Идентификация и анализ генов, вовлеченных в развитие коры головного мозга млекопитающих.

На правах рукописи

ПОЛЯКОВ АЛЕКСАНДР СВЯТОСЛАВОВИЧ ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ГЕНОВ, ВОВЛЕЧЕННЫХ В РАЗВИТИЕ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

Специальность – 03.00.26 – «молекулярная генетика»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН Научные руководители:

член-корреспондент РАН, Л.И. Корочкин доктор медицинских наук, профессор кандидат биологических наук Г.В. Павлова

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор К.В. Анохин доктор биологических наук, профессор С.А. Лимборская

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится «22» декабря 2006 года в « » часов на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан « 2006 года »

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат фарм. наук Л.С. Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность проблемы. В последние годы обнаружена существенная генетическая обусловленность поведенческих реакций млекопитающих и человека.

Роль наследственности в формировании личности оказалась значительно большей, чем это было принято считать. Изучению этой роли способствовало вторжение в неврологию современной молекулярно- биологической и молекулярно генетической техники. Понятно, что особое внимание уделяется при этом тем отделам головного мозга, которые играют определяющую роль в детерминации поведения в первую очередь теленцефалону.

Основными компонентами теленцефалона являются паллиум (pallium) (кора головного мозга у млекопитающих) и субпаллиум (subpallium) (базальный ганглий). Функционирование теленцефалона зависит от интегрального взаимодействия с рядом нейрональных структур, таких как таламус, гипоталамус, обонятельный эпителий и ствол мозга. Данные структуры ответственны как за обработку сенсорной информации, так и за ее интеграцию с ранее установленной памятью (приобретенной и инстинктивной) и последующее формирование поведенческих реакций.

Теленцефалон человека- это область, где сосредоточены нейральные элементы, ответственные за языковые функции, за контроль двигательной деятельности, сознание и эмоции. Различного рода повреждения данной структуры приводят к специфическим сенсорным, моторным и эмоциональным расстройствам, к существенным изменениям личности. Теленцефалон контролирует сходные функции в ряду позвоночных и основные элементы его организации теленцефалона в эволюции в ряду позвоночных, несмотря на высокую морфологическую вариабельность.

Исследования развития теленцефалона способны ответить на вопросы, касающиеся закономерностей функционирования и эволюции мозга. Они установят топологическую взаимосвязь регионов теленцефалона и определят гомологию между производными теленцефалона различных животных, раскроют механизмы, обусловливающие у человека ряд поведенческих особенностей и заболеваний, таких как ментальная ретардация, аутизм, эпилепсия и др. Знание о том, как формируется теленцефалон откроет новые пути в разработке лекарств против некоторых нейрологических и психических расстройств.

До последнего времени исследования развития теленцефалона ограничивались изучением морфологии и анатомии. И в этой области накоплен значительный фактический материал. Однако молекулярно- биологические основы развития и функционирования теленцефалона остаются в значительной степени непознанными. Определенный прорыв в определении генов, вовлеченных в развитие теленцефалона был сделан благодаря применению методов молекулярной генетики. Выстраиваются генетические сети, контролирующие особенности создания паттерна и организации обусловленных ими поведенческих реакций.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования – идентификация генов, вовлеченных в регуляцию развития коры головного мозга. Задачи исследования предусматривают: 1) разработку методики поиска и отбора генов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга;

2) клонирование и определение первичной последовательности полноразмерных кДНК полученных генов;

3) анализ экспрессии;

4) функциональный анализ.

Научная новизна и практическая ценность работы. С помощью метода вычитающей гибридизации клонирован ряд транскриптов, дифференциально экспрессирующихся в коре головного мозга. Проведен анализ паттернов экспрессии выявленных генов в эмбриональной коре головного мозга.

Выявленные в ходе данной работы гены являются молекулярными маркерами различных слоев коры и могут быть использованны как инструмент для изучения развития коры головного мозга.

Один из генов, Sip1 был подвергнут функциональному анализу с использованием метода ткане-специфической инактивации белкового продукта гена. Показано, что функция данного гена необходима для нормального развития медиального компонента коры головного мозга.

Линия мышей с инактивированным геном Sip1 в коре головного мозга является моделью синдрома Mowat- Wilson человека. Данная линия мышей поможет при изучении данной болезни, характеризующейся дефектами в структуре медиального аспекта коры головного мозга.

Публикации. По теме диссертации опубликовано две печатные работы.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на двух международных конференциях (Annual meeting of German genetic society, Kassel, 2003;

Neural Stem Cell Conference, Melbourn, 2003), семинар лаборатории «нейрогенетики и генетики развития», Институт биологии гена РАН (февраль 2006).

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на « 92 » страницах машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (95 источников). Содержит 21 рисунок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Применение вычитающей гибридизации на модели коры головного мозга мыши. Для идентификации генов, регулирующих развитие коры головного мозга, мы использовали метод супрессионной вычитающей гибридизации ПЦР амплифированных кДНК библиотек коры головного мозга. Для вычитающей гибридизации использовались библиотеки кДНК, приготовленные на основе тотальной РНК коры головного мозга, взятой на стадиях Е13 и Е эмбрионального развития мыши. Е13 - стадия, при которой происходит ранняя регионализация коры головного мозга и определяется клеточная судьба глубоких слоев коры. Данные о роли регуляторных молекул пролиферативного компартмента в развитии коры головного мозга продолжают накапливаться.

Предполагается, что направление клеточной дифференцировки определяется регуляторными молекулами в пролиферативном слое. Эти регуляторные молекулы определяют пролиферацию в зоне деления и размечают территорию внутри коры головного мозга.

Для идентификации генов вентрикулярной зоны была получена библиотека кДНК, обогащенная транскриптами, специфичными для Е13. Отобранные после первичного скрининга транскрипты секвенировались и далее были использованы в качестве зондов для гибридизации против исходных амплифицированных кДНК стадий Е13 и Е15. Транскрипты, воспроизводящие дифференциальность, отбирались для детального анализа экспрессии. На основе ДНК фрагментов ДЭГ синтезировались РНК-зонды, меченные изотопом серы 35. Далее проводилась in situ гибридизация со срезами эмбриональной ткани мыши двух стадий: Е13 и Е15.

Особый интерес представляли транскрипты, экспрессирующиеся в вентрикулярной зоне коры ГМ. Для анализа паттерна экспресии на стадий Е использовались сагиттальные срезы целого эмбриона. Детальный анализ экспрессии отобранных генов внутри стадии Е15 фрональные и сагиттальные срезы головного мозга. Гены, паттерны экспрессии которых приведены ниже были отобраны для дальнейшего анализа (Рис. 1, 2).

Рис. 1. Распределение мРНК клонов 10h1, 1g10 и 6g8 в эмбриональной ткани мыши стадии Е13.

Гибридизация in situ рибопроб клонов 10h1 (A), 1g10 (Б) и 6g8 (В) с сагиттальными срезами ткани эмбриона мыши.

1- кора головного мозга, 2- зона медиального кортикального организатора, базальный 3 ганглий, 4- таламус, 5- средний мозг, 6- мост, 7- продолговатый мозг, 8- спинной мозг.

Следующим этапом было клонирование кодирующей части мРНК и детальное изучение экспрессии отобранных генов.

Рис. 2. Распределение мРНК клонов 10h1, и в 1g10 6g эмбриональной ткани мозга мыши стадии Е15.

Гибридизация in situ рибопроб клонов 10h1 (A), 1g10 (Б) и с 6g8 (В) сагиттальными срезами ткани мозга мыши стадии Е15.

А- вид светлого поля. 1- кортикальная пластинка, 2- зона пролиферации коры головного мозга, 3- гиппокамп, 4- базальный ганглий. Экспрессия клона 1g10 в маргинальной зоне коры обозначена стрелкой.

Анализ генов, полученных в результате вычитающей гибридизации.

Клонирование гена npas3, нового нейронального фактора транскрипции, содержащего PAS домен.

В образце кДНК, обогащенном транскриптами, специфическими для 13-го дня эмбрионального развития, был найден клон 1g10. В результате вычитающей гибридизации был получен фрагмент длиной 800 п.о., несодержащий открытой рамки считывания (ОРС). Мы предположили, что данный фрагмент относится к нетранслируемой 3'- концевой части гена. С помощью метода амплификации 5' концевых участков кДНК (RACE) и набора специфических праймеров нам удалось клонировать 5,8 т.п.о. Среди полученных 6 т.п.о. не было найдено ОРС длинее п.о.

Анализ общедоступных баз данных не выявил значимой гомологии последовательности клонированного нами фрагмента с известными последовательностями нуклеотидов. Анализ коммерческой базы данных CELERA (http://www.celera.com), недавно опубликовавшей аннотацию генов мыши показал, что клонированный ранее фрагмент идентичен последовательности интрона 3 гена npas3 и имеет ту же ориентацию на хромосоме. С помощью метода ОТ-ПЦР нам удалось подтвердить существование данной кДНК в развивающейся коре ГМ, взятой на стадии Е13. Для этого на уникальные участки кодирующей последовательности гена npas3 были сконструированы специфические праймеры, которые и использовались для ОТ-ПЦР пары. Фрагмент, полученный в результате ОТ-ПЦР, использовался в качестве зонда гибридизации. Распределение сигналов для гена npas3 и клона 1g10, клонированного в результате вычитающей гибридизации оказались идентичными. Таким образом, было показано, что клон 1g10 является частью гена npas3. Стратегия клонирования гена схематично npas представлена ниже (Рис. 3).

Рис. Схема 3.

структурной организации гена Npas3 (клон 1g10) и стратегия его клонирования.

Клон 1g10 был получен из библиотеки кДНК, обогащенной транскриптами, специфичными для 13 дня эмбрионального развития мыши. Стрелки показывают продукты амплификации 5'-концевого участка кДНК. Пара специфических праймеров, которые использовались для ОТ-ПЦР, обозначена треугольниками.

Светлыми сегментами показаны экзоны 3- 5, кодирующие PAS- ДНК связывающий домен. Волнистая линия показывает фрагмент кДНК, взятый в in situ гибридизацию для подтверждения идентичности генов 1g10 и Npas3.

Npas3 принадлежит к bHLH-PAS- суперсемейству транскрипционных факторов. Белки данного семейства выполняют широкий спектр функций, таких как регуляция суточных ритмов (Period, Clock), контроль процессов нейрогенеза (Sim), регуляция развития дыхательных органов (Trh).

Недавно сотрудниками лаборатории Muir WJ было показано, что npas мутировал у пациентов, больных шизофренией [1996, J. Med. Genetics]. Анализ взрослой ткани мозга мышей, несущей мутацию по гену npas3 показал значительное снижение уровня экспрессии гена reelin. Недавно коллегами из лаборатории MCKnight SL было установлено, что мыши npas3 -/- обнаруживают ряд существенных отклонений при анализе поведенческих реакций. Таким образом, клонированный нами ген npas3 необходим для нормального развития переднего мозга [2004, Proc Natl Acad Sci U S A].

Анализ экспрессии гена npas3 в эмбриогенезе мыши.

Известно, что транскрипты гена npas3 начинают определятся в уже на стадии Е9.5. На данной стадии экспрессия обнаруживается только в дорзальной части нервной трубки. В результате проведенного нами анализа распределения мРНК npas3 в ткани эмбриона мыши на 13 день эмбрионального развития было установлено, что для таких регионов ЦНС как мост, мозжечок и продолговатый мозг экспрессия гена npas3 характеризуется высоким уровнем в пролиферативном компартменте зона) в сравнении с зонами клеточной (вентрикулярная дифференцировки Рис. 1Б. Также было показано, что на стадии Е13 ген npas начинает экспрессироваться в ряде тканей за пределами ЦНС: перикард, мезенхимальная ткань, окружающая носовой эпителий, соединительная ткань, подстилающая эпидермис, мезенхима зачатков конечностей (Рис. 1Б). Анализ распределения мРНК гена npas3 в ткани переднего мозга мыши на стадии Е15. выявляет экспрессию в вентрикулярной зоне коры ГМ и базального ганглия (Рис.

2Б). Интересно то, что помимо зон пролиферации транскрипты гена npas3 были обнаружены и в маргинальной зоне коры ГМ (Рис. 2Б). Маргинальная зона коры ГМ становится морфологически различимой с появлением кортикальной пластинки и формируется нейронами, рано вышедшими из митоза. Среди них особое место занимает субпопуляция нейронов Кахала- Ретциуса, экспрессирующих Reelin. Ранее было показано, что белок Reelin необходим для нормального формирования стратификации коры ГМ.

Клонирование транскрипционного фактора Sip1.

Другой клон 6g8, полученный в результате вычитающей гибридизации, также не имел ОРС среди клонированных 880 п.о., (см. ниже). Первым этапом получения полноразмерной кДНК клона 6g8 был скрининг библиотеки кДНК, приготовленной на основе суммарной РНК из теленцефалонов, взятых на 15 день эмбрионального развития мыши. Среди исследованных 10 клонов были получены 12 позитивных, общей длиной 6157 п.о. Далее, с помощью метода быстрой амплификации концевых фрагментов кДНК (RACE) дополнительно был клонирован фрагмент длиной 1.2 т.п.о. Полученные 6.4 т.п.о. не содержали открытых рамок считывания длиной большей, чем 252 п.н. Предполагалось, что клонированный фрагмент относится к 3’ или 5’ нетранслируемой части гена. Для идентификации белков, кодируемых данным локусом была использована аннотация белков из базы данных Celera. В данном локусе были найдены 3 гена (mCT180818, mCT177259, mCT181019), имеющие то же направление смысловой цепи. На основе предсказанных последовательностей генов локуса были сконструированы пары праймеров для ОТ-ПЦР. Последующий анализ экспрессии с помощью метода гибридизации in situ показал, что один из предсказанных генов mCT177259 – Sip1, воспроизводит паттерн экспрессии ранее полученного клона 6g8 (Рис. 4).

Рис. 4. Сравнение паттерна экспрессии мРНК гена Sip1 и клона 6g8.

Гибридизация in situ рибопроб клона 6g8 (Б) и мРНК гена Sip1 (Г) с сагиттальными срезами ткани мозга мыши стадии Е18. Региональная специфичность экспрессии гена Sip1 в коре показана стрелками Из этого следует, что данный клон содержит часть гена Sip1.

Паттерн экспрессии гена Sip1 в период эмбрионального развития.

Мы проанализировали экспрессию начиная с дня Sip1 12-ого эмбрионального развития. Экспрессия Sip1 в спинном мозге разграничивает вентральную его часть от дорзальной с максимумом, приходящимся на вентрикулярную зону (Рис. 5В-М).

Рис. 5. Распределение мРНК гена Sip1 в ткани эмбриона мыши.

А- М- фронтальные срезы дня 12-го эмбрионального развития мыши. Н-Т сагиттальные срезы 13 го дня эмбриогенеза. П, Р- увеличенный вид теленцефалона. С,Т- вид коры головного мозга. 1 новая кора (неокортекс), 2- базальный ганглий, 3 таламус, губы, 4- 5 пищевод, 6 продоловатый мозг, 7 спинной мозг, 8- легкие, кишечник, 9- 10 тройничный нерв, 11 ганглий дорзальных корешков, 12- средний мозг, 13- варолиев мозг, 14- язык.

В ПНС экcпрессия Sip1 была обнаружена в следующих типах нервов и ганглиев: ганглий дорзальных корешков, спинальный акцессорный нерв, корешки и ганглий тройничного нерва, корешки и ганглий вестибулокохлеарного нерва (Рис.

5В, Д, Ж, И, Л). В некоторых регионах, таких как варолиев мост, средний мозг, таламус и базальный ганглий мозга, экспрессия Sip1 маркирует зону клеточной пролиферации (вентрикулярную зону). Sip1 найден в клетках пролиферативного нейроэпителия, разделяющих варолиев и продолговатый мозг, валики ромбовидной ямки и крышу варолиева моста (Рис. 5А, В, Д). Транскрипты гена Sip1 также были обнаружены в ряде тканей за пределами ЦНС: верхние и нижние губы, пищевод и носовая капсула (Рис. 5).

Анализ паттерна экспрессии Sip1 в конечном мозге.

Анализ распределения мРНК гена Sip1 в ткани коры головного мозга мыши показал, что Sip1 начинает экспрессироваться с 12 дня эмбрионального развития.

Транскрипты обнаруживаются, главным образом, в зоне кортикальной пластинки (Рис. 5Р, Т). Позднее, на Е15 помимо кортикальной пластинки, продукты гена Sip были найдены также в зоне клеточной пролиферации (вентрикулярной зоне) коры ГМ (Рис. 6Ж). Далее, на 18-ый день эмбриогенеза транскрипты гена Sip определяются только в кортикальной пластинке (Рис. 6Г, И). В результате анализа распределения мРНК SIP1 на стадии Е18.5 был установлен интересный факт региональная специфичность экспрессии гена внутри кортикальной SIP пластинки. В передней части коры большинство клеток SIP1-позитивны, а в каудальных ее зонах SIP1 экспрессируется только в клетках слоя VI (Рис. 6Г, Л).

Дифференциальный характер экспрессии в коре головного мозга воспроизводится также при иммуноокрашивании антителами против белка SIP1 (Рис. 6О).

Рис. 6. Распределение мРНК гена Sip1 и белка Sip1 в ткани мозга мыши в период эмбрионального и постнатального развития. Гибридизация in situ рибопробы гена Sip1 с сагиттальными и фронтальными срезами мозга мыши стадий Е15 (А, Б, Д, Ж) и Е18 (В, Г, З, И, Т, У). К, Л- увеличенные виды В и Г, слои коры головного мозга обозначены латинскими цифрами, региональная специфичность показана стрелками. М, Н, Р, С- Распределение мРНК гена Sip1 в ткани мозга мыши, несущей мутацию Reeler. О-распределение белка Sip1 в коре на стадии Е18. П гибридизация in situ рибопробы гена Sip1 с фронтальными срезами ткани взрослого мозга мыши. 1- кора головного мозга, 2- гиппокамп, 3- базальный ганглий, 4 таламус, 5- средний мозг, 6- пириформная кора, 7- обонятельная луковица.

В области вентрального теленцефалона экспрессия гена SIP1 также показывает дифференциальный характер. Начиная с 12-го дня эмбрионального развития, экспрессия гена обнаруживается, главным образом, в SIP пролиферативной зоне (вентрикулярная и субвентрикулярная зоны базального ганглия), в отличие от дорзальной части теленцефалона, где транскрипты SIP были найдены только в зоне дифференцировки (кортикальная пластинка) (Рис. 5Д).

Также было установлено, что во взрослой ткани мозга основными регионами SIP1 экспрессии являются гиппокамп, зубчатая извилина и белое вещество коры головного мозга (Рис. 6П). Посредством последовательного двойного окрашивания антителами против белка SIP и антителами против Vglut1 маркера глютамат- продуцирующих нейронов, было показано, что SIP специфичен для глютамат- продуцирующих нейронов коры головного мозга (Рис.

7).

Рис. 7. Двойное иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани мозга мыши антителами против Sip1 (В) и антителами против белка VGLUT1 (Б). А изображение, полученное в результате компьютерного совмещения изображений Б и В.

Экспрессия SIP1 в Reeler мутанте.

это мутация, которая характеризуется инвертированной Reeler стратификацией коры головного мозга. Ранее было показано, что данный дефект связан с мутацией гена реелин. Продукт гена реелин, белок экстраклеточного матрикса, необходимый для нормального формирования коры в радиальном направлении. С мутациями гена реелин ассоциированны такие заболевания человека, как аутосомная рецессивная лизенцефалия и гипоплазия мозжечка. Мы исследовали экспрессию гена SIP1 в ткани мозга у новорожденных Reeler-мутантов мыши. В результате анализа было установлено, что у дикого типа экспрессия гена SIP1 выявляется исключительно в верхних слоях пириформной коры, тогда как у мутанта экспрессия гена SIP1 в этой области имеет диффузный характер (Рис. 6 М, Н, Р, С).

Анализ функции гена SIP1 в развитии конечного мозга. Тканеспецифическая инактивация гена SIP1.

Из литературы следует, что SIP1 был обнаружен в двух-гибридной системе, как белок, реагирующий с факторами транскрипции Smad. Smad белки являются внутриклеточными медиаторами путей передачи сигнала, запускаемого BMP и Последние регулируют процессы пролиферации, миграции, TGF-b.

дифференцировки и запрограмированной клеточной смерти в развитии.

Интересным фактом является то, что BMP вовлечен в спецификацию медиального региона коры головного мозга. Вместе с геном dEF1, SIP1 формирует семейство ZFHX1 транскрипционных факторов у позвоночных. Белок SIP1 содержит доменов типа цинковые пальцы, организованных в С- и N- концевые кластеры.

Также SIP1 содержит неканонический гомео-домен и является транскрипционным репрессором. Было показано, что SIP1 мутировал у пациентов, страдающих синдромной формой болезни Гиршпрунга. Болезнь Гиршпрунга- генетически обусловленная неонатальная кишечная непроходимость с частотой встречаемости 1 на 5000 новорожденных. Около 30% пациентов имеют отклонения от нормы, такие как умственная отсталость, микроцефалия. SIP1 был мутирован у пациентов, показывающих данные дефекты. Также интересным фактом является то, что ген SIP1 мутирован у пациентов с умственной отсталостью не страдающих болезнью Гиршпрунга. У них также наблюдались задержки в развитии моторных навыков и эпилептические припадки.

SIP1flox Линия, несущая аллель была предоставлена коллегами D.Huylebroeck и T.Van de Putte из Фландерского института биотехнологии и описана ранее.

Нами было показано, что основными доменами экспрессии гена SIP1 в конечном мозге являются кортикальная пластинка и зона клеточной пролиферации (вентрикулярная зона) базального ганглия. Для установления функции гена SIP1 in vivo были созданы две линии мышей, несущих делецию экзона 7 в выше указанных компартментах теленцефалона. Для инактивации SIP1 в базальном ганглии использовалась линия, несущая ген Cre- рекомбиназы под контролем промотора гена Six3. Линия была предоставлена коллегами Y. Furuta и G. Oliver. Six3 гомеобокс содержащий ген, гомолог sine oculis D. melanogaster, регулирующий развитие зрительной системы. Основными сайтами активности Cre- рекомбиназы линии Cre в переднем мозге являются клетки пролиферативного Six3 нейроэпителия гипоталамуса и базального ганглия (Рис. 9И).

Для установления функции гена SIP1 в коре головного мозга была взята линия несущая knock- in гена Cre в локус гена Емх1. Cre- pекомбиназа Емх1- Cre линии экспрессируется во всех клетках коры головного мозга, включая клетки предшественники. Линия была создана K. Jones из университета Колорадо.

Первой стадией получения мутантов является совмещение трансгенов flox и Cre в одном генотипе. Далее, животные с генотипом SIP1flox /+ ;

Cre/+ SIP (двойные трансгенные гетерозиготы) скрещивали между собой для получения мутанта SIP1flox / SIP1flox ;

Cre / +.

Анализ морфологии мозга мышей, полученных при инактивации гена SIP1 в базальном ганглии.

Для установления функции гена SIP1 в вентральной части теленцефалона была использована трансгенная линия, экспрессирующая Cre- рекомбиназу под контролем промотора гена Six3. Помимо вентрикулярной зоны базального ганглия, активность рекомбиназы также детектируется в гипоталамусе, где Cre экспрессируется и ген SIP1. Таким образом, фенотипические изменения следует ожидать в вышеуказанных компартментах. Мутанты SIP1flox / SIP1flox ;

Cre / + легко различимы от гетерозигот по наличию экзенцефалии (Рис. 8).

Рис. 8. Общий вид эмбрионов 13- го дня.

А- дикий тип, Б- мутант.

Мутация проявляется рано в кортикогенезе и впервые была выявлена на Е11.

Окрашивание срезов ткани мозга эмбрионов 13-го и 16-го дня эмбриогенеза по Нисслю показало, что в районах коэкспрессии SIP1 и Cre наблюдается изменение морфологии ткани (Рис. 9А-Е). Интересно то, что в результате анализа морфологии было также обнаружено изменение морфологии и ткани коры головного мозга, где экспрессия CRE не обнаруживается (Рис. 9Ж, З). Непонятно, является ли изменение морфологии коры головного мозга результатом инактивации гена SIP1 в базальном ганглии. Также остается выяснить, что является причиной повышенного уровня клеточного роста в районах базального ганглия и гипоталамуса (Рис. 9А-Е).

Рис. Анализ 9.

морфологии мозга эмбрионов мыши, полученных при инактивации гена Sip1 в вентральной части теленцефалона.

Окрашивание по протоколу Nissl корональных срезов ткани мозга мыши стадий Е (А, Б) и Е16 (В, Г, Д, Е).

Ж, З- увеличенный вид коры головного мозга эмбриона мыши, несущей мутацию гена Sip1.И- тест активности Cre рекомбиназы линии Six3 Cre (линия, несущая ген под контролем cre промотора гена Six3). А, В, Д- дикий тип, Б, Г, Е, Ж, З- мутант. 1- базальный ганглий, 2- таламус, 3- кора головного мозга.

Фенотипический анализ мутантов, полученных при инактивации гена SIP1 в коре головного мозга.

Для установления роли гена в развитии дорзальной части SIP теленцефалона была выбрана линия мышей Emx1-Cre. В данной линии Cre рекомбиназа экспрессируется в каждой клетке коры головного мозга.

Анализ морфологии ткани мозга на ранних стадиях кортикогенеза (Е12- Е15) не выявил существенных фенотипических различий между мутантом и диким типом.

Первые фенотипические изменения в структуре коры обнаруживаются на стадии Е17. Проведенные исследования морфологии коры Sip1- мутантов и анализ экспрессии генов показали, что зоны гиппокампа СА1- СА3 и зубчатая извилина нормально специфицируются в ходе эмбриогенеза (Рис. 10, 11).

В норме СА1- СА3 зоны гиппокампа на 17-ый день эмбрионального развития уже заложены, зубчатая извилина на данной стадии представлена четко выраженной структурой (Рис. 10А, В). У мутантов район зубчатой извилины выглядит как менее морфологически оформленная группа клеток (Рис. 10Б, Г).

Рис. 10. Анализ морфологии мозга мыши, несущей мутацию гена Sip1 в коре головного мозга с помощью окрашивания по протоколу Nissl.

Корональные срезы ткани мозга мыши 17- ого дня эмбрионального развития. А, В дикий тип. Б, Г- мутант. Район зубчатой извилины отмечен стрелками. к- кора головного мозга, с- subiculum, з- зубчатая извилина.

Рис. 11. Распределение мРНК гена в ткани мозга np эмбриона мыши.

Гибридизация in situ рибопробы гена np2, меченой DIG с корональными срезами ткани мозга мыши стадии Е17. А- дикий тип, Б- мутант.

В результате анализа также было найдено, что у взрослых животных полностью отсутствуют гиппокамп и зубчатая извилина (Рис. 12). Медиальный район коры головного мозга представлен пре- и парасубикулярным комплексом (Рис. 12Б).

Зона subiculum выглядит значительно тоньше (Рис. 12Б). Также интересным фактом является отсутствие corpus callosum у мышей, мутантных по гену Sip (Рис. 12В, Г).

Рис. 12. Морфологический анализ ткани мозга мыши, полученной при инактивации гена Sip1 в коре головного мозга.

Окрашивание по протоколу Nissl корональных срезов ткани мозга мыши стадии Р30.

А, В- дикий тип, Б, Г- мутант. 1- кора головного мозга, 2- гиппокамп, 3- зубчатая извилина, 4- мозолистое тело.

Как было показано раньше, зоны, отсутствующие у взрослых животных нормально специфицируются в эмбриогенезе. Поэтому, дальнейшим предположением было то, что дефект происходит вследствие низкого уровня пролиферативной активности клеток примордиума каудо-медиального района коры. Анализ клеточной пролиферации изучался с использованием метода иммунноокрашивания парафиновых срезов эмбриональной ткани мозга мыши антителами против бромдеоксиуридина.

Разницы в уровне пролиферации между мутантом и диким типом на стадии Е16.5, в период, когда клетки каудомедиального района коры головного мозга отличаются максимальной пролиферативной активностью, не было выявлено (Рис. 13).

Рис. 13. Анализ пролиферативноой активности клеток гиппокампа мышей с инактивированным геном Sip1 в коре головного мозга. Корональные срезы мозга мыши ого дня 16 эмбрионального развития окрашенные антителами против BrdU. А, В- дикий тип, Б, Г- мутант. 1- базальный ганглий, 2- кора головного мозга, 3- таламус, 4- гиппокамп, 5- choroid plexus, 6 fimbria fornix.

Далее, мы решили проверить уровень клеточной смерти в медиальном паллиуме. Окрашивание ткани мозга мыши стадии Е17.5 по протоколу TUNEL показало высокий уровень запрограмированной клеточной смерти у мутантов в медиальном районе коры. В остальной части коры уровень клеточной смерти остается одинаковым (Рис. 14).

Также был проведен сравнительный анализ уровня генной экспрессии для двух пулов (мутант и дикий тип) тотальной РНК гиппокампа 16- ого дня эмбрионального развития с помощью микрочипов. В результате, были выявлены гены, экспрессирующиеся на более высоком уровне в ткани мутанта, позитивно регулирующие процесс апоптоза. Среди них были обнаружены Mic2/cd99, Ttk, К другой группе транскриптов, экспрессирующихся на более высоком Irak1.

уровне в мутанте, относятся гены ответной реакции клетки на оксидативный стресс Mt1, Mt2, Akr1b3 и Gas1. Информация, полученная в результате анализа микрочипов коррелирует с данными о повышенном уровне програмированной клеточной смерти в ткани гиппокампа мышей мутантных по гену Sip1.

Рис. 14. Анализ уровня клеточной смерти в ткани мозга эмбриона мыши, полученной при инактивации гена Sip1 в коре головного мозга.

Окрашивание по протоколу TUNEL фронтальных срезов ткани мозга мыши стадии Е17. А, В- дикий тип, Б, Г- мутант. В, Г- увеличенные виды, выделенные прямоугольниками на А и Б соответственно. Стрелками обозначены клетки, показывающие окраску.

Недавно стало известно, что мутация гена Sip1 у человека ведет также к изменениям в развитии медиального паллиума. Было показано также, что у пациентов с мутированным Sip1 наблюдается агенез мозолистого тела. В результате анализа морфологии мозга мышей мутантных по Sip1 был обнаружен подобный дефект (Рис. 12В, Г).

Ранее в литературе, был описан ряд направленных генных мутаций, приводящих к дефектам развития медиального паллиума. Было показано, что Wnt3А локально регулирует рост каудо- медиальной части коры, из которой формируется гиппокамп. При инактивации Wnt3a, также как и фактора транскрипции Emx2, спецификация клеток- предшественников каудо- медиальной зоны коры головного мозга проходит нормально, однако гиппокамп не формируется вследствие дефекта пролиферации. Недавно было показано, что Emx является прямой транскрипционной мишенью Wnt и Bmp. Для экспрессии Emx2 в дорзальной части теленцефалона также необходима активность медиаторов Wnt- и Bmp- сигнального пути, факторов транскрипции Smad и Tcf. Ранее было показано, что Smad- белки, медиаторы Bmp сигнального пути напрямую реагируют с Sip1.

Также известно, что один из членов генного семейства Tcf- Tcf8/ZEB-1 выполняет функцию, обратную функции Sip1/ZEB-2 в регуляции TGF-beta/BMP- сигнального пути. Мутации генов Wnt3a, Lef1, Emx2 и Sip1 приводят к схожим фенотипическим проявлениям.

Для точного установления роли Sip1 в развитии медиальной коры и о месте Sip1 в генной иерархии Wnt- и Tgf-beta- сигнального пути требуются дальнейшие исследования. На основании выше приведенных данных можно сделать вывод о том, что активность гена Sip1 необходима для нормального развития таких компонентов медиальной коры, как гиппокамп и зубчатая извилина.

Выводы.

1. Проведен сравнительный анализ мРНК пулов коры головного мозга мыши стадий 13-го и 15-го дня эмбрионального развития. Выявлен ряд генов, дифференциально экспрессирующихся в коре.

2. Идентифицирован ген нового нейронального фактора транскрипции, содержащего PAS- домен. Проведен анализ распределения мРНК гена Npas3 в эмбриональной ткани коры головного мозга. Показано, что экспрессия гена Npas3 в коре имеет дифференциальный характер.

3. Идентифицирован ген транскрипционного фактора Sip1. Проведен анализ паттерна экспрессии гена Sip1 в эмбриональном развитии. Показано изменение характера эскпрессии гена Sip1 в ткани мозга мыши reeler.

4. Анализ линии мышей с инактивированным геном Sip1 в коре головного мозга показал, что активность Sip1 необходима для нормального развития гиппокампа и зубчатой извилины.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. А.С.Поляков, О.В.Британова, Н.Ю.Усман, Н.А.Пунькова, С.А.Лукьянов, В.С.Тарабыкин, Л.И.Корочкин. Новые нейрогены млекопитающих // Докл.

АН, 2003, т. 392, N 3, С. 467-470.

2. А.С.Поляков, Н.Шпеер, О.В.Британова, С.А.Лукьянов, В.С.Тарабыкин, Л.И.Корочкин. Клонирование и анализ нового нейрогена мыши // Генетика, 2004, т.40, N 6, C. 853-857.

Тезисы конференций :

1. Polyakov AS, Britanova OB, van de Putte T, Korochkin LI, Tarabykin VS.

Smad- interacting protein 1 (Sip1) in the cerebral cortex development: expression and functional analysis study. Annual meeting of German genetic society, Kassel, 2003, p. 175.

2. Polyakov AS, Britanova OB, van de Putte T, Korochkin LI, Tarabykin VS.

Smad- interacting protein 1 (Sip1) in the cerebral cortex development: expression and functional analysis study. Neural Stem Cell Conference (NSCC), Melbourn, 2003, p. 220.