Физиолого-биохимические и популяционные адапта ции дикорастущих растений южной и центральной якутии
На правах рукописи
ПРОКОПЬЕВ ИЛЬЯ АНДРЕЕВИЧ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ И ПОПУЛЯЦИОННЫЕ АДАПТА ЦИИ ДИКОРАСТУЩИХ РАСТЕНИЙ ЮЖНОЙ И ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЯКУТИИ Специальность 03.00.16 - Экология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Якутск - 2009
Работа выполнена в Институте биологических проблем криолитозоны СО РАН
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Журавская Алла Николаевна
Официальные оппоненты: кандидат биологических наук, с.н.с.
Корогодина Виктория Львовна, Объе диненный институт ядерных исследо ваний г. Дубна доктор биологических наук, Нюкканов Аян Николаевич, ФГОУ ВПО “Якут ская государственная сельскохозяйст венная академия”, г. Якутск
Ведущая организация: Институт биохимической физики им.
Н.М. Эмануэля РАН, г. Москва
Защита диссертации состоится 2 октября 2009 г. в _час. на заседании диссертационного совета Д 212.306.03 при ГОУ ВПО «Якутский государст венный университет им. М.К. Аммосова» по адресу: 677000, Якутск, ул. Белин ского,
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Якут ский государственный университет им. М.К. Аммосова» по адресу: 677000, Якутск, ул. Белинского, Факс: 8(4112)335- E-mail: [email protected]
Автореферат разослан “ 18 ” августа 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Данилова Н.С.
Общая характеристика работы
Актуальность темы исследования. В связи с загрязнением окружающей среды на фоне глобальных изменений климата в настоящее время повысилась значимость оценки надежности и устойчивости биоты, испытывающей на себе совокупное действие стресс-факторов разной природы и интенсивности [Заха ров, 2000].
Вместе с тем, вся эволюция живой материи, происходившая в условиях действия на биоту различных экстремальных стресс-факторов, привела к фор мированию у организмов ряда адаптаций к этим раздражителям, которые повы сили устойчивость организмов к ним. Причем многие из этих адаптаций явля ются относительно неспецифическими, т.к., сформировавшись в ответ на дей ствие одного стресс-фактора, могут обеспечить устойчивость к группе других раздражителей [Кудряшов, 2004]. Поэтому ответная реакция организма и биоты на действие загрязнений окружающей среды будет зависеть не только от при роды самого стресс-фактора, но и от активности систем обеспечивающих ус тойчивость клетки и организма к нему [Гродзинский, 1989].
Тем не менее, исследований посвященных изучению влияния различных по своей природе и интенсивности стресс-факторов среды на изменение физио логических, биохимических характеристик и радиоустойчивость растений, су ществующих в экстремальных условиях криолитозоны, очень мало [Журавская и др., 2003;
2005].
Цель исследования: Выявить физиолого–биохимические и популяцион ные адаптации дикорастущих растений Южной и Центральной Якутии, изме нения радиоустойчивости их семенного потомства, при действии на них раз личных стресс-факторов среды, включая повышенный естественный радиаци онный фон.
В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
1. Выявить влияние повышенного естественного радиационного фона на физиолого-биохимические характеристики и их вариабельность, а также на ра диоустойчивость семенного потомства ольхи кустарниковой (Duschekia fruti cosa Rupr).
2. Выявить влияние микроклиматических различий и условий произраста ния на физиолого-биохимические характеристики и их вариабельность, а также на радиоустойчивость семенного потомства дескурайнии гулявниковой (Des curainia sophioides (Fisch.)).
3. Выявить влияние городского техногенного пылевого загрязнения на фи зиолого-биохимические характеристики и их вариабельность, а также на радио устойчивость семенного потомства клоповника безлепестного (Lepidium apeta lum Wild).
Рабочая гипотеза. Действие определённого экологического (климатиче ского, техногенного, радиационного) фактора среды на дикорастущие растения, может, проявляется не только в адаптивных изменениях их антиоксидантных и геномных систем, но и в вариабельности этих систем, что в свою очередь мо жет повлиять на их радиоустойчивость.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Неспецифические физиолого-биохимические адаптации дикорастущих растений на уровне антиоксидантной (ферментативной и низкомолекулярной) и геномной защиты возникают как ответ на действия различных стресс факторов среды произрастания 2. Радиоустойчивость к острому облучению популяций дикорастущих рас тений, адаптированных к разным экологическим условиям произрастания, оп ределяется внутрипопуляционной вариабельностью систем общей антиокси дантной защиты, общей устойчивости и дифференциальной активности генома в процессах репликации, репарации ДНК и направленных на трансляцию.
Научная новизна работы. На примере трех видов растений (ольха кус тарниковая, дескурайния гулявниковая и клоповник безлепестный) показано, что при действии различных стресс-факторов среды возникают адаптивные изменения антиоксидантных и геномных систем, которые способны в значи тельной степени влиять на радиоустойчивость их семенного потомства. Впер вые было рассмотрено влияние физиолого-биохимических свойств дикорасту щих растений и их внутрипопуляционной вариабельности, на формирование радиоустойчивости популяций с разной внутрипопуляционной вариабельно стью.
Практическая значимость работы. Полученные в работе закономерности по связи популяционной радиоустойчивости растений и их физиолого биохимических свойств могут быть использованы при проведении экологиче ской экспертизы в целях оценки состояния биоты и прогноза ее жизнеспособ ности при действии различных хронических стресс-факторов среды.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсу ждены на международных конференциях: «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, февраля-3 марта 2006 г.), «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии», (Санкт-Петербург, 29-30 мая 2008 г.), «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, ноябрь 2008 г.) Публикации: по теме диссертации опубликовано шесть печатных работ, в том числе, две - в рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, литературного обзора, описания материалов, использованных методик, трёх глав с анализом и обсуждением результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 17 иностранных и 128 отечественных источников. Диссертация изложена на 80 страницах, включая 10 таблицы, 5 рисунков.
Содержание работы Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и зада чи работы, перечислены основные положения, выносимые на защиту.
Глава 1. Обзор литературы. Освещены вопросы, связанные с физиолого биохимическими адаптациями к стрессу у растений, сформировавшимися в ус ловиях криолитозоны, и их влиянием на формирование радиоустойчивости се менного потомства.
Глава 2. Объекты и методы исследования Материалом для исследова ний служили семена и проростки дикорастущих растений - ольха кустарнико вая (Duschekia fruticosa), дескурайния гулявниковая (Descurainia Sophioides) и клоповника безлепестного (Lepidium apetalum), выросших в условиях влияния различных по природе стресс-факторов среды.
Семена проращивали в чашках Петри, на фильтрах при комнатной темпе ратуре (20-240 С), с длиной дня – 16 ч и ночи – 8 ч, по 50 штук в четырех по вторностях. Критериями оценки физиологических и биохимических параметров растений являлись: выживаемость проростков на 30-е сутки наблюдения на стадии настоящего листа (%), митотическая активность меристематических клеток корней проростков (МИ,%), суммарное содержание низкомолекулярных антиоксидантов (НМАО, мкг-эквкверц../гпр), активность антиоксидантных фер ментов супероксиддисмутазы (СОД), и пероксидазы (мкмоль/мингпр), интен сивность процессов перекистного окисления липидов (ПОЛ), определяемая по концентрация малонового диальдегида (ммоль/г·ткани);
скорости включения Н-тимидина (фмоль/сутгпр) в молекулы ДНК в процессах репликативного и репаративного синтеза и 14С-лейцина (пмоль/ сутгпр) в синтезируемые белки клеток проростков.
Определение активности пероксидазы проводили по стандартной методике [Асатиани, 1969], активность СОД - по методу [Constantine and all, 1977], сум марное содержание НМАО – по методу [Асатиани, 1969], концентрацию мало нового диальдегида - [Рогожин, 1999]. Активность функционирования белок синтезирующих, ДНК–реплицирующих и репарирующих систем определяли с применением радиоиндикаторного метода [Остерман, 1983].
Коэффициенты общей антиоксидантной защиты, репаративной способно сти, общей относительной устойчивости и активности генома клеток пророст ков рассчитывали, применяя комплексную цитолого-биохимическую методику [Журавская А.Н., 2001;
Филиппов, 2000].
Воздушно-сухие семена подвергали острому воздействию –излучения от источника 60Со, в диапазоне доз от 10 до 500 Гр.
Для выявления радиоустойчивости семенного потомства был применен анализ дозовых кривых выживаемости проростков на 30 день наблюдения, на стадии образования первого листа. Радиоустойчивость семян характеризовали значением полулетальной дозы на 30 день наблюдения (ЛД50/30).
Средняя арифметическая, стандартная ошибка среднего и коэффициент ва риации рассчитывались по [Гланц С.А., 1999]. Значимость отличия от контроля оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (U критерий Манна-Уитни) при уровне значимости p0,05. При этом нормаль ность распределения признака проверялась по критерию Шапиро – Уилка. Зна чение ЛД50/30 рассчитывался методом пробит-анализа, с использованием пакета AnalystSoft, StatPlus - программа статистического анализа, v.2007.
Глава 3. Результаты и обсуждение 3.1. Влияние повышенного естественного радиационного фона на фи зиологические, биохимические характеристики и радиоустойчивость се менного потомства ольхи кустарниковой 3.1.1. Характеристика среды обитания исследованной популяции ольхи кустарниковой Эльконский горст занимает территорию, расположенную на 126° в.д. и 58.5° с.в. По административному положению район Эльконского горста нахо дится в Алданском улусе Республики Саха (Якутия). Ближайший населенный пункт – г. Томмот в 30 км к северу. Поскольку отвалы сформированы в ходе геолого-разведочных работ, их площадь распространения рассредоточена на ~ 360 км2 по бассейнам рек Элькон и ее притока Курунг, а также рек Русская и Холодная – левых притоков Большого Ыллымаха.
Основной урановый минерал браннерит (титанат урана), приблизительного состава UTi2O6, распределен в руде неравномерно в виде прожилков микро брекчиевой и колломорфной текстуры, вкрапленностей и виде тонких сраста ний с пиритом и марказитом [Бойцов и др., 1999].
3.1.2. Физиологические и цитолого-биохимические характеристики семен ного потомства ольхи кустарниковой Полученные физиологические и цитолого-биохимические характеристики 30-суточных проростков семенного потомства ольхи кустарниковой представ лены в табл. 1. Видно, что с ростом мощности экспозиционных доз произраста ния материнских растений в диапазоне от 0,7 до 53,5 пКл/(кг·с) митотическая активность корневой меристемы снижается на 50-70% по сравнению с контро лем.
Таблица Физиологические и цитолого–биохимические характеристики проростков семенного потомства ольхи кустарниковой, выросшей в условиях разного ПЕРФ -фон, пКл/ МИ, % Скорость включения Содержание Активность фермента, Выживае НМАО, мость, мкмоль/(мингпр) (кгс) % мкгэквкверц./ Н3-тимидина гпр С-лейцина, перокси- СОД пмоль/ фмоль/ даза (гпрсут) (гпрсут) 0,7-1,6 1,3±0,2 3,2±0,7 4,1±0,6 3,8±0,5 1,4±0,3 2,1±0,1 37,1±2, 3,8-10,6 0,4±0,1* 1,2±0,2* 3,5±0,6 4,8±1,1 0,4±0,1* 0,4±0,1* 9,9±0,9* 18,2-25,0 0,7±0,1* 1,7±0,4 3,0±0,4 7,6±1,7* 0,8±0,1* 0,6±0,1* 15,5±3,2* 32,4-39,2 0,6±0,3* 2,2±0,8 5,1±1,1 4,7±1,7 0,4±0,1* 0,9±0,1* 17,6±2,7* 46,7-53,5 0,6±0,1* 2,1±0,9 4,2±0,7 5,3±0,6* 0,4±0,1* 1,6±0,3 23,1±2,5* * - различия статистически значимы по сравнению с контролем, p0,05 (U-критерий Ман на-Уитни) Активность процессов репликации и трансляции (рассчитанная по скоро сти включения 3Н-тимидина и 14С-лейцина) в клетках проростков статистиче ски достоверно не изменилась, кроме групп растений, произраставших при мощности экспозиционных доз от 3,8 до 10,6 пКл/(кг·с), где было отмечено значимое снижение на 62% активности трансляции относительно контроля.
Содержание НМАО в клетках проростков семенного потомства изменялось не линейно. По мере роста мощности -излучения, отмечено статистически достоверное увеличение содержания НМАО в клетках растений, произрастаю щих при мощности экспозиционных доз от 18,2 до 25,0 пКл/(кг·с) (7,6±1, мкгэквкверц./гпр) и от 46,7 до 53,5 пКл/(кг·с) (5,3±0,6 мкгэквкверц./гпр ), соответст венно. Активность ферментов антиоксидантной защиты супероксиддисмутазы и пероксидазы, с ростом мощности -излучения изменялась следующим обра зом: активность пероксидазы падала в 2-6 раз;
активность СОД снижалась на 80% в диапазоне мощности экспозиционных доз от 3,8 до 10,6 пКл/(кг·с). С по следующим ростом мощности экспозиционной дозы произрастания растений происходила постепенная активация супероксиддисмутазы. А при мощности экспозиционных доз от 46,7 до 53,5 пКл/(кг·с) активность СОД в клетках со ставляла 1,6±0,3 мкмоль/(мингпр), что статистически достоверно не отличалось от контроля.
Выживаемость проростков семенного потомства ольхи кустарниковой также уменьшалась по мере роста ПЕРФ, при этом была установлена положи тельная корреляция (r=0,98;
p=0,004) между активностью СОД и выживаемо стью проростков в зависимости от мощности экспозиционной дозы произра стания материнских растений (табл.1;
рис.1).
45 Рис.1. Выживаемость проростков и ак Выживаемость, % Гамма фон, пКл/(кг·с) тивность СОД в клетках ольхи кустар 0,7-1,6 никовой при разных уровнях ПЕРФ 3,8-10, произрастания материнских растений.
18,2-25, 30 32,4-39, 46,7-53, 10 r = 0,98;
p = 0, 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2, Активность СОД, мкмоль/(г·мин) С использованием комплексной цитолого-биохимической методики, были получены данные, характеризующие общую относительную активность генома (kаог), уровни антиоксидантной защиты (kаоз) и репаративной способности (kреп), общую относительную устойчивость (kуг) клеток проростков семенного потом ства ольхи кустарниковой (табл. 2).
Установлено, что значения исследованных коэффициентов с ростом мощ ности экспозиционных доз произрастания изменяются относительно контроль ных значений. Видно, что коэффициент общей антиоксидантной защиты по ме ре роста ПЕРФ произрастания, снижается у растений, произраставших в диапа зоне доз 3,810,6 пКл/(кгс) - на 40%, а в диапазоне доз 32,439,2 пКл/(кгс) на 30%. У семенного потомства растений, произраставших в диапазоне мощно сти доз от 18,2 до 25,0 и 46,7до 53,5 пКл/(кг·с), значения kаоз, сформировавший ся в основном за счет значительного увеличения суммарного содержания НМАО в клетках (табл.1), близки к контрольному значению. Установлено сни жение общей активности генома с ростом ПЕРФ произрастания, минимальное значение наблюдалась у группы растений в диапазоне мощностей экспозици онных доз от 3,8 до 10,6 пКл/(кгс) и составило 40% относительно контрольного значения. Значение коэффициента репарации не линейно увеличивалось по ме ре роста мощности экспозиционной дозы места произрастания, и достигало максимума в диапазонах доз от 3,8 до 10,6 (70%), от 18,2 до 25,0 (40%), от 32, до 39,2 (80%) и 46,7-53,5 пКл/ (кгс), где репаративная способность увеличилась на 50% относительно контроля. В целом, с ростом ПЕРФ значение коэффици ента устойчивости генома семенного потомства повышалась на 10-20%.
Таблица Значения коэффициентов антиоксидантной защиты, общей активности генома, репара ции, общей относительной устойчивости генома клеток семенного потомства ольхи кустар никовой, выросшей в условиях разного ПЕРФ (нормировано относительно контроля (0,7-1, пКл/(кгс) -фон, kаоз kоаг kреп kуг пКл/(кгс) 0,7-1,6 1,0 1,0 1,0 1, 3,8-10,6 0,6 0,6 1,7 1, 18,2-25,0 1,0 0,9 1,4 1, 32,4-39,2 0,7 0,8 1,8 1, 46,7-53,5 0,9 0,8 1,5 1, 3.1.3. Внутрипопуляционная изменчивость коэффициентов антиоксидант ной защиты, общей активности генома, репарации, общей относительной ус тойчивости генома клеток семенного потомства ольхи кустарниковой Установлено, что с ростом мощности экспозиционной дозы -излучения, на территории произрастания материнских растений, вариабельность общей ан тиоксидантной защиты клеток проростков семенного потомства увеличилась в 1,5–2,0 раза по сравнению с контролем (табл.3). Вариабельность коэффициен тов общей активности генома и устойчивости генома по мере роста мощности -фона не изменялась.
Таблица Значения вариабельности (%) коэффициентов антиоксидантной защиты, общей актив ности генома, репарации, общей относительной устойчивости генома клеток и полулеталь ной дозы семенного потомства ольхи кустарниковой, выросшей в условиях разного ПЕРФ -фон, Vkаоз Vkоаг Vkреп Vkуг ЛД50/30, Гр пКл (кгс) 0,7-1,6 22,8 32,9 54,2 40,9 27,0±3, 3,8-10,6 40,0 30,4 47,6 41,4 146,7±22,4* 18,2-25,0 36,2 32,6 67,9 47,9 287,5±20,0* 32,4-39,2 34,5 38,1 51,2 43,8 140,0±15,3* 46,7-53,5 36,4 38,2 50,0 41,1 155,1±19,8* * - различия статистически значимы по сравнению с контролем p0,05 (U-критерий Ман на-Уитни) Вариабельность расчетного коэффициента репарации также находилась на одном уровне с контролем, кроме групп растений, произраставших при мощности -фона в диапазоне от 18,2 до 25,0 пКл/(кг·с), для которых данное значение составило 67,9%, что выше на 13,7% контрольного значения (Vkреп=54,2%).
3.1.4. Радиоустойчивость семенного потомства ольхи кустарниковой Дополнительное острое воздействие на семена растений -квантами 60Со в диапазоне доз от 10 до 500 Гр позволило выявить скрытый адаптационный по тенциал и построить дозовые кривые выживаемости проростков, выросших из семенного потомства ольхи кустарниковой. Видно, что длительное произраста ние материнских растений в условиях ПЕРФ ведет к увеличению устойчивости к провокационному облучению их семенного потомства (рис.2). Проведенный анализ кривых выживаемости показал, что радиоустойчивость семенного по томства ольхи кустарниковой, созревших в условиях ПЕРФ, значимо возросла по сравнению с контролем. Максимальное значение по показателю ЛД50/30 287,5±20,0 Гр - имело семенное потомство растений, произраставших при мощ ностях экспозиционных доз -излучения от 18,2 до 25,0 пКл/(кг·с). Это более чем в 10 раз выше значения контроля (табл.3).
Следует отметить, что длительное произрастание материнских растений ольхи кустарниковой при мощности экспозиционных доз в диапазоне от 0,7 до 53,5 пКл/(кг·с) дало положительную корреляцию (r=0,97;
p=0,008;
рис.3) между содержанием низкомолекулярных антиоксидантов в клетках проростков и зна чением полулетальной дозы.
100 Гамма фон, пКл/(кг·с) 50/30, Гр 300 0,7-1, Выживаемость, % 3,8-10, 250 18,2-25, 20 32,4-39, 46,7-53, Гамма фон, пКл/(кг·с) Контроль 18,2-25,0 пКл/(кг·с) r =0,98;
p = 0, 46,7-53,5 пКл/(кг·с) 3 4 5 6 7 0 100 200 300 400 НМАО,мкг-эквкверц/гпр Доза, Гр Рис. 2. Выживаемость проростков семенного Рис. 3. Значения полулетальной дозы и сум потомства ольхи кустарниковой в зависимо- марного содержание НМАО в клетках про сти от дозы острого облучения при разных ростков ольхи кустарниковой при разных уровнях ПЕРФ произрастания материнских уровнях ПЕРФ произрастания материнских растений (нормировано относительно кон- растений троля) Таким образом показано, что длительное произрастание ольхи кустарни ковой в диапазоне мощностей экспозиционных доз -излучения от 3,8 до 53, пКл/(кг·с) вызвало неспецифические биохимические адаптивные изменения, о чем может свидетельствовать снижение активности генома, увеличение интен сивности процессов репарации ДНК и вариабельности коэффициента общей антиоксидантной защиты у семенного потомства. Можно предположить, что эти изменения привели к повышению устойчивости семян к острому облуче нию. Кроме того, длительное произрастание растений при мощности экспози ционной дозы -излучения от 18,2 до 25,0 пКл/(кг·с) привело дополнительно к повышению суммарного содержания низкомолекулярных антиоксидантов в клетках (7,6±1,7мкгэквкверц./гпр), что являлось благоприятным фактором для формирования более высокой радиоустойчивости к острому облучению (ЛД50/30=287,5±20,0 Гр). Повышенная вариабельность расчетных коэффициен тов (Vkреп=67,9%;
Vkаоз= 36,2%) может косвенно свидетельствовать о повыше нии радиоустойчивости выжившего семенного потомства [Позолотина, 2003].
3.2 Влияние микроклиматических условий произрастания на физио логические, биохимические характеристики и радиоустойчивость семен ного потомства дескурайнии гулявниковой 3.2.1. Характеристика среды обитания популяций дескурайнии гулявни ковой Были исследованы мохсоголлохская и маганская популяции дескурайнии гулявниковой. Расстояние между местами произрастания популяций составляло около 85 км. Микроэкологические условия мест произрастания отличались сте пенью увлажненности и высотой над уровнем моря. Высота местности произ растания маганской популяции составляет 200 м, а мохсоголлохская – 100 м над уровнем моря. Мохсоголлохская популяция дескурайнии гулявниковой росла на пологом берегу р. Лена и растения имели больший доступ к воде, чем маганская популяция, ареал которой находился на территории заброшенного поля, вдали от водоемов. Относительная влажность воздуха у реки, по много летним наблюдениям Гидрометеоцентра, составляет в среднем 50–70%, а на суходолах – 30% и ниже [Климат Якутска, 1982]. Известно, что наиболее важ ными факторами, способствующими накоплению биологически активных ве ществ, являются высокая температура и малое количество осадков в период ак тивной вегетации (июль) [Филиппова, 2003]. Одновременно обе популяции ис пытывали на себе действие всех особенностей резко-континентального климата Центральной Якутии, где развитие растений происходит в исключительно своеобразных почвенно-климатических условиях, обусловленных сочетанием суровой, продолжительной, малоснежной зимы и короткого, но относительно теплого, засушливого лета, наличием многолетне мерзлотных грунтов со свое образной динамикой частичной сезонной оттайки и водного режима.
3.2.2. Физиологические и цитолого-биохимические характеристики семен ного потомства дескурайнии гулявниковой Полученные физиологические и цитолого-биохимические характеристики 30-суточных проростков из семенного потомства двух популяций дескурайнии гулявниковой представлены в табл. 4.
Таблица Цитолого-биохимические характеристики проростков популяций дескурайнии гулявни ковой в зависимости от микроклиматических условий обитания Концентра Содержание Активность фер- Скорость включения МИ, % ция МДА, Популя- НМАО, ментов, ммоль/ ция мкг-эквкверц./ мкмоль/(мин·гпр) (г·ткани) гпр 3 СОД пероксида- H-тимидина, C-лейцина, за фмоль/сут·г пр пмоль/сут·г пр Маганская 10,2±0,8* 0,4±0,1 0,2±0,1 6,5±0,9 2,6±0,4 2,1±0,6 0,7±0, Мохсого- 7,8±0,7 0,3±0,1 0,5±0,1 5,5±0,9 2,0±0,3 1,9±1,2 0,6±0, ллохская * - различия статистически значимы по сравнению с контролем p0,05 (U-критерий Ман на-Уитни) Видно, что у проростков маганской популяции содержание НМАО соста вило 10,2±0,8 мкгэквкверц./гпр, что на 30% выше, чем у мохсоголлохской. Актив ность процессов репликации и трансляции (по скорости включения 3Н тимидина и 14С-лейцина), митотическая активности корневой меристемы, ак тивности ферментов СОД и пероксидазы, а также интенсивность процессов ПОЛ у проростов растений обеих популяций статистически значимо не разли чались. Показано, что микроклиматические различия условий места произра стания дескурайнии гулявниковой оказывают влияние на антиоксидантную за щиту клеток (kаоз=1,21) семенного потомства маганской популяции, которая формировалась в основном за счет увеличение суммарного содержания НМАО (табл. 5).
Также установлено, что у семенного потомства маганской популяции, уровень общей активности генома и репарации ДНК не отличим от уровня мох соголлохской. Показано увеличение показателя устойчивости генома клеток семенного потомства маганской популяции kуг=1,21 (за счет вклада антиокси дантной защиты), по сравнению с этим показателем мохсоголлохской популя ции.
Таблица Значения коэффициентов антиоксидантной защиты, общей активности генома, репа рации, общей относительной устойчивости генома клеток семенного потомства дескурайнии гулявниковой (нормировано относительно мохсоголлохской популяции) kаоз kоаг kреп kуг Популяция Маганская 1,21 1,0 1,0 1, Мохсоголлохская 1,0 1,0 1,0 1, 3.2.3. Внутривидовая изменчивость коэффициентов антиоксидантной за щиты, общей активности генома, репарации, общей относительной устойчиво сти генома клеток семенного дескурайнии гулявниковой Установлено, что вариабельность коэффициентов общей антиоксидант ной защиты и устойчивости генома у проростков маганской популяции выше на 17,8 и 8,8%, соответственно, чем у мохсоголлохской (табл.6). При этом пока затели вариабельности коэффициентов общей активности генома и репарации находились на одном уровне.
3.2.4. Радиоустойчивость семенного потомства популяций дескурайнии гу лявниковой.
Дополнительное воздействие на семена растений -квантами 60Со в диапа зоне доз от 10 до 500 Гр позволило выявить их скрытый адаптационный потен циал и построить дозовые кривые выживаемости семенного потомства деску райнии гулявниковой (табл.6;
рис.4). Видно, что более экстремальные условия произрастания материнских растений маганской популяции ведут к увеличе нию более чем в 2 раза устойчивости к острому облучению их семенного по томства (ЛД50/30=49,8±15,8 Гр), по сравнению с мохсоголлохской (ЛД50/30=20,6±4, Гр).
Таблица Значения вариабельности (%) коэффициентов антиоксидантной защиты, общей актив ности генома, репарации, общей относительной устойчивости генома клеток и полулеталь ной дозы семенного потомства дескурайнии гулявниковой Популяция Vkаоз Vkоаг Vkреп Vkуг ЛД, Гр 50/ Маганская 46,1 31,5 47,1 56,9 49,8±15,8* Мохсоголлохская 28,3 31,3 50,5 48,1 20,6±4, * - различия статистически значимы по сравнению с контролем p0,05 (U-критерий Ман на-Уитни) Рис. 4. Выживаемость проростков се менного потомства дескурайнии гуляв Выживаемость, % 50 никовой в зависимости от дозы острого облучения при различных микроклима тических условиях произрастания ма теринских растений (нормировано от 10 носительно контроля) 5 Популяция Маганская Мохсоголлохская 0 100 200 300 400 Доза, Гр Полученные результаты позволяют утверждать, что увеличение совокуп ных защитных антиоксидантных систем (прежде всего, низкомолекулярных) у семенного потомства растений маганской популяции, вызванные микроклима тическими особенностями ее произрастания, способствовало значительному повышению радиоустойчивости, а увеличение вариабельности коэффициентов антиоксидантной защиты и устойчивости генома косвенно свидетельствует о повышении резистентности семян в этой популяции.
3.3 Влияние техногенного пылевого загрязнения на физиологические, биохимические характеристики и радиоустойчивость семенного потомства клоповника безлепестного 3.3.1. Характеристика среды обитания исследованных популяций клопов ника безлепестного Семена клоповника безлепестного, подвергавшегося воздействию техно генного запыления, были собраны у растений на территории г. Якутска на рас стоянии 10 м от проезжей части, где уровень запыления составлял 6,9±0, г/(м2сут). В качестве контроля были взяты семена растений, произраставших на 10 км в удалении от города, где уровень запыления составлял 0,3±0, г/(м2сут).
3.3.2. Содержание ряда тяжелых металлов в исследованной пыли в зави симости от степени техногенного загрязнения места произрастания клоповника безлепестного.
В табл. 7 представлены содержания ряда тяжелых металлов в исследован ной пыли, полученные в аналитическом центре Всероссийского геологического института академии наук им. А.П. Карпинского методом ISP–MS. Установлено, что пыль собранная в точке (6,9±0,69 г/(м2сут) отличалась от контроля по со держанию только 4 из 15 исследованных нами элементов.
Таблица Содержание тяжелых металлов в пыли, мг/кг в зависимости от степени техногенного загрязнения места произрастания клоповника безлепестного Запыление, г/(м сут) Cu Zn Mo Pb 0,3±0,03 16,3 53,8 0,7 8, 6,9±0,69 33,5 143,0 2,4 16, Показано увеличение содержание меди в 2, цинка - в 2,7, молибдена - в 3,4 и свинца - в 2 раза по сравнению с наличием этих элементов в контрольной пробе пыли.
3.3.2. Физиологические и цитолого-биохимические характеристики семен ного потомства клоповника безлепестного Для выявления влияния техногенного пылевого загрязнения на семенное потомство были рассмотрены изменения физиологических и цитолого биохимических характеристик проростков семенного потомства клоповника безлепестного, которые представлены в табл. 8.
Таблица Физиологические и цитолого–биохимические характеристики проростков семенного потомства клоповника безлепестного в зависимости от степени пылевого загрязнения Концен Запыление, Содержание Активность фер- Скорость включения, МИ, % г/(м2сут) трация НМАО, ментов, МДА, мкг-эквкверц./ мкмоль/(мин·гпр) ммоль/(г·т 3 гпр СОД перокси- H-тимидина, C-лейцина, кани) даза фмоль/ пмоль/ сут·г пр сут·г пр 0,3±0,03 1,7±0,1 0,8±0,2 1,2±0,1 2,4±0,3 1,8±0,2 1,8±0,2 2,4±0, 6,9±0,69 3,6±0,1* 1,5±0,2* 1,6±0,2* 3,1±0,5 2,1±0,3 1,7±0,1 1,4±0,1* * - различия статистически значимы по сравнению с контролем p0,05 (U-критерий Ман на-Уитни) Видно, что у семенного потомства растений, произраставших в условиях хронического техногенного запыления (6,9±0,69 г/(м2сут), наблюдалось стати стически значимое увеличение активности всех исследованных нами антиокси дантных систем, относительно контроля (0,3±0,03 г/(м2сут). Так суммарное со держание НМАО увеличилось в 2 раза, активность ферментов СОД и перокси даза - на 87,5 и 33,3 %, соответственно. Интенсивность процессов ПОЛ была значимо ниже на 58,3% у проростков, произраставших при запылении (1,4±0, ммоль/г·ткани), что говорит о более высоком антиоксидантном статусе исследо ванных растений. Активность процессов репликации и трансляции (по скорости включения 3Н-тимидина и 14С-лейцина) и митотическая активности корневой меристемы у проростов растений статистически значимо не различались.
В табл. 9 представлены расчетные коэффициенты, полученные с помощью комплексной цитолого-биохимической методики.
Таблица Значения коэффициентов антиоксидантной защиты, общей активности генома, репара ции, общей относительной устойчивости генома клеток семенного потомства клоповника безлепестного (нормированы относительно контроля) Запыление, kаоз kоаг kреп kуг г/(м2сут) 0,3±0,003 1,0 1,0 1,0 1, 1,79 1,0 1,0 1, 6,9±0, Видно, что при увеличении степени запыления у растений изменялись зна чения расчетных коэффициентов активности и устойчивости геномных систем.
При этом наибольшее значения имел показатель общей антиоксидантной защи ты (kаоз=1,79), который внес самый значительный вклад в повышение устойчи вости генома клеток (kуг =1,79).
3.3.3. Внутривидовая изменчивость коэффициентов антиоксидантной за щиты, общей активности генома, репарации, общей относительной устойчиво сти генома клеток семенного потомства клоповника безлепестного В табл. 10 показано, что вариабельность коэффициентов биологически важных показателей у семенного потомства растений, выросших в условиях техногенного запыления, имели тенденцию к снижению относительно контро ля. Например, вариабельность коэффициента общей антиоксидантной защиты снизилась на 13,6%, устойчивости генома - на 36,1%, репарации - на 11,2%. Ва риабельность коэффициента общей активности генома находилась на одном уровне с контролем.
Таблица Значения вариабельности (%) коэффициентов антиоксидантной защиты, общей актив ности генома, репарации, общей относительной устойчивости генома клеток и полулеталь ной дозы семенного потомства клоповника безлепестного в зависимости от степени пылево го загрязнения Запыление, Vkаоз Vkоаг Vkреп Vkуг ЛД50/30, Гр г/(м2сут) 0,3±0,03 41,1 28,4 59,8 60,5 331,3±35, 6,9±0,69 27,5 27,9 48,6 24,4 361,9±25, Установлено снижение вариабельности исследованных коэффициентов се менного потомства растений, произраставших при запылении 6,9±0, г/(м2сут), что может указывать на действие стабилизирующего отбора, при ко тором происходит устранение особей с отклонением от сложившейся в данных условиях нормы.
3.3.4. Радиоустойчивость семенного потомства популяций клоповника без лепестного Острое дополнительное воздействие на семена растений -квантами 60Со в диапазоне доз от 10 до 500 Гр также позволило выявить скрытый адаптивный потенциал и построить дозовые кривые выживаемости семенного потомства клоповника безлепестного (табл.9;
рис.5).
Рис. 5. Выживаемость проростков се менного потомства клоповника без лепестного в зависимости от дозы Выживаемость, % 50 острого облучения при различной степени техногенного запыления места произрастания материнских растений (нормировано относительно 10 Запыление, г/(м2 сут) контроля) 5 0,3±0, 6,9±0, 0 100 200 300 400 Доза, Гр Показано, что высокая степень техногенного запыления (6,9±0,69 г/м2сут) места произрастания материнских растений статистически значимо не отрази лась на уровне радиоустойчивости семенного потомства относительно контро ля (0,3±0,03 г/м2сут).
Выводы 1. Установлена положительная корреляция между активностью СОД и вы живаемостью семенного потомства ольхи кустарниковой в зависимости от ПЕРФ произрастания материнских растений, что может рассматриваться как один из механизмов адаптации этого вида к хроническому радиационному стрессу.
2. Показано, что длительное произрастание материнских растений ольхи кустарниковой при мощности экспозиционной дозы -излучения от 18,2 до 25, пКл/(кг·с) вызвало повышение вариабельности коэффициентов репарации и ан тиоксидантной защиты семенного потомства, что может свидетельствовать об адаптивных изменениях, которые в сочетании с повышенным суммарным со держанием низкомолекулярных антиоксидантов и интенсивностью процессов репарации ДНК в клетках явились благоприятным фактором для формирования радиоадаптивного ответа к острому облучению.
3. Показано увеличение суммарного содержания низкомолекулярных ан тиоксидантов и вариабельности коэффициента антиоксидантной защиты маган ской популяции дескурайнии гулявниковой, по сравнению с мохсоголлохской популяцией. Предположено, что вызванные микроклиматическими особенно стями адаптивные изменения в семенном потомстве растений маганской попу ляции способствовали значительному повышению его радиоустойчивости к острому облучению, что аналогично механизму формирования радиоустойчи вости к острому облучению при действии ПЕРФ на семенное потомство ольхи кустарниковой.
4. Установлено, что длительное произрастание материнских растений кло повника безлепестного в условиях хронического техногенного загрязнения пы лью, содержащей тяжелые металлы, увеличило суммарное содержание низко молекулярных и активировало ферментативные антиоксиданты, что, в свою очередь, привело к повышению устойчивости генома их семенного потомства к данным условиям произрастания.
5. Выявлено, что радиоустойчивость семенного потомства клоповника без лепестного, длительное время произраставшего в условиях хронического тех ногенного запыления, несмотря на высокое значение антиоксидантного статуса, статистически значимо неотличима от контроля.
Условные обозначения СОД – супероксиддисмутаза НМАО – низкомолекулярные антиоксиданты МИ – митотический индекс МДА – малоновый диальдегид ПЕРФ – повышенный естественный радиационный фон, пКл/(кгс) kаоз – коэффициент общей антиоксидантной защиты kоаг – коэффициент общей активности генома kреп – коэффициент репарации kуг – коэффициент относительной устойчивости генома V – коэффициент вариабельности признака, % ЛД50/30 – полулетальная доза на 30-ый день наблюдения, Гр Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Прокопьев И.А. Влияние вариабельности физиолого-биохимических характеристик на радиочувствительность экоформ лебеды раскидистой (Atriplex patula L.) и полыни чернобыльник (Artemisia vulgaris L.)// Радиаци онная биология. Радиоэкология. – 2006. – Т. 46, №.1. - С. 85-90 (Соавт. Жу равская А.Н., Воронов И.В.) 2. Прокопьев И.А. Влияние вариабельности физиолого-биохимических характеристик на радиочувствительность ольхи кустарниковой (Dusche cia fruticjsa (Rupr), произрастающей в условиях повышенного естественно го радиационного фона // Наука и образование. – 2006. - №.2. - С. 34 - (Соавт. Журавская А.Н., Воронов И.В).
3. Прокопьев И.А. Радиочувствительность экоформ лебеды раскидистой (Atriplex patula L.) и полыни чернобыльник (Artemisia vulgaris L.) в зависимо сти от вариабельности их физиолого-биохимических характеристик// Биологи ческие эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязне ние среды: тезисы докл. Междунар. конф. (Сыктывкар, 28 февраля-3 марта г.). – Сыктывкар, 2006. - С.73. (Соавт. Журавская А.Н., Воронов И.В.).
4. Прокопьев И.А. Влияние вариабельности физиолого- биохимических харак теристик на радиоустойчивость ольхи кустарниковой (Duschekia fruticosa (Rupr)Pouzar) произрастающей в условиях повышенного радиационного фона // Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии: тезисы докл. Все рос. конф. (Санкт-Петербург, 29-30 мая 2008 г.). – М., 2008. – C. 87 (Соавт. Жу равская А.Н., Воронов И.В). – устный доклад 5. Прокопьев И.А. Влияние малых концентраций эндогенных антиоксидантов на радиоустойчивость семян Descurainia Sophioides (Fisch.) // Механизмы дей ствия сверхмалых доз: тезисы докл. Междунар. симпозиум. (Москва, ноябрь 2008 г.). М., 2008. – С. 91-92 (Соавт. Журавская А.Н.).
6. Прокопьев И.А. Изучение адаптивных возможностей ольхи кустарниковой, произрастающей в зоне повышенного естественного радиационного фона // Наука и образование. – 2009. - №2. – С. 69 – 73 (Соавт. Журавская А.Н., Воро нов И.В).