Молекулярное моделирование и структурно динамические особенности эукариотических катионных каналов
На правах рукописи
Попинако Анна Владимировна МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ И СТРУКТУРНО ДИНАМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КАТИОННЫХ КАНАЛОВ Специальность 03.01.02 – биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».
Научные руководители: доктор физико-математических наук, профессор кафедры биофизики биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Шайтан Константин Вольдемарович кандидат биологических наук, доцент кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Соколова Ольга Сергеевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории биологически активных наноструктур ФГБУ "НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.
Гамалеи" Минздрава России Карягина-Жулина Анна Станиславовна кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник ИХФ РАН, руководитель группы компьютерного моделирования Мазо Михаил Абрамович
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, г.
Пущино.
Защита диссертации состоится "18" апреля 2013 г. в часов мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория 389.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан " " марта 2013 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук М.Г. Страховская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Ионные каналы формируют большой функциональный класс интегральных трансмембранных белков и участвуют в регуляции разнообразных клеточных процессов (Jegla et al., 2009).
Основной функцией ионных каналов является селективное перемещение ионов через мембрану. Наиболее распространенные и многочисленные семейства ионных каналов представлены группами лиганд-зависимых (ЛЗ) и потенциал-зависимых (ПЗ) (Yu et al., 2004;
Minor, 2009) каналов, участвующих в межклеточной сигнализации. ЛЗ каналы генерируют электрический потенциал, превращая химические сигналы, приходящие к клетке, в электрические, ПЗ каналы участвуют в распространении потенциала действия.
Структурное и функциональное разнообразие ионных каналов, а также их участие в работе жизненно важных систем организма обуславливает повышенный интерес к их исследованию. На сегодняшний день клонировано более 500 генов, кодирующих субъединицы ионных каналов как эукариотического происхождения, так и их бактериальных аналогов (Jegla et al., 2009). Однако сложная молекулярная архитектура эукариотических ионных каналов, в состав которых входят крупные внемембранные домены, часто является препятствием для структурных исследований экспериментальными методами (Bill et al., 2011). Так, на сегодняшний день известна лишь одна атомарная структура ПЗ калиевого канала (Kv) млекопитающих Kv1.2 (Long et al., 2005), и полноразмерная структура ЛЗ канала, полученная методом крио-электронной микроскопии (Miyazawa et al, 2003;
Unwin, 2005).
Нарушение функций ЛЗ и ПЗ ионных каналов может приводить к тяжелым неврологическим и наследственным заболеваниям (Bernard, Shevell, 2008). Молекулярные механизмы дисфункции ионных каналов к настоящему времени остаются не до конца изученными, что обусловлено, в частности, недостатком данных об их структуре. Ионные каналы составляют третью по величине группу мишеней для фармацевтических препаратов (Overington 2006), что во многом также обусловлено ограниченными структурными данными (Wickenden et al., 2012).
Известно, что трансмембранная часть гомологична у многих эукариотических каналов (более 20% гомологии). В связи с этим, актуальной задачей является моделирование неизвестной структуры каналов согласно опубликованным данным о гомологах и исследование поровых интерьеров и специфических участков для выявления универсальных молекулярных механизмов активности ионных каналов.
Целью данной диссертационной работы явилось исследование структурных и динамических свойств ЛЗ и ПЗ ионных каналов на примере моделей серотонинового 5-HT3 рецептора человека и калиевых каналов Kv2.1 и Kv10.2 человека.
Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи:
1. Моделирование структур эукариотических катионных каналов (на примере 5-НТ3 рецептора и Kv каналов: Kv2.1, Kv10.2).
2. Анализ динамики конформационных изменений канала Kv2.1 и 5-НТ рецептора.
3. Структурно-динамическое сравнение селективности катионных каналов с различной симметрией.
Научная новизна и практическая значимость работы. В данной диссертационной работе с помощью комплексного метода моделирования впервые были построены модели 3D структур Kv2.1 и Kv10.2 каналов и серотонинового 5-НТ3 рецептора в разных конформациях. Исследуемые каналы, до настоящего времени не были кристаллизованы, и их атомная структура не была получена.
На основе анализа физических и динамических свойств моделей в разных конформациях впервые были получены важные структурные данные, о селективности и конформационных переходах у каналов с различной симметрией (пентамерные и тетрамерные). Впервые были продемонстрированы общие структурные закономерности формирования интерьера поры у пентамерных и тетрамерных ионных каналов.
Построенные модели каналов могут служить структурной основой при планировании экспериментов по сайт специфическому мутагенезу и для дальнейшего уточнения структурно-функциональных особенностей ионных каналов. Результаты исследования в перспективе могут стать основой для разработки фармацевтических препаратов нового поколения с заданной активностью и селективностью и минимальным числом побочных эффектов, а также для теоретических исследований в области строения мембранных белков и белок-белковых комплексов.
Построенные модели ПЗ калиевых каналов нашли практическое применение при интерпретации карт электронной плотности, рассчитанных по проекциям при проведении структурных исследований методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (Соколова с соавт., 2012).
Достоверность результатов диссертации обеспечивается использованием универсальных законов и уравнений классической и квантовой механики, проведением тестовых расчетов систем. Результаты моделирования пространственной структуры ионных каналов согласуются с известными экспериментальными данными, полученными Соколовой О.С. и Гризель А.В. методом ПЭМ в лаборатории структурной биотехнологии на кафедре Биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (Соколова с соавт., 2012), что говорит об адекватности построенных моделей. В связи с этим результаты работы являются достоверными, а сделанные на их основе выводы научно обоснованными.
Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на XVI, XVII, XVIII и XIX международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (2009, 2010, 2011, 2012 - Москва);
II III и IV студенческих симпозиумах по биоинженерии (2007, 2008, 2009 - Москва);
XV, XVII, XVIII международных конференциях «Математика. Компьютер. Образование» (2008, 2010 - Дубна, 2011 - Пущино);
XVII и XVIII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (2010, 2011- Москва);
XXIII Международной зимней школе «Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии» (2011 - Москва);
Межфакультетском и междисциплинарном семинаре биологов, математиков, физиков и химиков по перспективным направлениям науки, включая моделирование нано- и биоструктур (2009 - Москва);
Международной Интернет-конференции «Молекулярные механизмы шизофрении» (2011);
Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (2011 - Пущино);
36-м конгрессе Международного союза биохимиков и молекулярных биологов (2011 - Турин);
Международной конференции по молекулярной вычислительной биологии и биоинформатике (2011-Москва);
Школе конференции молодых ученых «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины» (2011 - Москва);
XXIII Международной зимней школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2011 - Москва);
IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (2012 Волгоград);
семинаре кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2012 - Москва).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ – 4, тезисов докладов и материалов конференций – 22.
Личный вклад автора состоит в обзоре имеющихся данных литературы относительно структурных особенностей и филогении ионных каналов, моделировании структур каналов, проведении расчетов, обработке, анализе и систематизации результатов, подготовке статей и докладов на конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из: введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты исследования и их обсуждение) и Выводов. Работа проиллюстрирована 46 рисунками и таблицами. Библиографический указатель содержит 243 источников.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во Введении сформулированы основные цели и задачи исследования, и обоснована его актуальность и практическая значимость. Глава I представляет собой обзор литературы. Он посвящен современным данным о структурных особенностях ПЗ и ЛЗ ионных каналов, конформационных перестройках при активации, а также их филогении и эволюции. Особое внимание уделено строению и функциям каналов Kv2.1, Kv10.2 и 5-НТ рецептора, изучаемых в данной работе.
В Главе II дано описание методов и расчетных программ, использованных в работе. В Главе III приведены полученные результаты и их обсуждение, которые далее будут кратко изложены.
Моделирование структуры пентамерных и тетрамерных ионных каналов в открытой и закрытой конформациях Моделирование структур проводили по разработанному нами алгоритму (рис.1), который включал несколько этапов. На каждом этапе моделирования применяли соответствующее программное обеспечение: поиск шаблона проводили с помощью сервера SWISS-MODEL (Schwede et al., 2003), выравнивание при помощи программы T-Coffee (Notredame et al., 2000), построение моделей проводили с использованием программы MODELLER (Fiser et al., 2003), стабильность построенных молекулярных моделей в динамических условиях проверяли методами молекулярной динамики (МД) с использованием программных пакетов NAMD (Phillips et al., 2005) и GROMACS (Hess et al., 2008). При этом для оптимизации моделирования использовали метод фиттинга, который позволяет улучшить качество атомарной модели благодаря соотнесению данных моделирования и ПЭМ (Pandurangan, Topf., 2012).
Рис. 1. Этапы алгоритма комплексного метода моделирования структур.
В ходе моделирования в качестве шаблонов использовали следующие структуры, опубликованные в базе данных PDB: ацетилхолиновый рецептор AChR Torpedo marmorata (коды pdb 2BG9 и 4AQ9 для моделирования 5-HT рецептора закрытой и открытой конформаций соответственно), разрешение структур составило 4 для закрытой и 6,2 для открытой. Структура калиевого канала Kv1.2 Rattus norvegicus (код pdb 2A79) служила в качестве шаблона для моделирования структуры канала Kv2.1 открытой конформации, разрешение структуры 2,9 ). Трансмембранная часть cAMP-зависимого канала MlotiK1 Mesorhizobium loti (код pdb 2ZD9 разрешением структуры ) использовалась для моделирования канала Kv10.2. Для моделирования цитоплазматических доменов Kv10.2 в качестве шаблонов были выбраны следующие ЯМР структуры: N-концевые домены калиевого канала человека herg и бактериальный cAMP-зависимый канал MloK1(коды pdb: 2L0W для моделирования N-концевых доменов PAS и PAC, 2KXL для сNBD домена).
Данные шаблоны были взяты из базы данных Protein Data Bank (Burley, 2013). Шаблон для моделирования закрытой конформации канала Kv2. (Delemotte et al., 2011) был любезно предоставлен лабораторией теоретической химии и биохимии под руководством проф. М.Тарека университета Нанси, Франция. Степень гомологии между шаблоном и объектом составила более 30%, что соответствует достаточно высокому уровню достоверности моделирования.
Построенные модели представляют собой гомомеры пирамидальной формы пятилучевой (пентамерный 5-НТ3 рецептор) и четырехсторонней (тетрамерные каналы Kv2.1, Kv10.2) симметрии (рис. 2, таблица 1). Внешний диаметр Kv2.1 составил 8 нм, его высота - 8 нм. Внешний диаметр Kv10.2 12 нм, высота - 9,5 нм. Для пентамерного 5-НТ3 рецептора соответствующие величины составили 8 нм и 11 нм.
Внешняя поверхность трансмембранной части ПЗ и ЛЗ каналов преимущественно гидрофобна. Внутренняя поверхность поры моделей гидрофильна. Изученные ионные каналы при нормальном рН имеют отрицательный суммарный заряд. При этом значительная часть отрицательно заряженных остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот локализованы во внемембранной части и взаимодействует с растворенными ионами (таблица 1). При функционировании каналов гидратная оболочка проходящих ионов частично разрушается за счет взаимодействия иона с зарядовыми центрами внутри канала.
Таблица1. Построенные модели тетрамерных Kv каналов Kv2.1, Kv10.2 и пентамерного 5 НТ3 рецептора. а. Открытый канал Kv2.1, выделены поровый домен (PD), VSD, сферами показаны кислороды карбонильной группы аминокислотных остатков (а.о.), участвующих в образовании солевых мостиков, селективный фильтр (SF), где сферами выделены кислороды карбонильной группы селективного фильтра, и сегмент S4. б. Открытый пентамерный 5-НТ3 рецептор, выделены петля С и сайт связывания с лигандом. в,г Внемембранные домены канала Kv10.2 и 5-НТ3 рецептора, сферами выделены отрицательно заряженные аминокислотные остатки, для 5-НТ3 рецептора показаны цистеиновая петля (СYS-CYS) и петля С. д, е Мембранные домены канала Kv2.1 ( субъединицы) и 5-НТ3 рецептора (4 субъединицы), сферами выделены отрицательно заряженные a.o., гидрофобные а.о. визуализированы в виде каркаса.
Аналогичный эффект наблюдался и при моделировании калиевых Kv каналов, механочувствительных каналов, грамицидина А и других каналов (Maffeo et al., 2012). Кислороды карбонильной группы селективного фильтра (СФ) как открытой, так и закрытой конформации каналов Kv2.1 и Kv10. ориентированы вовнутрь поры, что важно для проведения ионов и стабильности порового домена (Long et al., 2005). Потенциал-чувствительный домен (voltage sensing domain, VSD) ПЗ ионных каналов содержит солевые мостики, что дополнительно стабилизирует структуру и важно при активации канала (Delemotte et al., 2010).
Модель надмембранного домена 5-НТ3 рецептора сохраняет цистеиновый мостик, что также играет важную роль при активации (Cheng et al., 2006).
В целом, моделирование каналов Kv2.1, Kv10.2 и 5-НТ3 рецептора привело к согласованным результатам в соответствии с имеющимися экспериментальными данными о механизмах активации и кинетике переноса ионов (Long et al., 2005;
Cheng et al., 2006;
Delemotte et al., 2010;
Durdagi et al., 2012). Построенные нами модели трансмембранного домена каналов Kv2.1 и Кv10.2 хорошо соответствуют по размерам картам электронной плотности, соответствующих каналов, полученных методом ПЭМ (рис. 2).
Эксперименты по электронной микроскопии проводились Соколовой О.С. и Гризель А.В. (Соколова с соавт., 2012).
Структурные и динамические свойства тетрамерных ионных каналов в разных конформациях на примере канала Kv2.1.
Активация потенциал-чувствительных Kv каналов происходит при деполяризации мембраны, когда мембранный потенциал исчезает. Из-за отсутствия методов, позволяющих сохранить трансмембранный потенциал при приготовлении образцов каналов для изучения методами рентгеноструктурного анализа или спектроскопии ядерного магнитного резонанса, в настоящее время опубликованы кристаллические структуры только открытых ПЗ каналов (Jensen et al., 2012). Структура неактивного (закрытого) канала в высоком разрешении и подробности цикла активации /инактивации может быть изучена методами молекулярной динамики (МД).
а) б) Рис. 2. Фиттинг построенных моделей в карты электронной плотности, полученные с помощью электронной микроскопии. а) Канал Kv10.2. б) Канал Kv2.1. Каналы показаны с внемембранной стороны. Отмечены домены VSD и PD. Для визуализации полученных трехмерных структур и создания рисунков использовали программу Chimera (Goddard 2007).
Мы проводили вычислительные исследования моделей канала Kv2.1, встроенных в мембрану в открытой и закрытой конформации, для определения фрагментов белка, участвующих в конформационных изменениях при активации канала. Траектории МД позволили провести детальное сравнение динамики открытой и закрытой структур и оценить конформационную подвижность при активации ионных каналов на атомном уровне. Траектории МД рассчитывали в программном пакете NAMD (Phillips et al., 2005).
В моделировании участвовали следующие системы: построенные по гомологии модели Kv2.1 канала в открытом и закрытом состояниях были помещены в модельный бислой эукариотической фосфолипидной мембраны, состоящей из пальмитоилолеоилфосфатидилхолиновых (ПОФХ) липидов.
Для оценки стабильности и структурных изменений моделей Kv2.1 в разных конформациях рассчитывали среднеквадратичное отклонение (RMSD) координат C-атомов относительно начального положения С-атомов каналов (рис. 3). Было показано, что выход RMSD на плато происходит после 10 нс динамики для открытой конформации и 20 нс для закрытой. Это свидетельствует о наибольшей стабильности открытой структуры.
Для изучения конформационных изменений и выделения наиболее подвижного домена, RMSD рассчитывали не только для целого канала, но для его порового региона и VSD. RMSD целого белка флуктуировал в пределах от 0,27 до 0,37 нм (в открытом состоянии) и от 0,37 до 0,55 нм (в закрытом состоянии). В свою очередь поровый участок оказался наиболее стабилен, особенно у открытой структуры. Минимальное значение его RMSD составило 2 (рис. 3). Это может быть обусловлено тем, что в открытом состоянии пора канала заполнена ионами К+ (Шайтан с соавт., 2012). С другой стороны, значительные структурные изменения были показаны в ходе молекулярной динамики для VSD доменов. Максимальные значения RMSD 4 в открытом состоянии и 6,7 в закрытом состоянии. Эти данные свидетельствуют о большей подвижности VSD доменов по сравнению с поровыми участками в обеих системах.
В ходе динамики было показано, что при открытии канала VSD домен значительно изменяет положение (в направлении во внеклеточное пространство в пределах 4-6 и наружу от оси поры в пределах 8-11 ) (рис. 3).
Рис. 3. RMSD С-альфа атомов для целого канала, порового домена (PD) и домена чувствительного к потенциалу (VSD) (черные, серые и двойные черные линии, соответственно) канал KV2.1 в открытой (А) и закрытой (Б) конформации.
Спирали S1, S2, S3 и S4 вращаются по часовой стрелке - канал переходит из закрытой конформации в активированную конформацию. При этом спирали S3 и S4 двигаются вместе и имеют аналогичные смещения.
Наибольшее движение в направлении во внеклеточное пространство и наружу от оси поры характерно для S4 сегмента. Эти данные хорошо согласуются с данными, полученными другими исследователями для химеры Kv1.2/ Kv2.1 (Jensen et al., 2012).
Структурные и динамические свойства пентамерного ионного канала в разных конформациях на примере 5-HT3 рецептора.
Активация ЛЗ ионных каналов происходит в момент присоединения лиганда. Поэтому для изучения конформационной подвижности 5-НТ рецептора и роли различных факторов при активации проводили серию экспериментов, в которых изучали взаимодействие рецептора с лигандом.
Расчет траекторий МД для систем 5-НТ3 рецептора и комплекса 5-НТ рецептора с лигандом проводили в программном пакете GROMACS (Hess et al., 2008).
Рис. 4. (А) Модель 5-HT3 рецептора и (Б) карман для связывания лиганда. Черным выделена отдельная субъединица. Подписаны важные для связывания лиганда петли.
Ранее было показано (Unwin, 2005), что сайт связывания с лигандом ЛЗ канала в надмембранной части (рис. 4) образован петлями А, B, C одной субъединицы и D, E, F другой субъединицы.
При структурном сравнении разных конформаций надмембранных доменов было показано, что для структуры открытой конформации характерен отгиб С-петли, поэтому карман связывания лиганда открыт (рис.
5А). Петля С модели серотонинового 5-НТ3 рецептора закрытой конформации прижата к поре. Следовательно, петля С претерпевает большое относительное смещение при присоединении лиганда.
Б А Рис. 5. Структурное сравнение моделей надмембранных доменов 5-НТ3 рецептора в разных конформациях: черным выделена открытая конформация, серым - закрытая.
Структурное сравнение различных конформаций проводили в программе CE (Shindyalov, Bourne 1998). (А). Динамика петли С при взаимодействии с серотонином (Б).
В ходе динамики 5-НТ3 рецептора с серотонином С-петля изменила конформацию и приняла открытое положение: расстояние между петлей С и серотонином увеличилось, а расстояние между петлей С и фиксированными атомами изменилось, что подтверждает движение петли (рис.5 Б). При исследовании динамики комплекса 5-НТ3 рецептора с серотонином было показано, что стабилизация С-петли в открытом состоянии обусловлена реорганизацией водородных связей, удерживающих С-петлю в открытом положении.
Важную роль при взаимодействии с лигандом играют стекинг взаимодействия: ароматические остатки кармана связывания (W85, Y148, W178) и серотонин лежат друг над другом в стопке, что обеспечивает дополнительную стабилизацию комплекса (Spier et al., 2000). Стабильность комплекса рецептора с лигандом изучали с помощью оценки изменения расстояний между молекулой серотонина и аминокислотными остатками (а.о.), участвующими в связывании. Было показано, что расстояние для а.о.
W85, Y148, W178 изменяются в течение первых 1500 пс динамики и далее остаются стабильными в пределах 3,4 до 12. Это свидетельствует о том, что в течение 1500 пс происходит релаксация лиганда в комплексе. Далее комплекс остается стабильным в течение последующей динамики (рис. 6).
Рис. 6. Динамика сайта связывания с лигандом в комплексе с серотонином.
При этом величина расстояний соответствует длине стекинг взаимодействий у белков: от 3,4 до 12. В течение первых 800 пс петля С смещается: начинается перестройка остатков, непосредственно взаимодействующих с лигандом. Далее конформация белка приходит в равновесное состояние.
В результате исследования динамики 5-НТ3 рецептора с серотонином было показано, что стабилизация комплекса рецептора с лигандом обусловлена реорганизацией водородных связей и стекинг взаимодействиями. Сравнительный анализ динамик пентамерных и тетрамерных ионных каналов в разных конформациях проявил следующую закономерность: при активации открытая конформация канала является термодинамически более выгодной, чем закрытая. Это справедливо как для ЛЗ, так и для ПЗ ионных каналов.
Структурно-динамические особенности селективности катионных каналов с различной симметрией.
Построенные модели ПЗ и ЛЗ ионных каналов с различной симметрией позволили выявить общие закономерности и молекулярные механизмы их функционирования. Для изучения проведения ионов через пентамерные и тетрамерные ионные каналы было проведено сравнительное изучение строения поры каналов в разных конформациях на примере 5-НТ3 рецептора и канала Kv2. Строение PD пентамерного 5-НТ3 рецептора представлено пятью M спиралями, параллельными оси поры (таблица 1). Селективный фильтр открытой конформации 5-НТ3 рецептора проницаем для одновалентных и двувалентных катионов.
Четыре сегмента в составе тетрамерного канала Kv2. PD располагаются под углом относительно оси поры канала (рис. 7). Подобное расположение формирует узкий селективный фильтр с внеклеточной стороны и "вестибюль" с внутриклеточной стороны, позволяющий молекулам воды вместе с растворенными ионами проникать в открытый канал и взаимодействовать с канальным окружением, тем самым стабилизируя структуру (Шайтан с соавт., 2012). Согласно предложенному Jensen (Jensen et al., 2012) механизму "гидрофобной инактивации", при открытии канала пространство поры расширяется, что позволяет молекулам воды проникать в гидрофильную пору и стабилизировать структуру канала, взаимодействуя с канальным интерьером. Закрытие канала сопровождается сужением поры, что приводит к дегидратации порового пространства.
Данный механизм является универсальным для ионных каналов (Jensen et al., 2010).
Для выделения закономерностей селективности ионных каналов мы рассчитывали эффективный радиус поры и выделили селективные ворота исследуемых каналов с помощью программы HOLE (Smart et al., 1996). Для в открытой конформации минимальный радиус поры, 5-НТ сформированной остатками Т279, составил 2.3. Для тетрамерного Kv2.1самая узкая область канала открытой конформации имела радиус 1. и также оказалась образована остатками T192.
Подобное строение каналов имеет важное физиологическое значение:
при передаче нервного импульса в химических синапсах важна скорость генерации электрического потенциала на постсинаптической мембране.
Широкая пора ЛЗ каналов позволяет быстро транспортировать ионы одинакового заряда внутрь клетки и менять потенциал мембраны, что, в свою очередь, активирует ПЗ каналы. При деполяризации мембраны активируются ПЗ Kv каналы, которые, транспортируя К+ из клетки, вызывают реполяризацию мембраны, приводящее к снижению возбудимости нервной клетки.
Рис. 7. Визуализация эффективного радиуса поры канала Kv2.1 (S6 сегмент) и 5-НТ рецептора (М2 спираль) в открытой конформации (вид сбоку). Выделены а.о., определяющие селективность ионных каналов и участвующие в проведении ионов. Слева находится модель целого в 5-HT3 рецептора открытом состоянии. Ток ионов указан стрелками.
Сравнение фрагментов белка, обрамляющих пору (TM2 для 5-НТ рецептора и S6 для Kv2.1) показало, что катион, попадая в канал, встречает в устье поры отрицательно заряженные а.о. Минимальный радиус поры и селективный фильтр соответствуют T у всех исследованных каналов. На выходе катион также встречают отрицательно заряженные а.о. При этом последовательности с пролином P-T и Р-Р имеют важное структурообразующее значение: они создают изгиб поровой спирали, тем самым формируя "вестибюль" для молекул воды (рис.7).
Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей поровых спиралей ЛЗ ионных каналов и фрагментов порового домена ПЗ ионных каналов показало, что T оказывается консервативным для исследуемых групп каналов и создает стерический барьер для проходящих ионов (Таблица 2).
Таблица 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей поровых доменов ЛЗ и ПЗ каналов. Черным выделены консервативные аминокислотные остатки (а.о.), создающие интерьер поры. Серым выделен фрагмент с пролином: P-T(V,L,S,Р). В скобках указана катион (+) или анион (-) проводимость для ЛЗ каналов.
Из данных литературы (Moorhouse et al., 2001) известно, что зарядовая селективность (аниона по сравнению с катионом) для ЛЗ каналов создается с помощью а.о. в устье канала. Множественное выравнивание, проведенное нами, показало наличие консервативных заряженных колец D и E также и в устье каналов Kv. Возможно, молекулярный механизм обеспечения зарядовой селективности у Kv каналов устроен схожим образом.
Кроме этого, анализ выравнивания Kv каналов показал наличие консервативного G в петлях между S4, S5 и S6 канала Kv2.1 и Kv1.2.
Известно, что G может производить шарнирные движения, что придает этим регионам подвижность (Labro et al., 2008). Из-за отсутствия боковых цепей, G имеет большую степень свободы вращения вокруг двугранного угла фи и пси, что приводит к большей конформационной подвижности в области S спирали при активации ПЗ канала.
Анализ динамики движения катионов показал наличие неравномерного движения иона в поре, поскольку в ней наблюдались зоны торможения (рис.
8). Катионы К+ задерживаются в области Т в открытой конформации.
Рис.8. Движение иона К+ через пору ПЗ и ЛЗ каналов в разных конформациях.
Области отрицательно заряженных аминокислотных остатков E, D выполняют роль кулоновского фильтра для ионных каналов в закрытой конформации. Для каналов открытой конформации данные аминокислотные остатки оказывают влияние на ионную селективность канала и на разрыхление гидратной оболочки катионов.
Таким образом, результаты исследования структурно-динамических особенностей селективности катионных каналов с различной симметрией, полученные при использовании комплексного подхода к моделированию структур и метода МД, свидетельствуют о том, что существуют некоторые общие структурные закономерности функционирования эукариотических ионных каналов с различной симметрией. В ходе моделирования было показано, что консервативная последовательность с пролином P-T для ЛЗ и Р Р для ПЗ каналов создает изгиб спирали канала, а консервативный Т (для канала Kv2.1 - T192 и для реептора 5-НТ3 - Т279) соответствует самой узкой области поры. Селективность ПЗ и ЛЗ ионных каналов определяется областью колец, сформированных консервативными остатками E, D и стерическим фактором, образованным консервативным T. Комбинация этих факторов и определяет селективность каналов.
Данные различных работ, представленных в научной литературе, подтверждают факт, что селективность канала по отношению к катиону и аниону для большинства ионных каналов определяется зарядовыми особенностями интерьера поры. Так, отсутствие компенсации положительно заряженных а.о. в устье анион-проводящих каналов глицинового рецептора и рецептора гаммааминомасляной кислоты отвечает за анионную проводимость (Moorhouse et al., 2001). Для ПЗ и катион проводящих ЛЗ каналов селективность определяет наличие отрицательно заряженных а.о. в устье каналов (Renart et al., 2012;
Corry et al., 2012;
Cymes et al., 2012).
Экспериментальные исследования родственных ионных каналов обнаруживают консервативные аминокислотные остатки и сходные элементы структуры (Absalom et al., 2009;
Connolly et al., 2004).
Результаты, полученные в настоящей диссертационной работе, согласуются с данными литературы и расширяют фундаментальное представление о закономерностях формирования специфической активности ионных каналов с различной симметрией.
ВЫВОДЫ 1. Моделирование динамики построенных по гомологии моделей структур пентамерных и тетрамерных ионных каналов (серотонинового 5-НТ рецептора и Kv каналов: Kv2.1, Kv10.2) приводит к согласующимся с экспериментальными данными об активации и кинетике переноса ионов результатам.
2. Установлено, что при открытии Kv2.1 канала сенсор потенциала VSD значительно изменяет свое положение, двигаясь в направлении во внеклеточное пространство в пределах 4-6 и наружу от оси поры в пределах 8-11.
3. Показано, что при образовании комплекса 5-HT3 рецептора с лигандом происходит отгиб петли С на 3-4, стабилизация комплекса обусловлена реорганизацией водородных связей и стекинг-взаимодействиями.
4. Выявлены общие структурные закономерности функционирования эукариотических катионных каналов с различной симметрией. Показано, что селективность катионного канала определяется областью колец, сформированных консервативными остатками E и D и стерическим фактором, образованным консервативным T.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК РФ:
1. Попинако А.В. Молекулярное моделирование и динамика комплексов серотонинового 5-HT3 рецептора с лигандами // Компьютерные исследования и моделирование, 2011, Т. 3, № 1, cтр. 329334.
2. Попинако А.В., Левцова О.В., Антонов М.Ю., Николаев И.Н., Шайтан К.В., - Структурная и динамическая модель серотонинового 5-НТ рецептора человека. Сравнительный анализ структуры канальной части пентамерных лиганд-зависимых ионных каналов // Биофизика, 2011, Т.
56, № 6, стр. 1111-1116.
3. Соколова О.С., Шайтан К.В., Гризель А.В., Попинако А.В., Карлова М.Г., М.П.Кирпичников. Трехмерная структура потенциалзависимого человеческого канала Kv10.2 по данным электронной микроскопии макромолекул и молекулярного моделирования // Биоорганическая химия, 2012, Т.38, стр. 177-184.
4. Попинако А.В., Соколова О.С. Как предсказать неизвестную структуру белка // Природа, 2012, № 7, стр. 33-38.
Статьи в изданиях, не входящих в перечень ВАК РФ:
5. Соколова О.С., Попинако А.В. Структурные исследования в постгеномную эру – решение уравнения с несколькими неизвестными // сборник научно-популярных статей-победителей конкурса РФФИ за год "Биология и медицинские науки", 2012, стр. 167-175.
Тезисы докладов и материалы конференций:
6. Попинако А.В., Антонов М.Ю., - Изучение лиганд-связывающего домена серотонинового 5-НТ3 рецептора методом молекулярной динамики.
Research of Ligand –binding Domain of Serotonin 5-HT3 Receptor Using Molecular Dynamics Method // Cборник трудов Десятой Международной научно-практической конференции Высокие технологии, фундаментальные исследования, Санкт-Петербург, 2010, Т. 4, стр. 45-47.
7. Попинако А.В., Шайтан К.В. Сравнительный анализ динамики функционирования пентамерных и тетрамерных структур ионных каналов. Вестник Волгоградского государственного медицинского университета // 2012, стр.161-162.
8. Попинако А.В. Моделирование 5-НТ3 рецептора методом по гомологии.
Сборник тезисов второго студенческого симпозиума по биоинженерии.
М.: МГУ, 2007, Т. 1, стр. 19-20.
9. Попинако А.В., Терёшкина К.Б., Шайтан К.В. Молекулярная динамика надмембранной части рецептора 5-НТ3, полученной на основании гомологии. Сборник тезисов XV-ой международной конференции Математика. Компьютер. Образование. Ижевск: Научно-издателский центр «Регуляторная и хаотичная динамика», 2008, стр. 204.
10. Попинако А.В. Исследование серотонинового 5-НТ3 рецептора с помощью метода управляемой молекулярной динамики. Сборник тезисов третьего студенческого симпозиума по биоинженерии. М.: Макс Пресс, 2008, Т. 1, стр. 32-34.
11. Попинако А.В. Исследование серотонинового 5-НТ3 рецептора с помощью метода молекулярной динамики. Сборник тезисов четвертого студенческого симпозиума по биоинженерии. М.: Соцветие Красок, 2009, Т. 1, стр. 49-51.
12. ПопинакоА.В. Исследование серотонинового 5-HT3 рецептора с помощью метода молекулярной динамики. Сборник тезисов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», секция "Биология". М.: Макс Пресс, 2009, стр. 29-30.
13. Попинако А.В., Левцова О.В., Шайтан К.В. Исследование серотонинового 5-HT3 рецептора с помощью метода молекулярной динамики. Сборник тезисов XVII-ой международной конференции Математика. Компьютер. Образование. Ижевск: Научно-издателский центр «Регуляторная и хаотичная динамика», 2010, стр. 259.
14. Попинако А.В., Левцова О.В., Шайтан К.В. Молекулярное моделирование структуры и функции серотонинового 5-HT3 рецептора.
Сборник тезисов XVII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". 2010, стр.705-706.
15. Попинако А.В. Молекулярное моделирование структуры серотонинового 5-HT3 рецептора. Сборник тезисов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010», секция "Биология". Москва: Макс Пресс, 2010, стр. 33-34.
16. Попинако А.В., Шайтан К.В. Сравнительный анализ структур пентамерных лиганд-зависимых ионных каналов. Сборник тезисов XVIII-ой международной конференции Математика. Компьютер.
Образование. Ижевск: Научно-издателский центр «Регуляторная и хаотичная динамика», 2011, стр.56, 85.
17. Попинако А.В., Шайтан К.В. Потенциал средней силы для канальной части серотонинового 5-НТ3 рецептора: анализ энергетических барьеров.
Сборник тезисов Международной зимней школы XXIII-ой «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, ИБХ РАН, 2011, стр.4.
18. Попинако А.В., Шайтан К.В. Изучение лиганд-связывающего домена серотонинового 5-HT3 рецептора методом молекулярной динамики.
Сборник тезисов XVIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". 2011, стр.627.
19. Большакова М.А., Попинако А.В., Шайтан К.В. Сравнительный анализ структур и динамики катион проводящих лиганд-зависимых ионных каналов прокариот и эукариот. Сборник тезисов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2011», секция "Биология". Москва: Макс Пресс, 2011, стр.21.
20. Попинако А.В. Исследование молекулярных патофизиологических механизмов шизофрении на примере различных мутаций серотонинового 5-НТ3 рецептора. Международная Интернет-конференция Молекулярные механизмы шизофрении. Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет, 2011, стр. 44-46.
21. Николаев И.Н., Попинако А.В., Шайтан К.В. Исследование комплекса серотонин-серотониновый рецептор методами молекулярной динамики.
Седьмые Курдюмовские чтения, Международная междисциплинарная научная конференция с элементами научной школы для молодёжи «Синергетика в естественных науках». 2011, cтр. 244-247.
22. Попинако А.В., Антонов М.Ю., Шайтан К.В. Молекулярное моделирование комплекса серотонинового 5-НТ3 рецептора с серотонином. Сборник трудов Международной конференции “Рецепторы и внутриклеточная сигнализация”. 2011, стр. 710-714.
23. Popinako A., Antonov M., Shaitan K. Structural features of serotonin 5-HT receptors in native and modified forms. FEBS J. Wiley-Blackwell, 2011, V.
278, S. 1, pp. 127.
24. Popinako A., Homology Modeling and Comparative Analysis of Serotonin 5 HT3 Receptor Structure in Native and Modified Forms. The fifth International Moscow Conference on Computational Molecular Biology and Bioinformatics, MCCMB'11, Москва, 2011.
25. Попинако А.В., Шайтан К.В. Поиск новых мишеней и моделирование перспективных лигандов лиганд-зависимых ионных каналов. Школа конференция молодых ученых "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины-2011". Москва, «Ваш полиграфический партнер» 2011, стр.54-56.
26. Попинако А.В. Сравнительный структурный анализ катион проводящих лиганд-зависимых ионных каналов. Сборник тезисов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2012», секция "Биология". Москва: Макс Пресс, 2012, стр.25-26.
Соискатель Попинако А.В.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. – аминокислотный остаток МД – молекулярная динамика ЛЗ – лиганд-зависимые ПЗ – потенциал-зависимые ПОФХ – пальмитоилолеоилфосфатидилхолиновые липиды ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия СФ – селективный фильтр VSD – потенциал-чувствительный домен (voltage sensing domain) Kv – потенциал-зависимые калиевые каналы PD – поровый домен (pore domain) RMSD – среднеквадратичное отклонение координат C-атомов