Биохимическая диагностика загрязнения объектов окружающей среды

На правах рукописи

РИЗАЕВА Елена Петровна БИОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 03.00.16 - Экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

КАЗАНЬ - 1998

Работа выполнена на кафедре прикладной экологии экологического факультета Казан ского государственного университета.

Научный консультант: кандидат химических наук, доцент Евтюгин Г.А.

Научный консультант доктор химических наук, профессор Латыпова В.З.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, доцент Евгеньев М.И.

кандидат биологических нааук, старший научный сотрудник Зобов В.В.

Ведущая организация: Институт проблем прикладной экологии и природо пользования, г.Уфа

Защита состоится " " 1998 г. в часов на заседании Специализиро ванного ученого совета К 053.29.24 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, 18, Казанский государственный универси тет, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГУ.

Автореферат разослан " " 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного совета К 053.29.24, кандидат химических наук Евтюгин Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Экспресс-оценка загрязнения объектов окружающей среды является необходимым компонентом экологических исследований, вклю чая нормирование сбросов и выбросов загрязняющих веществ и оценку экологи ческих последствий загрязнения. Учитывая постоянно растущий перечень за грязняющих веществ, поступающих в окружающую среду, а также ужесточение гигиенических показателей их нормирования, полный химический анализ за грязнения вод, почв, растительности представляет собой очень сложную и доро гостоящую задачу. Поэтому возрастающее внимание уделяется экспресс мето дам контроля, ориентированным на детектирование опасных уровней загрязне ния и оценку совокупного воздействия токсикантов на окружающую среду. В этой связи актуальной является задача разработки методов биохимической диаг ностики загрязнения, сочетающих чувствительность методов биотестирования и операционные характеристики химических сенсоров. Практическое внедрение таких биосенсорных устройств позволит расширить сферу экологического мо ниторинга, снизить риск опасного загрязнения биосферы, в том числе среды обитания человека.

Диссертация выполнена в рамках основного научного направления кафед ры прикладной экологии Казанского государственного университета "Развитие теоретических и прикладных основ экологического мониторинга (рег.№ 0/980006937) при поддержке грантов РФФИ № 97-03-33210 "Разработка тестовых методов определения ингибиторов гидролитических ферментов с по мощью электрохимических биосенсоров", Санкт-Петербург-ского конкурсного центра № 97-0-9.5-238 "Методы групповой оценки загрязнителей окружающей среды на основе биохимических тестов и биосенсоров" и программы ФЦНТП РФ "Новые принципы и методы получения химических веществ и материалов", тема 30.05 "Теоретические и практические основы изменения избирательности биоспецифических методов анализа для решения конкретных аналитических за дач".

Целью настоящего исследования явилось изучение аналитических и опе рационных характеристик холинэстеразного биосенсора для контроля объектов окружающей среды, выявление экспериментальных факторов, определяющих чувствительность определения специфических ингибиторов в многокомпонент ных средах, включая реальные объекты окружающей среды, а также разработка экспертной системы для оценки загрязненности (токсичности) сточных вод на основе обобщенных показателей, включающих антихолинэстеразную актив ность образца.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выявить механизм формирования отклика биосенсора к ингибитору, в том числе изучить влияние носителя фермента, сорбции веществ на мембране на аналитические характеристики определения загрязнителей окружающей среды ингибиторов различного механизма действия;

- установить влияние макрокомпонентов тестируемого образца, таких как органические растворители, поверхностно-активные вещества, ингибиторы об ратимого механизма действия, на чувствительность определения специфических ингибиторов, определить способы дифференциации и интерпретации отклика биосенсора при совместном присутствии в анализируемом растворе ингибито ров различного механизма действия;

- произвести скрининг антихолинэстеразной активности промышленных сточных вод и на этой основе разработать экспертную систему продукционного типа для оценки характера загрязненности (токсичности) вод, базирующейся на результатах биохимического тестирования с привлечением других обобщенных физико-химических показателей, оценить эффективность методов математиче ской классификации, использованных для построения экспертных систем.

Научная новизна и практическая значимость работы заключается в том, что она углубляет представления о закономерностях функционирования биосенсоров для определения ингибиторов в многокомпонентных средах, а также расширяет сферу применения биохимических средств диагностики в экологическом монито ринге. Впервые на основе изучения влияния экспериментальных факторов (ус ловия измерения, присутствие поверхностно-активных веществ и органического растворителя, материал мембраны) установлен вклад поверхностных процессов (сорбция, массоперенос реагентов) в формирование отклика холинэстеразного биосенсора к ингибиторам различного механизма действия, показана возмож ность расчета кинетических параметров ингибирования. На этой основе опреде лены пути регулирования чувствительности и селективности определения инги биторов путем изменения гидрофобности ферментсодержащих мембран и по давления защитного эффекта обратимых ингибиторов холинэстераз. Впервые построена экспертная система оценки загрязненности сточных вод на основе обобщенных показателей, включающих биохимическое тестирование, и прове дена сравнительная оценка методов построения экспертной системы с помощью традиционных (дискриминантный анализ) и нетрадиционных (нейронные сети прямого распространения и Fuzzy ART Map) статистических методов.

Часть экспериментальных результатов и выводы на их основе исполь зованы в учебном процессе Казанского государственного университета при чте нии общего курса "Экологический мониторинг".

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Между народном симпозиуме "Применение биосенсоров для прямого определения за грязнителей окружающей среды в полевых условиях" (Смоленице, Слова кия,1997), Международном симпозиуме "Применение биосенсоров для анализа загрязнителей окружающей среды" (Коимбра, Португалия, 1998), 9 Европейской конференции по химическим сенсорам и трансдьюсерам (Варшава, 1997), 9 Ев ропейской конференции по электроаналитической химии (Коимбра, Португалия, 1998), на научных конференциях Казанского государственного университета в 1997, 1998 гг.

Основные результаты изложены в 2 статьях и 4 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, включает 23 рисунка и 26 таблиц и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы (151 источник) и приложе ния.

Во Введении обоснована актуальность работы, ее новизна и практическая значимость, сформулированы цель исследования и основные задачи. Первая гла ва посвящена обзору литературы по определению загрязнителей окружающей среды с помощью биосенсоров. Во второй главе приведено описание методов исследования. Основный результаты экспериментальных исследований и их об суждение приведено в главах 3-4.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В исследованиях использовали промышленно выпускаемые препараты бутирилхолинэстеразы (ХЭ) из сыворот ки крови лошади, КФ 3.1.1.8, производства НПО"Биомед", Пермь, с удельной активностью 4.2±0.5 Е/мг. Субстратами ферментативной реакции служили бути рилхолин иодид (БХИ), ацетилхолин иодид (АХИ) и хлорид. Измерения прово дили в 0.002 М. фосфатном или трис-буферных растворах, содержащих для по стоянства ионной силы 0.1 моль/л хлорида натрия.

Иммобилизацию ХЭ проводили путем кросс-сшивки глутаровым альдеги дом на поверхности кальки чертежной (ТУ 89289), нитратцеллюлозной (SM 11303, Sartorius) или нейлоновой (Hybond, Amersham) мембран. Мембраны фик сировали на поверхность плоского рН-метрического стеклянного электрода. От кликом служил максимальный сдвиг потенциала биосенсора после добавления субстрата, обусловленный выделяющейся в мембране в результате фермента тивного процесса масляной или уксусной кислотой.

ХЭ (CH3)3N+CH2CH2OCOC3H7 + H2O (CH3)3N+CH2CH2OH + C3H7COOH Измерения проводили относительно идентичного рН-электрода без мем браны с помощью иономера И-130 (Гомель, Белорусь).

Характеристики ферментсодержащих мембран и биосенсора на их основе приведены в табл.1.

Таблица Характеристики ферментсодержащих мембран и отклика биосенсоров Параметр Материал мембраны бумага нейлон нитрат целлюлозы Удельная активность ХЭ, Е/см2 0.010±0.003 1.8±0.3 1.4±0. Сохранение активности при 0.1 13 иммобилизации,% Продолжительность хранения в сухом до 15 1-2 2- о состоянии при 4 С, месяцев Отклик, мВ а) 55 70 Время отклика, мин 8 11 Примечание. а). Концентрация БХИ 0.002 моль/л В качестве модельных ингибиторов ХЭ были изучены фосфорорганиче ские пестициды - диазинон {О-(2-изопропил-4-метилпиримидил-6)-О,О-ди этилтиофосфат;

фозалон {О,О-диэтил-S-(6-хлор-2-оксобензоксазолинил-3 метил)-дитиофосфат;

метафос {О,О-диметил-О(4-нитрофенил)тиофосфат};

корал {О,О-диэтил-О-(3-хлор-4-метилкумаринил)тиофосфат}, а также соли меди(II), алюми-ния(III), кадмия(II), фторид натрия, гидразониевые соли диалкилдитио фосфатов и диалкилфосфитов:

A-1 [o-NO2C6H4CH=N-N(CH3)2] [(CH3O)2PHO] A-2 [o-ClC6H4CH=N-N(CH3)2] [(CH3O)2PHO] [m-NO2C6H4CH=N-NH(CH3)2]+ [S2P(OC2H5)2] В- [m-NO2C6H4CH=N-NH(CH3)2]+ [S2P(OC3H7)2] В- [m-NO2C6H4CH=N-NH(CH3)2]+ [S2P(OC3H7-i)2] В- [o-NO2C6H4CH=CHCH=N-NH(CH3)2]+ [S2P(OC2H5)2] С- [o-NO2C6H4CH=CHCH=N-NH(CH3)2]+ [S2P(OC3H7)2] С- [o-NO2C6H4CH=CHCH=N-NH(CH3)2]+ [S2P(OC3H7-i)2] С- Определение ингибиторов в модельных водных растворах. В табл. приведены аналитические характеристики определения пестицидов из модель ных водных растворов.

Таблица Аналитические характеристики определения необратимых ингибиторов с помощью холинэстеразного биосенсора (n=7, P=0.95) Пестицида) Мембра- I (%) = a + b lg (CI, моль/л) Диапазон определяемых r на a b ПО концентраций, моль/л 268±10 30±2 0.990 1.210-9 210-9-610- Диазинон Бумага (810-9) 257±7 29±2 0.988 210-9 310-9-610- Нейлон 145±6 15±3 0.992 110-9 1.510-9-510- НЦб) 201±10 22±2 0.987 210-9 310-9-110- Фозалон Бумага (210-8) 215±20 25±3 0.978 410-9 710-9-410- Нейлон 388±41 42±7 0.965 710-10 110-9-110- НЦ 318±14 40±3 0.985 110-8 210-8-210- Метафос Бумага (310-8) 338±13 45±3 0.990 210-8 310-8-610- Нейлон 420±21 50±6 0.980 510-9 910-9-110- НЦ 310±46 31±7 0.925 110-10 310-10-110- Корал Бумага (510-9) 927±78 96±10 0.975 210-10 310-10-210- Нейлон 730±65 74±4 0.987 110-10 210-10-310- НЦ Примечание: а). В скобках приведены значения предела обнаружения (ПО), по лученные в тех же условиях с помощью нативной ХЭ;

инкубиро вание 10 мин. б). Нитрат целлюлозы (Sartorius) Для повышения чувствительности определения тионовые фосфороргани ческие пестициды предварительно окисляли до кислородных аналогов. Чувстви тельность определения не зависит от природы субстрата и рН буферного раство ра в диапазоне 6.0-8.0. Биосенсор позволяет надежно детектировать присутствие остаточных количеств изученных пестицидов на уровне 0.1-0.01 ПДК, причем нативная ХЭ в тех же условиях показала более высокие пределы обнаружения пестицидов. Для изучения режима функционирования биосенсора и определения кинетических параметров ингибирования предложено использовать анаморфо зу градуировочных графиков определения необратимых ингибиторов в коорди натах CI - ln, где CI - конконцентрация ингибитора, моль/л, а I,% - степень 100 - I ингибирования. Угол наклона зависимости равен проиведению биомлекулярной константы ингибирования (kII) на время инкубирования. Рассчитанные значения kII приведены в табл.3.

Таблица Расчетные значения бимолекулярной константы ингибирования ХЭ фосфорорганическими пестицидами kII, Диапазон концентраций CI, моль/л, Пестицид Мембрана мин (моль/л)- - использовавшийся для расчетов 2106 110-9-810- Диазинон (а) 4106 110-9-110- Бумага 1106 210-9-110- Нейлон 5107 110-9-2.510- НЦ 3106 210-9-110- Фозалон (а) 5106 210-9-210- Бумага 7106 410-9-210- Нейлон 3108 110-9-810- НЦ 3105 110-8-910- Метафос (а) 7105 110-8-110- Бумага 2105 210-8-510- Нейлон 3106 510-9-110- НЦ 7.5105 210-8-810- Корал (а) 5107 110-10-110- Бумага 1.5108 210-10-710- Нейлон 2108 110-10-610- НЦ Примечание. (а). Нативный фермент Рассчитанные значения константы ингибирования согласуются с данны ми, полученными с нативной ХЭ. Это позволяет предположить отсутствие кине тического торможения реагирования вследствие замедленности массопереноса субстрата в мембрану. Завышенные значения kII по сравнению с характеристи ками нативного фермента, обнаруженные при использовании в качестве носите ля нитрата целлюлозы, могут быть обусловлены сорбционным накоплением ин гибитора в мембране. Для проверки этого было изучено влияние неионогенных СПАВ на характеристики определения пестицидов.

Предварительно было показано, что все изученные СПАВ не оказывают влияния на активность нативной ХЭ в диапазоне концентраций 0.001-0.5 % и не меняют отклика биосенсора в диапазоне концентраций 0.001-0.01%. При даль нейшем увеличении содержания СПАВ, наблюдается плохо воспроизводимое снижение величины отклика на 10-50%, сопровождаемое уменьшением времени жизни мембраны до 2-5 дней.

Неионогенные СПАВ повышают ингибирующее действие пестицидов. В качестве примера на рис.1 представлены градуировочные зависимости, полу ченные на бумажных мембранах.

90 I,% I,% 60 Без СПАВ ПЭГ- 30 Твин- Без СПАВ Тритон-Х- Твин- 0 6.3 6.8 7.3 5 6 7 -lgC, моль/ л -lgC, моль/ л (б) (а) Рис.1. Влияние СПАВ на необратимое ингибирующее действие диазинона (а) и метафоса (б). ХЭ иммобилизована на бумаге. Фосфатный 0.002 М. бу ферный раствор + 0.1 моль/л NaCl, рН 7.9. Субстрат БХИ 0.002 моль/л.

Инкубирование 10 мин. Концентрация СПАВ 0.01%.

Чувствительность определения пестицидов в присутствии СПАВ в сред нем в 1.5-2 раза выше, а пределы обнаружения - в 2-8 раз ниже, чем в отсутствии СПАВ. При этом поверхностно-активные вещества нивелируют различия в ана литических характеристиках определения, полученных для различных носите лей фермента: минимальные значения пределов обнаружения (биосенсоры с нитратцеллюлозной мембраной) меняются при добавки СПАВ меньше, макси мальные (биосенсоры с бумажной и нейлоновой мембранами) - больше. По видимому, поверхностно-активные вещества подавляют неспецифическую сорбцию ингибитора, увеличивая его подвижность в мембране, и гидрофобизи руют сам носитель, увеличивая коэффициент распределения пестицида между мембраной и водой. В подтверждение этого ингибирующее действие фторид ионов или ионов металлов в присутствии СПАВ либо не меняется, либо подав ляется (рис.2), причем как и при определении пестицидов, наибольший эффект наблюдается в тех случаях, когда гидрофобные свойства носителя и ингибитора максимально различны (пестициды - бумажные мембраны, фториды - нитрат целлюлозы).

без П АВ 70 без П АВ + 0.01% ТВИ Н - 80 I,% I, % + 0.1% Твин- + 0.03%П ЭГ- 75 + 0.1% Тритон- Х- + 0,02%П ЭГ- 2.5 3 3.5 4 4. 1.5 2 2.5 3 3.5 - lgC, моль/ л - lgC, моль/ л (а) (б) Рис.2. Градуировочные кривые определения фторид-ионов в присутствии СПАВ. ХЭ иммобилизована на бумаге (а) и нитрате целлюлозы (б).

Трис-буферный 0.002 М. раствор + 0.1 моль/л NaCl, рН 7.9. Субстрат БХИ 0.002 моль/л. Инкубирование 10 мин. Концентрация СПАВ 0.01%.

О том, что влияние СПАВ связано с гидрофобными свойствами носителя и ингибитора, а не с механизмом их действия, свидетельствуют результаты, по лученные с прозерином. Являясь необратимым ингибитором ХЭ, прозерин хо рошо растворим в воде, и для него было обнаружено незначительное снижение ингибирующей способности в присутствии СПАВ.

Другая возможная причина расхождения результатов определения инги биторов с помощью нативной и иммобилизованной ХЭ может состоять в нерав номерности распределения ингибитора в мембране. Для проверки этой возмож ности нами был использован биосенсор с двумя слоями мембраны. Удвоение толщины мембраны приводит к значительному снижению отклика биосенсора.

При этом за счет торможения переноса субстрата в мембрану необратимое инги бирующее действие пестицидов снижается. Однако снижение активности ХЭ, измеренное в каждом отдельном слое, оказалось одинаковым, что говорит о рав номерном распределении ингибитора в мембране. Это подтверждается результа тами измерения обратимого ингибирующего действия ионов металлов и фтори дов: оно проводится в стационарных условиях и не зависит от числа слоев (тол щины) мембраны (рис.3).

100 1- слойная мембрана I, % I,% 2- слойная мембрана 5.5 6 6.5 7 7. 2.2 2.6 3 3. - lgC, моль/ л -lgC, моль/ л (а) (б) Рис.3. Градуировочные зависимости метафоса (а, фосфатный буферный раствор, рН 7.9, инкубирование 10 мин, субстрат БХИ 0.002 моль/л) и CuCl2 (б, трис-буферный раствор, рН 6.0, без инкубирования, субстрат ацетилхо лин хлорид 0.002 моль/л) Поведение холинэстеразного биосенсора в многокомпонентных рас творах. Присутствие обратимых эффекторов фермента подавляет необратимое ингибирующее действие фосфорорганических пестицидов независимо от того, активатором (соли алюминия) или ингибитором (соли меди, фториды) является эффектор в отношении нативной ХЭ. Относительное снижение степени ингиби рования определяется природой эффектора и его устойчивостью в водном рас творе. Ионы металлов, ингибирующее действие которых зависит от накопления гидроксо-формы МеОНn+, проявляют слабое защитное действие с максимум в слабощелочной области. Напротив, фторид-ионы, устойчивые в широком диапа зоне рН, в наибольшей степени подавляют ингибирование фосфорорганических пестицидов (рис.4).

М етафос 60 М етафос I,% I,% М етафос + Al М етафос 75 + NaF 0 5.5 6.5 7.5 5 5.4 5.8 6.2 6.6 -lgC, моль/ л -lgC, моль/ л (а) (б) Рис.4. Защитное действие эффекторов ХЭ при определении метафоса: а). Влия ние 0.002 М. KAl(SO4)2. Трис-буферный раствор, рН 6.5. ХЭ иммобили зована на бумаге. Субстрат ацетилхолин хлорид 0.002 моль/л;

б). Влия ние 3…10-4 моль/л NaF. Фосфатный буферный раствор, pH 7.9, субстрат БХИ 0.002 моль/л В тех случаях, когда молекула ингибитора имеет несколько центров свя зывания с ферментом, защитный эффект может проявляться и в отсутствие эф фекторов фермента. Так, гидразониевые соли диалкилфосфитов и диалкилди тиофосфатов проявляют слабое обратимое ингибирующее действие с максиму мом в слабокислой области (рН 6.0-6.5). Ингибирующее действие солей уменьша ется с увеличением объема радикала при атоме фосфора: C2H5 н-C3H7 i-C3H7. С переходом от гидразониевых производных бензальдегида (В-1, В-2, В-3) к про изводным коричного альдегида (С-1, С-2, С-3) обратимое ингибирующее дейст вие усиливается. Электрохимическое окисление дитиофосфатного фрагмента до фосфорильного аналога увеличивает общее ингибирующее действие и наклоны градуировочных графиков, особенно для производных бензальдегида. Соответст вующие пределы обнаружения составляют n(10-4-10-5) моль/л. При этом было об наружено явление "памяти" биосенсора: если после инкубирования биосенсора в растворе гидразониевой соли провести измерение отклика, промыть мембрану и повторить измерение отклика без дополнительного инкубирования, наблюдается дополнительное уменьшение отклика: гидразониевый катион выступает как эф фектор, защищая активный центр ХЭ от фосфорилирования. Промывка удаляет подвижный катион из мембраны, в результате чего необратимое ингибирующее действие усиливается (рис.5).

100 (a) (б) I,% I,% 3.6 4 4.4 4. 1.8 2.3 2.8 3. - lgC, моль/ л - lgC, моль/ л Рис.5. Ингибирующее действие С-2 (a) и С-3 (б) до (1) и после (2) отмывки био сенсора после инкубирования. Фосфатный 0.002 М. буферный раствор, рН 6.0. Субстрат БХИ 0.002 моль/л Иммобилизация ХЭ повышает ее устойчивость в отношении органиче ских растворителей. В растворе ХЭ полностью инактивируется в присутствии 20% этанола и ацетона, при иммобилизации на бумаге и нейлоне активность фермента сохраняется при содержании растворителей до 30%, причем присутст вие до 25% органических растворителей не влияет на градуировочные графики фосфорорганических пестицидов. Это позволяет определять остаточные количе ства пестицидов в растительном материале после их экстракции без удаления органического растворителя. Исключение составляет тетрахлорид углерода. В его присутствии чувствительность определения пестицидов несколько увеличи вается, а фторидов - снижается. При этом резко сокращается время жизни фер ментсодержащей мембраны и эффективность реактивации фермента после инги бирования (рис.6).

буферный раствор I, % + 5% ацетона + 10% этанола 75 + 8% CCl +8%CCl 7.8 8.5 9.2 9.9 10. - lgC, моль/ л Рис.6. Влияние органических растворителей на ингибирующее действие корала.

ХЭ иммобилизована на нейлоне. Фосфатный буферный раствор, рН 7.9.

Субстрат БХИ 0.002 моль/л. Инкубирование 10 мин.

Напротив, действие ингибирующее действие фторидов в присутствии 20 25% этанола незначительно снижается при сохранении наклона градуировочно го графика. По-видимому, указанные изменения также связаны с гидрофильно гидрофобными свойствами мембраны и ингибиторов.

Экспертная оценка загрязненности сточных вод. Многообразие факто ров, определяющих отклик холинэстеразного биосенсора позволяет предложить его для оценки общей загрязненности тестируемого образца аналогично другим методам биотестирования. Совместно с сектором биотестирования Центральной специализированной инспекции аналитического контроля Минприроды РТ нами был проведен скрининг антихолинэстеразной активности промышленных сточ ных вод г.Казани и приказанского региона. Несмотря на отсутствие в пробах пестицидов, более 70% всех проб показали ингибирующее действие, связанное, по-видимому, с присутствием обратимых органических и неорганических инги биторов ХЭ. Сравнение с результатами определения острой токсичности вод для равноресничных инфузорий Paramecium caudatum (экспозиция 1 ч.) позволило разделить все воды на три условные группы. Сточные воды предприятий маши ностроительного комплекса, кожевенного объединения и др., содержащие боль шие количества солей тяжелых металлов, показывают умеренное ингибирование ХЭ (до 60%) и смертность парамеций (40-80%). Небольшая часть проб показала токсичность для парамеций при отсутствии или незначительном (менее 20%) ин гибировании отклика биосенсора. Это сточные воды небольших муниципальных предприятий, мясокомбината, завода по переработке шерсти и других предпри ятий, загрязненые преимущественно органическими соединениями, в том числе нефтепродуктами и жирами. Третью группу составили сточные воды, для кото рых наблюдалась умеренная антихолинэстеразная активность (ингибирование до 40%), но отсутствовала токсичность для парамеций (ливневой сток в сельской местности, сточные воды сельскохозяйственных предприятий и предприятий химической промышленности).

По результатам предварительных испытаний была предложена экспертная система продукционного типа для оценки источника сточных вод по трем клас сам - преимущественное загрязнение вод тяжелыми металлами, устойчивыми органическими соединениями и лабильными органическими соединениями и биогенными элементами.

Классификацию сточных вод поводили на выборке из 175 элементов (проб сточных вод) по пяти независимым переменным, включающим показатели БПК5, ХПК, антихолинэстеразную активность до и после электрохимической обработки вод, токсичность для парамеций. Внутригрупповой статистический анализ показал отсутствие корреляций между данными показателям и нормаль ное распределение всех независимых переменных. Для построения экспертной системы использовали три метода - дискриминантный анализ, нейронные сети прямого распространения и нейронные сети, основанные на теории адаптивного резонанса (Fuzzy ART Map).

Дискриминантный анализ не позволил осуществить классификацию вы борки. При построении дискриминантных функций на всей выборке успешный прогноз класса достигается лишь в 48% случаев при априорной вероятности 33%, причем третий класс вообще не выделяется. При объединении второго и третьего класса (органическое загрязнение вод) успешный прогноз составил 59% при априорной вероятности 50%. Одна из причин низкой эффективности линей ных регрессионных методов явилась большая разнородность исходных данных, что в сочетании с небольшим размером выборки не позволяет однозначно про извести задачу классификации выборки. Для получения нелинейных классифи цирующих функций была использована искусственная нейронная сеть прямого распространения, состоящая из пяти входных нейронов, двух невидимых слоев по 9 и 5 нейронов соответственно и трех (двух) выходных нейронов. Результаты классификации при обучении нейронной сети на полной выборке (175 элемен тов) приведена в табл.4.

Таблица Классификация элементов выборки по трем классам методом нейронных сетей прямого распространения Реальный Предсказанный класс, % класс 1 2 1 21 2 24 3 27 17 В целом по всей выборке успешный прогноз реализуется в 79% случаев и 83% - при делении выборки на два класса (неорганическое и органическое за грязнение). При этом проверка производилась на тех же элементах, что и обуче ние нейронной сети.

Учитывая высокую разнородность данных, для проверки предсказатель ной способности экспертной системы был использован более эффективный для малых выборок вариант искусственных нейронных сетей Fuzzy ART Map, осно ванный на теории адаптивного резонанса. Первоначально случайным образом было проведено разделение исходной выборки на обучающую (150 элементов) и контрольную (25 элементов), после чего проведилось обучение нейронной сети на обучающей выборке и оценка успешности прогноза на контрольной. Резуль таты обучения зависели от способа генерирования выборок, что явилось следст вием небольшого объема исходной выборки. В табл.5 приведена сравнительная характеристика результатов классификации (оценка успешности прогноза на не зависимой выборке) по всем трем методам. Как видно, в равных условиях Fuzzy ART Map демонстрирует в большинстве обучающих выборок лучшие результа ты по сравнению с другими методами классификации. Оценка успешного про гноза не менее чем на 20% выше, чем в дискриминантном методе и на 4-12 % выше, чем при использовании нейронной сети прямого распространения. Кроме того, даже при близкой эффективности Fuzzy ART Map и нейронной сети пря мого распространения в последней успешность прогноза достигается за счет ди агностики загрязнения тяжелыми металлами (1 класс), а 3 класс практически не определяется. Так, вероятность правильного определения 3 класса в выборках №2-5,8,12,17 равна 0%, в выборках 1,6,11,14,17 - менее 25%.

Таблица Оценка эффективности экспертных систем классификации сточных вод на три класса загрязненности различными статистическими методами № Оценка успешного прогноза,% выборки Fuzzy ART Map нейронная сеть прямого дискриминантный распространения анализ 1 68 68 2 72 60 3 64 68 4 68 68 5 76 52 6 76 64 7 68 60 8 64 68 9 72 68 10 64 64 11 64 60 12 68 64 13 64 56 14 68 64 15 64 64 16 64 72 17 64 64 18 64 68 19 64 56 ВЫВОДЫ 1. Разработан биосенсор на основе плоского стеклянного рН-метрического элек трода и бутирилхолинэстеразы, иммобилизованной на бумажной, нитратцеллю лозной и нейлоновых сменных мембранах, который позволяет детектировать присутствие фосфорорганических пестицидов на уровне n(10-1-10-2) ПДК. Дос тигнутые пределы обнаружения составили 110-8110-10 моль/л.

2. Чувствительность определения ингибиторов холинэстераз определяется гид рофобностью носителя фермента. Добавки неионогенных поверхностно активных веществ (ПЭГ, Тритон-Х-100, Твин) оказывают дифференцирующее действие на поведение биосенсора в многокомпонентных растворах: в их при сутствии необратимое ингибирующее действие пестицидов усиливается, тогда как обратимое ингибирующее действие ионов металлов, фторидов остается не изменным или снижается. Присутствие n10-2% СПАВ подавляет защитное дей ствие обратимых ингибиторов, снижающих чувствительность определения пес тицидов.

3. Иммобилизация холинэстеразы повышает устойчивость фермента к поляр ным органическим растворителям. Присутствие 10-25% этанола и ацетона ока зывает незначительное влияние на аналитические характеристики определения обратимых и необратимых ингибиторов холинэстеразы, присутствие 8% тетра хлорида углерода снижает пределы обнаружения необратимых ингибиторов при постоянстве аналитических характеристик определения обратимых ингибиторов.

4. Разработана методика определения кинетических параметров необратимого ингибирования и оценки влияния поверхностных факторов (сорбция, массопе ренос компонентов ферментативной реакции).

5. Скрининг токсичности промышленных сточных вод г. Казани и приказанско го региона показал антихолинэстеразную активность у более чем 70% проб и токсичность для Paramecium caudatum у 20-30% проб. Проведен анализ показа телей токсичности вод в зависимости от содержания загрязняющих веществ и основных гидрохимических показателей вод.

6. Разработана система экспертной оценки загрязненности сточных вод по пока зателям антихолинэстеразной активности, токсичности для парамеций, БПК и ХПК, выявляющая позволяющая определить характер загрязнения вод (соли тя желых металлов, устойчивые и неустойчивые органические загрязнители).

6. Проведена сравнительная оценка методов построения системы экспертной оценки загрязненности вод по характеру загрязнения методами дискриминант ного анализа, искусственных нейронных сетей прямого распространения и Fuzzy ART Map. Показано, что применение нейрокомпьютерных технологий позволяет достичь 80% вероятности успешного прогноза характера загрязнения по обоб щенным показателям.

Основное содержание работы

изложено в следующих публикациях:

1. Evtugyn G.A., Rizaeva E.P. The application of inhibitor biosensors in local pro grammes of environmental monitoring./ NATO Advanced Research Workshop "Bio sensors for direct monitoring of environmental pollutants in field", Smolenice, Slova kia, 1997, P. 69.

2. Evtugyn G.A., Rizaeva E.P., Stepanova N.Ju., Petrov A.M. Preliminary testing of waste and sewage waters based on cholinesterase biosensor.// Environ. Radiology Ap plied Ecology. 1997. V.3. №1. P.7-12.

3. Evtugyn G.A., Rizaeva E.P., Stoikova E.E., Budnikov H.C. The application of cholinesterase potentiometric biosensor for preliminary screening of the toxicity of waste waters. // Electroanalysis. 1997. V.9. N 14. 1124-1128.

4. Evtugyn G.A., Rizaeva E.P., Petrov A.M., Stepanova N.Ju. Сholinesterase based biosensors for preliminary testing of waste waters./ ACS Annual Meeting "Biosensors in Environmental Monitoring" San-Francisco, April 1997. P.G-07.

5. Евтюгин Г.А., Ризаева Е.П., Петров А.М., Степанова Н.Ю. Экспресс диагностика загрязнения сточных вод г.Казани с помощью ферментного биосен сора./ "Актуальные экологические проблемы РТ" Тез.докл.респ. конф. г.Казань, 1997. С.288-289.

6. Evtugyn G.A., Saveliev A.A., Rizaeva E.P., Budnikov H.C. Non-selective potenti ometric biosensors for the control of waste waters: artificial neural network approach./ ESEAC’98. 7th European Conference of Electroanalysis. Book of Abstr. Coimbra 1998. P.189.