Ханиповна цитогенетические эффекты нефтехимического загрязнения у детей чеченской популяции в зависимости от полиморфизма генов оксидативного ответа, детоксикации ксенобиотиков и репарации днк

Солтаева Арбият Магомед - Ханиповна ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ У ДЕТЕЙ ЧЕЧЕНСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ОКСИДАТИВНОГО ОТВЕТА, ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ И РЕПАРАЦИИ ДНК 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2013 Работа выполнена в лаборатории экологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждении науки Института общей генетики имени Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва Научный руководитель: Рубанович Александр Владимирович доктор биологических наук Официальные оппоненты: Осипов Андреян Николаевич, доктор биологических наук заведующий лабораторией радиационной биофизики, ФГБУ Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна ФМБА России.

доктор биологических наук, Жукова Ольга Владимировна, доцент заведующая лабораторией генетики человека, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.

Федеральное государственное бюджетное Ведущее учреждение:

учреждение науки Институт биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук Защита диссертации состоится «23» мая 2013г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук по адресу: 119991, ГСП-1, г. Москва, ул. Губкина, дом 3. Факс: (499) 132-89-62, e-mail: [email protected] С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан «_» апреля 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.А. Синельщикова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования.

В последние годы, в связи с увеличением объемов добычи нефти в России, одним из серьезных загрязнителей окружающей среды нашей страны является нефть и нефтепродукты. Проблема загрязнения окружающей среды продуктами первичной переработки нефти особенно остро стоит в Чеченской Республике, которая несколько последних десятилетий относится к числу самых неблагополучных в экологическом отношении территорий на Северном Кавказе. Несмотря на то, что крупные промышленные предприятия не функционируют в последние годы, мощными источниками загрязнения окружающей среды на территории Чеченской республики являются многочисленные горящие нефтяные скважины, а также открытое горение нефти и ее переработка на кустарных мини-заводах (Джамбетова и др., 2009;

Солтаева и др., 2011).

Компоненты нефти (полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), бенз[а]пирен, фенолы, тяжелые металлы и др.) и продукты ее переработки оказывают токсическое, мутагенное, канцерогенное действие на живые организмы, что также приводит к нарушению генетической структуры природных популяций (Petrilli et al, 1980;

Dickson et al, 1980;

Granella et al, 1991;

Granella et al, 1995;

Бочков с соавт., 1989;

Сериков, Оразбаев, 2002).

Важную роль в ограничении оксидативного стресса, возникающего как ответ на экзогенные и эндогенные интоксикации, влияние техногенных загрязнений окружающей среды и излучения играют специализированные системы ферментативных антиоксидантов. Необходимые для защиты от активных форм кислорода, выработанные в процессе эволюции во всех типах клеток, действие которых зависит от полиморфизма детерминируемых их генов.

В настоящее время систематические данные о влиянии нефтехимических продуктов на генетическое здоровье населения, проживающего на загрязненных территориях, малочисленны. В частности, полностью отсутствуют данные о возможном генотоксическом влиянии нефтехимических продуктов на детей младшего школьного возраста, организм которых наиболее чувствителен к негативным факторам окружающей среды.

Цель работы и задачи исследования.

Анализ ассоциаций генетического полиморфизма с цитогенетическими показателями в буккальных эпителиоцитах детей чеченской популяции, проживающих в разных природно-климатических зонах и при различных уровнях загрязнения окружающей среды продуктами первичной переработки нефти.

Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Оценить однородность чеченской популяции в загрязненных и экологически благополучных районах по полиморфным локусам:

- генов 1-й и 2-й фаз биотрансформации ксенобиотиков (гена CYP1A rs2606345, rs4646903, rs1048943, CYP1B1 rs1056836, NQ01 rs1800566, GSTT1, GSTM1);

- генов репарации ДНК (гена XRCC1 rs1799782, rs25487, гена XPD rs1799793, rs13181, ERCC1 rs11615, APEX rs1130409, ATM rs664143, OGG rs1052133, ADPRT rs1136410, ABCB1 rs1045642 );

- генов оксидативного ответа (SOD2 rs4880, CAT rs7943316, GCLC rs17883901);

- гена-триггера MTHFR C677T rsl801133.

2. Сравнить частоты микроядер в буккальных эпителиоцитах детей из разных эколого-ландшафтных районов;

3. Провести анализ сопряженности полиморфизма перечисленных генов с уровнем частот микроядер в буккальных эпителиоцитах исследованных выборок детей.

Научная новизна работы.

Впервые определены частоты генов репарации ДНК, детоксикации ксенобиотиков и оксидативного ответа в чеченской популяции.

Впервые показано, что для детей, имеющих контакт с продуктами первичной переработки нефти в непроизводственной сфере, характерен повышенный уровень микроядер в клетках буккального эпителия.

Впервые проведен анализ сопряженности генетического полиморфизма ферментов биотрансформации ксенобиотиков, репарации и оксидативного ответа с цитогенетическими параметрами у лиц, проживающих в экологически чистых селах и в селах с загрязнением почв нефтепродуктами.

Практическая значимость работы.

Данная работа показывает ключевую роль молекулярно-генетических методов в оценке здоровья населения на донозологическом уровне.

Результаты исследования демонстрируют целесообразность включения разработанных методов в программу проведения предварительных медицинских осмотров;

анализа причин возникновения экологозависимых заболеваний;

определения повышенного риска профессиональной, мультифакториальной патологии;

при формировании групп специалистов устраняющих техногенные аварии и работающих в условиях загрязнения окружающей среды продуктами первичной переработки нефти.

Основные положения, выносимые на защиту.

Частоты генотипов изученных полиморфных вариантов генов у детей чеченской популяции, имеющих, контакт с нефтепродуктами и детей контрольной группы не различаются.

Дети чеченской популяции, проживающие в условиях загрязнения почв нефтепродуктами и в экологически благополучных селах, различаются по цитогенетическим показателям.

Генетический полиморфизм по системе ферментов антиоксидантов SOD2 rs4880, CAT rs7943316, GCLC rs17883901 ассоциирован с уровнями цитогенетических аномалий в соматических клетках детей чеченской популяции из разных эколого-ландшафтных районов.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Объединенном пленуме научных советов РФ по экологии человека и гигиене окружающей среды (Москва, 15-16 декабря, 2010г.);

Всероссийской конференции «Наука и образование в ЧР: состояние и перспективы» (г. Грозный, 7 апреля 2011 г.);

Всероссийской ежегодной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и молодежь» (г. Грозный, 3-4 июня 2011г.);

международной молодежной конференции «Популяционная генетика:

современное состояние и перспективы» посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова (Москва, 17-18 ноября 2011г.);

на заседании Ученого совета Учреждения Российской академии наук Комплексного научно-исследовательского института им. Х.И. Ибрагимова РАН (г. Грозный, 28 ноября 2011г.).

Декларация личного участия автора.

Автором лично проведен сбор биоматериала у детей для исследования.

Подготовка цитогенетических препаратов и просчет микроядер в клетках буккального эпителия детей проведена совместно с к.б.н., доцентом Джамбетовой П.М.. Самостоятельно проведено генотипирование исследуемых выборок по локусам CYP1A1 (rs2606345, rs4646903, rs1048943, rs1056836), NQ01 (rs1800566), GSTM1 (инсерционно-делеционный полиморфизм), GSTT (инсерционно-делеционный полиморфизм), XRCC1( rs1799782, rs25487), гена XPD (ERCC2) (rs1799793, rs13181), ERCC1 (rs11615), APEX1 (rs1130409), ATM (rs664143), OGG1 (rs1052133), ADPRT (PARP1) (rs1136410), ABCB1(MDR1) (rs1045642), MTHFR (rs1801133), SOD2 (rs4880), CAT (rs7943316), GCLC (rs17883901). Автором также проведена статистическая обработка полученных результатов, оформлены результаты тезисов и докладов для научных конференций и все материалы диссертации.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 115 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и обсуждение результатов, выводы, список использованной литературы, приложение и список сокращений. Указатель литературы содержит 201 источника, в том числе 131 на иностранном языке. Текст работы иллюстрирован 9 таблицами и рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Изученные выборки.

Проведено генотипирование по 21 локусу и цитогенетическое обследование у 529 детей чеченской популяции в возрасте от 7 до 11 лет, проживающих в восьми селах разных районов Чеченской Республики. Из них три села с различной степенью загрязнения нефтепродуктами, где в течение 15 лет проводилась первичная переработка нефти кустарным способом (Долинск, Мескер-Юрт, Николаевская). Пять сел, где подобного производства не было, представляют экологически «чистые» высокогорные поселки - Шатой, Зандак и равнинные экологически благополучные села (Гойты, Червленная, Ачхой-Мартан).

Были обследованы только дети из семей коренных жителей региона. Все они относятся к одной национальности - чеченцы. Родители каждого ребенка заполнили анкету, содержащую сведения о ребенке. От всех родителей получено информационное согласие на проведение генетического исследования (Таблица 1).

Таблица Характеристика обследованных районов и групп детей чеченской популяции Населенный Число детей Средний возраст Район пункт Мальчики Девочки Мальчики Девочки Долинск 8.28±0.16 8.44±0. 40 «Загрязнен Мескер 7.87±0.12 8.20±0. -ный» 46 Юрт нефтью Николаевская 8.33±0.23 8.5±0. 15 Червленая 8.64±0.10 8.53±0. 25 Гойты 8.89±0.15 8.67±0. 19 Зандак 9.22±0.17 8.75±0. 18 Экологи Шатой 8.05±0.22 8.21±0. 18 чески Ачхой «чистый» 8.05±0.25 8.20±0. 85 Мартан 266 Всего 8.36±0.07 8.44±0. 529 детей Материалом исследования являлись клетки слизистых оболочек полости рта буккальные эпителиоциты и клетки периферической крови.

Несмотря на то, что в настоящее время в Чеченской республике крупные промышленные предприятия разрушены и не функционируют, количество выбрасываемых вредных веществ не уменьшилось, а скорей всего, увеличилось за счет переработки нефти на кустарных мини-установках и десятка нефтяных скважин, горевших в течение нескольких лет. С конца 1999 года по 2002 год число горящих нефтяных скважин колебалось от 28 до 50, а вокруг г. Грозного было равно 14. К 2001г. уровень загрязнения нефтепродуктами почв территории республики превышает ПДК на 10%. (Оценка природного потенциала, 2001).

И.Я. Шахтамировым с соавторами (2010) получены результаты определения суммы нефтепродуктов в почвах населенных пунктах Чеченской республики (Таблица 2).

Таблица Содержание нефтепродуктов в почвах Чеченской республики (Шахтамиров и др., 2010).

№ пробы Район Сумма нефтепродуктов, мкг/г почвы Грозненский 7 71, Ножай - Юртовский 15 33, Шалинский 18 41, Урус – Мартановский 32 16, Ачхой - Мартоновский 38 24, Шелковской 49 62, Таблица Показатели загрязнения почв нефтепродуктами в экологически чистых и загрязненных нефтепродуктами селах Чеченской республики (по данным Биткаевой и др., 2011) Нефтепродукты Геоступень Населенные пункты мкг/г почвы 1 Горная Зандак (Шатой) 18,0(24,7) 2 Равнинная Гойты/Мескер-юрт (Долинск) 19,0/42, 3 Низменная Червленная/Николаевская 21,7/135, Кариологический анализ буккального эпителия.

Цитогенетические исследования проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека» (Беляева и др., 2005) и классификацией Л. П. Сычевой (Сычева, 2007).

Биоматериал у обследуемых детей брали со слизистой щеки в области коренных зубов стерильным шпателем и затем равномерно распределяли по поверхности предметного стекла. Из материала, полученного от одного ребенка, готовили по 2 предметных стекла. Материал высушивали при комнатной температуре и погружали в свежеприготовленный фиксатор: смесь этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1).

Препараты помещали на 1 час в 2,5% раствор ацето-орсеина (orcein Merck) при 37 °С для окраски хроматина, затем докрашивали цитоплазму 1% раствором светлого зеленого (light green, ICN Biomedicals Inc.) при комнатной температуре в течение 1 мин. На шифрованных препаратах учитывали частоту клеток с микроядрами. На каждом препарате изучали по 1000 клеток.

Генотипирование по генам кандидатам.

Образцы крови собирали в эппендорфы, содержащие К2ЭДТА, и хранили при t = - 18C. ДНК выделяли из клеток периферической крови с помощью наборов Diatom DNA Prep 200, основанных на использовании гуанидинтиоционата и Nucleus - соберната (фирма Изоген, Москва).

Генотипирование проводили методом аллель-специфической тетрапраймернаой ПЦР. Праймеры подбирали с использованием программы РrіmегЗ, находящейся в открытом доступе (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/).

Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 2% ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Статистические методы анализа.

Статистическую обработку результатов исследований проводили стандартными методами с помощью пакета WinSTAT 2003.1, интегрированного в Excel. При сравнении межгрупповых различий частот микроядер использовали непараметрический критерий U-критерий Манна-Уитни.

Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью критерия 2.

Проводили ROC-анализ для точной оценки зависимости чувствительности теста (Se) от специфичности (Sp) при изменении порогового значения числа микроядер. – графическая характеристика качества ROC-кривая количественного классификатора;

зависимость доли верных положительных классификаций от доли ложных положительных классификаций при варьировании порога решающего правила. Преимуществом применения ROC кривой является её инвариантность относительно отношения цены ошибки I и II рода.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты цитогенетического обследования детей чеченской популяции.

Для реализации поставленных задач в рамках данного исследования нами проведен микроядерный тест на клетках слизистой оболочки щеки для 529 детей, из которых 200 человек проживают в экологически загрязненных нефтехимическими веществами районах и 329 человек в экологически «чистых» селах.

В результате анализа уровня цитогенетических нарушений нами выявлена значимо повышенная частота цитогенетических нарушений у детей, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды нефтепродуктами.

Так, наблюдалось трехкратное повышение частоты микроядер у детей, проживающих в «загрязненных» нефтепродуктами селах Мескер-Юрт (1,98 ± 0,34) и Долинск (1,72 ± 0,39) по сравнению с частотой микроядер у детей из экологически «чистых» территорий Гойты (0,43 ± 0,18), Червленная (0,48 ± 0,22), Ачхой - Мартан (0,54 ± 0,11). В высокогорных селах наблюдалась повышенная частота микроядер - Зандак (0,74 ± 0,28) и Шатой (0,84 ± 0,36).

Мы предполагаем, что причиной этих отличий внутри «чистого» района может служить повышенный фон природной ионизирующей радиации и УФ – облучения в горной местности. Экзогенными природными источниками повреждений ДНК являются солнечный свет, естественный фон ионизирующей радиации (Засухина, 2011). В тоже время в «загрязненном» Николаевске отмечен более низкий уровень микроядер (0,49 ± 0,29), что, возможно, связано с невысокой концентрацией ПАУ, в том числе бенз[a]пирена, анализы содержания, которых не проводились.

Средние частоты микроядер достоверно отличались, составляя у детей в «загрязненных» районах 1.54±0.23 на 1000 просмотренных клеток и 0.58±0.09 в «чистых» районах на 1000 клеток (p=4.810-9) (рис.1).

1, Частоты микроядер на тысячу клеток 1, 1, 1, 1, 0, 0, 0, 0, 0, Чистые районы Загрязненные районы Рисунок 1. Средние частоты микроядер у детей, проживающих в «чистых» и загрязненных нефтепродуктами районах.

У 58% детей из экологически чистых населенных пунктов не было зарегистрировано микроядер. По 3 микроядра на 1000 клеток имели всего 2% детей. В «загрязненных» нефтепродуктами районах число детей, не имевших микроядер на 1000 клеток, составило только 33%, и в то же время у 27% детей было выявлено по 1 микроядру, по 2 и 3 микроядра имели 20% и 8% детей соответственно. Повышенное количество микроядер (4 и больше) зарегистрировано только у детей из загрязненных нефтепродуктами территорий (рис.2).

- чистый район - грязный район 70, 60, Частоты (%) 50, 40, 30, 20, 10, 0, 0 1 2 3 4 5 6 Количество микроядер на тысячу клеток Рисунок 2. Распределение частот клеток с микроядрами у детей, проживающих в загрязненных и экологически «чистых» районах.

Эффективность микроядерного теста для обнаружения генотоксического действия продуктов нефтепереработки подтверждается результатами ROC анализа (рис.3).

1-Sp Рисунок 3. ROC-кривая, построенная по распределениям, представленным на рисунке 2.

Кривая отражает зависимость чувствительности теста (Se) от специфичности (Sp) при изменении порогового значения числа микроядер, превышение которого свидетельствует о наличии загрязнения окружающей среды. Площадь под ROC-кривой равна AUC=0,677 0,025 (p-value = 810-12).

Изучение полиморфных вариантов генов у детей чеченской популяции.

Результаты изучения аллельных вариантов генов оксидативного ответа SOD2 C47T, CAT T21A, GCLC C129T представлены в таблице 4.

Таблица Частоты генотипов полиморфных генов SOD2 C47T, CAT C129T, GCLC C129T у детей, проживающих на территории, загрязненной нефтепродуктами и в группе сравнения № Локусы и генотипы Контроль Экспонированные п/п N % P N % P 1 SOD2 T/T 108 34,07 49 34, C47T 0,42 43,75 0, T/C 160 50,47 rs4880 C/C 49 15,46 32 22, 2 CAT T/T 151 46,60 78 41, T21A 0,27 40,96 0, T/A 146 45,06 rs7943316 A/A 27 8,33 33 17, 3 GCLC C/C 282 88,68 144 89, C129T 0.29 10,56 0, C/T 36 11,32 rs17883901 T/T 0 0 0 N - количество человек;

% - частота встречаемости данного генотипа;

Р – значимость отличий от распределения Харди-Вайнберга.

Проведенный анализ полиморфизма гена SOD2 C47T показал, что частота гетерозиготного генотипа T/C в экспонированной группе составляет 43,8%, что несущественно отличается от таковой в группе контроля - 50,5%. Определено, что частота мажорного генотипа T/T в группе экспонированных лиц и в группе сравнения составила 34,0% и 34,1% соответственно. Среди экспонированных лиц частота минорного генотипа C/C гена SOD2 C47T составила 22,2%, а в контрольной группе частота встречаемости данного генотипа - 15,5%.

В данной работе частота гетерозиготного генотипа T/A гена CAT T21A в группе экспонированных лиц и в группе сравнения составила 41,0% и 45,1% соответственно. Частота мажорного генотипа T/T у детей из загрязненных сел (46,6%) и в контрольной группе (41,5%) одинакова, в то время как частота минорного генотипа A/A гена CAT T21A у детей из экспонированной группы существенно выше (17,6%) встречаемости данного генотипа у детей из экологически «чистых» населенных пунктов (8,3%).

Как видно из табл. 4. распределение частот генотипов гена GCLC C129T одинаково в контрольной и в экспонированной группах (значимость отличий от распределения Харди-Вайнберга составила р = 0,29 и р = 0,48 соответственно).

Частота мажорного генотипа C/C составила 89%, гетерозиготного генотипа C/T - 11%, минорного T/T - 0%.

Распределение генотипов изученных полиморфных вариантов генов оксидативного ответа SOD2 C47T, CAT T21A, GCLC C129T, как в контрольной выборке, так и в группе экспонированных соответствовало ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга.

Исследование и анализ частот полиморфных генов детоксикации ксенобиотиков.

Нами были установлены частоты генотипов и аллелей полиморфных генов детоксикации ксенобиотиков CYP1B1(G1294C), CYP1A1(T606G, A4889G, Т3801С), GSTM1, GSTT1 и NQ01(609CT) у детей, проживающих на загрязненной нефтепродуктами территории, и в группе контроля (табл. 5).

В контрольной группе отклонение от равновесия Харди – Вайнберга, обусловленное избытком гетерозигот, обнаружено для CYP1B1 G1294C (p=0.008), также избыток гетерозигот наблюдается по локусу CYP1A1 A4889G (p=0.010). В остальных случаях частоты аллельных вариантов соответствовали распределению Харди-Вайнберга.

Проведенное в данной работе исследование частоты генотипов и аллелей локуса CYP1A1 Т3801С не выявило существенных различий между экспонированной и контрольной группой, и составили в экспонированной группе: T/T - 88,4%, C/C – 0%, T/C - 11,6%;

в контрольной группе - 84,7%,0% и 15,26%, соответственно.

Распределение частот генотипов локуса CYP1A1 T606G в экспонированной группе (T/T - 27,1%, T/G - 57,8%, G/G - 15,1%) также не отличалось от группы сравнения (T/T - 34,5%, T/G - 48,9%, G/G - 16,6%).

Частоты гомозиготных генотипов локуса CYP1A1 A4889G по мажорному (A/A) и минорному аллелю (G/G) отличались незначительно в экспонированной (85,4% и 0%) и контрольной группах (90,4% и 0%). По гетерозиготному генотипу A/G наблюдается повышенная частота в экспонированной группе (14,6%), по сравнению с контрольной (9,6%). В проведенном исследовании частота нулевого генотипа по гену GSTM1 не различалась и составляла 56,1% и 53,0% в группе контроля и группе экспонированных детей, соответственно (табл.5).

Как видно из табл. 5., нами не выявлено различий в частоте встречаемости как нулевого генотипа Del/Del гена GSTT1 в группе экспонированных лиц 12,5% и в группе сравнения 11,4% так и нормального аллеля I/* 87,5% и 88,7%. Полученные результаты соответствуют данным литературы: частота делеции гена GSTT1 варьирует от 15% до 30% в европеоидных популяциях. (Баранов B.C. с соавт., 2000;

Garte et al., 2001).

Распределения частот генотипов гена NQ01 609CT в группе сравнения и в экспонированной группе также не различаются. Частота генотипа C/C составила 57,2% и 60,8%, C/T - 36,8% и 33,6%,T/T около 6%.

Полученные частоты как для генов GSTT1 и GSTM1, так и для остальных полиморфных вариантов генов системы детоксикации ксенобиотиков, изученных в настоящей работе близки к значениям в других европеоидных популяциях.

Таблица Частоты генотипов и аллелей полиморфных генов CYP1B1 (G1294C), CYP1A1 (T606G, A4889G, Т3801С), GSTM1,T1, NQ01 в изученной выборке № Контроль Экспонированные п/ Локусы и генотипы N % P N % P п C/C 0 0,00 0 0, CYP1A Т3801С 1 T/C 49 15,26 20 11, 0.2 0. rs4646903 T/T 272 84,74 153 88, G/G 54 16,62 29 15, CYP1A 2 T606G T/G 159 48,92 111 57, 0.85 0. rs2606345 T/T 112 34,46 52 27, A/A 282 90,38 169 85, CYP1A 3 A4889G A/G 30 9,62 29 14, 0.010 0. rs1048943 G/G 0 0 0 C/C 213 65,94 134 69, CYP1B 4 G1294C C/G 107 33,13 51 26, 0.008 0. rs1056836 G/G 3 0,93 9 4, D/D 183 56,13 106 53, GSTM 6 - I/* 143 43,87 94 47, D/D 37 11,35 25 12, 7 GSTT1 - I/* 289 88,65 175 87, C/C 163 57,19 87 60, NQ 8 C/T 105 36,84 48 33, 609CT 0.99 0. T/T 17 5,96 8 5, Здесь и далее* означает произвольный аллель.

N - количество человек;

% - частота встречаемости данного генотипа, аллеля;

Р - значимость отличий от распределения Харди-Вайнберга.

Изучение и анализ полиморфных вариантов генов ферментов репарации Проведенное исследование полиморфизма генов репарации установило, что в обеих исследуемых группах статистически значимых различий в распределении частот генотипов нет. В гене XRCC1 C589T контрольной и экспонированной группах выявлены одинаковые частоты генотипов (C/C 93,8% и 92,9%;

C/T - 6,2% и 7,1%;

T/T - 0% и 0% соответственно). Аналогичная картина наблюдается по генам: XRCC1 G1996A (A/A - 11,5% и 11,9%;

G/A 46,4% и 49,5%;

G/G - 42,1% и 38,5%), APEX1 T444G (G/G - 44,7% и 44,1%;

G/T 45,7% и 46,9%;

T/T - 9,5% и 9,0%), ATM G5557A (G/G - 16,3% и 18,8%;

G/A 83,7% и 81,2%;

A/A - 0% и 0%), OGG1 C977G (C/C - 51,72% и 54,1%;

C/G 38,2% и 37,5%;

G/G - 10,0% и 8,5%).

Генотипирование ABCB1 T3435C показало, что в экспонированной группе частота минорного генотипа выше C/C - 25,61%, чем в группе контроля 16,88%, а частоты мажорного и гетерозиготного генотипа в обеих группах отличаются незначительно (T/C - 49,5% и 45,5%, T/T - 33,4% и 28,7%).

Разница частот мажорного, гетерозиготного и минорного генотипов гена ADPRT 285TC в обеих изучаемых группах составила: C/C - 3, 42% и 1,66%, T/C - 30,43% и 24,86%, Т/T - 66,15% и 73,48%.

При изучении распределения генотипов гена ERCC1 T354C у детей из загрязненных районов выявлено, что частоты минорного, гетерозиготного и мажорного генотипов (C/C - 21,39%, T/T - 19,65%, T/C - 46,2%) незначимо отличаются от частот генотипов детей из контрольной группы (C/C - 32,91%;

и T/T - 20,89%;

T/C - 58,9%).

При исследовании полиморфизма гена эксцизионной репарации XPD T2251G (Lys751Glnу) у детей чеченской популяции выявлено, что частоты генотипов в обеих исследуемых выборках одинаковы: T/G - 55,0%;

T/T 24,26%;

G/G - 20,7% в экспонированной группе и T/G - 48,7%;

T/T - 25,0%;

G/G - 26,3% в контрольной.

Частоты гетерозиготного и мажорного генотипов гена XPD G862A у детей из загрязненных сел незначимо выше (G/G - 32,1%, G/A - 51,2%) по сравнению с детьми из контрольной группы (G/G - 30,3%, G/A - 46,5%). При этом частоты минорного генотипа A/A в изученных выборках составили:

16,7% и 23,00%, соответственно.

Для изученных полиморфных вариантов генов репарации в обследованных выборках распределение генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга.

Изучение и анализ полиморфных вариантов гена MTHFR C677T При анализе частот генотипов гена MTHFR C677T у детей из контрольной группы и из загрязненных районов не были установлены значимые различия: C/C - 62,9% и 63,7%, C/T - 33,8% и 31,8%, T/T - 3,34% и 4,5%. Распределение частот генотипов соответствует ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга.

Изучив частоту полиморфных вариантов генов оксидативного ответа, детоксикации ксенобиотиков и генов репарации ДНК мы не обнаружили значимых различий в выборках обследуемых детей, за исключением минорного генотипа гена CAT T21A. У детей из загрязненных нефтепродуктами районов частота минорного генотипа в 2 раза выше по сравнению с детьми из контрольной группы. Ген CAT кодирует гемсодержащий фермент тканевого дыхания антиоксидантной защиты класса оксидоредуктаз катализирующий разложение перекиси водорода, образующиеся в ходе различных окислительных процессов в организме с образованием кислорода и воды.

Возможно, что полиморфизм данного гена Т21А связан с изменением активности фермента у минорного варианта (Young et al., 2006).

Ассоциативное исследование полиморфных маркеров изученных генов с уровнями цитогенетических нарушений у обследованных детей Нами проведен анализ сопряженности полиморфных вариантов изученных генов систем биотрансформации ксенобиотиков, репарации и оксидативного ответа с частотой микроядер в эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости у детей чеченской популяции, проживающих в разных эколого-ландшафтных районах: равнинных загрязненных нефтепродуктами и равнинно - высокогорных незагрязненных. Изменчивость цитогенетических показателей для выборки в целом оказалась достаточно высокой (в загрязненных районах 1.54±0.23 и 0.58±0.09 в «чистых» районах на 1000 клеток), чтобы обеспечить возможность поиска генотипических ассоциаций.

В настоящей работе выявлена сопряженность локуса SOD2 с частотой микроядер в буккальных эпителиоцитах детей из загрязненных нефтепродуктами районов. У носителей минорного варианта 47С она была достоверно выше чем у детей с мажорным аллелем 47Т/* (2.16±0.61 против 1.62±0.15;

p=0.007 по тесту Манна - Уитни). Для детей из чистых районов эти различия не были статистически значимыми: 47С - 0.69±0.24 против 0,53±0,08 для носителей мажорного аллеля 47Т/* гена SOD2.

Результаты исследований показали, что частота микроядер в клетках слизистой оболочки щеки детей из загрязненных районов выше у носителей минорного генотипа 21A гена CAT (1,79±0,26), чем у носителей мажорного и гетерозиготного генотипа (1,57±0,61), однако эти различия не были статистически значимыми.

На уровне однолокусных эффектов достоверные ассоциации получены также для полиморфных вариантов гена глутаматцистеинлигазы GCLC. При анализе частоты микроядер у детей из загрязненных зон установлено достоверное повышение частоты микроядер у детей с минорным вариантом гена GCLC. Частота микроядер в этой группе составила 24±1,02, что в 1,4 раза выше, чем в группе носителей мажорного аллеля этого гена, в которой частота микроядер равнялась - 1,69±0,28, (p=0,027 по тесту Манна - Уитни).

Минорный вариант 129 Т сайта GCLC С129Т обуславливает пониженную активность промотора и, как результат, более низкий уровень глутатиона в плазме крови у гомозигот Т/Т (Cortes-Wanstreet et al., 2009).

В исследованиях Сальниковой Л.Е. и других (2010) показано протективное влияние варианта 21A CAT на радиационно-индуцированный уровень хромосомных аберраций. У ликвидаторов аварии ЧАЭС, гетерозиготные по сайту SOD2 C47T, уровень хромосомных аберраций значимо не превышал контрольное значение этого же показателя, а также частоты аберраций в лимфоцитах человека на спонтанном и индуцированном уровне не зависят от полиморфизма C47T гена SOD2. Уровень спонтанных и индуцированных аберраций для носителей разных генотипов локуса GCLC значимо не различался.

В настоящей работе анализ двухлокусных сочетаний в выборках показал, что в когорте детей из загрязненных районов сочетание минорных вариантов генов SOD2 и GCLC ассоциирован с повышенной частотой микроядер, а у детей из незагрязненных районов такой сопряженности нет.

Дети с минорными вариантами генотипов гена C/T GCLC и 21A гена САТ из загрязненных территорий более чувствительны к нефтехимическому загрязнению. У таких детей выявлена повышенная частота микроядер в буккальных эпителиоцитах щеки, по сравнению с детьми из экологически благополучных районов. Дети с двухлокусным сочетанием минорных генотипов 47С генов SOD2 и 21A CAT имеют повышенный уровень частот микроядер в буккальных эпителиоцитах как в «чистых», так и в «грязных» районах.

Сочетание минорных генотипов генов SOD247С, CAT 21A и GCLC увеличивает частоты микроядер в эпителиоцитах, т.е. является «предрасполагающим» генотипом (рис.4). Регрессионный анализ зависимости частоты микроядер от суммарного числа минорных аллелей генов оксидативного ответа (GCLC, SOD2 и CAT) показал, что эта зависимость четче выражена для детей из загрязненных нефтепродуктами территорий (p-value = 0,016).

Рисунок.4. Зависимость частоты микроядер от суммарного числа минорных аллелей генов оксидативного ответа у детей чеченской популяции (0 – чистый район, 1 – загрязненный район) Таким образом, проведенный анализ сопряженности полиморфных вариантов генов оксидативного ответа, репарации и детоксикации ксенобиотиков с цитогенетическими аномалиями подтвердил данные литературы о существовании так называемых «защитных» и «предрасполагающих» генотипов (Сидорова, 2004, 2005;

Григорьева, 2007).

Показано, что у детей чеченской популяции, проживающих в районах с повышенным уровнем загрязнения нефтепродуктами, «протективными» генами являтся мажорные (преобладающие по частоте) аллели генов оксидативного ответа (SOD2, CAT и GCLC) и их комбинации.

ВЫВОДЫ:

1. Показана однородность сравниваемых групп детей чеченской популяции по аллельным вариантам полиморфных генов 1-й и 2-й фазы биотрансформации ксенобиотиков, оксидативного ответа, репарации ДНК и гена MTHFR.

2. При кариологическом анализе буккальных эпителиоцитов детей, проживающих в загрязненных районах Чеченской республики, обнаружен достоверно повышенный уровень частоты микроядер по сравнению с данным показателем в контрольной группе;

3. Согласно ROC-анализу наличие в буккальных эпителиоцитах более двух микроядер однозначно свидетельствует о загрязнении окружающей среды генотоксикантами.

4. Уровень микроядер в клетках буккального эпителия детей, проживающих в зоне загрязнения нефтепродуктами, статистически значимо сопряжен с полиморфными вариантами генов оксидативного ответа (SOD2, GCLC, и CAT), а именно пропорционален числу минорных аллелей данных локусов (p = 0,016).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Солтаева А. М.-Х, Джамбетова П.М., Абилев С.К. Сычева Л.П., Сальникова Л.Е., Рубанович А.В. Комплексное исследование мутагенного действия загрязнений почв нефтепродуктами в Чеченской республике // «Санитария и гигиена» г. Москва, №5, 2011.С.50-55.

2. Солтаева А. М.-Х., Джамбетова П.М., Сальникова Л.Е., Рубанович А.В., Абилев С.К. Анализ сопряженности цитогенетических аномалий у детей чеченской популяции в связи с полиморфизмом генов детоксикации ксенобиотиков и генов оксидативного ответа // Известия Кабардино Балкарского научного центра РАН г. Нальчик,.№4, 2012.С.256-262.

3. Солтаева А. М.-Х., Джамбетова П.М., Сальникова Л.Е., Рубанович А.В., Абилев С.К. Связь полиморфных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков, SOD2 и CAT с частотой микроядер у детей // Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН г. Нальчик, № 1, 2013.С.201-205.

Статьи в сборниках и тезисы конференций:

1. Солтаева А. М.-Х., Джамбетова П.М., Абилев С.К., Сальникова Л.Е., Рубанович А.В. Сравнительное ассоциативное исследование частот микроядер у чеченских детей, проживающих на чистых и загрязненных территориях // Сб.

научных трудов посвященный 35-летию образования биолого-химического факультета и факультета геоэкологии ЧГУ, Грозный. 2010. №2.С.95.

2. Солтаева А. М.-Х., Джамбетова П.М., Абилев С.К., Сычева Л.П.

Исследование ассоциации частот клеток с микроядрами у детей, проживающих на чистых и загрязненных нефтепродуктами территориях, с полиморфизмом генов детоксикации и репарации // Материалы объединенного пленума научных советов РФ по экологии человека и гигиене окружающей среды, 15- декабря, Москва. 2010.С.173-175.

3. Солтаева А. М.-Х., Джамбетова П.М., Абилев С.К., Сальникова Л.Е., Рубанович А.В.Исследование полиморфизма генов детоксикации ксенобиотиков у чеченских детей // Материалы межд. молодежной конференции «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы» посвященной 75-летию со дня рождения ак. Ю.П. Алтухова, 17 18 ноября, Москва. 2011.С.42.

4. Солтаева А. М.-Х., Джамбетова П.М. Генетический полиморфизм генов детоксикации у чеченских детей, проживающих на чистых и загрязненных территориях // Всероссийская ежегодная научно- практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых, конференция «Наука и молодежь» 3-4 июня, Грозный. 2011.С.63.

5. Солтаева А. М.-Х., Джамбетова П.М., Сычева Л.П. Исследование врожденных морфогенетических вариантов и микроядер у детей, проживающих на чистых и загрязненных нефтепродуктами территориях ЧР // «Вестник Академии наук Чеченской Республики», №3. 2011.С. 159-164.

6. Солтаева А. М.-Х., Джамбетова П.М., Сычева Л.П. Исследование ВМГВ и микроядер у детей, проживающих на чистых и загрязненных нефтепродуктами территориях ЧР // Материалы Всероссийской конференции «Наука и образование в ЧР: состояние и перспективы», Грозный. 2011.С. 268 270.

7. Солтаева А. М-Х., Джамбетова П.М., Рубанович А.В., Абилев С.К.

Исследование взаимосвязи полиморфизма генов оксидативного ответа с частотой микроядер в клетках буккального эпителия детей // Международный сборник научных трудов, посвященный году Германии в России «Естественные и гуманитарные науки – устойчивому развитию общества». М.: ООО «ПКЦ Альтекс», 2012.С. 233-240.