авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Аспорогенный рекомбинантный штамм bacillus anthracis – продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба

На правах рукописи

Шулепов Дмитрий Викторович АСПОРОГЕННЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ BACILLUS ANTHRACIS – ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА 03.00.07 - микробиология 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов – 2009

Работа выполнена в ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противо чумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич Кандидат медицинских наук Микшис Наталья Ивановна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, доцент Бойко Андрей Витальевич Доктор медицинских наук, профессор Еременко Евгений Иванович

Ведущая организация: ФГУЗ " Волгоградский научно-исследовательский проти вочумный институт"

Защита состоится "_" _ 2009 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208. 078. 01 по защите диссертаций на соискание уче ной степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ "Российский научно исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г.

Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ "Российский на учно-исследовательский противочумный институт "Микроб".

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Сибирская язва - особо опасное зооантропонозное заболевание. Возбудите лем инфекции является грамположительный спорообразующий микроорганизм Bacillus anthracis, принадлежащий к роду Bacillus. Вследствие чрезвычайной рези стентности к воздействию повреждающих факторов, споровые формы бактерий способны длительно сохраняться в объектах внешней среды. При попадании в ор ганизм человека или восприимчивого животного споры B. anthracis прорастают и инициируют развитие инфекционного процесса.

Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются многочислен ные случаи сибиреязвенной инфекции. Эпидемическая обстановка по сибирской язве находится в прямой зависимости от эпизоотической ситуации (Бургасов П.Н., 1984). К увеличению эпидемических проявлений может привести расширение но зоареала патогенного микроорганизма, ухудшение ветеринарного контроля за ско томогильниками и сельскохозяйственным сырьем, снижение масштабов иммуниза ции сельскохозяйственных животных и населения групп риска (Черкасский Б.Л. с соавт., 2002). Кроме того, необходимо помнить о трагичном опыте и возможности использования сибиреязвенного микроба в качестве биологического агента для со вершения террористических актов и создания оружия массового поражения (Spencer R., Wilcox M., 1993;

Jernigan J. et al., 2001;

Bush L. et al., 2001;

Spencer R., Lightfoot N., 2001;

Brachman P., 2002).

В реализации патогенного действия сибиреязвенного микроба ключевая роль отводится полиглютаминовой капсуле и бифункциональнуму экзотоксину. Капсула защищает бактериальные клетки от фагоцитоза, способствуя их размножению и накоплению в организме хозяина. Экзотоксин, состоящий из протективного анти гена (ПА), отечного (ОФ) и летального (ЛФ) факторов, запускает основные звенья патогенеза сибиреязвенной инфекции. При взаимодействии протеолитически акти вированного ПА с ОФ и ЛФ образуются токсичные комплексы, оказывающие по вреждающее действие на клетки макроорганизма (Leppla S., 1991;

Singh Y. et al., 1989).

За синтез и регуляцию компонентов экзотоксина отвечают гены, входящие в состав плазмиды pXO1 (182 т.п.н.). Образование капсулы кодируют детерминанты, расположенные на внехромосомном репликоне pXO2 (93,5 т.п.н.) (Mikesell P. et al., 1983;

Uchida I. et al., 1985;

Okinaka R. et al., 1999). Вакцинные штаммы, лицензиро ванные для использования в медицине (B. anthracis СТИ-1) или ветеринарии (B.

anthracis Sterne34F2, B. anthracis 55), в процессе аттенуации утратили плазмиду pXO2. Результатом элиминации pXO2 стало резкое снижение их вирулентности.

Чувствительные к фагоцитозу микробные клетки неспособны реализовать свое па тогенное действие. Иммуногенность вакцинных штаммов обеспечивается, главным образом, протективным антигеном (ПА) - одним из компонентов экзотоксина. На основе ПА в середине прошлого столетия ученые разработали химическую вакци ну для иммунопрофилактики людей (Wright G. et al., 1954).

В производстве лицензированных бесклеточных препаратов продуцентами ПА служат аттенуированные штаммы B. anthracis. В специальных условиях выра щивания они экскретируют сибиреязвенный токсин. Опыт выделения ПА из куль туральных фильтратов аттенуированных штаммов B. anthracis показал, что полного разделения компонентов сибиреязвенного токсина, имеющих лишь небольшие от личия в значениях молекулярных масс (ПА - 83 кДа, ОФ - 89 кДа, ЛФ - 85 кДа), достигнуть практически невозможно. Данное обстоятельство неблагоприятно ска зывается на свойствах выпускаемых в настоящее время химических вакцин. По данным медицинских наблюдений в США у 30 % людей, вакцинированных против сибирской язвы, наблюдаются локальные реакции в виде аллергических проявле ний или даже некроза тканей (Swanson-Biearman B., Krenzelok E., 2001). Еще одной проблемой промышленного получения ПА является его выраженная деградация на этапах выделения и очистки, что связано с высокой активностью протеолитических ферментов большинства культур B. anthracis.

С развитием генно-инженерных технологий стало возможным получение ре комбинантных штаммов, продуцирующих только один компонент токсина – ПА.

Известно много прецедентов клонирования детерминанты синтеза ПА (pag) в штаммах различных видов бактерий, а также в геномах вирусов и трансгенных рас тений (Тедиков В.М., Добрица А.П., 1993;

Алимов А.П., Павлов В.М., 1995;

Дар мов И.В. с соавт., 1999;

Vodkin M., Leppla S., 1983;

Ivins B., Welkos S., 1986;

Iacono Connors L. et al., 1991;

Coulson N. et al., 1994;

Baillie L. et al., 1998;

Zegers N. еt al., 1999;

Barnard J., Friedlander A., 1999;

Gupta P. et al., 1999;

Cohen S. et al., 2000;

Chauhan V. et al., 2001;

Garmory H. et al., 2003;

Azhar A. et al., 2002;

Hull A. et al., 2005;

Chichester J. et al., 2007;

Stokes M. et al., 2007). Однако далеко не во всех слу чаях авторам удалось добиться стабильного функционирования гибридных плаз мид в гетерологичных системах. Проблематичным оказалось и достижение доста точно высокого уровня продукции ПА.

Ранее в лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ "Микроб" были созда ны генно-инженерные штаммы, продуцирующие ПА (Микшис Н.И. с соавт., 2007).

Посредством встраивания участка pXOl, содержащего ген pag, детерминирующий синтез ПА сибиреязвенного микроба, в мультикопийный вектор pUB110 по сайтам рестрикции BamH1 была сконструирована гибридная плазмида pUB110PA и селек тирован ее делеционный вариант pUB110PA-1. Плазмида pUB110PA-1 стабильно функционировала в геномах бациллярных штаммов B. anhtracis СТИ Т, В. anth racis 55 Т и В. subtilis WB600, обеспечивая продукцию ПА на уровне до мкг/мл, что в несколько раз превышает секретируемый синтез данного белкового продукта, зарегистрированный для вакцинных штаммов B. anthracis.

С позиций биологической и экологической безопасности в промышленном производстве химических сибиреязвенных вакцин предпочтительнее использова ние штаммов-продуцентов, не образующих спор. Анализируя отечественный и за рубежный опыт создания бациллярных продуцентов ПА, выявили лишь единичные случаи получения их аспорогенных вариантов. Самой перспективной оказалась конструкция на основе рекомбинантного штамма B. anthracis Sterne-1(рPA102) (Worsham P., Sowers M., 1999). Хотя селектированный в его популяции спонтанный аспорогенный мутант отличался выраженной протеолитической активностью, до биться приемлемого выхода очищенного ПА (20 - 30 мкг/мл) удалось за счет кор рекции условий его культивирования (Farchaus J. et al., 1998). В США зарегистри рован патент на метод приготовления химической вакцины на основе ПА, проду цируемого аспорогенным штаммом B. anthracis Sterne-1(рPA102)CR4 (Ivins B. et al., 2002). Отечественных аналогов продуцентов для безопасной и экологичной технологии выделения ПА не существует.

Все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертацион ной работы, целью которой является: получение стабильного аспорогенного ре комбинантного штамма B. anthracis и оценка его в качестве продуцента протектив ного антигена сибиреязвенного микроба.

Задачи исследования:

Получить рекомбинантный штамм с клонированным геном pag, яв 1.

ляющийся продуцентом протективного антигена сибиреязвенного микроба и ха рактеризующийся отсутствием способности к образованию спор.

Оценить стабильность биологических свойств аспорогенного реком 2.

бинантного штамма-продуцента в условиях хранения и при культивировании на питательных средах.

Провести оценку уровня продукции протективного антигена сконст 3.

руированного штамма, сравнить с уровнями продукции вакцинных культур.

Оптимизировать условия культивирования аспорогенного рекомби 4.

нантного штамма, разработать экспериментальную схему выделения и хромато графической очистки протективного антигена из его культурального фильтрата.

Получить высокоочищенный препарат рекомбинантного протективно 5.

го антигена, осуществить его биохимическую и иммунохимическую характеристи ку.

В экспериментах in vivo показать перспективность использования ре 6.

комбинантного протективного антигена в создании профилактических сибиреяз венных препаратов.

Получить поликлональные антитела к рекомбинантному ПА и оценить 7.

возможность их применения для постановки иммунохимических реакций.

Научная новизна исследования:

Впервые на основе бесплазмидного производного отечественного вакцинно го штамма B. anthracis 55 получен аспорогенный рекомбинантный продуцент про тективного антигена сибиреязвенного микроба. Штамм стабильно наследует гиб ридный репликон pUB110PA-1 и не реверсирует к спорообразующему фенотипу.

Сконструированный штамм не содержит гены, детерминирующие синтез факторов вирулентности B. anthracis, и характеризуется низкой активностью про теолитических ферментов. Перспективы его использования в качестве продуцента протективного антигена связаны с отсутствием риска контаминации помещений и оборудования спорами B. anthracis.

Аспорогенный бациллярный штамм с клонированным геном pag - B.

anthracis 55 TПА-1Spo-, продуцирует в 4 раза больше протективного антигена, чем вакцинный штамм B. anthracis 55.

Биологические характеристики протективного антигена, синтезируемого штаммом B. anthracis 55 TПА-1(Spo-), позволяют предложить его в качестве ос новного компонента современных химических и комбинированных сибиреязвен ных вакцин. Установлено, что двукратная иммунизация кроликов дозой 50 мкг очищенного препарата протективного антигена, выделенного из аспорогеннного рекомбинантного штамма B. anthracis 55 TПА-1Spo-, обеспечивает защиту 100 % животных от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1.

Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтвержде на патентом Российской Федерации на изобретение: № 2321629 - аспорогенный ре комбинантный штамм B. anthracis 55 ТПА-1 Spo- (pUB110PA-1) - продуцент про тективного антигена сибиреязвенного микроба.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован рекомбинантный штамм - B. anthracis 55 TПА-1Spo- (КМ97) - стабильный аспо рогенный продуцент протективного антигена возбудителя сибирской язвы.

Штамм и иммунные сыворотки к ПА использовались при выполнении гене тических, молекулярно-генетических, молекулярно-биологических, биохимических и других исследований по плановым НИР: "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (№ Гос. регистрации 0.1.200.208130, 2002 - 2004 гг.), «Ис пользование препаратов протективного антигена и белков S-слоя для создания средств диагностики и профилактики сибирской язвы» (№ Гос. регистрации 0120. 603179, 2006-2008 гг.), а также в совместных исследованиях с отделом профилак тических препаратов РосНИПЧИ "Микроб".

По материалам диссертации составлены методические рекомендации "Ком плекс методических подходов к определению продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба", одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого совета Рос НИПЧИ "Микроб" №2 от 17.04.06 г.) Материалы диссертации используются в лекциях по генетике бактерий на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов при Рос НИПЧИ «Микроб» и биотехнологическом факультете Саратовского Государствен ного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

Получен аспорогенный рекомбинантный продуцент протективного ан 1.

тигена - B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-). При пассировании in vitro штамм сохраняет свойство аспорогенности и способность к репликации гибридной плазмиды. Ре комбинантный штамм содержат структурный ген pag в составе гибридного репли кона pUB110PA-1 и не содержат детерминанты, кодирующие синтез основных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы.

Уровень продукции протективного антигена аспорогенным генно 2.

инженерным штаммом составляет около 80 мкг/мл, что в 4 - 5 раз больше значе ний, установленных для вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55.

Из сконструированного штамма B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-) выделен 3.

белковый препарат, на основании биохимических, иммунохимических и иммуно логических характеристик являющийся протективным антигеном сибиреязвенного микроба. Получены поликлональные антитела к рекомбинантному протективному антигену, перспективные для осуществления диагностических исследований.

Протективный антиген, синтезируемый аспорогенным рекомбинантным 4.

продуцентом, является биологически активным. Двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного продукта обеспечивает защиту 100 % кроли ков от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма возбудителя сибирской яз вы.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всероссий ской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - ХХI век» (Саратов, 2004);

Всероссийской научно-практической конференции молодых уче ных и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005);

VI Межго сударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопастности и противо действия биологическому терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005);

Российском медицинском форуме "Фундаментальная наука и практика" (Москва, 2006 г.);

IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007);

Межгосударственной научно практической конференции «Международные медико-санитарные правила и реа лизация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государст вах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), а также на научных конференциях РосНИП ЧИ "Микроб" (Саратов, 2005-2008).

Публикации. Основное содержание работы

отражено в 12 научных публи кациях, из них - 1 статья в рекомендованных ВАК изданиях, 1 патент и 10 тезисов, в том числе 6 тезисов в сборниках международных и Российских конференций.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка при нятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 5 глав собственных иссле дований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 39 отечествен ных и 95 зарубежных источников. Общий объем диссертации составляет 124 стра ниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 5 таблицами и 18 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы. При проведении собственных исследований было использованы: вакцинные штаммы (pXO1+pXO2-) - B. anthracis СТИ-1 (Государст венный институт стандартизации и контроля (ГИСК) им. Л.А. Тарасевича, г. Мо сква) и B. anthracis 55 (НИИ микробиологии МО РФ, г. Киров);

бесплазмидные производные (pXO1-pXO2-) - В. anthracis СТИ Т (КМ56-1), В. anthracis 55 Т (КМ92(2)) и 55 TSpo- (КМ92(3)) (Государственная коллекция патогенных бактерий (pXO1-pXO2 «Микроб» (ГКПБ «Микроб»));

рекомбинантные штаммы pUB110PA-1+) - В. anthracis СТИ ТПА-1 (КМ96);

В. anthracis 55 ТПА-1 (КМ95), B. subtilis WB600ПА-1 (КМ199) (ГКПБ «Микроб») и 55ДТПА-1Spo- (КМ97) (полу чен в ходе настоящего исследования);

высоковирулентный тест-заражающий штамм (pXO1+pXO2+) - В. anthracis 81/1 (ГКПБ «Микроб»).

В работе по определению специфичности поликлональных антител к ПА ис пользовали следующие культуры: B. anthracis Pasteur, Sterne34F2, Ихтиман, Wright, 17JB, 2-ая вакцина Ценковского (71/12);

B. cereus 569, др-7, 336, 8, 96, 104, 108, 1;

B. subtilis 35, 36, 38, 168, 430, 350, 33, IE-20, IE-21, IE-26, IE-4, BD366, BD407, WB600;

B. thuringiensis 482/3, 8а, 15а, 351, 2090, 19/31, 482/7, 35 v. galeriae, 17/5, 48, toumanoffi, 13M v. galeriae, 10M v. finitimus, 10B v. finitimus, tompsoni 11M;

B. me gaterium 5;

B. mesentericus 5;

B. mycoides 2, 10;

B. stearotermophylus;

B.

licheniformis.

В качестве питательных сред использовали бульон BHI («Difco», США), бульон и агар Хоттингера, L-бульон и L-агар (Маниатис Т. с соавт., 1984), в кото рые при необходимости канамицин (25 или 50 мкг/мл). Для выделения сибиреяз венного токсина штаммы B. anthracis выращивали на среде (S-бульоне), предло женной J. Farchaus et al. (1995). Реакцию радиальной диффузионной преципитации ставили на казаминовой среде C. Thorne, F. Belton (1957) с добавлением сибиреяз венного -глобулина или кроличьих анти-ПА антител кроличьих антител к ПА – ( мл/25 мл среды). Определение протеолитической активности проводили на ори гинальной среде с казеином (Микшис Н. И. с соавт., 2003).

В опытах по определению иммуногенности использовали морских свинок весом 300 - 350 г, беспородных белых мышей или мышей линии BALB/с весом 18 20 г. Для получения специфических антител к белковым препаратам использовали кроликов весом от 2,5 до 3 кг.

Микробиологические и иммунологические методы. Определение видовых признаков сибиреязвенных штаммов проводили согласно регламентирующему до кументу - «Инструкции и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей» (М., 1980). Для определения протеолитической активности не более 16-ти изолированных колоний суточной агаровой культуры B. anthracis наносили на поверхность пластинки ага ра, инкубировали при температуре 37 0С в течение 24 часов и регистрировали ши рину зоны лизиса вокруг колоний. Способность к споруляции определяли сравне нием жизнеспособности прогретых (при температуре 65 0С в течение 30 минут) и непрогретых культур. Дополнительно способность к образованию спор проверяли при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля.

Подготовку споровой взвеси сибиреязвенных культур и определение ЛД штаммов B. anthracis проводили согласно регламенту производства №831-98 вак цины сибиреязвенной живой, а также в соответствии с методическими рекоменда циями - «Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей» (2002). Для определения протективных свойств получен ного препарата ПА кроликов, в количестве 10 штук на одну группу, иммунизиро вали препаратом очищенного рекомбинантного ПА в дозе 50 мкг двукратно с ин тервалом в 14 суток. Препарат вводили подкожно в объеме 1 мл в сочетании с пол ным адьювантом Фрейнда (в объемных соотношениях 1:1). Через 21 день живот ных заражали 50 ЛД50 высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1 однократно, подкожно, в объеме 0,5 мл.

Анти-ПА антитела получали из сывороток кроликов, иммунизированных очищенным препаратом ПА в дозе 50 мкг семикратно с интервалом в 1 неделю.

Генетические и молекулярно-генетические методы. Электростимулируемую трансформацию штаммов B. anthracis проводили по методике С.А. Еремина с со авт. (1990). Выделение гибридных плазмид из штаммов B. anthracis осуществляли модифицированным способом C. Kado and S. Liu (1981). Результаты электрофоре зов в агарозном геле сканировали с помощью гель-документирующей системы Vi Tran (Биоком, Россия). Полимеразную цепную реакцию в модификации И.В. Туч кова с соавт. (1991) осуществляли на программируемом амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) с диагностическими праймерами на последовательно сти гена pag. Рестрикцию выделенной плазмидной ДНК проводили в соответствии с рекомендациями фирмы производителя ферментов Sigma (США) или MBI Fermentas (Литва). Стабильность гибридных плазмид оценивали согласно методи кам, предложенным J. Barnard, A. Friedlander (1999) и S. Cohen et al. (2000).

Биохимические методы. Электрофоретическое разделение протеинов осуще ствляли в 10 % полиакриламидном геле в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 50 мА в течение 5 часов. Концентрацию белка в препаратах опреде ляли общепринятыми методами: по М. Брэдфорду (Практическая химия белка, 1989) и спектрофотометрически (Скоупс Р., 1985). Хроматографическую очистку ПА проводили согласно рекомендациям C. Quinn et al. (1988) с модификациями.

Бульонную культуру штамма B. anthracis 55ДТПА-1(Spo-), выращенную в течение 18 часов при температуре 37 0С в S-бульоне с канамицином (25 мкг/мл), фильтро вали через мембранные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0,22 мкм. Ох лажденный фильтрат концентрировали в 10 раз на установке "Амикон" (США) с картриджем (Millipore, США), имеющим предел исключения белков с молекуляр ной массой 30 кДа, и диализовали 18 часов против 10 объемов буфера (25 мМ ди этаноламина, 50 мМ хлорида натрия, 2 мМ ЭДТА, 30 мМ хлорида калия (pH 8,9)).

Иионобменную хроматографию проводили на колонке с Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США). Полученный препарат вновь концентрировали в 10 раз на установке "Амикон", диализовали при тех же условиях и фильтровали через мембранные фильтры. Высокая степень очистки препарата ПА достигалась за счет последую щих этапов гель фильтрации на сефакриле 300 НR в буфере, содержащем 0,1 М ос новного триса, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ хлорида натрия (рН 8,0). Пробы, соответст вующие пику поглощения белка ПА, собирали, концентрировали в 5 раз и фильт ровали, как описано выше. Образцы хранили аликвотами при температуре – 70 0С.

Иммунохимические методы. Для анализа иммуноспецифичности препарата проводили иммуноблотинг по методу H. Towbin et al. (1979). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (Amersham, США) проводили при силе тока 0,4 А и напряжении 100 V в течение 1,5 часов. Титр антител к протективному антигену в сыворотках иммунизированных животных и количественную оценку уровня продукции ПА рекомбинантными штаммами определяли с помощью дот анализа и твердофазного ИФА (Фримель Г., 1987).

Экспериментальные материалы обрабатывали посредством статистических методов, описанных И.П. Ашмариным, А.А. Воробьевым (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Клонирование гена, определяющего синтез ПА сибиреязвенного микроба, сопряжено с преодолением трудностей, связанных в первую очередь со стабильно стью воспроизведения и функционирования детерминанты в гетерологичных сис темах. Помимо этого, конструирование рекомбинантных продуцентов ПА на осно ве бациллярных штаммов неизбежно сталкивается с проблемой выраженной ак тивности протеолитических ферментов большинства представителей рода Bacillus, а также их способности к образованию спор в условиях культивирования in vitro.

В этой связи, в качестве первоочередной задачи настоящего исследования определено конструирование стабильного аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis, сочетающего высокую продукцию протективного антигена с низкой активностью протеолитических ферментов.

Для успешного решения поставленной задачи имелись предпосылки: нали чие аспорогенного реципиентного штамма B. anthracis и гибридной плазмиды pUB110PA-1 со встроенным геном pag.

Не образующий спор спонтанный мутант был селектирован ранее в популя ции бесплазмидного производного вакцинного штамма B. anthracis 55, характери зующегося низкой активностью протеолитических ферментов. Аспорогенность штамма B. anthracis 55 TSpo- (КМ92(3)) сохранялась при культивировании in vitro и в процессе хранения (Микшис Н.И. с соавт., 2003).

Гибридная плазмида pUB110PA-1 (6,5 т.п.н.), содержащая интактный ген pag, получена на основе мультикопийного вектора pUB110. Функционирование данного репликона в бациллярных штаммах отличалось стабильностью и обеспе чивало выраженную эспрессию гена, детерминирующего синтез ПА сибиреязвен ного микроба (Микшис Н.И. с соавт., 2007).

ДНК плазмиды pUB110PA-1 выделяли из спорообразующего рекомбинант ного штамма В. anthracis СТИ ТПА-1. Полученный препарат плазмидной ДНК после определения электрофоретической подвижности, концентрации и осуществ ления рестрикционного анализа использовали в экспериментах по электростиму лируемой трансформации.

Культуру реципиентного штамма В. anthracis 55 ТSpo- выращивали в буль оне до середины логарифмической фазы роста при температуре 37 0С. В одном случае в соответствии с рекомендациями авторов методики перед электропорацией проводили обработку клеток пенициллином, в другом - этот дополнительный этап опускали. После стимуляции электрическим разрядом трансформационную смесь в течение 2-х часов инкубировали при температуре 37 0С, а затем высевали на твер дую питательную среду с селективным антибиотиком. В результате были получены антибиотикорезистентные трансформанты. Эффективность трансформации не за висела от использования пенициллина и составила приблизительно 30 КОЕ/мкг ДНК.

Трансформанты переносили методом реплик на чашки со специальной сре дой, содержащей антитела к ПА. После инкубации в течение 16 часов в атмосфере CO2 и в течение 24 часов при комнатной температуре вокруг посевов образовыва лись зоны радиальной преципитации шириной около 6 – 8 мм.

Факт переноса плазмиды подтверждали данными электрофоретического разделения ДНК в агарозном геле (рис. 1,А). Наличие клонированного гена pag результатами ПЦР-анализа. ПЦР-анализ с "диагностическими" праймерами на по следовательности гена pag подтвердил его присутствие в трансформантах B.

anthracis 55ДТПА-1Spo- (рис. 1,Б).

А Б 1234567 pUB110РА- Рисунок 1. А - Результаты исследования плазмидных профилей клонов трансформантов, получивших в результате генетического переноса плазмиду pUB110PA-1. 1 – 4 – клоны аспорогенных трансформантов;

5 – бесплазмидный ре ципиент;

6 – ДНК плазмиды pUB110PА-1;

7 - маркеры молекулярных масс – ДНК фага л/EcoRI + HindIII. Б - Результаты ПЦР-анализа с "диагностическими" прай мерами на последовательности гена pag. 1 - маркеры молекулярных масс – ДНК фага л/EcoRI;

2 – реципиентный штамм;

3 – 5 – клоны аспорогенных трансформан тов.

Важно, что после введения чужеродной наследственной информации клоны трансформантов сохраняли свойства, присущие реципиентному штамму - аспоро генность и низкую активность протеолитических ферментов.

Определение стабильности репликации pUB110PA-1 в аспорогенном штам ме проводили с применением схемы последовательных пассажей в жидкой пита тельной среде с канамицином. Через каждые 5 пересевов производили контроль ный высев культуры на твердую питательную среду и осуществляли клональный анализ, для чего методом реплик на чашки с канамицином и без него переносили до 100 изолированных колоний. Для нескольких произвольно выбранных антибио тикорезистентных колоний осуществляли плазмидный скрининг, контролируя при сутствие в образцах ДНК репликона с электрофоретической подвижностью, свой ственной pUB110PA-1.

Установлено, что трансформанты B. anthracis 55ДТПА-1Spo- при пассирова нии in vitro в присутствии селективного антибиотика стабильно наследуют плазми ду pUB110PA-1. Частота элиминации гибридного репликона в популяциях иссле дованных клонов не превышала 5 %. Клональный анализ трех трансформантов (№ 5, 23 и 48) не выявил ни одного случая утраты pUB110PA-1 в продолжение 15 по следовательных пассажей в условиях селективного давления.

Экспрессию клонированного гена pag в составе аспорогенного штамма B.

anthracis 55 ТПА-1(Spo-) исследовали с помощью комплекса биохимических и иммунохимических методов. В иммунохимических реакциях использовали поли клональные антитела к ПА. Специфичные сыворотки получали при иммунизации кроликов белковым препаратом, выделенным из спорообразующего рекомбинант ного продуцента B. anthracis СТИ ТПА-1.

Продукцию ПА тестировали у стабильных трансформантов № 5, 23 и 48, отобранных на предыдущем этапе. Перечисленные клоны выращивали в стандарт ных условиях в питательной среде с добавлением бикарбоната натрия. Стериль ные культуральные фильтраты концентрировали в 10 раз и вносили в одинако вом количестве в лунки акриламидного геля.

Белок с электрофоретической подвижностью, установленной для ПА сиби реязвенного микроба (83 кДа), секретировали все три клона B. anthracis 55 ТПА 1(Spo-). Продукция ПА аспорогенными рекомбинантами по данным белкового электрофореза превосходила продукцию контрольного вакцинного штамма B. anth racis 55. Среди тестированных рекомбинантных клонов наибольшее количество ПА секретировали трансформанты № 5 и 48.

Иммунореактивность синтезируемого белка подтверждали с помощью по становки реакции иммуноблота с поликлональными антителами к ПА. Электрофо ретически разделенные белки концентрированных культуральных фильтратов ас порогенных трансформантов переносили из полиакриламидного геля на нитроцел люлозную мембрану Hybond-C. После этого мембрану последовательно инкубиро вали со специфичными кроличьими антителами и диагностическими антителами против кроличьих иммуноглобулинов, мечеными пероксидазой. В результате ок рашивания раствором диаминобензидина на нитроцеллюлозной мембране образо вывались четкие полосы на уровне электрофоретической подвижности ПА.

Способность к синтезу ПА трансформантов, получивших в результате гене тического переноса плазмиду pUB110PA-1, очень наглядно продемонстрирована результатами реакции преципитации на среде с анти-ПА антителами. Аспороген ные рекомбинантные клоны образовали одинаково большие зоны радиальной диф фузии антигена. Ширина колец преципитации вокруг их посевов составила около 10 мм, в то время как вокруг посева B. anthracis 55 аналогичные показатель был не более 2 мм. Штамм B. anthracis 55 Т, не содержащий ген pag, радиальной зоны преципитации не образовывал.

B.anthracis 55ТПА-1 Spo клон 5, клон 23, клон 48 (слева-направо) B.anthracis 55, B.anthracis 55ТПА-1, B.anthracis 55Т (слева-направо) Рисунок 2. Сравнение уровней продукции ПА на основании результатов ре акции радиальной преципитации на среде с анти-ПА антителами.

Сходные результаты получили при постановке дот-анализа. Тестировали культуральные фильтраты трех трансформантов B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-) №5, 23, 48, исходного вакцинного штамма B. anthracis 55 и спорообразующего реком бинанта B. anthracis 55 ТПА-1 (рис. 3). Более интенсивное окрашивание образо вавшихся иммунных комплексов отмечали в рядах, соответствующих образцам культуральных фильтратов рекомбинантных штаммов - трех клонов аспорогенных трансформантов и спорообразующего генно-инженерного продуцента. Из всех ис следованных стабильных трансформантов наилучшей способностью к секреции иммуногенного антигена обладал клон № 5. На основании данных дот-анализа он продуцировал ПА приблизительно в 8 раз больше, чем исходный штамм B. anthra cis 55.

С использованием твердофазного ИФА осуществили количественную оцен ку уровней продукции ПА. На основании сопоставления данных Ряды: 1 - B. anthracis 55, 2 - B. anthracis 55ДТПА-1Spo- клон 5, 3 - B. anthracis 55ДТПА-1Spo- клон 23, 4 - B. anthracis 55ДТПА-1Spo- клон 48, 5 - B. anthracis 55ДТПА-1.

Рисунок 3. Сравнение уровней продукции протективного антигена на осно вании результатов дот-анализа с анти-ПА антителами.

нескольких анализов определили, что трансформант B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-) №5 продуцирует 85 - 90 мкг/мл ПА, а клоны № 23 и 48 - чуть меньше - около мкг/мл. Продукция ПА вакцинными штаммами B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55 составила 15 и 20 мкг/мл, соответственно.

Таким образом, получен рекомбинантный штамм B. anthracis, являющийся стабильным аспорогенным протеазодефицитным продуцентом ПА сибиреязвенно го микроба. Совокупность свойств рекомбинантного штамма определяет перспек тивы его практического использования. В частности, он может служить прототи пом для создания безопасной и экологичной технологии производства химических сибиреязвенных вакцин. Сконструированный штамм продуцирует ПА в несколько раз больше, чем вакцинные штаммы B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. Он не со держит генов, детерминирующих синтез основных факторов патогенности возбу дителя сибирской язвы, и не образует спор, способных длительно сохраняться и накапливаться в окружающей среде. Применение аспорогенного продуцента не бу дет связано с риском контаминации помещений и оборудования спорами, чрезвы чайно устойчивыми к действию обеззараживающих агентов.

Немаловажно, что рекомбинантный штамм B. anthracis 55 ТПА-1 (Spo-) создан на основе протеазодефицитного реципиента. Низкая активность собствен ных протеаз штамма-продуцента позволит избежать значительных потерь биологи чески значимого продукта в процессе его выделения и очистки.

Перспектива использования сконструированного нами аспорогеннного штамма для получения ПА сибиреязвенного микроба в лабораторных или даже промышленных условиях накладывает определенную долю ответственности за стабильность воспроизведения заключенной в нем наследственной информации. В этой связи, нам необходимо было получить убедительные свидетельства сохране ния аспорогенности и способности к репликации гибридной плазмиды в процессе длительного пассирования штамма in vitro, а также при его хранении.

Для изучения стабильности использовали различные схемы последователь ных пересевов культур с регулярным анализом свойств аспорогенности и анти биотикорезистентности. Способность к спорообразованию тестировали у 10-ти произвольно выбранных клонов, резистентность к селективному антибиотику - не менее чем у 50-ти.

В течение более 30 суточных пассажей штамма B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-) на питательных средах с добавлением селективного антибиотика случаев элимина ции плазмиды pUB110PA-1 отмечено не было. По окончании пассирования, а так же на промежуточных этапах (через каждые 5-7 пересевов) реверсии к спорообра зующему фенотипу также не наблюдали.

Данные электрофореза белковых препаратов, выделенных из культуральных фильтратов исследуемых клонов, свидетельствовали об их неизмененной способ ности к продукции ПА. Специфичность взаимодействия соответствующих белков с антителами к ПА подтверждали постановкой реакции иммуноблота.

Дополнительно тестировали протеолитическую активность штамма. При ис следовании на среде с казеином у всех тестированных клонов отсутствовали зоны деградации белкового субстрата вокруг посевов.

В процессе исследования было также установлено, что элиминация плазми ды pUB110PA-1 не происходит в течение непродолжительного периода выращива ния штамма B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-) в жидкой питательной среде без селек тивного антибиотика. Однако продление времени культивирования рекомбинант ного аспорогенного продуцента ПА в отсутствии канамицина, как и увеличение количества суточных пассажей, приводило к постепенному нарастанию темпов утраты репликона, несущего детерминанту синтеза ПА. Элиминация pUB110PA- после третьих суток достигала уровня 40 %. К пятому пассажу количество чувст вительных к канамицину клонов составляло почти 90 %. Вместе с тем, реверсии к спорообразующему и протеазоположительному фенотипу даже при многократном пассировании в жидкой питательной среде без селективного антибиотика не на блюдали.

После депонирования в ГКПБ "Микроб" лиофильно высушенного штамма B.

anthracis 55 ТПА-1(Spo-) (КМ97) периодически тестировали стабильность его биологических свойств в условиях хранения. В течение более двух лет наблюдения штамм сохранял все присущие ему свойства.

На следующем этапе решали задачу оптимизации условий культивирования аспорогенного рекомбинантного продуцента на питательных средах. Обычно вы ращивание культуры B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-) осуществляли в богатой пита тельной среде, содержащей в больших количествах триптон и дрожжевой экстракт (S-бульон), и при повышенном содержании СО2. В качестве альтернативы нами были апробированы способы культивирования аспорогенного продуцента ПА с применением более доступных сред и в обычной атмосфере.

Параллельно тестировали 4 вида сред: S-бульон, L-бульон, бульон Хоттин гера и бульон Хоттингера с добавлением дрожжевого аутолизата. Одну порцию инкубировали в атмосфере CO2, другую - в обычной атмосфере. Уровни продукции ПА сравнивали на основании данных электрофореза.

Электрофоретическое разделение протеинов культуральных фильтратов по казало, что штамм B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-) продуцирует наибольшее количест во ПА при его росте в S-бульоне. Данная среда является оптимальной для развития микроорганизма и секреции иммуногенного белка. Использование бульона Хот тингера возможно только при условии добавления дополнительных ингредиентов, например, дрожжевого аутолизата.

Очень важным оказалось наблюдение, что продукция ПА аспорогенным ре комбинантом не зависит от содержания в атмосфере CO2. Как известно, экспрессия гена pag в составе pXO1, находится под строгим контролем СО2 - зависимого транскрипционного регулятора – AtxA. Область AtxA участвует в координирован ной регуляции синтеза ПА, ОФ, ЛФ, капсулы, белков S-слоя и, возможно, других факторов (Hoffmaster A., Koehler T.,1997;

Mignot T. et al., 2003). В рекомбинантном штамме с клонированным геном pag область AtxA отсутствует, что объясняет СО2 независимый синтез ПА.

То обстоятельство, что продукция ПА рекомбинантным штаммом B. anthra cis 55 ТПА-1(Spo-) не зависит от содержания в атмосфере СО2, выгодно отличает полученный аспорогенный продуцент ПА с pUB110PA-1 от аттенуированных штаммов, несущих в своем составе высокомолекулярную плазмиду pXO1.

С целью получения препаративных количеств ПА суточную агаровую куль туру аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis 55ДТПА-1(Spo-) засева ли в 5 л S-бульона, содержащего 25 мкг/мл канамицина. Бикарбонат натрия в среду не добавляли. Культуру выращивали при температуре 37 оС в течение 18 часов с аэрацией. По окончании инкубации, полученный после осаждения клеточной мас сы супернатант фильтровали, концентрировали в 10 раз и диализовали против ди этаноламинового буфера.

Выделение ПА проводили по схеме, предложенной C. Quinn et al. (1988), в нашей модификации. В качестве первой ступени очистки использовали ионообме ную хроматографию. Сконцентрированный и диализованный препарат порционно наносили на колонку с Macro Prep 50Q. Выход протеинов регистрировали спектро фотометрически. Образцы, соответствующие пикам поглощения, объединяли и ис следовали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Пробы, содержа щие ПА, объединяли, вновь концентрировали в 10 раз, диализовали и фильтровали.

На заключительном этапе осуществляли гель-фильтрацию с использованием Se phacryl-HR300. Отобранные на основании спектрофотометрического анализа про бы концентрировали в 10 раз и диализовали.

Результаты электрофореза в полиакриламидном геле показали почти полное освобождение образцов, как от низкомолекулярных, так и высокомолекулярных сопутствующих белков (рис. 4). Электрофоретическая подвижность протеина, вы деленного из аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis 55ДТПА1(Spo-), соответствовала молекулярной массе 83 кДа. Всего из 5 литров исходной культуры штамма B. anthracis 55ДТПА-1(Spo-) было получено 80 мл высокоочищенного 1 2 3 4 5 6 Треки: 1 – культуральный фильтрат B. anthracis 55ДТПА-1Spo-;

2 – этап очистки на колонке с Macro Prep 50Q;

3 - маркеры молекулярных масс (116,0;

97,0;

66,0;

45,0;

29,0 кДа);

4 - 7 – этап хроматографии на колонке с Sephacryl-HR (пробы, соответствующие пику поглощения при 280 нм).

Рисунок 4. Результаты основных этапов хроматографической очистки ПА, выделенного из культурального фильтрата аспорогенного продуцента B. anthracis 55ДТПА-1Spo-.

препарата ПА с концентрацией белка 0,8 мг/мл. В данном случае выход составил 12,8 мг очищенного ПА на 1 литр культуры аспорогенного рекомбинатного штам ма.

Иммунореактивность и специфичность данного белка подтверждали резуль татами реакции иммуноблота, дот-анализа, твердофазного ИФА с антителами к ПА. Во всех случаях отмечали образование окрашенных иммунных комплексов.

Полученные результаты очистки ПА и относительно высокий выход конеч ного продукта позволяют и в дальнейшем использовать данную оптимизированную схему для получения препаративных количеств иммуногенного антигена из реком бинантного продуцента. Достигнутая степень очистки в совокупности с полным отсутствием в препарате ОФ и ЛФ обуславливают перспективность в плане конст руирования на его основе современных профилактических и диагностических си биреязвенных препаратов.

Иммуногенные свойства полученного белкового препарата ПА изучали в экспериментах на лабораторных животных. Одну группу кроликов (10 особей) им мунизировали очищенным препаратом ПА, выделенным из аспорогенного проду цента B. anthracis 55ДТПА-1(Spo-). Белок вводили двукратно с интервалом в дней в дозе 50 мкг в сочетании с полным адъювантом Фрейнда. Другую группу вакцинировали однократно штаммом B. anthracis СТИ-1 в дозе 5 · 107 КОЕ. Особей третьей группы оставляли интактными.

В конце поствакцинального периода (на 19 сутки поле окончания иммуниза ции) у произвольно выбранных особей производили забор крови для определения титров антител к ПА. Адаптивный иммунитет формировался у всех опытных кро ликов. В случае иммунизации белковым препаратом титры анти-ПА составили 1:8192 - 1:16384, при иммунизации живой вакциной - 1:1024 - 1:2048.

Через 21 день после последней инъекции препаратов осуществляли зараже ние животных опытных и контрольной групп 50 ЛД50 высоковирулентного тест штамма B. anthracis 81/1. Значение ЛД50 определяли предварительными экспери ментами - 5 · 102 КОЕ.

В результате выжило 100 % животных, иммунизированных B. anthracis СТИ 1 и препаратом ПА. У всех неиммунизированных особей сибиреязвенная инфек ция закончилась летально на третьи сутки. Специфичность инфекционного процес са подтверждали контрольным вскрытием павших животных.

Перспективы практического использования ПА, выделяемого из аспороген ного продуцента, не ограничиваются только созданием химических вакцин. Дан ный препарат и специфически взаимодействующими с ним антитела могут ока заться востребованными для постановки иммунохимических реакций и в конст руировании иммунодиагностических тест-систем.

В частности, наличие высокоочищенного препарата ПА и специфически взаимодействующих антител позволяет проводить количественную оценку про дукции ПА природными, аттенуированными и рекомбинантными штаммами B.

anthracis с помощью различных количественных и полуколичественных методов оценки продукции ПА - реакции радиальной иммунодиффузии, иммуноблота, дот анализа и твердофазного ИФА.

Поли- или моноклональные антитела к очищенному ПА могут быть исполь зованы для идентификации возбудителя сибирской язвы при осуществлении диаг ностических исследований. С целью доказательства такой возможности осущест вили эксперименты по постановке различных вариантов ИФА (дот-анализа и твер дофазного ИФА) на представительной выборке бациллярных штаммов, включаю щей 10 культур B. anthracis и 43 - близкородственных видов, таких как B. cereus, B. subtilis, B. thuringiensis, B. mycoides, B. megaterium, B. mesentericus, B. lichenifor mis и B. stearotermophylus.

Все исследованные сибиреязвенные штаммы положительно реагировали с антителами к ПА, выделенному из аспорогенного продуцента. Тестирование в дот анализе микробных взвесей близкородственных бактерий в 9 % случаев показало наличие умеренно выраженных перекрестных реакций - у 4-х штаммов из 43-х (B.

cereus 1, 8, 96 и B. mesentericus 5). Исследование стерильных культуральных фильтратов всех перечисленных бациллярных штаммов перекрестных реакций не выявило.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности сыворо ток, полученных к рекомбинантному протективному антигену B. anthracis и воз можности их использования для конструирования сибиреязвенных диагностику мов.

Кроме того, на основе синтезируемого B. anthracis 55ДТПА-1(Spo-) антигена возможно создание иммуноферментных тест-систем, позволяющих диагностиро вать заболевание сибирской язвой и проводить оценку состояния адаптивного им мунитета вакцинированных. В качестве иллюстрации такого подхода мы провели эксперимент по определению динамики титров антител у иммунизированных мор ских свинок. Лабораторным животным делали однократные инъекции 5 · 107 спор вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 и определяли титры антител к ПА на 24-е, 28-е, 32-е, 36-е сутки и через 2 месяца после иммунизации. Отмечали нарастание титров антител до максимальных значений 1:2048 - 1:4096 к 32-м суткам исследо вания и снижение показателей до 1:512 - 1:1024 спустя 2 месяца.

Таким образом, полученный нами высокоочищенный ПА, являющийся про дуктом рекомбинантного аспорогенного штаммма B. anthracis 55ДТПА-1(Spo-), может быть использован в конструировании профилактических и диагностических сибиреязвенных препаратов.

Выводы Сконструирован аспорогенный рекомбинантный авирулентный проду 1.

цент протективного антигена - B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-). Ген, детерминирую щий синтез протективного антигена, локализован в составе плазмиды pUB110PA-1.

Штамм B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-) стабильно наследует гибридный репликон в условиях селективного давления, не реверсирует к спорообразующему фенотипу и характеризуется низкой активностью протеолитических ферментов.

Аспорогенный рекомбинант B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-) продуцирует в 2.

среду выращивания около 80 мкг/мл биологически активного протективного анти гена, что почти в 4 раза превышает его продукцию вакцинным штаммом B. anthra cis 55.

Оптимизирована экспериментальная схема выделения и очистки протек 3.

тивного антигена, синтезируемого генно-инженерным продуцентом. Установлено, что продукция ПА рекомбинантным штаммом B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-) не за висит от содержания в атмосфере СО2. Использование в технологическом процессе сконструированного на основе вакцинного штамма B. anthracis аспорогенного продуцента позволит обеспечить безопасность и экологичность процедуры выде ления протективного антигена.

Достигнута высокая степень очистки протеина, продуцируемого сконст 4.

руированным штаммом B. anthracis 55ДТПА-1(Spo-). По биохимическим, иммуно химическим и биологическим свойствам полученный белковый препарат является протективным антигеном сибиреязвенного микроба.

При иммунизации лабораторных животных протективным антигеном, 5.

синтезируемым рекомбинантным штаммом B. anthracis 55 ТПА-1(Spo-), происхо дит развитие адаптивного иммунитета, характеризующегося высокими титрами ан ти-ПА антител. Двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинант ного протективного антигена обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1.

Получены специфичные поликлональные (кроличьи) антитела к протек 6.

тивному антигену сибиреязвенного микроба. Показана перспективность их исполь зования в схеме идентификации возбудителя сибирской язвы и для определения уровней продукции иммуногенного антигена вакцинными штаммами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Новикова Л.В., Болотнико 1.

ва М.Ф., Киреев М.Н. Генетическое конструирование продуцентов протективного ан тигена сибиреязвенного микроба // Медицинская микробиология – XXI век: Материа лы Всероссийской научно-практической конференции. - Саратов, 2004. - С. 156 - 157.

Попов Ю.А., Микшис Н.И., Корсакова А. Ю., Кудрявцева О.М., Болотни 2.

кова М.Ф., Новикова Л.В., Шулепов Д.В., Киреев М.Н., Коннов Н.П., Щуковская Т.Н., Фирстова В.В., Брандзишевский Ю.В., Полунина Т.А. Конструирование рекомбинант ных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин // Методические документы и отчеты по санитарно эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2005. - С.

41.

Шулепов Д.В., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Киреев М.Н., Попов Ю.А.

3.

Выделение и очистка протективного антигена из рекомбинантного штамма Bacillus anthracis // Окружающая среда и здоровье: Окружающая среда и здоровье: Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. Суздаль, 2005 г. - С. 212-213.

Микшис Н.И., Шулепов Д.В., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Нови 4.

кова Л.В., Попов Ю.А., Дроздов И.Г. Сравнение уровней продукции протективного антигена вакцинным и рекомбинантными штаммами Bacillus anthracis // Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасно сти и противодействия биологическому терроризму в современных условиях: Мате риалы VI Межгосударственной научно-практической конференции. - Волгоград, 2005.

- С. 166-168.

Попов Ю.А., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Корсакова А.Ю., Шулепов 5.

Д.В., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Щуковская Т.Н., Киреев М.Н., Брандзишев ский Ю.В., Коннов Н.П. Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин // Мето дические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. – Саратов, 2006. - С. 51.

Кудрявцева О.М., Микшис Н.И., Новикова Л.В, Болотникова М.Ф., Шуле 6.

пов Д.В., Попов Ю.А. Селекция стабильных и эффективных рекомбинантных проду центов протективного антигена Bacillus anthracis // Проблемы особо опасных инфек ций. - 2006. - Вып. 1 (91). - С. 38-41.

Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Болотникова М.Ф., Нови 7.

кова Л.В., Попов Ю.А. Экспрессия гена синтеза протективного антигена сибиреязвен ного микроба в рекомбинантных бациллярных штаммах // В сб. «Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и па разитологов». - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 84.

Микшис Н.И., Шулепов Д.В., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Нови 8.

кова Л.В., Попов Ю.А. Конструирование рекомбинантного аспорогенного штамма продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба // В сб. «Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиоло гов и паразитологов». - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 83-84.

Шулепов Д.В., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Попов Ю.А., Киреев М.Н.

9.

Получение высокоочищенного препарата протективного антигена из рекомбинантного аспорогенного штамма Bacillus anthracis // Международные медико-санитарные пра вила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в госу дарствах-участниках СНГ: Материалы Межгосударственной научно-практической конференции. - Саратов, 2007. - С. 320-321.

10. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Попов Ю.А. Комплекс ме тодических подходов к определению протективного антигена сибиреязвенного микро ба // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. – Саратов, 2007. - С. 16.

11. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Шулепов Д.В., Нови кова Л.В., Попов Ю.А., Щуковская Т.Н., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Иммуногенность рекомбинантных бациллярных штаммов с клонированным геном синтеза протектив ного антигена Bacillus anthracis // Молекулярная генетика, микробиология и виру сология. - 2007. - № 3. - С. 15-21.

12. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Шулепов Д.В. Патент РФ на изобретение № 2321629 – аспорогенный рекомбинантный штамм B. anthracis 55 ТПА-1 Spo (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба // Бюл летень №10 от 10.04.2008 г.



 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.