Исследование сигнальных функций пероксида водорода в процессе фагоцитоза

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

на правах рукописи

Марквичёва Ксения Николаевна ИССЛЕДОВАНИЕ СИГНАЛЬНЫХ ФУНКЦИЙ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В ПРОЦЕССЕ ФАГОЦИТОЗА специальность – 03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2010 Рабо выполн ота нена в лабо оратории м молекулярн ных технол логий Инст титута биоо органическ кой хими им. акад ии демиков М. Шемяк.М. кина и Ю.А Овчинникова РАН А.

Науч чный руко оводитель:

кандидат б биологичес ских наук В Всеволод Вадимович Белоусов В Б Офи ициальные оппонент е ты:

Юрий Бор рисович Ле ебедев, док ктор биологических наук, заве едующий лаборатори л ией сравнитель ьной и фун нкциональн геномики Инсти ной итута биоор рганическо химии и ой им.

академиков М.М. Шеемякина и Ю А. Овчи Ю. инникова РАН Р Александр Вячеслав р вович Ворротников, кандидат биологич ческих нау ук, ведущ щий научный сотрудник кафедры биологич ческой и медицинск кой химии факульт и, тет фундамент тальной ме едицины, М Московский государственный у й университет имени М т М.В.

Ломоносов ва Веду ущая орган низация:

Институт физико-химической биологи й ии им. А.Н. Бело А озерского, Московск кий государств венный уни иверситет и имени М.В. Ломоносо ова Защи состои ита ится «24» ноября 20 10 г. в 100:00 на зас седании дииссертацио онного сове ета Д. 02.019.01 п Инстит при туте биоорг ганической химии им академи й м. иков М.М. Шемякина и а Ю.А Овчинни А. икова РАН по адресу : 117871, ГСП-7, Мо Г осква В-437 ул. Микл 7, лухо-Макл лая, д.16/ /10.

С ди иссертацией можно оз й знакомитьс в библио ся отеке Института биоо органическ химии и кой им.

академиков М.М. Шемяки и Ю.А Овчинник ина А. кова РАН Авто ореферат ра азослан «22» октября 2010 г.

я Учён ный секрет тарь диссе ертационн ого совета а, докт физико тор о-математи ических на аук В. А. Олейников О в

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Основными источниками активных форм кислорода (АФК) в клетках являются митохондрии и мембранные ферменты NADPH оксидазы (NOX).

Продукция ферментами NOX супероксид-анион радикала (O2.-) и пероксида водорода (H2O2) была впервые открыта в фагоцитирующих нейтрофилах. Это явление получило название «окислительного взрыва» и долгое время связывалось только с токсичностью АФК для бактериальных или иных чужеродныз клеток, захваченных в фагосому. Однако впоследствии стали cтремительно накапливаться данные об экспрессии ферментов семейства NOX практически во всех тканях и клетках многоклеточных. Стало понятно, что в нефагоцитирующих клетках H2O2, производимый ферментами NOX, задействован во внутриклеточной передаче сигнала. Пероксид водорода окисляет цистеины в активном центре тирозин-фосфатаз и других белков, модулируя таким образом их активность и, следовательно, активность связанных с ними сигнальных каскадов. Сигнальная функция АФК стала объектом интенсивных исследований относительно недавно, так что актуальными задачами на сегодня являются непосредственное изучения сигнальных процессов с участием АФК и разработка новых методов исследования клеточных АФК in vivo.

Важно отметить что как повышенная, так и пониженная продукция клетками эндогенных АФК связана с нейродегенеративными и сосудистыми заболеваниями, патологиями иммунной системы. Таким образом, понимание функций эндогенного H2O2 в разных типах клеток важно не только для фундаментальных исследований процессов внутриклеточной передачи сигнала или фагоцитоза, но и для биомедицинских и фармакологических исследований.

Лучшими инструментами для изучения сигнальной функции АФК в индивидуальных живых клетках являются генетически кодируемые биосенсоры на основе гомологов зеленого флуоресцентного белка GFP. Биосенсор HyPer, созданный ранее в нашей лаборатории, позволяет с высокой специфичностью детектировать субмикромолярные концентрации H2O2 в клетке. Ввиду растущей значимости исследования сигнальных каскадов с участием H2O2 усовершенствование биосенсора HyPer представляется актуальной задачей.

Цели и задачи работы. Целью работы было изучение сигнальной роли фагоцитарной NADPH оксидазы в процессе фагоцитоза, а также усовершенствование основного молекулярного инструмента для визуализации внутриклеточного H2O2, биосенсора HyPer.

Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:

1) Разработка метода визуализации с помощью HyPer эндогенного H2O2, вырабатываемого клетками при различных физиологических стимуляциях.

2) Изучение динамики продукции H2O2 фагоцитирущими макрофагами.

3) Выявление взаимосвязи активации фагоцитарной NOX с активацией основных MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) каскадов.

4) Оптимизация биосенсора HyPer с целью увеличения диапазона флуоресцентного ответа.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы впервые получены серии изображений, отражающих продукцию пероксида водорода в индивидуальной живой клетке после физиологической стимуляции ростовыми факторами и в процессе фагоцитоза. Анализ полученных изображений позволяет лучше понять сигнальную роль АФК. Апробированы и оптимизированы методики прижизненной конфокальной и флуоресцентной микроскопии фагоцитирующих клеток. Оптимизированные в ходе данной работы методики могут применяться для фундаментальных исследований клеточной биологии и биомедицинских исследований. Изучена взаимосвязь активации NADPH оксидазы и основных MAPK каскадов в процессе фагоцитоза, что особенно важно в контексте растущей значимости MAP-киназ как мишеней лекарственных препаратов. Разработаны новые версии HyPer с увеличенным диапазоном флуоресцентного ответа, HyPer2 и HyPer-H36Y. Усовершенствованные биосенсоры позволяют осуществить более подробное исследование эндогенного H2O2 в индивидуальных живых клетках.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 104 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 184 ссылки. Диссертация содержит 25 рисунков и 1 таблицу.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены на VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, Россия, 2006), XIX Международной Конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2007), Международной Конференции в честь 75-летия со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, Россия, 2009), конференции по химической биологии EMBL (EMBL, Гейдельберг, Германия), V Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и переспективы развития» (Москва, Россия, 2009), а также на 49-ой ежегодной конференции The American Society For Cell Biology (Сан-Диего, США, 2009).

Публикации. По материалам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах.

Содержание работы I. Изучение продукции H2O2 в индивидуальной клетке Открытое в 1933 году явление интенсивного потребления кислорода фагоцитирующими клетками млекопитающих получило название окислительного или дыхательного взрыва.

Именно наличием окислительного взрыва у фагоцитов долгое время объяснялась способность макрофагов и нейтрофилов инактивировать захваченных в фагосому бактерий и эукариотические клетки. Считалось, что разрушение чужеродных клеток в фагосомах происходит путём окисления их АФК, производимыми NADPH оксидазами.

Сегодня показано, что в разрушении патогенных клеток в фагосомах главную роль играет электрогенная активность NOX, а не продукция АФК. Закачивая электроны в просвет фагосомы, NOX создает градиент отрицательного заряда, который компенсируется протонами и ионами K+. Активный транспорт в просвет фагосомы ионов K+ приводит сначала к тому, что изначально закисленная среда фаголизосомы нейтрализуется, а затем и защелачивается. В фаголизосоме создается оптимальная среда для активации протеиназ, которые разрушают поглощенные фагоцитом клетки.

Радикальное изменение взглядов на способы, которыми фагоцит инактивирует чужеродные клетки, в совокупности со сведениями о сигнальной функции H2O2 в нефагоцитирующих клетках, сделало особенно интересными исследования сигнальной роли H2O2 в процессе фагоцитоза. До настоящего времени исследования сигнального аспекта окислительного взрыва в фагоцитозе проводились методами, подразумевающими оценку продукции H2O2 популяцией фагоцитов, а детекция продукции АФК осуществлялась с применением необратимо взаимодействующих с АФК красителей.

Однако детекция продукции АФК фагоцитами в кювете или в культуральной чашке не позволяют изучить динамику продукции H2O2 в отдельно взятой фагоцитирующей клетке in vivo. В данной работе впервые изучена динамика продукции H2O2 в индивидуальных живых фагоцитирующих и нефагоцитирующих клетках. Полученные для фагоцитов данные сопоставлены с данными об активации двух основных MAP-киназных сигнальных каскадов, Erk1/2 и p38, при фагоцитозе.

Основным инструментом для изучения эндогенного H2O2 в рамках данного исследования является биосенсор HyPer. HyPer представляет собой химерный флуоресцентный белок, состоящий из чувствительного к H2O2 и флуоресцентного доменов. Входящий в состав HyPer регуляторный домен транскрипционного фактора E.coli OxyR (OxyR-RD) содержит в активном центре два цистеиновых остатка, образующих под действием H2O дисульфидную связь, приводящую к изменению конформации всего домена. OxyR-RD в составе HyPer обладает высокой селективностью к H2O2, в отсутствии H2O2 дисульфидная связь быстро восстанавливается тиол-восстанавливающими системами клетки, происходит реактивация HyPer. Флуоресцентный домен HyPer представляет собой вариант жёлтого флуоресцентного белка cpYFP с двумя пиками поглощения (420 и нм) и эмиссией при 510 нм. cpYFP интегрирован в OxyR-RD с помощью 2-х коротких полипептидных линкеров. Изменение конформации OxyR-RD под действием H2O приводит к изменению соотношения двух пиков поглощения cpYFP: интенсивность поглощения хромофора cpYFP при 500 нм (F500) растёт пропорционально уменьшению поглощения при 420 нм (F420). Сигнал HyPer можно детектировать не только как изменение интенсивности поглощения в одном из двух пиков cpYFP, но и как отношение двух величин (F500/F420), и в этом случае он не зависит от уровня экспрессии сенсора в клетке.

Визуализация низких концентраций эндогенного H2O2 в клетках HeLa, стимулированных эпидермальным фактором роста Ранее HyPer применялся для детекции продукции H2O2 клетками PC-12 при стимуляции их фактором роста нервов (NGF). Чтобы проверить, вызывают ли другие ростовые факторы продукцию H2O2, и отработать условия микроскопии, была показана продукция H2O2 клетками HeLa, простимулированными эпидермальным фактором роста (EGF).

Мы установили, что при стимуляции EGF клеток HeLa, экспрессирующих HyPer, происходит легко детектируемый всплеск эндогенной продукции H2O2 (рис.1). Для малоподвижных клеток HeLa детекция поглощения только в области 480 нм оказалась вполне достаточной для визуализации низких концентраций эндогенного H2O2.

Концентрация эндогенного H2O2 в цитоплазме стимулированных EGF клеток HeLa через 40-60 минут после стимуляции составила приблизительно от 25 до 100 нМ в зависимости от клетки.

(а) (б) Рис.1. Продукция H2O2 в HeLa при стимуляции фактором роста эпидермиса (EGF).

(а) Конфокальная микроскопия клеток HeLa, экспрессирующих HyPer-Cyto, псевдоцвета соответствуют разным интенсивностям зеленой флуоресценции: чёрный – нет флуоресценции, красный – максимальная интенсивность флуоресценции. (б) Графики продукции H2O2 6-ю индивидуальными клетками HeLa, показанными на панели (а) после стимуляции, EGF добавлен к клеткам в 0-ой момент времени. Кривые представляют собой зависимость интенсивности флуоресценции HyPer (возбуждение 488 нм, эмиссия 520 нм) от времени. Масштабная линейка 40 мкм.

Графики продукции H2O2 значительно отличались между соседними клетками. Обращает на себя внимание выраженная двухфазность процесса генерации H2O2. Примечательно, что по литературным данным подобная двухфазность с похожими временными характеристиками прослеживается при активации MAPK каскадов в клетках HeLa простимулированных EGF, что косвенно подтверждает связь эндогенного H2O2 с модуляцией активности MAPK в данном процессе. Таким образом, была продемонстрирована возможность детекции эндогенного H2O2 с помощью HyPer, а также наличие гетерогенности ответа на физиологическую стимуляцию в одной популяции клеток. Следующим этапом работы было изучение с помощью HyPer окислительного взрыва в фагоцитах.

Изучение динамики продукции H2O2 макрофагами RAW264.7, фагоцирующими гранулы опсонизированного сывороткой зимозана Из результатов проведенных другими группами исследований продукции H2O макрофагами RAW264.7 в процессе фагоцитоза опсонизированного полисахарида клеточной стенки дрожжей зимозана (Opz) следует, что концентрация H2O2 начинает расти через несколько минут после добавления к клеткам Opz, достигает максимума через приблизительно 40 минут и постепенно снижается. Снижение концентрации до исходной не наблюдается в течение нескольких часов. Подобные исследования ранее проводились только для популяций макрофагов RAW264.7 и некоторых других фагоцитов.

Используя высокоселективный к H2O2 флуоресцентный краситель Amplex UltraRed, мы также получили схожую кривую, отражающую продукцию H2O2 популяцией фагоцитирующих RAW264.7 (рис. 2). Таким образом, наша экспериментальная система представляет собой «классическую» модель для исследования динамики окислительного взрыва при фагоцитозе.

Рис.2. Продукции H2O2 популяцией макрофагов RAW264.7 фагоцитирующих Opz. Зимозан добавлен в 0-ой момент времени в культуральную чашку с 1 х 106 клеток RAW264.7.

Для визуализации окислительного взрыва в индивидуальных макрофагах мы использовали клетки RAW264.7, транзиентно экспрессирующие HyPer-Cyto. Для получения серий изображений отдельных фагоцитирующих макрофагов применяли конфокальную флуоресцентную микроскопию. Поскольку макрофаги обладают высокой подвижностью, в качестве сигнала HyPer мы рассматривали отношение интенсивностей поглощения при 420 и 500 нм (F500/F420). Сигнал, представляющий собой отношение двух величин (рациометрический), отражает только концентрацию H2O2, и не зависит от изменения плотности цитоплазмы, движения клеток и уровня экспрессии биосенсора.

На примере отдельных клеток RAW264.7 было установлено, что концентрация H2O внутри клетки начинает расти немедленно после захвата гранулы Opz, достигает максимума через 2 минуты, и возвращается на исходный уровень через 10-15 минут (рис. б, г). При частоте съёмки 1 раз в 10 секунд сигнал HyPer-Сyto был делокализован в цитоплазме, специфической локализации окисленного HyPer-Cyto вокруг фагосом не наблюдалось (рис.3 а, б).

В некоторых клетках происходит более одного кратковременного повышения уровня продукции внутриклеточного H2O2, причём «всплески» продукции H2O2 следовали немедленно за захватом одной или нескольких гранул (рис.3 а, в).

Полученные нами графики продукции H2O2 в индивидуальных фагоцитрующих макрофагах радикально отличаются от аналогичных графиков для популяций клеток.

(а) (б) (в) (г) Рис.3. Окислительный взрыв в индивидуальных макрофагах RAW264.7, фагоцитирующих гранулы опсонизированного зимозана (Opz). Все клетки экспрессируют HyPer-Cyto. Серия конфокальных рациометрических изображений макрофага RAW264.7, в цитоплазме которого происходит два кратковременных всплеска продукции H2O (а), показанных на графике (в). Серия конфокальных рациометрических изображений двух фагоцитирующих макрофагов (б), и графики продукции H2O2 нижней клеткой (красная линия) и верхней клеткой (чёрная линия) (г). Моменты захвата гранул Opz в отмечены стрелочками, шкала цветов отражает отношение F500/F420 (чёрный – 0;

белый – 4). Масштабная линейка 10 мкм.

При такой постановке эксперимента, когда в культуральную чашку с фагоцитами добавляют гранулы Opz, захват отдельными клетками гранул происходит в разное время.

Кроме того, в некоторых клетках происходит несколько повышений концентрации H2O2, что на графике содержания АФК в среде с фагоцитирующими клетками отражается замедлением падения концентрации АФК. Таким образом, разницу между результатами, полученными с помощью HyPer, и графиками продукции АФК популяцией макрофагов RAW264.7 можно объяснить асинхронностью и гетерогенностью профилей продукции H2O2 индивидуальных фагоцитов.

Изучение распределения H2O2, производимого в процессе фагоцитоза, между ядром и цитоплазмой фагоцита.

Надо отметить, что HyPer–Cyto при экспрессии в клетках распределяется равномерно между ядром и цитоплазмой. Ферментов ядерной локализации, продуцирующих АФК, на сегодня не выявлено, так что присутствие в ядре клеток RAW 264.7 окисленного HyPer может объясняться только диффузией из цитоплазмы H2O2, или окисленного HyPer.

Кроме того, ядро клетки в нормальном состоянии отличается по своему окислительно восстановительному потенциалу от цитоплазмы, так что изучение различий в концентрации H2O2 в ядре и цитоплазме во время окислительного взрыва представляется интересной задачей.

Для решения этой задачи были сконструированы HyPer-NLS (HyPer- Nuclear Localization Signal) ядерной локализации и локализующийся в цитоплазме HyPer-NLS (HyPer- Nuclear Export Signal) (рис.4).

(а) (б) Рис.4. Флуоресцентная микрофотография макрофагов RAW264.7, экспрессирующих HyPer- Nuclear Localization Signal (HyPer NLS) (a) и HyPer-Nuclear Export Signal (HyPer-NES) (б). Масштабная линейка мкм.

При коэкспрессии HyPer-NLS и HyPer-NES в одной клетке не происходит «перемешивания» HyPer, находящегося в ядре, с HyPer из цитоплазмы. Таким образом, детекция окислительного взрыва в макрофагах RAW264.7, коэкспрессирующих обе конструкции, позволяет установить локализацию источника АФК при окислительном взрыве и источник окисленного HyPer в ядре.

После визуализации окислительного взрыва в макрофагах RAW264.7, коэкспрессирующих HyPer-NLS и HyPer-NES, и анализа графиков содержания H2O2 в цитоплазме и ядре, было установлено, что величина F500/F420 выше в цитоплазме. Форма кривых и времена достижения максимальных концентраций H2O2 в ядре и цитоплазме совпадают (рис.5). Это позволяет говорить о 1) поддержании более низких базальных концентраций H2O2 в ядре по сравнению с цитоплазмой фагоцитирующего макрофага RAW264.7 2) том, что H2O2 диффундирует из цитоплазмы в ядро.

(а) (б) Рис.5. Окислительный взрыв в индивидуальном мкрофаге RAW264.7 в процессе фагоцитоза: (а) серия конфокальных рациометрических изображений фагоцитирующего макрофага, котрансфецированнрго HyPer-NLS и HyPer-NLS;

(б) графики, отражающие изменение содержания H2O2 в ядре (красная линия) и цитоплазме (чёрная линия) фагоцитирующего макрофага, изображенного на панели (а) Чёрный цвет соответствует величине F500/F420 0;

белый – 4;

Масштабная линейка10 мкм.

Описанные эксперименты с макрофагами RAW264.7 наглядно показывают, что фагоциты контролируют концентрацию H2O2 в процессе фагоцитоза, а в некоторых фагоцитирующих клетках может происходить более одного кратковременного повышения концентрации H2O2. Показано, что изменение уровня внеклеточных АФК в популяции фагоцитов отражают не ход окислительного взрыва в индивидуальной клетке, а кумулятивный асинхронный ответ множества клеток с различными индивидуальными особенностями продукции АФК. Быстрое, по сравнению с экспериментами с HeLa и ростовыми факторами, окисление и восстановление HyPer во время фагоцитоза может свидетельствовать о сигнальной функции H2O2 именно в этом процессе. Следующим этапом работы было более подробное исследование сигнальной функции H2O2 в процессе фагоцитоза.

Изучение влияния H2O2 на эффективность фагоцитоза Пероксид водорода, производимый макрофагами при окислительном взрыве, предположительно может выступать в качестве сигнальной молекулы. Однако, аспекты «поведения» фагоцитирующего макрофага, связанные с активацией каскадов, контролируемых H2O2, в настоящее время практически неизвестны.

Было обнаружено, что в рамках изучаемой экспериментальной модели большинство макрофагов фагоцитируют от 1 до 9 гранул Opz практически одновременно, за 1- минуты, после чего фагоцитоз прекращается. В 20% случаев макрофаг после быстрой интернализации первых гранул продолжает фагоцитировать, причём такие фагоциты уходят в апоптоз сразу после прекращения фагоцитоза. Таким образом, возможно, интернализация макрофагом первой «порции» гранул зимозана снижает вероятность интернализации этим же макрофагом зимозана в дальнейшем.

Было предположено, что продуцируемый при окислительном взрыве H2O2 используется макрофагами для предотвращения захвата большого количества гранул зимозана. Для проверки этой гипотезы макрофаги RAW264.7 были проинкубированы в среде, содержащей 100 нМ H2O2 перед индукцией фагоцитоза. Инкубация макрофагов с H2O вызвала не только уменьшение количества фагоцитирующих клеток (фагоцитарного индекса) в 2 раза, но и уменьшение среднего количества захваченных гранул на клетку (фагоцитарного числа) в 6 раз (рис.6).

(а) (б) Рис.6. Влияние H2O2 на эффективность фагоцитоза макрофагами RAW264. опсонизированного зимозана. Влияние преинкубации с 100 нм H2O2 на среднее количество гранул, интернализованных одним макрофагом, (n30, показано стандартное отклонение) (а), и на общее число фагоцитирующих макрофагов (n30, показано стандартное отклонение)(б).

Таким образом, было установлено, что добавление к клеткам субмикромолярных и микромолярных количеств H2O2 приводит к существенному снижению эффективности фагоцитоза.

Как было показано ранее, во время фагоцитоза в макрофаге происходит всплеск продукции H2O2, распространяющийся из цитоплазмы в ядро. Известно, что H2O2 и некоторые продукты реакций пероксида водорода способны привести к повреждению биомолекул, в т.ч. и ДНК. Можно предположить, что механизм, ограничивающий количество и интенсивность окислительных взрывов в фагоцитирующей клетке, направлен в первую очередь на защиту фагоцита от разрушения собственными АФК. В отличие от короткоживущих нейтрофилов, основной задачей которых является фагоцитоз, после чего они уходят в апоптоз, активированные фагоцитозом патогенных клеток макрофаги живут длительное время, осуществляют презентацию антигенов лимфоцитам и вырабатывают большое количество цитокинов. Таким образом, в макрофагах должны функционировать какие-то дополнительные механизмы защиты от апоптоза, связанного с фагоцитозом. Приведенные данные позволяют предположить участие H2O2 в сигнальных процессах, задействованных в такой защите.

II. Изучение сигнальной функции NADPH оксидазы при активации каскадов p и Erk1/2 в фагоцитирующих макрофагах RAW264. Хорошо известно, что активность ферментов NOX не обязательно связана с фагоцитозом.

Она также необходима для прохождения процессов, универсально представленных в разных клетках. Производимая NADPH оксидазами H2O2 модулирует активность протеиновых тирозиновых фосфатаз (PTP), и, как следствие, MAP (Mitogen-Activated Protein Kinase) киназных каскадов. MAPK представляют собой серин-треониновые протеинкиназы, обеспечивающие клеточный ответ на различные физиологические стимулы (факторы роста, цитокины, хемокины и другие вещества, вызывающие активацию рецепторов на поверхности клетки). Три основных группы MAP-киназных каскадов – каскады Erk 1/2, p38 и Jnk. Регуляция активности MAPK осуществляется множеством ферментов, в том числе и фосфатазами PTP, cодержащими в активном центре обратимо окисляемый тиолат. Хотя подобные MAPK каскады исследовались в основном на нефагоцитирующих клетках, справедливо было бы предположить наличие подобной регуляции и в фагоцитах. Значительное количество довольно разрозненных данных позволяют предположить активацию МАРK при фагоцитозе, однако взаимосвязь между разными каскадами и их зависимость от активности NOX остаются неисследованными. В данной работе была поставлена задача исследовать активацию двух МАРK каскадов, р и Erk1/2, в процессе фагоцитоза.

Как правило, для получения информации об активации МАРK каскадов, используют электрофорез образцов в денатурирующих условиях с последующей детекцией фосфорилированных форм МАРK с помощью специфичных антител. Однако при исследовании активации МАРK в процессе фагоцитоза данный метод несет в себе возможность ошибочной интерпретации полученных результатов. Так, например, при проведении ингибиторного анализа фосфорилирования МАРK, ингибирующий эффект какого-либо химического соединения может свидетельствовать как об ингибировании вышестоящей ступени сигнального каскада, так и о снижении эффективности фагоцитоза под влиянием этого вещества. Для получения наиболее достоверной картины, мы использовали комбинацию двух независимых методов: вестерн-блоттинг, совмещенный с ингибиторным анализом, и иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами к фосфорилированным формам МАР-киназ р38 и Erk1/2. Было обнаружено, что добавление опсонизированных гранул зимозана к макрофагам приводит к быстрой активации обоих исследуемых нами сигнальных каскадов (рис.7).

Рис.7. Вестерн-блоттинг лизатов клеток RAW264.7, проинкубированных в присутствии 0,5 mM специфического ингибитора NADPH оксидазы апоцинина (Apo), nM ингибитора PI3-киназы вортманнина (Wort), 10 мкM ингибитора p38 SB 203580 (SB), 20 мкM ингибитора MAPKK Erk1/2 киназы MEK-1 PD 98059 (PD), и 1 mM антиоксиданта N-ацетилцистеина (NAC), либо в отсутствие ингибиторов (контроль). Клетки были стимулированы добавлением опсонизированного зимозана (+), либо, в качестве контроля, PBS (-). Клетки лизировали спустя 10 минут после стимуляции. (а) Вестерн-блоттинг с антителами к фосфорилированной форме р38 (Р-р38), суммарному пулу р38 (р38) и к тубулину. (б) Вестерн-блоттинг с антителами к фосфорилированной форме Erk1/2 (P Erk1/2), суммарному пулу Erk1/2 (Erk1/2) и к -тубулину.

Чтобы проверить, является ли активация следствием фагоцитоза зимозана или происходит под влиянием низкомолекулярных примесей в суспензии зимозана, клетки RAW264. фиксировали через 10 минут после добавления суспензии зимозана с последующей иммуноцитохимической детекцией фосфорилированной p38 (Р-р38) и фосфорилированой Erk (Р-Erk1/2). Такая постановка эксперимента позволила получить изображения фагоцитировавших и нефагоцитировавших клеток в одном поле зрения. Результаты, приведенные на рис. 7 и 8 позволяют утверждать, что активация р38 и Erk1/2 происходит в результате фагоцитоза. Видно, что в фагоцитировавших клетках обе киназы находятся в фосфорилированной форме, тогда как клетки, в которых не содержится гранул зимозана, дают лишь фоновое окрашивание.

Рис.8.

Иммуноцитохимическое окрашивание клеток RAW264.7, стимулированных Opz в отсутствие ингибиторов (а,г), и в присутствии SB 203580 (б), PD 98059 (д) либо апоцинина (в,е).

Клетки окрашены с использованием антител к фосфорилированной форме Erk1/2 (а-в) или p (г-д). Стрелки указывает на фагоцитированные гранулы зимозана, масштабная линейка мкм.

.

В нестимулированных гранулами Opz макрофагах небольшая фоновая активация р38 и Erk1/2 выявляется и при иммуноцитохимической детекции (рис.8), и с помощью вестерн блоттинга (рис.7). Интересно, что инкубация клеток с ингибитором киназы р38, SB 203580, приводит к снижению интенсивности фагоцитоза (таб.1). Степень фосфорилирования Erk1/2, напротив, возрастает при ингибировании р38 как в фагоцитировавших, так и в контрольных клетках (Рис.7 б), что свидетельствует об ингибировании каскада Erk1/2 каскадом р38.

В свою очередь, инкубация клеток в присутствии PD 98059, ингибитора киназы МЕК-1, фосфорилирующей киназы для Erk1/2, приводит к заметному снижению числа фагоцитировавших клеток (таб.1) и снижению степени фосфорилирования киназ Erk1/ как в по данным вестерн-блоттинга (рис.7 б), так и в отдельных фагоцитировавших клетках (Рис.8 б). При этом по данным вестерн-блоттинга, в контрольных (нестимулированных) клетках наблюдается значительная активация р38 (Рис.7 а), что указывает на ингибирование каскада р38 каскадом Erk1/2.

Таб.1. Влияние ингибиторов на эффективность фагоцитоза зимозана клетками RAW264.7.

Реагент Действие Кол-во фагоцитировавших клеток, % нет 45 ± Апоцинин, 1,5 мM ингибитор NADPH оксидазы Апоцинин, 0,5 мM 13 ± SB 203580, 10 мкM ингибитор p38 23 ± PD 98059, 20 мкM ингибитор МЕК-1, 20 ± фосфорилирующей Erk1/ киназы N-ацетилцистеин, 10 мM антиоксидант N-ацетилцистеин, 1 мM 6± Вортманнин, 10 нM ингибитор PI3 киназы Таким образом, была показана не только активация каскадов р38 и Erk1/2 в фагоцитирующих клетках, но и их взаимное угнетение. Следующим этапом работы было выявление связи фагоцитарной NOX c активацией MAP-киназных сигнальных каскадов.

Изучение зависимости фосфорилирования р38 и Erk1/2 от активности NADPH оксидазы Было предположено, что в фагоцитирующих клетках активность NADPH оксидазы также необходима для успешной активации МАРK. Для проверки данного предположения, клетки RAW 264.7 инкубировали в присутствии апоцинина, специфичного ингибитора NADPH оксидаз NOX1 и NOX2. Добавление апоцинина до конечной концентрации 1, мM полностью блокировало фагоцитоз, использование меньшей концентрации (0,5 мM) частично блокировало фагоцитоз (таб.1). Данные иммуноцитохимического окрашивания позволяют утверждать, что ингибирование NOX приводит к ингибированию фосфорилирования Erk1/2 (рис.7 б). Следовательно, для активации каскада Erk1/ требуется активация фагоцитарной NADPH оксидазы, что также свидетельствует в пользу сигнальной функции H2O2 в фагоцитах. Кроме того, некоторый фоновый уровень активности NADPH оксидазы необходим для эффективного осуществления фагоцитоза.

Каскад р38, напротив, активируется при ингибировании NADPH оксидазы в нестимулированных клетках (рис.7 а), что, по-видимому, является следствием ингибирования каскада Erk1/2.

Таким образом, из двух исследавнных каскадов, р38 и Erk1/2, только Erk1/2 активируется по механизму, предусматривающему генерацию H2O2 NADPH оксидазой.

Изучение зависимости фосфорилирования р38 и Erk1/2 от активности фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и антиоксидантов Ассоциация на мембране и активация ферментов NOX связана с появлением в мембране фосфатидилинозитола-3,4,5-трифосфата (PI3), производимого фосфатидилиназитол-3 киназой (PI3K). Чтобы удостовериться в наличии связи ассоциации NOX и активации MAPK каскадов, мы исследовали влияние специфического ингибитора PI3K на фагоцитоз.

Поскольку активация PI3K необходима для сборки активного комплекса фагоцитарной NOX, мы предположили, что влияние ингибитора NOX апоцинина на фагоцитоз и активацию МАРK должны воспроизводиться при ингибировании PI3K высокоспецифичным ингибитором вортманнином. Действительно, инкубация с вортманнином как контрольных (нестимулированных) клеток, так и обработка клеток с последующей стимуляцией зимозаном, практически полностью воспроизводила все эффекты апоцинина: блокирование фагоцитоза, ингибирование Erk1/2, активацию р38 в нестимулированных клетках (рис.7).

Роль NADPH оксидазы в активации Erk1/2 опосредована продукцией супероксид-анион радикала, дисмутирующего в H2O2, следовательно эффекты ингибиторов NADPH оксидазы должны быть сходны с эффектами антиоксидантов. Действительно, при инкубации клеток RAW264.7 в присутствии N-ацетилцистеина наблюдалось практически полное ингибирование фагоцитоза (таб.1), снижение уровня фосфорилирования Erk1/ (рис.7 б), и рост уровня фосфорилирования р38 в контрольных (нестимулированных) клетках (рис.7 а) Следовательно, роль NOX в активации Erk1/2 с высокой вероятностью связана с продукцией этим ферментом H2O2.

Результаты проделанной работы позволяют утверждать, что МАР-киназы р38 и Erk1/ принимают активное участие в процессе фагоцитоза. Начальная фоновая активность как р38, так и Erk1/2 существенна для эффективного осуществления фагоцитоза. Оба каскада взаимно ингибируют друг друга, что является, по-видимому, защитой от избыточной активации одного из них.

Активация каскада Erk1/2 опосредована АФК, образующимися в процессе фагоцитоза в результате работы NADPH оксидазы плазматической мембраны. Активация р38 не требует участия NADPH оксидазы.

Известно, что активация каскадов р38 и Erk1/2 приводит к выбору разных форм клеточного ответа. Баланс этих каскадов определяет, будет ли клетка пролиферировать, дифференцироваться, или подвергнется апоптозу. Наиболее вероятно, что в фагоцитировавшей клетке осуществляется конкурентная активация обоих каскадов и выбор дальнейшей судьбы клетки зависит от дополнительных факторов, например от того, насколько сама клетка оказывается поврежденной в условиях повышения продукции АФК. Вместе с тем, одним из основных выводов данного исследования является то, что фагоцитарная NADPH оксидаза, а вместе с ней и АФК, являются нормальными компонентами внутриклеточных сигнальных каскадов, а цепочка «стимул - NADPH оксидаза – МАР киназы – клеточный ответ» является универсальной для различных типов клеток фагоцитарной и нефагоцитарной природы.

III. Создание новых вариантов HyPer c увеличенным динамическим диапазоном флуоресцентного ответа на H2O С момента создания биосенсора HyPer в 2006 г. непрерывно предпринимались попытки его усовершенствования, направленные на увеличение диапазона флуоресцентного ответа на H2O2.

HyPer зарекомендовал себя удобным молекулярном инструментом для исследования продукции эндогенного H2O2 в ряде физиологических процессов. Однако во всех исследованиях продукции H2O2 при физиологической стимуляции живых клеток, не достигается максимального диапазона ответа биосенсора, равного приблизительно 3.

Таким образом динамический диапазон ответа данного сенсора не обладает желаемой амплитудой. Следовательно, была поставлена задача создать HyPer с увеличенным динамическим диапазоном флуоресцентного ответа.

Получение HyPer Ранее мы предполагали, что все флуоресцентные свойства HyPer, в том числе и диапазон ответа на окисление, зависят исключительно от GFP-подобного домена HyPer, cpYFP. Для создания более контрастной версии HyPer применяли случайный и направленный мутагенез линкеров и cpYFP, заменяли cpYFP на другие флуоресцентные белки, но все получаемые в результате мутагенезов варианты HyPer были хуже или сравнимы с исходным биосенсором.

При переклонировании гена HyPer для получения HyPer-NES, в одном из клонов HyPer NES были обнаружены две случайные мутации, приведшие к аминокислотным заменам.

Одна из замен в последовательности HyPer-NES, N353S, локализованная в cpYFP соответствовала N121S в GFP, вторая, A406V, соответствовала A233V в OxyR дикого типа (wtOxyR). Проэкспрессированый в клетках HeLa HyPer-NES c двумя аминокислотными заменами (HyPer-N353S-A406V-NES) обладал существенно большим динамическим диапазоном ответа на H2O2, чем HyPer-Cyto. Проведенные измерения показали, что динамический диапазон, т.е. соотношение F500/F420 HyPer-Cyto и HyPer-NES не отличается и составляет приблизительно 3, а F500/F420 для HyPer-N353S-A406V-NES и полученного нами HyPer-N353S-A406V-Cyto составляет от 6 до 7 (рис. 9).

Рис.9. Сравнение флуоресцентного ответа HyPer-Cyto и HyPer-N353S-A406V-Cyto, проэкспрессированных в HeLa, на добавление 100 мкМ H2O2: (а) серия изображений клеток, экспрессирующих HyPer-N353S-A406V-Cyto, между 2-ым и 3-им кадром к клеткам добавлен H2O2 до концентрации 100 мкМ.. Псевдоцвета отражают соотношение F500/F420, черный соответствует величине 0,5, белый – 8,0;

(б) график изменения F500/F420 для HyPer-Cyto (красная линия) и HyPer-N353S-A406V-Cyto (чёрная линия), представляющая ответ биосенсоров на добавление к клеткам, изображенным на панели (а) 100 мкМ H2O2.Масштабная линейка 20 мкм.

Поскольку добавление последовательности NES не привело к увеличению диапазона флуоресцентного ответа HyPer, был сделан вывод о ключевой роли одной или обеих мутаций (N353S и A406V) в изменении свойств биосенсора.

Чтобы установить, какая именно из мутаций, приводит к изменению свойств HyPer, были сконструированы HyPer-N353S и HyPer-A406V цитоплазматической локализации. Было показано, что только замена A406V приводит к изменению динамического диапазона HyPer. HyPer-A406V был назван HyPer2 (рис.10).

Рис.10. Изменение F500/F420 в ответ на добавление 100 мкМ H2O2 к клеткам HeLa экспрессирующим HyPer (красная линия), HyPer-N353S (синяя линия) и HyPer-A406V (HyPer2, чёрная линия).

Сравнение времен полуокисления и полувосcтановления HyPer и HyPer2 показало, что для HyPer2 эти времена в 2 раза больше, чем для HyPer (рис.11).

(а) (б) Рис.11. Средние времена полуокисления (а) и полувосстановления (б) трёх вариантов HyPer, (n=20, P0.05).

Мутация по позиции A233V в wtOxyR, соответствующая замене по позиции A406V в HyPer, описана ранее как дестабилизирующая интерфейс димеризации белка wtOxtR. Мы предположили, что дестабилизация димерного состояния OxyR-RD в составе HyPer могла привести к большей подвижности участка пептидной цепи с 205 по 225 а.о., в который интегрирован cpYFP. Для оценки олигомерного состояния HyPer и HyPer применили гель-фильтрационную хроматографию. Была установлена склонность HyPer к образованию димерной формы в высоких концентрациях, при этом в разбавленном состоянии HyPer присутствует в растворе в качестве мономерного белка, в то время как HyPer2, вопреки нашим ожиданиям, оказался белком, находящимся в димерной форме даже в низких концентрациях (рис.12).

Рис.12. Гель фильтрация 4-х вариантов HyPer, синяя линия соответствует концентрации 1 мг/мл, красная – 0,02 мг/мл.

Результаты гель-фильтрации HyPer и HyPer2 и их сравнение с литературными данными могут свидетельствовать больших структурных различиях интерфейсов димеризации HyPer и wtOxyR. Также можно предположить, что более гидрофобный по сравнению с аланином валин в позиции 233 для wtOxyR (406 для HyPer), способствует димерезации HyPer2 за счёт гидрофобных взаимодействий с I110 и L124.

Детекция эндогенного H2O2, производимого клетками NIH-3T3 при стимуляции фактором роста тромбоцитов (PDGF) Чтобы показать большую, по сравнению с HyPer, эффективность HyPer2 для визуализации низких концентрации эндогенного H2O2, мы сравнили графики продукции H2O2 клетками NIH-3T3 трансфецированными HyPer и HyPer2, в ответ на стимуляцию PDGF (Platelet derived growth factor).

(а) Рис.13. Продукция H2O мышиными фибробластами NIH-3T3 в ответ на стимуляцию фактором роста тромбоцитов (PDGF):

cерия конфокальных рациометрических изображений клеток NIH (б) 3T3, экспрессирующих HyPer2 (a) и HyPer (б), нг/мл PDGF добавлено к клеткам в 0-ой момент времени, чёрный цвет соответствует величине F500/F420 0,5;

белый – (в). Графики изменения (в) флуоресцентного сигнала (F500/F420) в клетках NIH 3T3, продуцирующих низкие концентрации эндогенного H2O2 в ответ на стимуляцию PDGF. Чёрная линия соответствует HyPer2 экстраядерной локализации, красная – HyPer. Масштабная линейка 20 мкм.

Мышиные фибробласты NIH-3T3 были выбраны для данного эксперимента ввиду наличия у них выраженного физиологического ответа на PDGF. В ответ на PDGF наблюдался плавный рост продукции H2O2 в цитоплазме клеток NIH-3T3, причём амплитуда ответа (F500/F420) HyPer2, оказалась значительно большей, чем HyPer (рис.13). Таким образом, HyPer2 является более совершенным биосенсором для детекции низких концентраций эндогеннго H2O2.

Однако HyPer2 по сравнению с исходным HyPer обладал существенно большими временами полуокисления (активации) и полувосстановления (реактивации) (рис.11).

Следующим этапом работы было создание биосенсора с увеличенным динамическим диапазоном флуоресцентного ответа, но с меньшими временами активации и реактивации.

Создание и изучение HyPer-H36Y Анализ положения случайной замены A406V в HyPer и её влияния на свойства биосенсора подвёл нас к предположению, что и другие аминокислотные замены в интерфейсе димеризации wtOxyR могут изменить свойства HyPer. Позиции L124 и H114 описаны в литературе, как ключевые для образования димера wtOxyR. Аминокислотные замены L124D и H114Y, по-видимому, снижают способность OxyR димеризоваться. Нами были сконструированы и протестированы варианты HyPer с заменами в инерфейсе димеризации OxyR-RD HyPer-H36Y (H114Y для wtOxyR) и HyPer-L46D (L124D для wtOxyR).

HyPer-L46D обладал пониженным по сравнению с исходным HyPer диапазоном ответа (рис.14), в то время как HyPer-H36Y, обладая значительно меньшими, чем HyPer2, временами полуокисления и полувосстановления (рис.11), сохранил при этом повышенную контрастность (рис 14).

Рис.14. Сравнение диапазонов флуоресцентного ответа (F500/F420) четырёх вариантов HyPer. Графики отражают изменение интенсивностей флуоресцентного ответа биосенсоров, экспрессипрованных в HeLa, после добавления к клеткам 100 мкМ H2O2.

Интересно, что HyPer-L46D не способен к димеризации, в то время как HyPer-H36Y образует димеры, хотя в низких концентрациях, в отличие от HyPer2, присутствует в растворе и в мономерной форме (рис.12).

Таким образом, были получены варианты HyPer c увеличенным диапазоном флуоресцентного ответа. Анализ мутаций, детерминировавших диапазон флуоресцентного ответа HyPer2, позволил нам получить HyPer-H36Y. HyPer-H36Y обладает повышенной по сравнению с HyPer амплитудой флуоресцентного ответа и реактивируется в два раза быстрее, чем HyPer2. Применение новых вариантов HyPer особенно удобно для визуализации низких уровней эндогенного H2O2, участвующего во внутриклеточной передачи сигнала.

Интересно, что мутантные формы белка OxyR OxyR-A233V, по данным ряда исследований, обладают пониженной способностью к димеризации. Эта же мутация в OxyR-RD в составе HyPer привела к обратному результату.

Мы предполагаем, что значительная часть изменения соотношения пиков поглощения HyPer, HyPer2 и HyPer-H36Y при окислении их H2O2 связана с процессом димеризации этих белков. Это логично следует из сопоставления низкой амплитуды флуоресцентного ответа на H2O2 не способного к димеризации HyPer-L46D, средней амплитуды ответа способного к частичной димеризации HyPer, и высокой амплитуды ответа легко димеризующихся HyPer2 и Hyper-H36Y.

Таким образом, в этой части работы были созданы и охарактеризованы новые варианты биосенсорных белков, обладающие большим контрастом флуоресцентного ответа на H2O2, чем исходный биосенсор HyPer. Применение этих биосенсоров в дальнейшем позволит лучше понять широкий спектр физиологических процессов с участием эндогенного пероксида водорода, и поможет более подробно изучить роль АФК в нормальных и патологических состояниях живого организма.

Выводы 1) В данной работе предложены и оптимизированы методы, позволяющие детектировать продукцию пероксида водорода на уровне индивидуальных клеток in vivo. С помощью флуоресцентного генетически кодируемого биосенсора HyPer показана продукция пероксида водорода в фагоцитирующих макрофагах и прстимулированных факторами роста клетках HeLa и NIH-3T3.

2) Продукция пероксида водорода при окислительном взрыве в фагоцитирующих макрофагах носит кратковременный характер. Зависимость концентрации пероксида водорода от времени, измеренная для индивидуальных клеток, принципиально отличается от таковой, измеренной для популяции фагоцитирующих клеток.

3) Пероксид водорода, производимый макрофагом при фагоцитозе, выполняет сигнальную функцию в фагоцитах. Активация MAP-киназного каскада Erk1/2 при фагоцитозе зависит от продукции пероксида водорода NADPH оксидазами.

4) Продукция пероксида водорода является достаточным условием снижения вероятности повторных событий фагоцитоза в одной и той же клетке. На основе полученных данных cформулирована гипотеза о существовании в макрофагах сигнальных процессов, проходящих с участием пероксида водорода и приводящих к подавлению фагоцитоза.

5) Новые варианты биосенсора HyPer, разработанные и охарактеризованные в данной работе, обладают увеличенным, по сравнению с исходным биосенсором, диапазоном флуоресцентного ответа на пероксид водорода. Мутации, влияющие на динамический диапазон флуоресцентного ответа биосенсора, локализованы в чувствительном к пероксиду водорода, а не во флуоресцентном домене.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1. Markvicheva, K.N., Bogdanova, E.A., Staroverov, D.B., Lukyanov, S., & Belousov, V.V., Imaging of intracellular hydrogen peroxide production with HyPer upon stimulation of HeLa cells with epidermal growth factor. Methods Mol Biol 476, 76-83 (2009).

2. Markvicheva, K.N., Bilan, D.S., Mishina, N.M., Gorokhovatsky, A.Y., Vinokurov, L.M., Lukyanov S., Belousov, V.V. A genetically encoded sensor for H(2)O(2) with expanded dynamic range. Bioorg Med Chem.(2010) 3. Марквичева, К.Н., Гороховатский, А.Ю., Мишина, Н.М., Мудрик, Н.Н., Винокуров, Л.М., Лукьянов, С.А., Белоусов, В.В. Сигнальная функция фагоцитарной NADPH оксидазы: активация МАР-киназных каскадов при фагоцитозе. Биоорг.химия, 36 (1):

133-138 (2010).

Тезисы докладов на конференциях 1. Белоусов, В.В., Чудоков, Д.М., Суслова, Е.А, Марквичева, К.Н., Шашкова, А.А., Фрадков, А.Ф., Лукьянов, С.А. Новые внутриклеточные сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка. VIII чтения, посвященные памяти акад. Ю.А.Овчинникова, (ИБХ РАН, Москва, Россия, 2006).

2. Markvicheva, K.N., Belousov, V.V., Terskikh, A.V., Shakhbazov, K.S., Fradkov, A.F., Lukyanov, K.A., Lukyanov, S.A. Study and optimization of genetically encoded fluorescent probe for detection of hydrogen pyroxide, Nineteenth International Conference “New Information Technology in Medicine, Pharmacology Biology and Ecology” (Gurzuf, Ukraine, 2007).

3. Belousov, V.V., Markvicheva, K.N., Safronova, N.M., Leibl, D., Schultz, C. Real-time monitoring of intracellular hydrogen peroxide production in phagocyting macrophages using HyPer, a genetically encoded fluorescent probe, EMBL Chemical Biology Conference (European Molecular Biology Laboratory, Hiedelberg, Germany, 2008).

4. Лукьянов, С.А., Белоусов, В.В., Чудаков, Д.М., Марквичева, К.Н., Мишина Н.М., Суслова, Е.А. Наномолекулярные внутриклеточные биосенсоры: современные достижения и перспективы развития, V Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и переспективы развития» (Москва, Россия, 2009).

5. Марквичева, К.Н., Мишина, Н.М., Белоусов, В.В., Лукьянов, С.А. Роль NADPH оксидазы в активации MAP-киназных каскадов при фагоцитозе. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения акад. Ю.А. Овчинникова, (ИБХ РАН, Москва, Россия, 2009).

6. Markvicheva K.N., Belousov V.V, Mishina, N.M., Shultz, C. The role of NADPH oxidase in MAP kinase cascades activation at phagocytosis, 49-th annual meeting of The American Society for Cell Biology (San-Diego, USA, 2009).