис. 4) не четко отделил попу ляции северо-востока от остальных восточносибирских, что указывает на недавнюю дивергенцию L. cajanderi от L. gmelinii. Отличие этих двух групп зафиксировали хло ропластные маркеры. На территории северо-востока распространен специфичный хло ротип Н6, который не встречается за пределами Верхоянского хребта, в то время как хлоротип Н72 распространен в остальной части Восточной Сибири (рис. 1-А). Орди нация популяций на основе парных RST выявила среди L. cajanderi популяции как близкие к типичной L.gmelinii, так и достаточно дифференцированные от нее, в част ности, группу популяций непосредственно с побережья Охотского моря (рис. 2). Осо бый характер лиственниц побережья Охотского моря ранее отмечался рядом авторов (Дылис, 1961;
Бобров, 1978), а некоторыми даже возводился в ранг вида – L. ochoten sis (Колесников, 1946). Различия лиственниц Восточной Сибири и крайнего северо востока Азии также показаны ранее по ядерным маркерам (Semerikov et al., 1999;
Phy logeography of Eurasian Larix..., 2008). Все это подтверждает возможность выживания лиственницы северо-востока в периоды оледенений в пределах ее современного ареа ла. Географическое распределение митотипов и хлоротипов отражает самостоятельное историческое развитие лиственниц по разные стороны от Верхоянского хребта, покры того во время последнего ледникового максимума ледниками (Развитие ландшаф тов...,1993) и выступавшего в качестве мощного барьера для потока генов, что способ ствовало обособленной эволюции лиственницы на крайнем северо-востоке и образова нию нового вида – L. cajanderi.
Таксономический статус и история лиственницы Камчатки. Камчатская популя ция мономорфна по митотипу S (рис. 3-Б, группа I), с низкой частотой также встре чающегося на севере и юге о.Сахалин и в Хабаровском крае (популяции № 27, 43 и 46, рис. 3-Б). Одними авторами для Камчатского полуострова указывается распростране ние либо L. cajanderi (Бобров, 1978), либо L. gmelinii (Farjon, 1990). Другие трактуют ее как L. gmelinii var. kamtschatica (Seed collection..., 2002) или L. kurilensis ssp. glabra.
Обособленный характер популяций лиственницы с Камчатки отмечался также по ка риологическим (Муратова, 1993) и фенотипическим признакам (Putenikhin, 1998). В нашем исследовании SAMOVA выделил по митохондриальным данным камчатские популяции в самостоятельную группу (рис. 4). Однако присутствие митотипа S в крае вых популяциях Сахалина (рис. 3-Б) указывает на его более широкое распространение в прошлом и, несомненно, близкое родство лиственниц Камчатки и Сахалина. Хлоро пластные данные, напротив, указывают на родство лиственницы Камчатки с L.gmelinii в широком ее понимании (рис.1-А;
2). Следует отметить, что по ядерным маркерам было зафиксировано значительное отличие L.gmelinii var. kamtschatica от L.gmelinii из центральной Сибири, однако L.gmelinii var. kamtschatica практически не отличалась от L. cajanderi (FST = 0,01-(-0,11)) (Phylogeography of Eurasian Larix..., 2008). Подобное несоответствие в распределении митохондриальных и хлоропластных гаплотипов у лиственницы на Камчатке может быть объяснено ее предположительно гибридным происхождением в эпоху, предшествующую одному из последних оледенений. Веро ятно, популяции лиственницы, близкие современной L. kamtschatica, распространен ной ныне на Сахалине и Курильских островах, обитали повсеместно на Дальнем Вос токе. В ходе оледенения лиственница на севере Дальнего Востока исчезла, сохранив шись на Камчатке. При наступлении благоприятных климатических условий безлес ные северные территории заселились популяциями, близкими современной L. gmelinii s.l., которые проникли и на Камчатку, сформировав гибридный комплекс с автохтон ными формами. Особенности распространения митохондриальной и хлоропластной ДНК обусловили сохранение пула матерински наследуемых митотипов автохтонных популяций и замещение пула автохтонных хлоротипов на хлоротипы пришлых попу ляций. Альтернативная гипотеза предполагает заселение Камчатки из рефугиума с юга Дальнего Востока через о-ва Сахалин, Хоккайдо и гряду Курильских островов. Однако она маловероятна, так как считается, что один из самых крупных проливов Курильской гряды – Буссоль – не исчезал в период последнего ледникового максимума, и таким образом, представлял собой биогеографический барьер (Богатов, 2002). В пользу со хранения на Камчатке древесной растительности в период последнего максимума по холодания свидетельствует биогеография Picea jezoensis и Abies gracilis, чьи популя ции с полуострова резко дифференцированы от близкородственных видов с юга Даль него Востока (Potenko, Knysh, 2003;
Range-wide genetic structure..., 2009;
Семерикова, Семериков, 2008). Таким образом, использование двух типов цитоплазматических мар керов, имеющих контрастное наследование, позволило выявить гибридный генезис по пуляций лиственниц Камчатки, что было невозможным при использовании ядерных (Phylogeography of Eurasian Larix..., 2008) или только одних митохондриальный данных (Семериков, Полежаева, 2007). Генетическая обособленность популяций лиственницы Камчатки подтверждает правомерность выделения ее в самостоятельный таксон.
Лиственницы юга Дальнего Востока. Отношение лиственницы с юга Сахалина с остальными видами. По палеогеографическим реконструкциям в сартанское время оледенение отсутствовало на юге Дальнего Востока и близлежащих островах. Здесь были распространены редкостойные лиственничники и местами сохранялись элементы третичной флоры (Короткий и др., 1999;
Реликтовые комплексы…, 2009). Наибольшая изменчивость мтДНК выявлена на о.Сахалин (рис. 3-Б, группа VI), для которого раз ными авторами указывается повсеместное распространение L. gmelinii var. japonica (Farjon, 1990) или L. kamtschatica, а для северной части гибриды L. gmelinii L. kam tschatica (Дылис, 1961;
Бобров, 1978). Для континентальной части юга Дальнего Восто ка также описываются популяции лиственниц, характеризующиеся промежуточными морфологическими признаками между L. gmelinii, L. cajanderi, L. olgensis и L. kam tschatika. Многообразие митотипов (в том числе рекомбинантных), очевидно, обусловле но процессами гибридизации при перекрывания ареалов изолированных и частично дифференцировавшихся популяций. Подобные события в период плейстоцена могли по вторяться неоднократно, учитывая флуктуации климата, влияющие на размеры популя ций, и исчезновение проливов между материком и о. Сахалин, а также о.Сахалин и Ку рильскими островами. Гибридное происхождение лиственниц на данной территории бы ло также показано с использованием аллозимных (Semerikov et al., 1999) и митохондри альных (Semerikov, Lascoux 2003) маркеров.
Соединением в течение плейстоцена о.Сахалин в его северной части с матери ком (Плетнев, 2004) объясняется преобладание здесь митотипов G1 и G2 и гибридов L.
gmelinii L. kamtschatica. Согласно этому SAMOVA объединил в одну группу популя ции с северного и среднего Сахалина с материковыми популяциями (рис. 4). SAMOVA также объединил выборки L. olgensis из Приморья с выборками с севера Красноярского края (рис. 4), которые располагаются в зоне гибридизации L. gmelinii и L. sibirica (Круклис, Милютин, 1977;
Катышев и др., 2004). Учитывая, что митотип L. olgensis яв ляется предковым по отношению к митотипам всех остальных видов североевроазиат ских лиственниц и обычен у L. sibirica (Semerikov, Lascoux, 2003;
RAPD-derived …, 2006), подобное объединение закономерно. В выборке L. olgensis, взятой из места, от куда она была впервые описана А. Генри (Бобров, 1978) – бухты Ольга (51, рис. 3-Б), митотип L фиксирован. К югу от бухты Ольга на протяжении ареала L. olgensis частота митотипа L уменьшается, появляются даурский митотип G2, редкий митотип U (веро ятно, рекомбинантный от SN и G2) (рис. 3-Б), что говорит о замещении этого древнего вида гибридами (Semerikov, Lascoux, 2003). Хлоропластные данные указывают на об щий генетический пул лиственниц восточной Сибири (рис. 1;
2).
Как митохондриальные (рис. 3-Б;
4), так и хлоропластные (рис. 1-Г;
2) данные указывают на родственную связь лиственниц юга Сахалина с японской лиственницей Larix kaempferi. Присутствие в естественных популяциях лиственницы на Сахалине ми тотипа К (рис. 3-Б), а также хлоротипа Н36 (рис. 1-Г), специфичного для японской ли ственницы, может быть частично объяснено лесокультурной деятельностью на юге ост рова. Однако присутствие митотипа К на севере острова, а также наличие рекомби нантных митотипов, содержащих признаки японской лиственницы (KG1, KG2, КS), не позволяет рассматривать это объяснение как единственное. Очевидно данный митотип, как и его производные автохтонный для Сахалина. Фиксация митотипа К на о.Хонсю, очевидно, произошла в результате эффекта основателя при проникновении лиственни цы на остров на фоне резких сокращений размера популяции в межледниковьях. Так, пыльцевые данные свидетельствуют о распространении лиственницы в позднем плей стоцене по всей Японии (Igarashi, 1994), с наступлением же благоприятной обстановки, она в результате конкуренции с теплолюбивыми видами сохранилась только в горах Хонсю на больших высотах. Можно предполагать, что лиственницы Сахалина и Япон ских островов некогда составляли единый вид, впоследствии разделенный физически ми и ценотическими барьерами.
ВЫВОДЫ 1. Уровень изменчивости микросателлитных локусов хлоропластной ДНК и по лиморфных фрагментов митохондриальной ДНК лиственниц Дальнего Востока нахо дится в пределах изменчивости этих маркеров у других видов сем. Pinaceae. Отклоне ния в отдельных популяциях могут быть объяснены сокращениями их численности в прошлом и процессами гибридизации.
2. Структура изменчивости митохондриальной и хлоропластной ДНК подтвер ждает, что в течение последнего ледникового максимума лиственница сохранялась на побережье Охотского моря, на Камчатке, в Приморье и на Сахалине.
3. Характер распределения митохондриальных и хлоропластных гаплотипов в со временных популяциях лиственницы с Камчатки обусловлено процессами интрогрес сивной гибридизации между популяциями, пережившими последние ледниковые мак симумы на полуострове, и популяциями, заселившимися на него позже.
4. Структура изменчивости хлоропластных и митохондриальных генетических маркеров указывает на то, что Верхоянский хребет в прошлом представлял собой барь ер для потока генов, определивший генетическую обособленность лиственниц северо востока Азии и самостоятельный видовой статус восточной расы даурской лиственни цы – Larix cajanderi.
5. Генетическое разнообразие митохондриальных маркеров лиственниц юга Дальнего Востока свидетельствует об отсутствии значительных сокращений размеров их популяций на протяжении плейстоцена и о процессах гибридизации между отдель ными таксонами.
6. По обоим типам цитоплазматических генетических маркеров популяции лист венницы юга о.Сахалина обнаруживают родственные связи с Larix kaempferi, произра стающей ныне на о. Хонсю (Япония), указывая на возможность генетического обмена между ними в прошлом. По данным митохондриальной ДНК популяции с северного Сахалина несут генетические признаки миграций со стороны континентальных попу ляций.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ – статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ:
1.Семериков В.Л. Структура изменчивости митохондриальной ДНК лиственниц Восточной Сибири и Дальнего Востока / В.Л. Семериков, Полежаева М.А. // Генетика.
2007. Т.43. №6. С 782-789.
2. Полежаева М.А. Генетическая изменчивость cpSSR маркеров в роде Larix на Даль нем Востоке / М.А. Полежаева, В.Л. Семериков // Вестник СВНЦ, 2009. №2. С. 75-84.
– публикации в других изданиях:
3. Семериков В.Л. Исследование изменчивости митохондриальной ДНК листвен ниц Дальнего Востока / В.Л. Семериков, М.А. Полежаева // «Лесные экосистемы Се веро-Восточной Азии и их динамика: материалы междунар. конф. Владивосток. 2006.
С.234-237.
4. Polezhaeva M.A. Variation of mtDNA in larch species of Eastern Siberia / M.A.
Polezhaeva, V.L. Semerikov // Modern achievements in population, evolutionary and eco logical genetics: аabstracts of international symposium. Vladivostok. 2007. -P.45.
5. Полежаева М.А. Генетическая изменчивость лиственниц Дальнего Востока на основе изменчивости цитоплазматических маркеров / М.А. Полежаева, В.Л. Семериков // Экология: от Арктики до Антарктики: материалы конф. молодых ученых. Екатерин бург, 2007.С.238-247.
6.Полежаева М.А. Изучение истории расселения лиственниц Дальнего Востока на основе изменчивости цитоплазматических маркеров / М.А. Полежаева // Сохранение био разнообразия Камчатки и прилегающих морей: материалы VIII международной научной конференции, посвященной 275-летию с начала Второй Камчатской экспедиции (1732– 1733 гг.). – Петропавловск-Камчатский, 2007. С. 159-163.
7. Полежаева М.А. Новые данные о плейстоценовом рефугиуме лесной расти тельности на побережье Охотского моря: молекулярный подход./ М.А. Полежаева, В.Л. Семериков // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: материалы всероссийской конференции, проведенной в рамках XII съезда Русско го Ботанического Общества.Петрозаводск, 2008. Часть 3, С.59- 8. Полежаева М.А. срSSR маркеры: новый подход в изучении истории древес ной растительности Дальнего Востока (на примере рода Lаrix)./ М.А. Полежаева.// Со временное состояние и пути развития популяционной биологии: материалы X всерос сийского популяционного семинара. Ижевск, 2008. С.361- 9. Полежаева М.А. Изменчивость митохондриальной ДНК лиственниц Восточной Евразии. / М.А. Полежаева // Материалы V съезда ВОГиС. Москва, 2009. С. 179.
_ Пописано в печать 15.01.2010 г. Формат 60 84 1/ Усл. печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Заказ № _ Отпечатано в типографии Института экономики УрО РАН 620014, г.Екатеринбург, ул. Московская, 29. Тел.: (343) 371-16-