Молекулярно-генетический анализ клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений трибы vicieae, произрастающих на территории республики башкортостан
На правах рукописи
ПТИЦЫН КОНСТАНТИН ГЕОРГИЕВИЧ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ДИКОРАСТУЩИХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ ТРИБЫ VICIEAE, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН 03.02.07 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2012 1
Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждение науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Кандидат биологических наук, доцент
Научный консультант:
Баймиев Андрей Ханифович Доктор биологических наук, доцент
Официальные оппоненты:
Беньковская Галина Васильевна Кандидат биологических наук, доцент Маркушева Татьяна Вячеславовна Институт биохимии и физиологии растений и
Ведущая организация:
микроорганизмов РАН, г. Саратов
Защита диссертации состоится «24» февраля 2012 г. в «14» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133. при ИБГ УНЦ РАН по адресу: Уфа, пр. Октября,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), с авторефератом – на сайте ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: [email protected]
Автореферат разослан «24» января 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Симбиотические взаимоотношения бобовых растений и клубеньковых бактерий являются актуальной проблемой современной биологии в рамках изучения процесса азотфиксации и служат объектом интенсивных исследований различных специалистов в течение нескольких десятков лет (Rivas et al., 2009). Решение этой проблемы важно как с научной, так и с практической точек зрения и связано с необходимостью повышения уровня усвоения атмосферного азота хозяйственно значимыми бобовыми растениями, большинство из которых в умеренных широтах относятся к трибе Vicieae ((Adans.) Bronn) сем. Fabaceae. Одной из актуальных задач современной биотехнологии и генетики в данном аспекте является исследование генетических ресурсов клубеньковых бактерий, особенно естественных природных популяций. Наиболее эффективным подходом для этих исследований является молекулярно-генетический анализ их генетического разнообразия, результатом которого может быть более полное понимание процессов возникновения новых генотипов за счет мутаций, генетических перестроек, горизонтального переноса генов.
Значение таких исследований велико, поскольку они дают материал для отбора наиболее удачных комбинаций геномов ризобий для использования при выращивании бобовых растений, а также могут быть использованы в качестве основы для направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для практики.
Начиная с 2000 годов, в систематике клубеньковых бактерий появились существенные изменения, так, были открыты неризобиальные виды, способные к образованию азотфиксирующих клубеньков (Sy et al., 2001;
van Berkum et al., 2002;
Chen et al., 2007;
2008). Данная способность во многом связана с горизонтальным переносом симбиотических генов (ГПГ), который может происходить как между близкородственными видами (Sullivan et all., 1996), так и среди неродственных видов (Zhao et.al., 2008).
Исследование симбионтов дикорастущих видов бобовых растений является актуальной задачей, поскольку может способствовать расширению границ систематики клубеньковых бактерий и выявлению среди них наиболее конкурентоспособных и эффективных в определенных экологических условиях штаммов для их последующего использования в сельском хозяйстве.
Цель работы заключалась в исследовании генетического разнообразия и филогении клубеньковых бактерий бобовых трибы Vicieae, произрастающих на территории Республики Башкортостан.
Задачи исследования:
1) Сформировать коллекцию клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими бобовыми растениями трибы Vicieae, произрастающими в различных районах Республики Башкортостан.
2) Провести с помощью RAPD анализа исследование генетического разнообразия изолированных штаммов микроорганизмов.
3) Методом сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК бактерий определить их филогенетическое положение.
4) Провести филогенетический анализ симбиотических генов изолированных штаммов микроорганизмов.
Научная новизна. Впервые исследована филогения и генетическое разнообразие клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала, относящихся к трибе Vicieae. Показано, что клубеньковые бактерии дикорастущих бобовых растений трибы Vicieae характеризуются высоким уровнем полиморфизма последовательности ДНК, вызванным различиями в составе их плазмид. У некоторых представителей растений рода Lathyrus (чина) в клубеньках обнаружены не типичные для них виды клубеньковых бактерий: у чины L. vernus и L. sylvestris – бактерии Rhizobium tropici, у L. palustris - Agrobacterium sp., а у L. gmelinii - Phyllobacterium sp.
Обнаруженные у данных микроорганизмов симбиотические гены имеют высокий уровень сходства нуклеотидных последовательностей с аналогичными генами R. leguminosarum bv. viciae, что предполагает приобретение sym-генов исследуемыми штаммами посредством горизонтального переноса, что и явилось причиной изменения их специфичности.
Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о генетическом разнообразии клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений трибы Vicieae, что может быть использовано для выявления наиболее удачных комбинаций геномов ризобий, которые могут быть использованы в качестве основы для отбора и направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для сельскохозяйственной практики.
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье (№ 10-04-97018-а) и грантами Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ России (НШ-1003.2006.4 и НШ-649.2008.4), ГК N02.740.11.0290 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 2013гг.».
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 1-й и 2-й всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биомика - наука века» (Уфа, 2007, 2011), XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2009), II и III Всероссийском c международным участием конгрессе студентов и аспирантов биологов «СИМБИОЗ» (Пермь, 2009;
Нижний Новгород, 2010), V Всероссийской конференции молодых учных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), международной Пущинской школе-конференции молодых учных «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс (Plants under Environmental Stress)» (Москва, 2010), VI Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» и Международной научной школе «Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции» (Нижний Новгород, 2011).
Публикации. Материалы диссертации изложены в 14 публикациях, из них 5 статей в журналах из перечня ВАК, а также депонированы в международных банках данных DDBJ/EMBL/GenBank.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах, содержит 10 рисунков и 3 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 215 работ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования в данной работе служили бактерии, выделенные из клубеньков дикорастущих бобовых растений 9-ти видов рода Lathyrus (чина) и 6-ти видов рода Vicia (горошек), относящихся к трибе Vicieae, собранных в 9 ти районах Республики Башкортостан (РБ) (рис. 1): чины Литвинова (Lathyrus litvinovii Iljin.), чины лесной (L. sylvestris L.), чины гороховидной (L. pisiformis L.), чины болотной (L. palustris L.), чины луговой (L. pratensis L.), чины клубненосной (L. tuberosus L.), чины весенней (L. vernus L.), чины бледноватой (L. pallescens Bieb.), чины Гмелина (L. gmelinii Fritsch), горошка мышиного (Vicia cracca L.), горошка тонколистного (V. tenuifolia Roth), горошка заборного (V. sepium L.), горошка лесного (V. sylvatica L.), горошка гороховидного (V.
pisiformis L.), горошка волосистого (V. hirsuta L.).
Рис. 1. Районы сбора клубеньков растений родов Vicia и Lathyrus на территории Республики Башкортостан.
Схема анализа клубеньковых бактерий. Клубеньки собирали с корней дикорастущих бобовых растений в естественных ареалах их произрастания.
География сбора охватывала районы Республики Башкортостан, характеризующиеся большим разнообразием растительности, обусловленным расположением данных территорий на стыке степной и лесной зон. На равнинных участках преобладают степная, лесостепная и лесная зоны.
Широтная зональность растительности республики усложнена явлениями вертикальной поясности, которые вызваны наличием на ее территории крупной горной системы - Уральских гор.
При генетическом анализе клубеньковых бактерий мы придерживались следующей схемы. Вначале проводили общий анализ генетического разнообразия штаммов методом с использованием нескольких RAPD произвольных праймеров. Данный этап позволял выявить степень гетерогенности штаммов, вступающих в симбиоз с видами бобовых растений, а также объединить штаммы с идентичными RAPD-профилями в гомогенные группы, из которых в дальнейшем в работу брали только по одному образцу, поскольку полное совпадение RAPD-профилей по нескольким произвольным праймерам предполагает идентичность штаммов. Это давало возможность сократить количество образцов для дальнейшего анализа.
На следующем этапе проводили предварительные филогенетические исследования методами ПЦР-ПДРФ анализа генов 16S рРНК и 16S-23S межгенного транскрибируемого спейсера с использованием нескольких мелкощепящих эндонуклеаз рестрикции, а также в некоторых случаях дополнительно методами ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) и BOX (повторяющаяся ДНК последовательность BOXA субъединицы BOX элемента Streptococcus pneumoniae)-PCR анализов на повторы в геномной ДНК.
Данный этап позволил разделить штаммы на филогенетически однородные группы (рис. 2).
Для определения филогенетического положения исследуемых штаммов клубеньковых бактерий были секвенированы нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S рРНК бактерий размером около 1400 п.н. и проведен их сравнительный анализ с уже известными аналогичными последовательностями из базы данных GenBank и RDP (http://rdp.cme.msu.edu/).
Рис. 2. Схема проведения генетического анализа клубеньковых бактерий.
Выделение высокомолекулярной бактериальной ДНК проводили с помощью 1% лизирующего раствора (1%Triton X100, 1% Tween 20, 1% Chelex 100). Выделение плазмидной ДНК, а также электрофорез фрагментов ДНК проводили по лабораторному руководству Sambrook J. с соавт. (1989).
Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1» и секвенаторе GenomeLab фирмы Beckman Coulter, используя наборы для секвенирования «GenomeLab». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc.» (США) и программы «MEGA 5.0» фирмы Sudhir Kumar & MEGA Team Center for Evolutionary Medicine & Informatics Biodesign Institute and School of Life ПЦР проводили с Sciences Arizona State University, Tempe, USA.
использованием стандартных наборов для амплификации ДНК с помощью приборов МС2 «Терцик» компании "ДНК-технология" (Россия). Кластерный анализ проводили при помощи программы GelCompar II 6.5 компании «Applied Maths».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ К дикорастущим видам растений трибы Vicieae (виковые) в умеренных широтах в основном относятся представители двух родов: Vicia L. - Горошек (или Вика) и Lathyrus L. – Чина (Алексеев и др., 1989). В рамках теории групп перекрестной инокуляции (ГПИ), в соответствии с которой виды бобовых разделяют на ряд групп, внутри которых растения могут свободно “обмениваться” микросимбионтами, считается, что растения трибы Vicieae образуют одну из истинных групп перекрстной инокуляции, и данная группа вступает в симбиоз с различными штаммами бактерий вида Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Проворов, 1992).
Анализ гетерогенности изолированных штаммов, исследованных с помощью с применением нескольких «произвольных» RAPD-метода олигонуклеотидных праймеров, показал, что клубеньковые бактерии, выделенные из растений трибы Vicieae отличаются относительно высоким полиморфизмом последовательности ДНК. В наших исследованиях наиболее гетерогенными оказались микросимбионты чины клубненосной, где индекс разнообразия Шеннона составил 0,84 (нормализованный коэффициент Шеннона: Hs = - gi * ln (gi) / lnN, где gi – частота i-го генотипа, а N – объм выборки). Менее разнородными оказались микросимбионты чины болотной и чины Литвинова, где данные индексы были равными 0,39 и 0,36, соответственно (рис. 3).
Филогенетический анализ клубеньковых бактерий бобовых трибы Vicieae. С целью предварительного исследования филогении исследуемых клубеньковых бактерий был проведен ПДРФ-анализ гена 16S рРНК c использованием мелкощепящих рестриктаз Kzo91 и HaeIII. Было выявлено, что, несмотря на высокую гетерогенность штаммов бактерий, образующих клубеньки у одного вида растения, по ПДРФ-профилю гена 16S рРНК они достаточно однородны (табл. 1).
Hs Рис. 3. Оценка генетического разнообразия штаммов, изолированных из клубеньков растений трибы Vicieae.
Таблица Результаты анализа штаммов бактерий, изолированных из клубеньков дикорастущих бобовых трибы Vicieae Вид Количество Количество Индекс Кол-во Предполагаемый вид растения- выделенных гомогенных разно- групп бактерий и их %-ное хозяина штаммов (N) по RAPD образия штаммов, отношение к общему групп Шеннона гомоген- кол-ву выявленных у штаммов ных по данного вида растения (Hs) штаммов 16S (gi) ПДРФ V. tenuifolia 24 16 0,62 1 R. leguminosarum 100 % V. sepium 50 21 0,73 1 R. leguminosarum 100 % V. sylvatica 60 42 0,78 2 R. leguminosarum 100 % V. pisiformis 30 23 0,53 2 R. leguminosarum 100 % V. cracca 57 27 0,65 1 R. leguminosarum 100 % V. hirsuta 25 14 0,55 1 R. leguminosarum 100 % L. litvinovii 63 20 0,36 1 R. leguminosarum 100 % L. palustris 42 13 0,39 3 R. leguminosarum 79% 1 Agrobacterium sp. 21% L. pallescens 77 40 0,51 3 R. leguminosarum 100 % L. pisiformis 51 42 0,80 4 R. leguminosarum 100 % L. vernus 159 120 0,72 1 R. tropici 70% 4 R. leguminosarum 30% L. sylvestris 78 59 0,70 1 R. tropici 67% 1 R. leguminosarum 33% L. tuberosus 49 40 0,84 2 R. leguminosarum 100 % L. pratensis 19 11 0,63 3 R. leguminosarum 100 % L. gmelinii 5 - - 2 Phyllobacterium sp. 100 % Определение филогенетического положения исследуемых штаммов клубеньковых бактерий по сравнительному анализу их секвенированных фрагментов генов 16S рРНК размером примерно 1400 п.н. с уже известными аналогичными последовательностями из базы данных GenBank и RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) показало, что последовательности гена 16S рРНК у большинства исследованных микроорганизмов имеют высокое сходство с последовательностями аналогичных генов R. leguminosarum (99,5% гомологии). Но наряду с этим у некоторых растений обнаружены микросимбионты, близкие по последовательности генов 16S рРНК к другим видам бактерий. У чины весенней и чины лесной в клубеньках были обнаружены ризобии, близкие (99,7% гомологии) к R. tropici, у чины болотной – бактерии, близкие (98,2% гомологии) к Agrobacterium albertimagni, а у чины Гмелина – к Phyllobacterium myrsinacearum (99,9% гомологии).
В эволюционном плане триба считается наиболее Vicieae специализированной в семействе Fabaceae, и это эволюционное продвижение в свою очередь сопровождалось увеличением специфичности и активности азотфиксирующего симбиоза (Парийская и др., 1979). Именно данное обстоятельство объясняет то, что «истинные» ГПИ состоят из эволюционно продвинутых бобовых умеренных широт. Как было сказано выше, большинство видов трибы Vicieae принято объединять в одну ГПИ, члены которой вступают в симбиоз с различными штаммами R. leguminosarum bv. viciae (Проворов и др., 1992). Результаты, полученные нами, в целом подтверждают данную теорию.
Показано, что все представители трибы Vicieae (кроме чины Гмелина, у которой мы обнаружили в клубеньках только бактерии, близкие к Phyllobacterium myrsinacearum), произрастающие на территории РБ, вступают в симбиоз со штаммами клубеньковых бактерий, которые филогенетически родственны с R. leguminosarum (99,5% сходства по последовательности гена 16S рРНК). Хотя данные штаммы клубеньковых бактерий отличаются высоким уровнем полиморфизма ДНК. Тем не менее, выявление нами и другими авторами (Mantelin, 2006;
Sui, 2009) среди микросимбионтов некоторых исследованных видов чин отличных от R. leguminosarum клубеньковых бактерий показывает, что данные границы ГПИ не столь строги, и растения в некоторых исключительных случаях могут вступать в симбиоз с нехарактерными для них клубеньковыми бактериями.
Исследование плазмидного состава клубеньковых бактерий.
Несомненно, обращает на себя внимание высокий уровень полиморфизма ДНК штаммов, вступающих в симбиоз с растениями трибы Vicieae. Подобная высокая гетерогенность исследуемых штаммов при их относительно высокой филогенетической однородности дает возможность предположить, что штаммы имеют различия в мобильной части их генома.
Для проверки данного предположения были исследованы плазмидные профили клубеньковых бактерий. Обнаружено, что все полиморфные по ДНК штаммы микросимбионтов внутри филогенетически однородных групп действительно имеют различный состав плазмид. Разброс плазмид по количеству среди штаммов варьировал от 2 до 13 и по размеру от 150 Kb до Mb (рис. 4.).
Рис. 4. Пульс-электрофореграмма плазмидных профилей штаммов ризобий, вступающих в симбиоз с чиной весенней, относящихся к одной филогенетически однородной группе.
Цифрами обозначены номера штаммов.
Значительные различия плазмидного состава штаммов филогенетически однородных бактерий указывают на довольно высокую трансмиссивность их плазмид и свидетельствуют о высокой частоте генетической рекомбинации между ризосферными бактериями, приводящей к появлению большого количества высокополиморфных по ДНК штаммов.
Кластерный анализ RAPD-профилей ДНК клубеньковых бактерий. С целью выявления закономерности распределения штаммов филогенетически однородных бактерий в клубеньках растений одной популяции и сравнения их с бактериями, вступающими в симбиоз с этим же видом растений другой популяции, был проведен кластерный анализ ДНК RAPD-профилей микроорганизмов. В качестве объекта были выбраны микросимбионты чины весенней (Lathyrus vernus), так как данное растение широко распространено, что делает возможным сбор клубеньков с географически разобщенных популяций растений. Клубеньки были собраны в двух районах РБ:
Татышлинском и Белорецком.
В Татышлинском районе клубеньки были собраны у 15 растений, относящихся к одной популяции, отстоящих друг от друга на расстоянии 10 м по схеме, представленной на рис. 5, из которых в дальнейшем были выделены чистые культуры клубеньковых бактерий. От каждого растения было собрано от 5 до 15 клубеньков. Результаты RAPD-профилей ДНК полученных штаммов были подвергнуты кластерному анализу. Так же в анализ были взяты RAPD профили штаммов, полученных из клубеньков растений, произрастающих в Белорецком районе и RAPD-профили штаммов, полученных из клубеньков чины лесной, произрастающей совместно с чиной весенней в Татышлинском районе. Все взятые в анализ штаммы по последовательности 16S рРНК являлись филогенетически однородными и родственными R. leguminosarum (99,5% сходства).
Рис. 5. Схема расположения растений чины весенней и чины лесной, из клубеньков которых были выделены ризобии для кластерного анализа их RAPD-профилей. В кружках отмечены номера растений. А – растения, ризобии которых образуют кластер А в кластерном анализе, Б - растения, ризобии которых образуют кластер Б в кластерном анализе.
Из результатов кластерного анализа (рис. 6) видно, что штаммы, взаимодействующие с одним растением, на схеме образуют преимущественно отдельные кластеры.
Рис. 6. Кластерный анализ RAPD-профилей штаммов, выделенных из чины весенней и чины лесной в Татышлинском (А и Б) и Белорецком районе (В).
Одинаковым цветом указаны штаммы, полученные из клубеньков одного растения.
Также на сходство RAPD-профилей имеет значительное влияние близость мест произрастаний растений, с клубеньков которых были получены штаммы.
Так, у штаммов, выделенных из растений, произрастающих на более близком расстоянии, RAPD-профили сходны по сравнению со штаммами, выделенными у растений, произрастающих в большем отдалении друг от друга. Также на дендрограмме можно наблюдать, что все штаммы, полученные из клубеньков растений, произрастающих в Татышлинском районе, образуют два больших отдельных кластера, обозначенные как А и Б.
Исходя из этого видно, что в клубеньках, а, скорее всего, и в ризосфере многолетних растений чины весенней наблюдается преобладание в основном однородных штаммов, тем не менее, очевидна тенденция к их гетерогенизации, проявляющаяся в появлении отдельных отличающихся полос в RAPD профилях микросимбионтов одного растения. При сравнении симбионтов растений уже из соседних точек сбора наблюдаются более существенные изменения, которые имеют тенденцию к увеличению различий между ними, с увеличением расстояния между растениями. Исходя из этого можно предположить, что между штаммами происходит постоянный рекомбинативный процесс, скорее всего, из-за высокой трансмиссивности плазмид, что и приводит к появлению отличающихся фрагментов ДНК в RAPD-профилях. Увеличение расстояния между растениями и, соответственно, между ризосферными бактериями, приводит к уменьшению контактов между ними, что, в конечном счете, приводит к пространственной изоляции, приводящей к накоплению различий между штаммами. Это также подтверждается и тем, что RAPD-профили штаммов, полученные из клубеньков растений, произрастающих в Белорецком районе, образуют отдельный кластер - В.
Однако нельзя объяснить пространственным разобщением распределение RAPD-профилей клубеньковых бактерий, полученных из клубеньков чины весенней в Татышлинском районе в два отдельных кластера - А и Б. В данном случае, скорее всего, мы имеем дело с биологическим барьером рекомбинативных процессов между этими штаммами, что также приводит к накоплению генетических различий. Ограничение горизонтального переноса генов между бактериями, образующими кластер А, и бактериями, образующими кластер Б, говорит о более глубоких отличиях данных бактерий, не отраженных в последовательности 16S рибосомных генов.
Схожесть же RAPD-профилей клубеньковых бактерий из клубеньков чины лесной с RAPD-профилями клубеньковых бактерий из клубеньков чины весенней при совместном произрастании растений-хозяев, скорее всего, вызвана незначительностью влияния их видовой принадлежности на различия в составе их микросимбионтов, если эти виды относятся к одной группе перекрестной инокуляции.
Филогенетический анализ симбиотических генов клубеньковых бактерий. При исследовании клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими растениями рода Чина (Lathyrus), нами были обнаружены у некоторых видов растений в клубеньках помимо R. leguminosarum и другие виды ризобий, которые не являются типичными симбионтами для растений трибы Vicieae, хотя подобные случаи не уникальны. Ранее при исследовании клубеньковых бактерий растений рода Чина произрастающих на территории Китая и Монголии, Sui X. H. с соавторами обнаружили R. tropici в клубеньках L. davidii. Кроме того, у L. quinquenervius и L. odoratus в клубеньках были обнаружены также клубеньковые бактерии рода Sinorhizobium (Sui et all, 2009).
Все эти данные говорят о том, что растения рода Lathyrus в зависимости от почвенно-климатических условий в некоторых исключительных случаях могут нодулироваться отличными от R. leguminosarum bv. viciae ризобиями, что выходит за рамки существующей теории ГПИ. Одним из объяснений причин данного явления может быть горизонтальный перенос симбиотических генов, вследствие которого бактерии могли изменить свою специфичность по отношению к растению-хозяину. Такая возможность показана в работах многих авторов (Sullivan et al., 1995;
Andam et al., 2007a,b;
Barcellos et al., 2007;
Zhao et al., 2008).
С целью выявления возможного влияния процесса горизонтального переноса sym-генов на изменение специфичности микросимбионтов растений рода Lathyrus, относящихся по последовательностям генов 16S рРНК к R. tropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., была исследована филогения их симбиотических генов.
В качестве кандидатов для филогенетических исследований были выбраны активно участвующие в образовании азотфиксирующего симбиоза и общие для всех клубеньковых бактерий симбиотические гены: nifH, nifD и nodA.
С помощью сравнительного анализа уже известных нуклеотидных последовательностей генов nifH и nifD клубеньковых бактерий были выявлены консервативные участки данных генов, к которым в дальнейшем были подобраны олигонуклеотидные праймеры. В случае с геном nodA подобрать универсальные праймеры не представлялось возможным ввиду высокой вариабельности данного гена у клубеньковых бактерий. В связи с этим были подобраны несколько пар видоспецифичных праймеров к последовательности гена nodA R. leguminosarum bv. viciae (ViciaNodA F и ViciaNodA R), (TrifoNodA F и TrifoNodA R), R.leguminosarum bv. trifolii R. tropici (RtropNodA F и RtropNodA R), и Mesorhizobium spp. (MesoNodA F MesoNodA R), Sinorhizobium spp. (SinoNodA F и SinoNodA R), Bradyrhizobium (BraNodA F и BraNodA R). У исследуемых штаммов были spp.
амплифицированы и секвенированы фрагменты генов nifH.
Сравнительный анализ показал высокий уровень гомологии между секвенированными последовательностями всех исследуемых штаммов.
Фрагменты генов микроорганизмов независимо от видовой nifH принадлежности отличались лишь некоторыми единичными несовпадениями в нуклеотидных последовательностях. Поиск сходных последовательностей в базе данных генов показал, что секвенированные фрагменты генов nifH всех исследуемых штаммов клубеньковых бактерий имеют высокий уровень гомологии с аналогичными последовательностями бактерий вида R. leguminosarum bv. viciae, что показывает их филогенетическую близость (рис. 7).
Рис. 7. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основе сравнительного анализа последовательностей генов nifH.
У штаммов R. tropici и R. leguminosarum, нодулирующих растения L. vernus, были амплифицированы и секвенированы также фрагменты генов nifD. Сравнительный анализ секвенированных фрагментов с аналогичными последовательностями других клубеньковых бактерий, депонированными в GenBank, также показал их высокий уровень гомологии с генами nifD R. leguminosarum bv. viciae (рис. 8).
Рис. 8. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основе сравнительного анализа последовательностей генов nifD.
Для исследования гена nodA выбранных штаммов был проведен ПЦР анализ ДНК образцов с использованием подобранных ранее видоспецифичных праймеров. Данный анализ показал, что у всех образцов ПЦР-продукт нужного размера нарабатывается только при использовании праймеров, подобранных к гену nodA R. leguminosarum bv. viciae (рис. 9).
Для проверки и уточнения полученных результатов ПЦР-продукты размером 188 пн также были секвенированы. Сравнительный анализ с уже известными нуклеотидными последовательностями аналогичных генов из базы данных GenBank также показал, что секвенированные фрагменты ДНК действительно имеют 100% гомологию с геном nodA R. leguminosarum bv.
viciae.
Рис. 9. Электрофореграмма ПЦР-анализа ДНК штаммов клубеньковых бактерий с использованием праймеров, подобранных к гену nodA:
А – R. leguminosarum bv. viciae, Б – R. leguminosarum bv. trifolii, В- Mesorhizobium spp, Г- R. tropici. 1-4 – R. tropici из клубеньков L. vernus;
5, 6 – R. leguminosarum из клубеньков L. vernus;
7, 8 - Agrobacterium sp. из клубеньков L. palustris;
9 Phyllobacterium sp. из клубеньков L. gmelinii;
10- R. leguminosarum bv. viciae штамм 1078. М – 100 п.н. маркер.
Для быстрорастущих клубеньковых бактерий Rhizobium и Sinorhizobium характерна плазмидная локализация симбиотических генов (Freiberg et al., 1997;
Barnett et al., 2001;
Galibert et al., 2001;
Gonzalez et al., 2006). Для некоторых pSym плазмид документально подтверждена возможность передачи их в другие клетки ризобий посредством коньюгации (Freiberg et al., 1997;
Barnett et al., 2001;
Gonzalez et al., 2003;
Brom et al., 2004;
Perez-Mendoza et al., 2004).
Многочисленные работы показывают, что горизонтальный перенос sym-генов является неотъемлемой частью в эволюции симбиотических взаимоотношений ризобий и бобовых растений (Freiberg et al., 1997;
Bailly et al., 2007;
Estrella et al., 2009;
Marchetti et al., 2009). Полученные нами результаты, показывающие филогенетическую близость симбиотических генов исследуемых клубеньковых бактерий с аналогичными генами R. leguminosarum bv. viciae, скорее всего, также свидетельствуют об имевшем место горизонтальном переносе симбиотических генов R. leguminosarum bv. viciae в штаммы R. tropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp.
*** Таким образом, было изолировано и генетически охарактеризовано штаммов клубеньковых бактерий из клубеньков 15 видов дикорастущих бобовых трибы Vicieae, произрастающих на территории РБ. Были получены сведения об их генетическом разнообразии и филогенетической принадлежности. Показано, что основная часть исследованных бактерий филогенетически близка к бактериям вида R. leguminosarum bv. viciae, что подтверждает образование растениями данной трибы одной группы перекрстной инокуляции.
Но, тем не менее, у некоторых растений рода Lathyrus были обнаружены в клубеньках бактерии R. tropici, Agrobacterium sp. и Phyllobacterium sp., считавшиеся для них нехарактерными. Предполагается, что данные микроорганизмы получили способность образовывать клубеньки на корнях растений рода Lathyrus вследствие получения ими симбиотических генов бактерий R. leguminosarum bv. viciae путем горизонтального их переноса.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что исследованные штаммы клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых трибы Vicieae характеризуются высоким уровнем полиморфности ДНК.
2. На основании сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК показано, что большинство штаммов клубеньковых бактерий филогенетически относятся к одному виду Rhizobium leguminosarum.
3. Выявлено, что высокая генетическая гетерогенность штаммов при их филогенетической однородности вызвана различиями в составе их плазмид.
4. В клубеньках некоторых представителей растений рода Lathyrus обнаружены не типичные для них виды клубеньковых бактерий: у чин L.
vernus и L. sylvestris – бактерии Rhizobium tropici, у L. palustris Agrobacterium sp., у L. gmelinii - Phyllobacterium sp.
5. Обнаруженные нетипичные для растений рода виды Lathyrus клубеньковых бактерий имеют в составе своего генома симбиотические гены, филогенетически близкие к аналогичным генам бактерий R.
что, возможно, является следствием leguminosarum bv. viciae, горизонтального переноса генов, повлиявшим на изменение специфичности данных микросимбионтов
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Микросимбионты 1.
декоративных бобовых растений, применяемых в ландшафтном озеленении // Аграрная Россия. 2009. Специальный выпуск (февраль). С. 97.
Баймиев Ан. Х., Птицын К. Г., Благова Д. К., Мулдашев А. А., Баймиев Ал.
2.
Х. Генетическое разнообразие и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с чиной весенней Lathyrus vernus (L.) Bernh // Микробиология. 2011. Т. 80, № 1. С. 100-104.
Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Мулдашев А.А., Баймиев Ал.Х. Генетическая 3.
характеристика клубеньковых бактерий бобовых рода Lathyrus, произрастающих на территории республики Башкортостан // Экологическая генетика. 2011. Т. 9, № 2. С. 3-8.
Баймиев Ан. Х., Иванова Е.С., Птицын К. Г., Чубукова О.В., 4.
Баймиев Ал. Х. Филогенетический анализ симбиотических генов клубеньковых бактерий растений рода Lathyrus (L.) (FABACEAE) // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. № 4. С. 14-17.
Баймиев Ан. Х., Иванова Е.С., Птицын К. Г., Белимов А.А., Баймиев Ал. Х.
5.
Генетическая характеристика клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых южного Урала // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012. № 1. С. 29-34.
ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ И СТАТЬИ В СБОРНИКАХ КОНФЕРЕНЦИЙ Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х. Определение филогении ризобиальных 6.
бактерий, вступающих в симбиоз с горошком заборным (Vicia sepium) // Школа-семинар молодых ученых УфНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии «Биомика – наука XXI века». Уфа. 2007.
С. 109-110.
Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х. Генетическое разнообразие клубеньковых 7.
бактерий, вступающих в симбиоз с чиной лесной (Lathyrus sylvestris L.) // II Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009». Пермь. 2009. С. 241-242.
Птицын К.Г. Генетическая гетерогенность клубеньковых бактерий 8.
вступающих в симбиоз с чиной весенней Lathyrus vernus (L.) Bernh // Международный Молодежный Научный Форум «Ломоносов-2009» XVI Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ». Москва. 2009. С. 18.
Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал. Х. Генетическая гетерогенность 9.
и филогения клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими растениями рода чина (Lathyrus), произрастающими на территории республики Башкортостан // V Всероссийская конференция молодых учных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов. 2010. С. 29.
10. Птицын К.Г., Баймиев А.Х. Генетическое биоразнообразие клубеньковых бактерий вступающих в симбиоз с чиной гмелина (Lathyrus gmelini Fritschi) // III всероссийский c международным участием конгресс Студентов и аспирантов-биологов «СимбиозРоссия 2010». 2010. С. 68-69.
11. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Генетическая гетерогенность клубеньковых бактерий вступающих в симбиоз с чиной бледноватой (Lathyrus pallescens (Bieb.) Koch) // 14 международная пущинская школа конференция молодых учных «Биология – наука XXI века». Пущино.
2010. Т. 2. С. 255.
12. Баймиев Ан.Х., Птицын К.Г., Благова Д.К., Баймиев Ал.Х. Изменение видового состава клубеньковых бактерий чины весенней Lathyrus vernus (L.) Bernh и чины лесной Lathyrus sylvestris L. в зависимости от почвенно климатических условий // Общество физиологов растений России Всероссийский симпозиум «Растение и стресс (Plants under Environmental Stress)». Москва. 2010. С. 44-45.
13. Птицын К.Г., Баймиев Ан.Х., Баймиев Ал.Х. Генетическое разнообразие клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых южного Урала // Школа семинар молодых ученых Волго-Уральского региона по физико химической биологии «Биомика – наука XXI века». Уфа. 2011.
Биомика/Biomics/ Т. 1. С. 103-105.
Список сокращений ПДРФ – полиморфизм длин рестрикционных фрагментов RAPD - random amplification of polymorphic DNA ГПИ – группа перекрстной инокуляции ГПГ – горизонтальный перенос генов Подписано в печать 17.01.12 г. Формат 60х84 1/16.
Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 598.
Гарнитура «TimesNewRoman». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО.
Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-