авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости escherichia coli

На правах рукописи

ШУМКОВ Михаил Сергеевич ПОЛИАМИНЫ КАК ФАКТОР МНОЖЕСТВЕННОЙ СТРЕССОРНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ESCHERICHIA COLI 03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2007

Работа выполнена в лаборатории адаптации микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Ткаченко Александр Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Пшеничнов Роберт Алексеевич доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва

Защита состоится “ ” 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 004.019.01. в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, Пермь, ул. Голева, 13.

Факс: (342) 244 67 11.

Автореферат диссертации размещён на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН: http://www.iegm.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан “”_ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Ившина Ирина Борисовна чл.-корр. РАН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследования в области микробиологии и молекулярной биологии обеспечили значительный прогресс в изучении генов и закодированных в них белков, участвующих в адаптации микроорганизмов к различным видам стресса. Вместе с тем, вопрос о механизмах, лежащих в основе регуляции стрессорных реакций, во многом остается малоизученным. В частности, недостаточно полно исследована роль нормальных продуктов обмена веществ в тонкой настройке адаптивного ответа клетки. Среди факторов метаболической природы в последние годы особенно возрос интерес к биогенным полиаминам. Имеются данные об их влиянии на клеточные процессы про- и эукариот. Известно, что полиамины не только участвуют в регуляции нормального клеточного цикла (Yoshida et al., 2004;

Igarashi, 2006), но и выполняют важные функции в канцерогенезе (Tatib et al., 1998;

Sandgren, Belting, 2003). На основании широкого спектра генов, регулируемых полиаминами, в последнее время выделена отдельная структурная единица, объединяющая их в единую регуляторную систему – полиаминовый модулон (Yoshida et al., 2004). Особенности молекулярной структуры полиаминов определяют их способность взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами клетки (Kashiwagi et al., 1986).

Имеются данные о специфическом влиянии полиаминов на транскрипцию некоторых генов (Lindemose et al., 2005) и их участии в регуляции вторичной структуры тРНК, рРНК и мРНК (Igarashi, Kashiwagi, 2000). Эти свойства полиаминов, а также влияние, которое они оказывают на адаптацию клеток Escherichia coli к осмотическому, тепловому и другим видам стрессовых воздействий (Ткаченко и др., 1997, 1998;

Ткаченко, Федотова, 2007), обосновывают необходимость изучения их роли при переходе бактериальной культуры к стационарной фазе роста и углеводному голоданию, в адаптации к кислотному стрессу и действию антибиотиков.

Цель настоящей работы - изучение роли полиаминов в формировании множественной стрессорной устойчивости клеток E. coli.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать влияние полиаминов на экспрессию rpoS в условиях перехода культуры E. coli к стационарной фазе роста и голоданию по глюкозе.

2. Оценить роль полиаминов в повышении устойчивости E. coli к действию органических кислот.

3. Изучить влияние различных стрессовых воздействий на уровень антибиотикорезистентности клеток E. coli.

4. Исследовать изменения экспрессии rpoS и внутриклеточного содержания полиаминов в условиях воздействия на клетки E. coli различных антибиотиков.

5. Оценить возможность участия полиаминов в регуляции пориновой проницаемости клеточной стенки E. coli в условиях добавки антибиотиков.

Научная новизна. Установлено, что полиамины принимают участие в формировании адаптивного ответа E. coli при переходе к стационарной фазе роста и углеводному голоданию, в условиях воздействия органических кислот и антибиотиков. Впервые показано участие полиаминов в ингибировании протеолиза и выявлена их положительная модулирующая активность в отношении экспрессии rpoS на уровнях транскрипции, трансляции и стабильности белка. С помощью сконструированного полиаминзависимого мутанта E. coli, несущего rpoS::lacZ слияние, установлено усиление стимулирующего эффекта полиаминов на уровень экспрессии rpoS в ряду кадаверинпутресцинспермидин. На основании различий регуляторных эффектов полиаминов продемонстрирована их функциональная специализация в реализации адаптивных функций в условиях стресса. Показано, что путресцин и спермидин играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, в то время как кадаверин выполняет функции ингибитора поринового транспорта.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Материалы диссертации используются в лекционном курсе «Адаптация микроорганизмов к стрессу» на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета. На их основе возможна разработка рекомендаций по профилактике развития сопряжённой с антибиотикотерапией множественной лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Полиамины выполняют функции положительных модуляторов экспрессии rpoS, обеспечивая адаптацию клеток E. coli к действию органических кислот, в условиях перехода к стационарной фазе роста и голодания по глюкозе.

2. Резистентность клеток E. coli к действию фторхинолоновых антибиотиков возрастает в условиях кислотного, осмотического и теплового стрессов.

3. Полиамины повышают устойчивость E. coli к действию -лактамных и фторхинолоновых антибиотиков, транспортируемых в цитоплазму через пориновые каналы, но не задействованы в адаптации к аминогликозидам, проникающим в клетку путём диффузии через липидный бислой.

4. В клетках E. coli, подвергнутых действию -лактамных и фторхинолоновых антибиотиков путресцин и спермидин выполняют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, тогда как у кадаверина преобладают функции ингибитора транспортной активности пориновых каналов.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на V и VI международных конференциях «Проблемы загрязнения окружающей среды», Волгоград-Пермь, 2001, Пермь-Казань Пермь, 2005;

6-ой, 8-ой, 9-ой и 10-ой Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология – наука XXI века», Пущино, 2002, 2004, 2005 и 2006;

Межрегиональной конференции молодых учёных «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 31 рисунком. Список литературы включает 251 наименование, из них 15 отечественных и 236 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Механизмы адаптации микроорганизмов к стрессу», индекс приоритетного направления 5.19, 5.21, 5.24, номер госрегистрации 01.2.01.2.00 3 06932. Работа дополнительно финансируются в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», а также поддержана грантами РФФИ (04-04-97501, 05-04-48091, 04-04-96062, 07-04-96003) и департаментом Пермского края по науке и образованию.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объекта исследования использованы культуры различных штаммов Escherichia coli (табл. 1), которые выращивали в синтетической питательной среде М-9 или LB бульоне при 37°С. Биомассу клеток оценивали по оптической плотности (OD600). Влияние кислотного стресса на культуру E. coli изучали при внесении в среду сукцината, формиата и ацетата натрия. Антибиотики (левофлоксацин, пефлоксацин, цефотаксим, цефазолин, ампициллин и нетромицин) добавляли в сублетальных концентрациях, использование которых приводило к 30-50%-ному подавлению накопления биомассы в культуре E. coli после 2 часов культивирования. Уровень экспрессии генов rpoS и osmY исследовали с использованием их транскрипционных и трансляционных lacZ слияний и оценивали по активности -галактозидазы методом Миллера (Miller, 1992). Содержание полиаминов определяли тонкослойной хроматографией их дансилированных производных (Чудинов и др., 1984) и высокоэффективной жидкостной хроматографией с использованием хроматографа высокого давления LC 10Avp (Shimadzu, Япония). Выделение плазмидной ДНК проводили традиционным методом щелочного лизиса (Харди, 1989). Трансформацию клеток E. coli плазмидой рBR322 осуществляли при действии теплового шока в среде с CaCl2 (Маниатис и др., 1984). Транспортную активность пориновых каналов внешней мембраны E. coli определяли в соответствии с модифицированным вариантом метода Циммермана и Росселета (Nikaido et al., 1983). Минимальную ингибиторную концентрацию антибиотиков выявляли микрометодом серийных разведений в соответствии с методическими рекомендациями (Методические указания МУК 4.2.1890-04).

Концентрацию ацетата определяли колориметрическим методом Роуза (Rose, 1955).

Таблица Штаммы E. coli и плазмиды, использованные в работе Штамм, Генотип Источник плазмида Штамм Muffler et al., RO200 MC4100(RZ5:rpoS742::lacZ) RO90 MC4100(RZ5:rpoS379::lacZ[hybr]) RO91 MC4100(RZ5:rpoS742::lacZ[hybr]) (pBR322) F- (arg-lac)U169 araD139 rpsL MC ptsF25 flbB5301 rbsR deoC relA Chen et al., MC4100DE3Y MC4100, но DE3 osmY::lacZ pSOPR трансформирован плазмидой pSOPR Chen, Schellhorn, HS1600DE3Y MC4100DE3 rpoS13::Tn10 osmY::lacZ pRPOS + Martin, Rosner, M2073 GC4468 (Str-R) mar marR::lacZ (pBR322) M2076 N7840 ( marRAB ) marR:lacZ mar-, rob+, sox+, (Str-R) GC4468 (Str-R) mar-, rob+, sox+, (Kan-R) N Tabor et al., HT306 thr-1, araC14, speD98, (gpt-proA)62, lacY1, gln V44(AS), galK2(Oc),, (SpeB SpeA)97, ( SpeC-glcB)63, rpsL25(strR), xylA5, mtl-1, thi-1, ampCp-1, cadA HT306, но lacZ- DE3 Данная работа SHT (RZ5:rpoS742:lacZ[hybr]) HT306, но lacZ- DE3 (RZ5:rpoS742::lacZ) SHT25/ Плазмида pBR322 4361-bp rep и rop из pMB1 bla из Tn3 tet из БНИИ СПГУ pSC pRPOS 1298-bp EcoRI фрагмент из pGC1, Chen, Schellhorn, клонированный в pET21, T7lac промотор в ориентации гена rpoS pSOPR pET21, содержащая 1042-bp EcoRI Chen et al., фрагмент из pGC2a в ориентации, противоположной T7lac промотору Примечание. Название плазмиды, заключённое в скобки (табл. 1), означает использование в экспериментах как плазмидного, так и бесплазмидного штаммов.

Автор выражает искреннюю благодарность Роберту Дж. Мартину из Национального института здоровья (Бесезда, США) за предоставленные штаммы E. coli M2073, M2076 и N7840, Регине Хенгге из берлинского университета (Берлин, Германия) за предоставленные штаммы E. coli RO200, RO90 и RO91, Герберту Тэйбору из Национального института здоровья (Бесезда, США) за штамм HT306, а также Хербу Шеллхорну из университета МакМастер (Гамильтон, Канада) за штаммы E. coli HS1600DE3Y pRPOS и MC4100DE3Y pSOPR.

Статистическая обработка результатов исследований проведена с использованием пакетов стандартных программ Statistica for Windows 5, (StatSoft, Inc., 1995) и Statistica 6,0 (StatSoft, Inc., 2001). Приведены средние данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех). Вертикальными отрезками на рисунках обозначены величины среднего квадратического отклонения (), в таблицах данные также представлены в формате среднее±.

Оценка статистической значимости различий сравниваемых групп произведена с использованием непарного и парного t-критериев Стьюдента.

Для множественных сравнений использовали критерий Ньюмена-Кейлса или вводили поправку Бонферрони. Различия считали значимыми при р0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование полиаминов как фактора регуляции экспрессии rpoS при переходе культуры Escherichia coli в стационарную фазу роста.

Исчерпание источника питания, накопление конечных продуктов метаболизма или иные факторы, действующие на бактериальную культуру в природной среде, нередко приводят к прекращению роста и переходу культуры в стационарную фазу. Причины этого разнообразны, но все они активируют единый механизм множественной стрессорной устойчивости (Jenkins et al., 1988;

Matin, 1991), в основе которого лежит изменение содержания в клетке S-субъединицы РНК-полимеразы, кодируемой геном rpoS (Lange, Hengge-Aronis, 1991). Реакция S на многие сигналы возможна, благодаря сложной системе ее регуляции, в которой участвует большое число разнообразных факторов, в том числе нормальных продуктов метаболизма, таких как полиамины.

Исследование роли полиаминов в регуляции экспрессии rpoS проведено с использованием штаммов E. coli, позволяющих определить вклад транскрипции (RO200), трансляции (RO90) и стабильности белка (RO91) в накопление S в клетке. Несмотря на то, что на уровне транскрипции стимулирующего действия путресцина не обнаружено, он оказывал существенный статистически значимый положительный эффект на трансляцию и стабильность белка S как в лимитированных по глюкозе, так и нелимитированных культурах E. coli (табл. 2).

Таблица Модулирующий эффект путресцина в отношении экспрессии rpoS E. coli на уровнях транскрипции (RO200), трансляции (RO90) и белковой стабильности (RO91) в зависимости от содержания глюкозы в среде Добавка Конц-ия Уровень индукции rpoS E. coli.

путресцина глюкозы в RO200 RO90 RO (5 мМ) среде, % 0,13 1,8±0,26 1,6±0,08 3,9±0, 0,4 2,0±0,32 1,9±0,12 3,5±0, 0,13 1,6±0,07 1,8±0,19 4,5±0, + 0,4 1,8±0,09 1,8±0,10 5,7±2, Эффект 0,13 отсутствует 11,2* 17,0* путресцина, 0,4 отсутствует отсутств. 64,8* % от контроля Стимулирующий эффект путресцина рассчитан по средним значениям уровня индукции rpoS. * - статистически значимые различия экспрессии rpoS в культурах E. coli, содержащих и не содержащих путресцин.

Примечание. Уровень индукции - отношение максимальной величины -галактозидазной активности в стационарной фазе роста к её минимальной величине в начале экспоненциальной фазы.

Приведённые данные были получены с использованием штаммов, способных к нормальному синтезу полиаминов, что затрудняло выявление эффекта этих соединений ввиду присутствия в клетках их существенного эндогенного пула и послужило причиной для проведения серии экспериментов на сконструированных нами полиаминдефицитных мутантах E. coli, несущих rpoS::lacZ генные слияния.

При таком подходе действие экзогенных добавок полиаминов на экспрессию rpoS было обнаружено не только на уровнях регуляции трансляции и стабильности S, но и при транскрипции этого гена (табл. 3).

Характерная прямая зависимость экспрессии rpoS от концентрации добавленных полиаминов (см. табл. 3) при повышении их концентраций выше 10 мкМ сменялась эффектом насыщения. На основании неравнозначного влияния эквимолярных количеств полиаминов на экспрессию rpoS в экспоненциальной фазе роста (рис. 1) можно прийти к заключению об усилениии их регуляторного эффекта в ряду кадаверинпутресцин спермидин.

Таблица Роль полиаминов в регуляции экспрессии rpoS периодических культур полиаминдефицитных штаммов E. coli, несущих транскрипционное Степень стимуляции экспрессии rpoS (%) в Штамм Полиамин зависимости от концентрации полиаминов, мкМ 0,2 1 5 10 50 61±13 а Путресцин 10±2 25±1 54± 53±10 а SHT25/2 Кадаверин 32±8 53±5 61± а Спермидин 5±2* 40±1 84±5 83± Путресцин 48±4 125±16 188± а SHT03 Кадаверин 76±1 95±8 102±9 117± а Спермидин 16±8 49±7 106±12 107± (SHT25/2) и трансляционное (SHT03) rpoS::lacZ генные слияния * - отсутствие статистически значимых различий с контролем, а – отсутствие различий с группой с добавлением меньшей концентрации полиаминов.

экспрессии rpoS, ед.

Степень стимуляции 0 1 2 3 4 5 Время, ч.

Рис. 1. Роль эквимолярных концентраций полиаминов в регуляции экспрессии rpoS периодической культуры полиаминдефицитного штамма E. coli SHT03.

1 – 10 мкМ спермидина, 2 – 10 мкМ путресцина, 3 – 10 мкМ кадаверина.

Стрелка обозначает момент внесения полиаминов.

Таким образом, путресцин, кадаверин и спермидин оказывают статистически значимый, концентрационно-зависимый эффект на экспрессию rpoS, сменяющийся эффектом насыщения. Отсутствие статистически значимых различий степени стимуляции экспрессии rpoS в культурах E. coli SHT25/2 и SHT03 при внесении одинаковых концентраций спермидина (см. табл. 3) свидетельствует о его преимущественном участии в регуляции транскрипции rpoS, в то время как путресцин и кадаверин проявляют индуцирующую активность как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях.

Исследование роли полиаминов в адаптации клеток E. coli к кислотному стрессу. Рост периодической культуры E. coli на синтетической среде с глюкозой сопровождается постепенным её закислением вследствие накопления продуктов обмена, среди которых доминируют органические кислоты, в первую очередь, ацетат, сукцинат и формиат (el-Manci, Holms, 1989). Внесение сукцината в культуру E. coli в экспоненциальной фазе роста вызывало выраженное зависимое от концентрации возрастание экспрессии rpoS (рис. 2) на уровнях трансляции (до 50%) и стабильности белка (до 300%). Добавки ацетата и формиата приводили к аналогичному эффекту, что согласуется с данными литературы (Schellhorn, Stones, 1992;

Hengge Aronis, 2002).

* ** 300 Степень стимуляции экспрессии rpoS, % * ** * * * ** 0 25 50 75 Сукцинат, мМ Рис. 2. Влияние сукцината на экспрессию rpoS на уровнях транскрипции (1), трансляции (2) и стабильности белка RpoS (3) в экспонециальной фазе роста.

* - статистически значимые отличия от контроля;

** - статистически значимые отличия от предыдущей концентрации сукцината.

Исследование роли путресцина в регуляции экспрессии rpoS в условиях кислотного стресса, индуцированного внесением сукцината, показало отсутствие его стимулирующего влияния на транскрипцию и трансляцию rpoS. Однако на уровне стабильности белка путресцин обеспечивал статистически значимое повышение экспрессии (рис. 3) до 100% и более. В условиях добавки ацетата он вызывал принципиально сходный эффект.

* * экспрессии rpoS, % * Степень стимуляции ** ** 1 2 3 1 2 3 1 2 А Б В Рис. 3. Роль путресцина в регуляции экспрессии rpoS на уровне стабильности белка в экспоненциальной фазе роста E. coli RO91 при кислотном стрессе, индуцированном добавкой сукцината.

1 – стимулирующий эффект путресцина в концентрации А – 5 мМ, Б – мМ, В - 15 мМ;

2 – влияние 5 мМ сукцината;

3 – совокупный эффект путресцина в тех же концентрациях и 5 мМ сукцината. * - статистически значимые отличия от культуры с добавкой путресцина, ** - отличия от культуры с добавлением сукцината.

Таким образом, в присутствии различных органических кислот полиамины воздействуют на экспрессию rpoS по единому механизму, обусловленному положительной модуляцией стабильности S.

Выраженная индукция rpoS при действии ацетата в экспоненциальных культурах E. coli вызывала падение общего пула путресцина (в клетках и среде) и внутриклеточного содержания спермидина (рис. 4). В отличие от этого, искусственное отключение экспрессии rpoS, регистрируемое по снижению уровня экспрессии RpoS-зависимого гена osmY, индуцировало возрастание концентрации путресцина и спермидина в клетке по сравнению с контролем (рис. 5). Добавка путресцина в контрольную культуру вызывала концентрационно-зависимое возрастание экспрессии гена-мишени, подтверждая стимулирующее воздействие этого диамина на экспрессию rpoS (см. рис. 5).

75 путресцин в среде, нмоль/мг АСБ Путресцин в клетке, нмоль/мг АСБ * Спермидин в клетке, * * 0 1 2 3 1 2 А Б Рис. 4. Изменение содержания полиаминов в экспоненциально растущих клетках E. coli штаммов RO200, RO90 и RO91 при добавке ацетата.

А – контроль, без ацетата, Б - культуры с добавкой 50 мМ ацетата.

1 – внутриклеточная концентрация путресцина, 2 – спермидина, 3 – накопление путресцина в среде. * - статистически значимые различия содержания полиаминов в культурах с добавкой 50 мМ ацетата (Б) в сравнении с контролем (А).

Показанная отрицательная корреляция уровня экспрессии rpoS и накопления путресцина и спермидина в клетках (r=-0,54 и r=-0,76, соответственно) свидетельствует в пользу существования у E. coli механизма кислотоустойчивости, связанного с деградацией полиаминов. Это согласуется с тем, что гены, кодирующие белки, ответственные за катаболизм путресцина, gabDTPС (Schellhorn et al., 1998;

Baca-DeLancey et al., 1999), включены в оперон, находящийся под контролем S-зависимых промоторов, что может приводить к их индукции в стрессорных ситуациях, повышающих содержание S в клетке, в том числе – в условиях действия органических кислот (Metzner et al., 2004).

Таким образом, в условиях кислотного стресса добавка путресцина, посредством положительной регуляции содержания S, индуцирует гены собственного катаболизма, продукты которых участвуют в регуляции клеточного рН и поддержании гомеостаза полиаминов в клетке.

36 Экспрессия osmY, ед. Миллера 30 Спермидин, нмоль/мг АСБ * Путресцин, нмоль/мг АСБ * 24 * 18 12 * 6 0 1 23 4 56 Рис. 5. Влияние отключения rpoS на экспрессию гена-мишени osmY и содержание полиаминов в экспоненциально растущих клетках E. coli MC4100DE3Y pSOPR.

Уровень экспрессии osmY: 1 – в контрольной культуре, 2 – при отключении rpoS, 3 – в контрольной культуре с добавлением 5 мМ путресцина, 4 – то же с 10 мМ путресцина. Внутриклеточное содержание путресцина: 5 – в контрольной культуре, 6 – при отключении rpoS. Внутриклеточное содержание спермидина: 7 – в контрольной культуре, 8 – при отключении rpoS. * - статистически значимое отличие от контрольной культуры.

На основе собственных данных и анализа литературы может быть представлена следующая обобщённая схема, описывающая участие полиаминов в кислотоустойчивости E. coli (рис. 6). Органические кислоты индуцируют экспрессию rpoS, что способствует активации систем деградации путресцина до -аминобутирата (Metzner et al., 2004). При переаминировании последнего -кетоглутарат превращается в глутамат, вступающий в реакцию декарбоксилирования (Jung, Kim, 2003a), которое осуществляется при участии двух изоферментов GadAB и сопровождается связыванием протонов из цитоплазмы, составляя основу защиты E. coli от кислотного стресса на минимальных питательных средах. При этом добавка экзогенного путресцина как положительного модулятора rpoS и субстрата для деградации усиливает описанные процессы. Прекращение действия кислотного стресса способствует замедлению деградации путресцина.

Поскольку глутамат является отправной точкой пути образования орнитина, его поток из реакции декарбоксилирования направляется на синтез путресцина, вследствие чего происходит восполнение пула полиаминов в клетке и обеспечивается гомеостатическая регуляция их внутриклеточного содержания.

путресци -амино СО2 н сукцинат бутират SpeC СО Н орнити GadAB GabT ЦТК Н+ глутамат -кетоглутарат Путь биосинтеза путресцина Рис. 6. Схема регуляции внутриклеточного рН E. coli, включающая пути катаболизма и биосинтеза путресцина.

ЦТК – цикл трикарбоновых кислот. Пояснения даны в тексте.

Исследование полиаминов как фактора множественной антибиотикоустойчивости E. coli. В последнее время в литературе появляются данные, указывающие на возможность участия S-субъединицы РНК-полимеразы в формировании множественной лекарственной устойчивости E. coli (Greenway, England, 1999;

Rami et al., 2005;

Murakami et al., 2005). Результаты наших экспериментов с использованием генетических конструкций, позволяющих управлять экспрессией rpoS, свидетельствуют, что продукт данного гена, S-субъединица РНК-полимеразы принимает участие в формировании множественной антибиотикоустойчивости (рис. 7).

В условиях осмотического (рис. 8), теплового и кислотного стрессов (рис. 9), приводящих к повышению содержания S-субъединицы РНК полимеразы в клетке (Hengge-Aronis, 2002), наблюдается увеличение резистентности E. coli к действию фторхинолоновых антибиотиков в 2-4 раза по сравнению с контролем. В то же время, минимальные ингибиторные концентрации (МИК) -лактамных антибиотиков не изменяются.

4-кратное возрастание МИК левофлоксацина по мере снижения рН (рис. 10) сопровождалось увеличением внутриклеточной концентрации кадаверина, в 4 раза более высоким (при рН=5,5) в условиях добавки левофлоксацина (см. рис. 10). Это послужило основанием для предположения о том, что в отсутствие кислотного стресса антибиотики также способны индуцировать накопление полиаминов, что обеспечивает более высокую антибиотикоустойчивость бактериальной клетки.

0, МИК нетромицина, *100 нг/мл МИК цефазолина, мкг/мл, МИК левофлоксацина, цефотаксима, мкг/мл 0, 0, 0, 0, 0,00 1234 RpoS+ RpoS Рис. 7. Зависимость резистентности E. coli HS1600DE3Y pRPOS к левофлоксацину (1), цефотаксиму (2), цефазолину (3) и нетромицину (4) от индукции rpoS.

Примечание: микроорганизмы культивировали в колбах на среде М-9.

Экспрессию rpoS индуцировали добавлением к одной из культур 0,3 мМ ИПТГ (RpoS+), вторую оставляли интактной (RpoS-). По достижении максимальной индукции rpoS клетки освобождали от среды и использовали для определения МИК с добавкой ИПТГ к индуцированным клеткам.

0,40 1, пефлоксацина, цефотаксима, мкг/мл 0, 1, МИК цефазолина, мкг/мл МИК левофлоксацина, 0, 1, 0, 0,20 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,00 0, 12 12 12 ПФЛ ЦФТ ЦФЗ ЛФЛ Рис. 8. Изменение чувствительности E. coli М2073 к антибиотикам в условиях осмотического стресса, вызванного внесением 0,25 М NaCl.

1 - контрольная культура, 2 - культура в условиях осмотического стресса;

ЛФЛ - левофлоксацин, ПФЛ - пефлоксацин, ЦФТ - цефотаксим, ЦФЗ цефазолин.

0, МИК левофлоксацина, мкг/мл 0, 0, 0, 0, 0, 12 12 34 12 Этанол Контроль рН=5, 4% Рис. 9. Изменение чувствительности E. coli к левофлоксацину в условиях теплового (4% этанола) и кислотного (рН=5,8) стрессов и добавки путресцина (ПТ).

1 – E. coli M2073, 2 – E. coli М2076, 3 - E. coli M2073 + 5 мМ ПТ, 4 - E. coli М2076 + 5 мМ ПТ. Контроль – отсутствие стрессового воздействия.

* МИК левофлоксацина, мкг/мл Кадаверин, мкмоль/мг АСБ 0,04 0,02 0,00 123 123 123 123 123 7,4 7,0 6,6 6,4 5,8 5,5 рН Рис. 10. Резистентность E. coli М2073 к левофлоксацину (3) и изменение содержания кадаверина в клетках в отсутствие (1) и в присутствии (2) антибиотика в зависимости от рН среды.

* - статистически значимое отличие указанной группы от контроля.

Примечание: культуры микроорганизмов взяты для анализа из лунок иммунологических планшетов в экспериментах по определению МИК.

Результаты исследований показали статистически значимое возрастание внутриклеточных концентраций полиаминов в ответ на добавку -лактамных и фторхинолоновых антибиотиков в отсутствие других стрессовых воздействий (рис. 11). При этом достижение максимального внутриклеточного уровня путресцина и спермидина наблюдалось уже на 2-ой час после добавки антибиотиков и существенно опережало по времени возрастание концентрации кадаверина, которое отмечено к 6-му часу после добавки (см. рис. 11). Максимальная индукция экспрессии rpoS в ответ на добавку фторхинолоновых и -лактамных антибиотиков наблюдалась уже к 4-му часу после их внесения (рис. 12), то есть следовала за возрастанием концентраций путресцина и спермидина и предшестовала накоплению кадаверина. Это свидетельствует о функциональной специализации полиаминов в механизме формирования устойчивости к антибиотикам.

+ * полиаминов, нмоль/мг АСБ Содержание клеточных + * * *+ * + 200 + * ** ++ * + * *+ * * +* * * + *+ + * ** * ** 1234567 1234567 спермидин путресцин кадаверин Рис. 11. Изменение внутриклеточного содержания полиаминов в условиях воздействия сублетальных концентраций антибиотиков на культуры E. coli RO200 и RO91 в среде LB.

1 – контроль, без антибиотика, 2 – 0,7 мкг/мл цефотаксима;

3 – 8 мкг/мл цефазолина;

4 – 120 мкг/мл ампициллина;

5 – 0,012 мкг/мл левофлоксацина;

6 – 0,038 мкг/мл пефлоксацима;

7 – 0,08 мкг/мл нетромицина.

Заштрихованные столбцы – через 2 часа после добавки антибиотика, тёмные - через 6 часов. * - статистически значимое отличие от контроля;

+ - отличие от той же группы, взятой через 2 часа после добавки антибиотика.

^ на посттранскрипционном уровне, ед. Миллера Экспрессия rpoS ^ 300 * ^ * *+ *^ * 1 2 3 4 5 6 Рис. 12. Изменение экспрессии rpoS в культуре E. coli RO91 через 2 (светлые столбцы), 4 (тёмные столбцы) и 6 (заштрихованные столбцы) часов после внесения антибиотиков в среду культивирования (LB бульон).

1 – контроль, без добавок;

2 – 0,7 мкг/мл цефотаксима;

3 – 8 мкг/мл цефазолина;

4 – 120 мкг/мл ампициллина;

5 – 0,012 мкг/мл левофлоксацина;

6 – 0,038 мкг/мл пефлоксацима;

7 – 0,08 мкг/мл нетромицина. * - отсутствие статистически значимых различий данной группы с контролем;

+ отсутствие различий c данной группой, взятой на второй час;

^ - отсутствие различий с данной группой в предыдущий период времени.

Фторхинолоны по структуре близки к сигнальным молекулам системы ощущения кворума, относящимся к классу 4-хинолонов (Pesci et al., 1999), которые могут воздействовать на экспрессию rpoS (Diggle et al., 2003;

Yang et al., 2006). Этот механизм, по-видимому, лежит в основе индукции rpoS (см.

рис. 12), положительно модулируемой путресцином и спермидином, что повышает экспрессию генов-мишеней rpoS-регулона, в том числе ldc, кодирующего лизиндекарбоксилазу (Kikuchi et al., 1998). Накопление кадаверина снижает транспортную активность пориновых каналов E. coli (рис. 13) и, замедляя проникновение антибиотиков в клетку (рис. 14), способствует повышению лекарственной устойчивости (см. рис. 10).

Добавка к культуре E. coli -лактамных антибиотиков, как и внесение фторхинолонов, вызывала изменение внутриклеточных концентраций полиаминов, причём их временная динамика была выражена более ярко (см.

рис. 11). Вместе с тем, статистически значимое влияние антибиотиков этой группы на содержание S в клетке отмечается лишь в первые часы после их добавки (см. рис. 12). Это даёт основание утверждать, что RpoS-зависимый механизм адаптации E. coli к -лактамным антибиоткам не является основным и действует наряду с каким-то иным, не связанным с S, но включающим участие полиаминов.

Изменение поринового транспорта, % 0 50 100 200 Концентрация кадаверина, мМ Рис. 13. Зависимость активности поринового транспорта от концентрации экзогенного кадаверина в культуре E. coli M2073 pBR322.

Показаны средние значения коэффициентов проницаемости, выраженные в процентах по отношению к контролю (транспорт в отсутствие кадаверина).

транспорта, *10 см/сек Активность поринового - * 1 Рис. 14. Изменение активности поринового транспорта при действии антибиотиков в культуре E. coli RO91 pBR322 в среде LB. 1 – контроль, без добавок, 2 – добавка 0,038 мкг/мл пефлоксацина. * статистически значимые отличия от контрольной культуры.

Нетромицин, в отличие от других исследованных антибактериальных препаратов, не только не приводил к возрастанию внутриклеточных концентраций полиаминов (см. рис. 11), но и вызывал статистически значимую репрессию rpoS (см. рис. 12). Адаптация бактериальной клетки к действию этого антибиотика, очевидно, осуществляется без участия полиаминов.

Таким образом, полиамины принимают участие в формировании устойчивости E. coli к действию фторхинолоновых и -лактамных антибиотиков. При этом наблюдается специализация их функций, когда путресцин и спермидин преимущественно играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, а кадаверин, в первую очередь, выполняет функции ингибитора поринового транспорта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты проведенных исследований свидетельствуют о значительной роли полиаминов в формировании множественной стрессорной устойчивости E. coli. В условиях перехода культур E. coli к стационарной фазе роста и глюкозному голоданию путресцин, кадаверин и спермидин оказывают стимулирующий эффект на экспрессию rpoS. Для спермидина он проявляется преимущественно в регуляции транскрипции, для путресцина и кадаверина – на уровнях трансляции и стабильности белка. По возрастанию стимулирующего эффекта на экспрессию rpoS исследованные полиамины можно расположить в ряд кадаверинпутресцинспермидин. В условиях кислотного стресса, когда действие продуктов метаболизма E. coli, ацетата, формиата и сукцината, индуцирует процесс трансляции мРНК rpoS и приводит к повышению стабильности RpoS, полиамины препятствуют протеолизу S. На основании полученных результатов и данных литературы предлагается схема, иллюстрирующая участие полиаминов в адаптации E. coli к кислотному стрессу на минеральной среде с глюкозой.

Формирование адаптивного ответа E. coli на различные стрессорные воздействия сопровождается повышением антибиотикоустойчивости, происходящем при участии кадаверина, накапливающегося в клетке в результате активации синтеза S. Этот же механизм функционирует при действии -лактамных и фторхинолоновых антибиотиков в отсутствие других видов стресса. При этом наблюдается специализация функций различных полиаминов в реализации ими защитных механизмов. Путресцин и спермидин преимущественно играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, тогда как кадаверин блокирует пориновую проницаемость клеточной стенки E. coli, что позволяет рассматривать S-зависимую систему его синтеза как механизм формирования устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.

Таким образом, изучение роли полиаминов в условиях стационарной фазы роста, приспособлении к углеводному голоданию, действию антибиотиков и слабых кислот свидетельствует об их участии, по меньшей мере, в двух адаптивных механизмах: (1) регуляции уровня экспрессии rpoS при действии спермидина и путресцина;

(2) ограничении пориновой проницаемости внешней мембраны E. coli посредством блокирования работы поринов при участии кадаверина. Тесное взаимодействие RpoS, как глобального регулятора общего стрессового ответа, и полиаминов, регуляторная активность которых лежит в основе функционирования полиаминового модулона, предоставляет бактериальной клетке широкий спектр адаптивных возможностей и позволяет выработать адекватные приспособительные реакции в ответ на разнообразные стрессорные воздействия.

ВЫВОДЫ 1. Установлено, что полиамины оказывают стимулирующий эффект на экспрессию rpoS в клетках E. coli при переходе к стационарной фазе роста и в условиях голодания по глюкозе на уровнях регуляции транскрипции, трансляции и стабильности белка. При этом величина стимулирующего эффекта полиаминов возрастает в ряду кадаверинпутресцинспермидин.

2. Экспериментально показано, что путресцин стимулирует экспрессию rpoS, индуцированную кислыми продуктами обмена, на уровне белковой стабильности, что приводит к усилению RpoS-зависимой деградации полиаминов, которая играет роль в адаптации E. coli к кислотному стрессу.

3. Выявлено, что воздействие кислотного, теплового и осмотического стрессов на клетки E. coli сопровождается возрастанием устойчивости бактерий к фторхинолоновым антибиотикам.

4. Установлено, что ответная реакция E. coli на воздействие сублетальных концентраций -лактамных и фторхинолоновых антибиотиков включает возрастание внутриклеточного содержания путресцина и спермидина, которые играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, что не наблюдается при добавке аминогликозидов.

5. Показано, что содержание кадаверина в клетках E. coli в условиях воздействия на них сублетальных концентраций фторхинолоновых и лактамных антибиотиков находится под контролем S-субъединицы РНК полимеразы.

6. Установлено, что кадаверин, в отличие от экспрессионных модуляторов путресцина и спермидина, преимущественно выполняет функции ингибитора транспортной активности пориновых каналов E. coli, повышая выживаемость бактериальных клеток в условиях воздействия фторхинолоновых и -лактамных антбиотиков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Шумков М.С., Ткаченко А.Г., Нестерова Л.Ю. Роль полиаминов в транскрипционной регуляции csiD, гена адаптации Escherichia coli к стрессу углеводного голодания//В кн.: Проблемы загрязнения окружающей среды:

Тез.V Междунар. конфер. - Пермь, 2001. - С. 107.

2. Шумков М.С., Нестерова Л.Ю., Ткаченко А.Г. Путресцин как модулятор экспрессии rpoS и csiD генов адаптации Escherichia coli к стационарной фазе//В кн.: Биология – наука XXI века. 6-я Пущинская школа конфер. молодых учёных. - Пущино, 2002. - Т. 1. - С. 348.

3. Шумков М.С. Путресцин как модулятор экспрессии rpoS гена адаптации Escherichia coli к различным типам стационарной фазы//В кн.:

Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Матер.

межрегион. конфер. молодых учёных. - Пермь, 2002. - С. 73-75.

4. Ткаченко А.Г., Чудинов А.А., Пшеничнов М.Р., Нестерова Л.Ю., Шумков М.С. Полиамины как регуляторы адаптивных ответов микроорганизмов на стресс углеводного голодания//В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: Результаты научных исследований, полученные за 2001 г. Аннотационные отчёты. - Пермь, 2002. - С. 108-111.

5. Ткаченко А.Г., Шумков М.С., Чудинов А.А. Полиамины как регуляторы адаптивных ответов микроорганизмов на стресс углеводного голодания//В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: Результаты научных исследований, полученные за 2002 г. Аннотационные отчёты. - Пермь, 2003. С. 229-233.

6. Ахова А.В., Шумков М.С. Продукты обмена периодической культуры Escherichia coli как индукторы гена rpoS в условиях стационарной фазы//В кн.: Биология – наука XXI века. 8-я Пущинская школа-конфер. молодых учёных. - Пущино, 2004. - С. 42.

7. Шумков М.С. Путресцин как модулятор экспрессии гена rpoS в периодической культуре Escherichia coli в условиях добавки ацетата//Там же.

- С. 73.

Ткаченко А.Г., Шумков М.С. Роль путресцина в регуляции уровня S 8.

субъединицы РНК-полимеразы в клетках Escherichia coli при переходе к стационарной фазе//Биохимия. - 2004. - Т. 69, вып. 8. - С. 1079-1087.

9. Ткаченко А.Г., Шумков М.С., Чудинов А.А. Полиамины как регуляторы адаптивных ответов микроорганизмов на стресс углеводного голодания//В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: Результаты научных исследований, полученные за 2003 г. Аннотационные отчёты. - Пермь, 2004. С. 204-212.

10. Шумков М.С., Ахова А.В. Продукты обмена периодической культуры Escherichia coli как регуляторы экспрессии гена rpoS//В кн.: Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. - Екатеринбург-Пермь:

УрО РАН, 2004. - С. 47-59.

11. Шумков М.С. Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к кислотному стрессу//В кн.: Биология – наука XXI века: 9-я Междунар.

Пущинская школа-конфер. молодых учёных. - Пущино, 2005. - С. 105.

12. Ахова А.В., Шумков М.С., Чугаева Т.А., Ткаченко А.Г. Полиамины как факторы адаптации E. coli к кислотному стрессу//В кн.: Проблемы загрязнения окружающей среды: Матер. VI Междунар. конфер. - Пермь, 2005. - С. 55.

13. Ткаченко А.Г., Шумков М.С., Ахова А.В. Путресцин как модулятор содержания S-субъединицы РНК-полимеразы в клетках Escherichia coli при кислотном стрессе//Биохимия - 2006. - Т. 71, вып. 2. - С. 237-246.

14. Шумков М.С. Путресцин как положительный модулятор экспрессии гена rpoS Escherichia coli//В кн.: Биология – наука XXI века: 10-я Пущинская школа-конфер. молодых учёных. - Пущино, 2006. - С. 221.

15. Ткаченко А.Г., Пожидаева О.Н., Шумков М.С. Роль полиаминов в формировании множественной антибиотикоустойчивости Escherichia coli в условиях стрессорных воздействий//Биохимия - 2006. - Т. 71, вып. 9. - С.

1287-1296.

16. Ткаченко А.Г., Шумков М.С., Чудинов А.А. Полиамины как факторы адаптации микроорганизмов к кислотному стрессу//В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: Результаты научных исследований, полученные за 2005 г. Аннотационные отчёты. - Пермь, Екатеринбург, 2006. - С. 199-202.

_ Подписано в печать 27.04.2007. Тираж 110 экз.

Формат 90X60/16. Усл. печ. л. 1,5.

Бумага ВХИ. Набор компьютерный.

Заказ № 262-к/2007.

_ Издательский дом “Пресстайм” Адрес: 614025, г. Пермь, ул. Героев Хасана,

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.