Взаимодействие между n- и с-доменами белка sup35 в процессе прионизации в дрожжах saccharomyces cerevisiae

На правах рукописи

СОПОВА Юлия Викторовна Взаимодействие между N- и С-доменами белка Sup35 в процессе прионизации в дрожжах Saccharomyces cerevisiae специальность: 03.02.07. – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Научный консультант: академик РАН, профессор, доктор биологических наук Инге-Вечтомов Сергей Георгиевич Кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского Государственного Университета, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Сойдла Тыну Рихович Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук, профессор Квитко Константин Васильевич Кафедра микробиологии Санкт-Петербургского Государственного Университета, Санкт-Петербург Ведущее учреждение: Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН

Защита состоится “ “ 2010 г. в часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт Петербургском Государственном университете по адресу: 199034 Санкт Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М.

Горького Санкт-Петербургского Государственного университета.

Автореферат разослан 2010 г.

“ “

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.212.232. кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность проблемы. Прионы – наследуемые формы клеточных белков с модифицированной структурой, поддерживающиеся автокаталитически.

Фактор [PSI+] S. cerevisiae – прионная форма фактора терминации трансляции eRF3 (Sup35), один из наиболее изученных дрожжевых прионов. В экспериментах И. Л. Деркач с соавторами было показано, что возможность индукции фактора [PSI+] в штаммах [psi-] зависит от другого прионоподобного элемента - [PIN+] ([PSI+] inducible). Ключевую роль в прионизации белка Sup S. cerevisiae играет его N-терминальный домен (Ter-Avanesyan et al., 1994;

Derkatch et al., 1996), тогда как С-домен необходим для поддержания жизнеспособности клетки и выполнения функции eRF3 в терминации трансляции. Первичная структура N-домена значительно варьирует у различных эукариотических организмов, хотя особенности аминокислотного состава и вторичной структуры сохранены по крайней мере у низших эукариот. Изучение химерных белков, включающих прионизующий домен Sup35, – перспективное направление биологии прионов, позволяющее исследовать механизмы возникновения и воспроизведения приона [PSI+], а также изучать влияние взаимодействия между различными доменами как на эффективность процесса прионизации, так и на способность к преодолению межвидового барьера. В лаборатории физиологической генетики СПбГУ был сконструирован химерный белок Sup35SP, объединяющий NM-домен белка Sup35 S. cerevisiae и С-домен белка Sup35 дрожжей Pichia methanolica.

Настоящая работа посвящена характеристике прионной формы белка Sup35SP и его мутантного варианта Sup35SP-275, несущего замену T275A в первом сайте связывания гуаниновых нуклеотидов.

В работе показано, что рекомбинантный белок Sup35SP-275 не может эффективно выполнять функции терминации трансляции в дрожжах S. cerevisiae, при этом жизнеспособность трансгенных штаммов дрожжей, несущих ген sup35SP-275, снижена по сравнению с трансгенными штаммами, несущих ген SUP35SP.

Результаты работы свидетельствуют о способности белков Sup35SP и Sup35SP-275 образовывать по меньшей мере два типа агрегатов: неприонные агрегаты, возникающие [PIN+]-независимо, и прионные агрегаты, возникающие в штаммах [PIN+]. Прионизация белка Sup35SP-275, по видимому, приводит к гибели клетки из-за нарушений, связанных с инактивацией этого белка.

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование процесса прионизации eRF3 при экспрессии химерного гена SUP35SP и его мутантного варианта sup35SP-275.

Перед нами стояли следующие задачи:

1. Изучить фенотипическое проявление химерного гена SUP35SP и его мутантного варианта sup35SP-275 в дрожжах S.cerevisiae 2. Изучить возможность прионизации химерного белка Sup35SP и его мутантного варианта Sup35SP-275 в дрожжах S.cerevisiae 3. Изучить влияние С-домена на прионизующие свойства N-домена белка Sup Научная новизна работы. Получены жизнеспособные штаммы, содержащие мутацию в консервативном участке белка Sup35 - первом ГТФ-связывающем домене белка Sup35 P. methanolica. Показан нонсенс-супрессорный эффект замещения гена SUP35 химерными генами SUP35SP и sup35SP-275. В данной работе нами впервые была охарактеризована мутация в первом ГТФ связывающем участке белка Sup35 P.methanolica, приводящая к частичной инактивации химерного белка Sup35SP-275 и как следствие, к пониженной эффективности терминации трансляции. Белок Sup35SP-275, несмотря на аминокислотную замену, критичную для его функционирования в качестве фактора терминации трансляции, обладает такой же повышенной способностью к агрегации, как и белок Sup35SP.

Практическая ценность. Трансгенные штаммы S. cerevisiae с замещением SUP35 на химерные гены могут быть использованы в качестве модели для изучения прионных заболеваний человека и животных. Использование данной системы оправдано принципиальным сходством прионов дрожжей и млекопитающих. Изучение гомологичной и гетерологичной прионизации белков eRF3 P. methanolica и S. cerevisiae и гибридных белков, сконструированных на их основе, позволяет моделировать межвидовой перенос прионов, исследование которого приобрело большую актуальность в связи с эпизоотией «коровьего бешенства» в Европе и данными о возможности заражения человека через мясо больных животных (см. Ghani et al., 2000).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на XIX (Римини, Италия, 1999), XX (Прага, Чехия, 2001), XXI (Гетеборг, Швеция, 2003), XXII (Братислава, Словакия, 2005) международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей, на II (С-Петербург, 2000) и III (Москва, 2004) съездах ВОГиС, на 2-й конференции МОГиС (Москва, 2003), на международной конференции «Химические и биологические проблемы протеомики» (Новосибирск, 2004) и на семинарах лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ.

Объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 159 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и «Выводы». Работа содержит 9 таблиц, рисунков, список литературы из 141 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Обозначения и сокращения. Использованные в работе варианты генов SUP35 обозначали следующим образом: SUP35S - ген SUP35 S. cerevisiae;

SUP35SP - гибридный ген, состоящий из 5'-части SUP35S и 3'-части SUP35P (кодируемый этим геном белок объединяет NM-домен Sup35p S. cerevisiae и С домен Sup35p P. methanolica), sup35SP-275 – мутантная аллель гена SUP35SP, кодирующая белок с заменой Т275А (рис.1.).

G1.

S. cerevisiae (254) MFGGKDHVSLIFMGHVDAGKSTMGGNLLYLTGSVDKRTIEKYEREAKDAGRQGWYLS P. methanolica (312) MFGGKDHMSIIFMGHVDAGKSTMGGNLLFLTGAVDKRTVEKYEREAKDAGRQGWYLS Рисунок 1. Аминокислотные последовательности С-доменов белков Sup35S и Sup35P в районе первого участка связывания с ГТФ. T – треонин, замененный на аланин в мутантном белке sup35SP 275;

G1 – первый участок связывания с ГТФ Трансгенные интегранты S. cerevisiae с замещением SUP35 в хромосоме обозначали следующим образом: перед названием исходного нетрансгенного штамма указывали номер полученного на его основе трансгенного интегранта и один из символов “SP” или “sp”, обозначающий, что ген SUP35S в хромосоме этого штамма заменен на ген SUP35SP или sup35SP-275, соответственно.

Например, название 17SP-74-Д694 обозначает 17-й по счету трансгенный интегрант с геном SUP35SP в хромосоме на месте SUP35S, полученный на основе штамма 74-Д694.

Штаммы S. cerevisiae и E. coli. Основные штаммы дрожжей, использованные в работе, приведены в таблице 1. Все использованные штаммы принадлежат к Петергофской генетической коллекции.

Для поддержания и выделения плазмид и в качестве реципиента для трансформации использовали штамм бактерии E. coli XL1-Blue (Stratagene).

Таблица 1. Генотипы штаммов дрожжей S. cerevisiae, использованных в работе.

Обозначение Генотип Происхождение Петергофская генетическая коллекция 74-Д694 МАТа ade1-14 his3200 ura3- (Derkatch et al., 1996) leu2-3,112 trp1- Любезно предоставлен И.Л.Деркач rnq1- 74- МАТа ade1-14 his3200 ura3- Д694 (Michele et al., 2010) leu2-3,112 trp1-289 rnq Петергофские генетические линии 2Б-П3933 МАТa his (V.M.Andrianova et al., 2003) Петергофские генетические линии 78А-П2393 МАТ his (V.M.Andrianova et al., 2003) MAT ade1-14 his3200 lys2 ura3-52 Любезно предоставлен А.С.Борхсениусом GT81-1D (Chernoff et al., 1993) leu2-3,112 trp1- Любезно предоставлен А.С.Борхсениусом GT12 МАТа ade1-14 his3200 ura3- leu2-3,112 trp1-289 NMSUP Примечания:

Мутации ade1-14– UGA;

trp1-289 – UAG.

Плазмиды. В работе использовали челночные плазмиды, способные поддерживаться в клетках S. cerevisiae и E. coli: pFL38 (CEN URA3), pFL (2µmDNA URA3) (Bonneaud et al., 1991), pRS316 (CEN URA3) (Sikorski and Hieter, 1989) pRS415 (CEN LEU2) (Simons et al., 1987) и ряд плазмид, полученных на их основе. Использовали серию плазмид на основе pFL38 и pFL44, несущих гены SUP35S, SUP35SP и sup35SP-275. Плазмиды pSPZ3 и pSPZ3-275 использовали для замещения гена SUP35S в хромосоме генами SUP35SP и sup35SP-275, соответственно. Плазмиду pYS-GAL104 (Sanches et al., 1992) использовали для сверхэкспрессии гена HSP104, плазмиду pYS (Sanchez and Lindquist, 1990) – для умеренной экспрессии гена HSP104, плазмиду pKT218 (Patino et al., 1996) – для инактивации белка Hsp104.

Плазмиды pCUP-GFP и pSUP35-GFP (Patino et al., 1996), pSP-GFP, pSP 275-GFP использовали для цитологического анализа агрегации белков Sup35, слитых с зеленым флуоресцирующим белком Aequorea victoria (GFP). Плазмиды pID129 и pRS316-RNQ1 несут ген RNQ1 с собственными промоторной и терминаторной областями.

Генетические методы. В работе использовали стандартные методы генетики дрожжей (Инге-Вечтомов, 1971;

Захаров и др. 1984;

Sherman et al, 1986). Трансформацию дрожжей проводили по стандартной методике с использованием ацетата лития (Rose et al., 1990). Супрессорный фенотип трансгенных штаммов определяли по способности к росту на синтетических средах, не содержащих аминокислот или азотистых оснований, потребность в которых обусловлена нонсенс-мутацией. Супрессорный эффект [PSI+] или [PSI+]-подобных факторов определяли по наличию и эффективности подавления мутации ade1-14. Для элиминации [PSI+] и [PSI+]-подобных факторов инкубировали штаммы на среде YAPD, содержащей 5 мМ хлорида гуанидина (ГГХ), или трансформировали штаммы плазмидой pYS-GAL104 и индуцировали у трансформантов сверхэкспрессию гена HSP104 на среде с галактозой (20 г/л).

Индукция экспрессии генов под контролем промотора CUP1. Для индукции экспрессии гена GFP, а также химерных генов SUP35S-GFP, SUP35SP-GFP, SUP35S-CFP и SUP35SP-YFP мы выращивали трансформантов в жидкой среде, селективной для поддержания плазмиды, c добавлением CuSO4 в концентрации 50µмоль до оптической плотности OD600 2. Далее клетки отмывали от среды и микроскопировали.

Молекулярно-биологические методы. В работе использовали стандартные методы получения и анализа рекомбинантных ДНК (Sambrook et al, 1989).

Выделение тотальной ДНК из дрожжей проводили по методу Полайны и Адам (Polaina, Adam, 1991). Амплификацию фрагментов ДНК проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Sambrook et al., 1989) при помощи термоциклера PCR Express (Thermo Hybaid, UK).

Методы микроскопирования. Флуоресцентный анализ белков, слитых с GFP, проводили с использованием микроскопа Leica DM6000B (Leica Microsystems GmBH, Germany), используя систему компьютерного анализа изображения Leica QWin Standart V3.2.0. Флуоресценцию анализировали, используя комплект «GFP» (Leica Microsystems GmBH, Germany) с запирающим фильтром 525 нм и возбуждающим фильтром 470 нм.

Получение белковых экстрактов для электрофореза в полиакриламидном геле. Для получения дрожжевых экстрактов штаммы выращивали в жидкой среде до оптической плотности OD600=0.5-0.8, затем в среду добавляли циклогексимид до конечной концентрации 200 мкг/мл и инкубировали в течение 15 мин. Клетки осаждали центрифугированием при 40С, 3000 об/мин. Осадки промывали 3 мл водного раствора циклогексимида (200 мкг/мл), затем центрифугировали при 40С, 3000 об/мин, промывали 0,5 мл лизирующего буфера, затем центрифугировали при 40С, 3000 об/мин. Осадок растворяли в 300 µl лизирующего буфера (50 мМ Tris, pH 7,5;

0,1 mM EDTA;

1 mM бензамидин;

2 µg/ml пепстатин;

5 mM MgCl2;

0,1 mM DTT;

2 mM PMSF;

µg/ml РНКаза A;

10 mM KCl;

100 µg/ml циклогексимид;

10 µg/ml леупептин), добавляли равный объем стеклянных шариков (Sigma-Aldrich Co) и разрушали клетки встряхиванием на вортексе. После центрифугирования при 40С, об/мин полученный супернатант делили на две части, одну (180 µl) в дальнейшем использовали для оценки общего количества белка в пробе, а вторую центрифугировали при 40С (13500 об/мин) 15 мин. После центрифугирования супернатант (180 µl) помещали в отдельную пробирку, а осадок растворяли в 180 µl лизирующего буфера. Для нанесения на форез пробы смешивали с 4Х буфером для нанесения (100 мМ Tris, pH 6,8;

10% SDS;

40% глицерин;

0,2% бромфеноловый синий;

20% -меркаптоэтанол).

Получение белковых экстрактов для электрофореза в агарозном геле. Для получения дрожжевых экстрактов штаммы выращивали в жидкой среде до оптической плотности OD600=0.5-0.8, клетки осаждали центрифугированием при 40С, 3000 g. Начиная с данного момента, все последующие процедуры проводили при 40С. Осадки промывали 0,5 мл лизирующего буфера (50 мМ Tris, pH 7,5;

mM KCl;

10 mM MgCl2;

10 mM PMSF;

1 таблетка Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets (F. Hoffmann-La Roche Ltd)), затем центрифугировали при 40С, 3000 g. Осадок растворяли в 300 µl лизирующего буфера, добавляли равный объем стеклянных шариков (Sigma-Aldrich Co) и разрушали клетки встряхиванием на вортексе. После центрифугирования при 40С, 3000 g мы измеряли концентрацию белка в полученном супернатанте по методике Бредфорд (Bradford, 1976) и брали для дальнейшей работы по 150 µg белка из каждой пробы. Перед нанесением на гель пробы смешивали с 2Х буфером для нанесения (50 мМ Tris, pH 6,8;

2% SDS;

5% глицерин;

0,0025% бромфеноловый синий) и инкубировали при комнатной температуре в течение 7 минут.

Иммуноблотинг. Белки разделяли при помощи электрофореза в 10% полиакриламидном геле в присутствии SDS (Laemmli, 1970), или в 1,5% агарозном геле (Bagriantsev et al., 2006). Белки переносили иммерсионным методом на нитроцеллюлозную мембрану Trans-Blot (Bio-Rad, USA) или на мембрану ПВДФ (Amersham Biosciences, USA) при плотности тока 2 мА на 1 см мембраны (Bjerrum and Schafer-Nielsen, 1986). Для идентификации белков Sup35S и Sup35SP использовали кроличьи поликлональные антитела SE4292, специфичные к N-концевому домену белка Sup35S, любезно предоставленные Шабельской С.В. (Universit de Rennes, Rennes, France). В качестве вторичных антител были использованы ослиные антикроличьи антитела, связанные с пероксидазой (Amersham Biosciences, USA). Взаимодействие первичных и вторичных антител детектировали с помощью хемилюминесцентной системы ECL (Amersham Biosciences, USA) в соответствии с инструкциями фирмы производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение трансгенных штаммов S. cerevisiae с замещением SUP35 в хромосоме генами SUP35SP и sup35SP-275.

Для получения штаммов с замещением SUP35 в хромосоме исходные изогенные варианты [PIN+] и [pin-] штамма 74-Д694 трансформировали фрагментами BamHI-XhoI плазмид pSPZ3 и pSPZ3-275. Данные фрагменты содержали последовательности, фланкирующие SUP35S в хромосоме S.

cerevisiae, между которыми находились ген LEU2 S. cerevisiae и ген SUP35SP или sup35SP-275. Замещение аллели SUP35 в хромосоме происходило за счет гомологичной рекомбинации (рис.2). Отбирали клоны Leu+, у которых проверяли наличие замещенной копии SUP35 в хромосоме с помощью ПЦР и последующего рестрикционного анализа ПЦР-продуктов. В реакциях ПЦР использовали хромосомную ДНК исследованных клонов как матрицу и праймеры, специфичные к 5' и 3'-концевым участкам SUP35S и SUP35P. Для дальнейшего анализа нами были взяты штаммы 17SP-74-Д694 [PIN+] и 4SP-74 Д694 [pin-].

BamHI 3’SUP35S LEU SUP35SP 5’SUP35S XhoI SUP35S хромосома IV 3’SUP35S 5’SUP35S Рисунок 2. Cхема замещения хромосомной копии гена SUP35S рекомбинантным геном SUP35SP, тесно сцепленным с геном LEU2.

Фенотипическое проявление рекомбинантных генов SUP35SP и sup35SP 275 в дрожжах S.cerevisiae.

Мы исследовали эффективность супрессии нонсенс-мутации ade1-14 у полученных трансгенных штаммов (рис.3). Для штамма с химерным геном SUP35SP в хромосоме была характерна слабая нонсенс-супрессия (рост на среде без аденина в 200С на 7-10 день), тогда как для штамма с мутантной аллелью sup35SP-275 в хромосоме была характерна повышенная эффективность нонсенс супрессии (рост на среде без аденина в 20 С на 2 день). В целом для С-доменов белков Sup35S и Sup35P характерна высокая степень сходства – 75,9% аминокислот идентичны. Выравнивание их аминокислотных последовательностей показало, что большинство различий (61%) аминокислотных последовательностей сосредоточено в участке связывания с белком Sup45 и белками Upf2 и Upf3 (а.к. 465-685 белка Sup35S), тогда как в участке связывания с гуаниновыми нуклеотидами и белком Upf1 (а.к. 254- белка Sup35S) изменено только 20% аминокислот. Отличия в аминокислотных последовательностях С-доменов белков Sup35S и Sup35P могут объяснять сниженную эффективность взаимодействия белка Sup35SP с другими компонентами аппарата трансляции (в частности, с eRF1), и, как следствие, сниженную эффективность терминации трансляции. Замена треонина на аланин в консервативном участке связывания с ГТФ белка Sup35SP-275 приводит к нарушению терминации трансляции, при этом мутация sup35SP-275 не является летальной. Вероятно, у мутантного белка Sup35SP-275 частично инактивирована функция связывания и/или гидролиза ГТФ, что приводит в свою очередь к неэффективной терминации трансляции.

74-Д694 [pin-] 74-Д694 [PIN+] 1Р-74-Д694 [pin-] 1Р-74-Д694 [PIN+] 4SP-74-Д694 [pin-] 17SP-74-Д694 [PIN+] 1sp-74-Д694 [pin-] 1sp-74-Д694 [PIN+] Рисунок 3. Эффективность супрессии мутации ade1-14 у трансгенных штаммов, полученных на основе штаммов 74-Д694 [PIN+] и 74-Д694 [pin-]. Среда без аденина с глюкозой, 7 дней инкубации при 300.

Введение дополнительных копий гена SUP35 на центромерной или многокопийной плазмиде в штамм 17SP-74-Д694 [PIN+] приводило к повышению эффективности нонсенс-супрессии по сравнению с исходным штаммом. Причиной этого может быть повышение эффективности перехода белка Sup35 в прионную конформацию в штамме [PIN+], вызванное повышением количества этого белка в клетке.

Введение дополнительных копий гена SUP35 на центромерной или многокопийной плазмиде в штамм 4SP-74-Д694 [pin-] приводило к понижению эффективности нонсенс-супрессии. Причиной этого может быть то, что в штамме [pin-] прионизация белка Sup35 не происходит, поэтому за счет дополнительных молекул белка происходит более эффективная терминация трансляции. У трансформантов штамма 4SP-74-Д694 [pin-] центромерной плазмидой с геном sup35SP-275 нонсенс-супрессия остается на уровне исходного штамма, поскольку белок Sup35SP-275 не может эффективно участвовать в терминации трансляции и конкурировать с белком Sup35SP дикого типа.

После потери многокопийных плазмид с геном SUP35S, SUP35SP или sup35SP-275 у трансформантов штамма 17SP-74-Д694 [PIN+] выщеплялось большое количество клонов, растущих на среде без аденина на 3-4 день.

Инкубация таких клонов на среде с хлоридом гуанидина – универсальным антиприонным агентом, также как и сверхэкспрессия или инактивация гена HSP104, приводила к снижению нонсенс-супрессии до уровня штамма 4SP-74 Д694 [pin-]. Таким образом, у этих клонов произошел переход белка Sup35SP в стабильную прионную конформацию, в дальнейшем обозначаемую [PSI+]SP.

Агрегация белков Sup35SP и Sup35SP-275 в дрожжах S.cerevisiae Во всех исследованных трансгенных штаммах с геном SUP35SP или sup35SP-275 в хромосоме белки Sup35SP и Sup35SP-275 присутствовали как растворимой, так и в осадочной фракции независимо от [PIN]-статуса штамма (рис.4). В нетрансгенных штаммах 74-Д694 [PIN+] и [pin-] белок Sup35 был выявлен только в надосадочной фракции, тогда как в штамме 74-Д694 [PSI+] он присутствовал как в надосадочной, так и в осадочной фракциях. Таким образом, химерные белки Sup35SP и Sup35SP-275 обладают повышенной способностью к [PIN]-независимой спонтанной агрегации. При этом у трансформантов штамма 17SP-74-Д694 многокопийными и центромерными плазмидами с генами SUP35SP и sup35SP-275 большая часть белка Sup35 была выявлена в осадочной фракции. У трансформантов штамма 17SP-74-Д694 многокопийными и центромерными плазмидами с геном SUP35S белок Sup35 был выявлен как в осадочной, так и в надосадочной фракциях.

Для дополнительной характеристики агрегатов, образующихся в трансгенных штаммах с химерными генами SUP35SP и sup35SP-275, мы проанализировали белковые экстракты, выделенные из трансгенных и нетрансгенных штаммов, при помощи полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле. Перед нанесением на гель нативный белок был подвергнут действию 1% SDS. Результаты представлены на рис. 5.

В присутствии 1% SDS высокомолекулярные агрегаты белка Sup35 были выявлены в штаммах 74-Д694 [PIN+] [PSI+] и 17SP-74-Д694 [PIN+] [PSI+]SP, тогда как во всех остальных исследованных штаммах (74-Д694 [PIN+] [psi-], 17SP-74 Д694 [PIN+], 17SP-74-Д694 [pin-], 1sp-74-Д694 [PIN+] и 1sp-74-Д694 [pin-]) белок Sup35 присутствовал только во фракции мономеров. Таким образом, агрегаты, образующиеся в трансгенных штаммах с генами SUP35SP или sup35SP-275 в хромосоме, могут быть по меньшей мере двух типов.

Во-первых, это прионные агрегаты, выявляемые в штамме 17SP-74-Д [PIN ] [PSI+]SP с помощью дифференциального центрифугирования и на + полуденатурирующем форезе, устойчивые к действию SDS.

Во-вторых, это агрегаты, выявляемые в трансгенных штаммах [PIN+] [psi-] и [pin-] [psi-] с помощью дифференциального центрифугирования и не выявляемые на полуденатурирующем форезе в присутствии 1% SDS. Вероятнее всего, это неприонные аморфные агрегаты, чувствительные к действию SDS.

Трансформанты штамма 17SP-74-Д694 [PIN+] 17SP-74-Д [PIN+] [PIN+] [pin-] [PSI+]SP [psi-] [psi-] Н О НО Н О Н О Н О Н О Н О Н О Н О [PIN+][PSI+] [pin0] [pin-] [pin-] [psi-] [PIN+] [PIN+] [psi-] Н О Н О НОН О НО НО Рисунок 4. Анализ агрегации белков Sup35SP и Sup35SP-275 в трансгенных штаммах с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Представлен результат иммуногибридизации белковых экстрактов с использованием антител, специфичных к N-домену белка Sup35. О – осадочная фракция, Н – надосадочная фракция.

1 2 3 4 5 6 агрегаты белка Sup 1 - 74-Д694 [PIN+] [psi-] 2 - 74-Д694 [PIN+] [PSI+] 3 - 17SP-74-Д694 [PIN+] [PSI+SP] 4 - 17SP-74-Д694 [PIN+] 5 - 17SP-74-Д694 [pin-] 6 - 1sp-74-Д694 [PIN+] 7 - 1sp-74-Д694 [pin-] мономеры белка Sup Рисунок 5. Анализ агрегации белков Sup35SP и Sup35SP-275 в трансгенных штаммах с помощью полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле. Представлен результат иммуногибридизации белковых экстрактов с использованием антител, специфичных к N-домену белка Sup35.

Отметим, что мы не выявили отличий по размерам агрегатов между нетрансгенными штаммами [PSI+] и трансгенными штаммами [PSI+]SP, что может говорить о принципиальном сходстве прионных агрегатов белков Sup35S и Sup35SP.

Одним из методов выявления внутриклеточной локализации белка является использование химерных конструкций, в которых исследуемый белок объединен с белком-репортером. В нашей работе в качестве таких белков-репортеров мы использовали белок GFP, дающий при облучении ультрафиолетом зеленое свечение.

Мы наблюдали агрегаты белка Sup35S-GFP только в трансгенных штаммах [PIN ], но не в [pin-], что согласуется с литературными данными (Zhou et al., + 2001), при этом форма агрегатов была различной – встречались точечные и кольцевые варианты. Агрегаты белков Sup35SP-GFP и Sup35SP-275-GFP мы зафиксировали в трансгенных штаммах [PIN+] и [pin-], при этом нами были обнаружены только мелкие точечные агрегаты, тогда как кольцевых агрегатов зафиксировано не было. Отличий между трансгенными штаммами [PIN+] и [pin-] по форме, размеру и количеству агрегатов белков Sup35SP-GFP и Sup35SP-275 GFP в клетке мы не зафиксировали. В штамме 17SP-74-Д694 [PIN+] [PSI+]SP белки Sup35SP-GFP, Sup35SP-275-GFP и Sup35S-GFP наряду с мелкими агрегатами образовывали крупные точечные агрегаты. Полученные нами результаты согласуются с данными Вестерн-блот гибридизации, согласно которым белок Sup35SP образует агрегаты как в штаммах [PIN+], так и в штаммах [pin-].

[PIN+] [pin-] [PSI+SP] [PIN+] [pin-] [PSI+SP] Sup35S-GFP Sup35SP-GFP Рисунок 4.9. Локализация химерных белков Sup35S-GFP и Sup35SP-GFP в штаммах 17SP-74 Д694 [PIN+], 17SP-74-Д694 [pin-] и 17SP-74-Д694 [PIN+] [PSI+]SP.

Прионизация белков Sup35S и Sup35SP в штаммах, несущих гены SUP35S и SUP35SP.

Введение дополнительных копий гена SUP35SP или sup35SP-275 на центромерной плазмиде в штамм 74-Д694 [PIN+], но не 74-Д694 [pin-], вызывало появление нонсенс-супрессии, исчезающей после инкубации трансформантов на среде с ГГХ. У трансформантов штамма 74-Д694 [PIN+] центромерной плазмидой с геном SUP35S мы не зафиксировали нонсенс-супрессии. После потери центромерных плазмид, индуцирующих нонсенс-супрессию, в результате инкубации на среде с 5-FOA нонсенс-супрессия исчезала. Таким образом, супрессия, вызываемая 1-2 копиями гена SUP35SP или sup35SP-275 в нетрансгенном штамме 74-Д694, является [PIN+]-зависимой и, по всей вероятности, является результатом прионизации продуктов SUP35S и SUP35SP (sup35SP-275). Такой прионоподобный фактор, способный поддерживаться только в присутствии индуцировавшей его центромерной плазмиды, был обозначен нами [PSI+]SP/S.

Одним из возможных объяснений возникновения фактора [PSI+]SP/S может быть повышенная способность белка Sup35SP к переходу в прионизованное состояние. Экспрессия гена SUP35SP, находящегося на центромерной плазмиде, приводит к синтезу дополнительных молекул белка Sup35SP, что повышает вероятность перехода белков Sup35S и Sup35SP в прионную конформацию.

Белок Sup35S при небольшом повышении его концентрации в клетке за счет экспрессии гена на центромерной плазмиде в прионную конформацию не переходит. Потеря прионизованного состояния после потери центромерных плазмид может быть связана с тем, что присоединение новых белковых молекул Sup35S к уже имеющемуся агрегату происходит менее эффективно, чем дробление агрегатов за счет действия шаперонов, что приводит в итоге к исчезновению агрегатов белка Sup35.

Сверхэкспрессия HSP104 эффективно элиминировала фактор [PSI+]SP/S, что указывает на его прионную природу и принципиальное сходство с обычным [PSI+]. При этом фактор [PSI+]SP/S был более чувствителен к уровню экспрессии гена HSP104, чем фактор [PSI+], поскольку даже небольшое увеличение продукции белка Hsp104 приводило к дестабилизации фактора [PSI+]SP/S.Это может быть связано в том числе и с повышенной эффективностью дробления агрегатов [PSI+]SP/S.

Прион [PIN+] не является необходимым для поддержания установившегося фактора [PSI+]SP/S, так как фактор [PSI+]SP/S сохраняется после элиминации гена RNQ1. При этом наличие [PIN+] или RNQ1 в клетке не влияет на эффективность супрессии, вызываемой фактором [PSI+]SP/S и сохранение супрессорного эффекта после потери индуцирующей плазмиды с SUP35SP.

Индукция и поддержание фактора [PSI+]SP/S у диплоидных штаммов гетерозигот по гену SUP35, несущих одну копию гена SUP35S и одну копию гена SUP35SP.

Мы исследовали возможность индукции фактора [PSI+]SP/S в том случае, когда обе аллели (и SUP35S, и SUP35SP) находятся в хромосоме. Были получены гибриды Д912 (GT81-1D x 17SP-74-Д694 [PIN+] [psi-]) и Д927 (GT81-1D x 17SP 74-Д694 [pin-] [psi-]), являющиеся гетерозиготами по SUP35SP-LEU2 // SUP35 и гомозиготами по ade1-14 // ade1-14. Мы провели анализ окраски колоний митотического потомства клонов гибридов Д912 и Д927 (Таблица 2).

Предполагалось, что возникновение белых колоний может быть обусловлено появлением [PSI+]-подобного фактора. Ни одна из выявленных белых колоний не изменила окраску и эффективность супрессии после инкубации на YAPD с ГГХ, что говорит об отсутствии в них фактора [PSI+].

Полученные данные говорят о том, что эффективной индукции [PSI+] в гетерозиготных диплоидах SUP35S / SUP35SP не происходит. Таким образом, само по себе присутствие в клетке генов SUP35S и SUP35SP одновременно не приводит к индукции [PSI+]-подобного фактора. По-видимому, для эффективной индукции приона необходимо повышение концентрации белков Sup35SP и/или Sup35S, как это происходит в случае трансформантов гаплоидных штаммов с геном SUP35S или SUP35SP в хромосоме.

Таблица 2. Окраска колоний гибридов GT81-1D x 17SP-74-Д694 [PIN+] [psi-] и GT81-1D x 17SP-74-Д694 [pin-] [psi-] на среде C ± Ade.

Число Число Число Частота Гибрид красных белых клонов клонов [PSI+] [PSI+] колоний колоний GT81-1D x 17SP-74-Д694 [PIN+] [psi-]1 0 (0 – 1•10-4) 9607 14 GT81-1D x 17SP-74-Д694 [pin-] [psi-]1 0 (0 – 1•10-4) 48600 4 GT81-1D x 17SP-74-Д694 [PIN+] [psi-]2 0(0 – 2•10-4) 6538 0 GT81-1D x 17SP-74-Д694 [pin-] [psi-]2 0(0 – 1•10-4) 35258 3 Примечание. 1 - Отдельные клоны гибридов GT81-1D x 17SP-74-Д694 [PIN+] [psi-] и GT81-1D x 17SP-74-Д694 [pin-] [psi-] были высеяны на среду C ± Ade сразу после инокуляции в жидкую YAPD.

- Отдельные клоны гибридов GT81-1D x 17SP-74-Д694 [PIN+] [psi-] и GT81-1D x 17SP-74-Д694 [pin-] [psi-] были высеяны на среду C ± Ade через 24 часа после инокуляции в жидкую YAPD. Для значений частоты клонов [PSI+] указан 95% доверительный интервал.

Мы исследовали возможность поддержания фактора [PSI+]SP/S и фактора [PSI+] у диплоидов, гетерозиготных по гену SUP35SP/SUP35S. Мы трансформировали трансгенный штамм 17SP-74-Д694 [PIN+] центромерной плазмидой pFL38-SUP35S и у полученных трансформантов отобрали клоны с повышенной эффективностью супрессии. Инкубация таких клонов на среде с ГГХ приводила к исчезновению нонсенс-супрессии, поэтому мы считали, что у этих клонов был индуцирован фактор [PSI+]SP/S. Мы скрестили полученный штамм 17SP-74-Д694 [PIN+] [PSI+]SP/S, несущий плазмиду pFL38-SUP35S, и исходный штамм 17SP-74-Д694 [PIN+] со штаммом GT81-1D [pin-] [psi-]. Мы зафиксировали эффективную супрессию нонсенс-мутации ade1-14 в случае диплоида, несущего фактор [PSI+]SP/S, тогда как изогенный диплоид, не несущий фактора [PSI+]SP/S, не рос на среде без аденина. Инкубация диплоида [PSI+]SP/S на среде с ГГХ приводила к исчезновению нонсенс-супрессии. На основании этого можно сделать вывод, что, хотя у диплоидов, гетерозиготных по гену SUP35SР, эффективной индукции фактора [PSI+]SP/S не происходит, но поддержание его возможно.

Мы провели тетрадный анализ гибридов, гетерозиготных по генам SUP35S/SUP35SP или SUP35S/sup35SP-275 и несущих фактор [PSI+] или [PSI+]SP/S. Для этого мы использовали гибридов Д912 от скрещивания GT81-1D [psi ] х 17SP-74-Д694, гибридов Д914 от скрещивания GT81-1D [PSI+] х 17SP-74 Д694, гибридов Д928 от скрещивания GT81-1D [PSI+] х 1sp-74-Д694, гибрида Д929 от скрещивания GT81-1D [psi-] х 1sp-74-Д694 и гибрида Д930 от скрещивания GT81-1D [psi-] х 1sp-74-Д694 [PSI+]SP/S. Для получения гибрида Д930 мы трансформировали трансгенный штамм 1sp-74-Д694 [PIN+] центромерной плазмидой pFL38-SUP35S и скрестили полученный штамм 1sp-74 Д694 [PIN+] [PSI+]SP/S, несущий плазмиду pFL38-SUP35S, со штаммом GT81-1D [pin-] [psi-]. Результаты тетрадного анализа представлены в таблице 3. Поскольку гены SUP35SP и sup35SP-275 тесно сцеплены с геном LEU2 и в обоих родительских штаммах присутствует мутантный ген leu2, сегреганты Leu+ несут ген SUP35SP или sup35SP-275, а сегреганты Leu- – ген SUP35S дикого типа.

Тетрадный анализ диплоидов, гетерозиготных по гену SUP35SP, показал, что выживаемость аскоспор с геном SUP35SP не зависит от наличия в диплоиде фактора [PSI+]. Соотношение между аскоспорами, несущими ген SUP35S или SUP35SP, не отличалось от 1:1 статистически значимо ни в случае диплоида, несущего фактор [PSI+], ни в случае диплоида, не несущего этот фактор.

В случае диплоида Д929, не несущего ни фактора [PSI+], ни фактора [PSI+]SP/S, и гетерозиготного по мутантному гену sup35SP-275, в большинстве тетрад мы наблюдали 3 или 4 выживших аскоспоры. При этом соотношение аскоспор, несущих ген SUP35S или sup35SP-275, не отличалось статистически значимо от 1:1. В случае диплоида Д928 [PSI+], мы наблюдали статистически значимо неслучайную (2=19 Р0,95) гибель аскоспор с геном sup35SP-275, и большинство тетрад имело расщепление по выживаемости 2V:2L.

Микроскопирование показало, что все сегреганты, не образовавшие колоний, представляли собой 1 или 2 клетки.

Пониженную выживаемость аскоспор мы наблюдали и в мейотическом потомстве диплоида Д930 [PSI+]SP/S. Однако в этом случае гибель Leu+ и Leu аскоспор была случайной (2=0,39;

0,01P0,05). Соотношение Leu+/Leu- у выживших сегрегантов достоверно не отличалось от 1:1 (2=1,46;

0,5Р0,9). Все 6 сегрегантов Leu+ имели фенотип Ade- Lys- и нормально скрещивались с тестерами типа спаривания, поэтому мы предположили, что это гаплоиды, несущие наряду с геном SUP35S ген sup35SP-275, сцепленный с геном LEU2. У всех 6 проверенных сегрегантов мы выявили с помощью ПЦР-анализа наличие как гена SUP35S, так и гена sup35SP-275. На основании этих данных мы сделали вывод, что наличие у диплоида фактора [PSI+]SP/S и мутантного гена sup35SP- приводит к нарушениям в расхождении хромосом в мейозе, в частности, хромосомы IV, в которой локализован ген SUP35. Одним из вариантов образования таких гаплоидов является нерасхождение IV хромосомы в мейозе, при этом сегрегант – нуллисомик по IV хромосоме будет нежизнеспособен.

Поскольку использованные в работе диплоиды гомозиготны по большинству маркеров, мы смогли проследить только за расхождением хромосомы III, в которой локализован локус MAT. Из 17 выживших сегрегантов гибрида SUP35S + SP/S [psi-] х sup35SP-275 [PSI ] два были некопулирующими, при этом их клетки имели типичную для гаплоидов округлую форму. Таким образом, присутствие в клетке мутантной аллели sup35SP-275 и фактора [PSI+]SP/S приводит к нарушениям не только в процессе терминации трансляции, но и в работе цитоскелета.

Таблица 3. Тетрадный анализ диплоидов, гетерозиготных по гену SUP35S/SUP35SP или SUP35S/sup35SP-275.

Соотношение типов Соотношение Общее тетрад выживших/ Соотношение Диплоид количество V:L погибших фенотипов аскоспор тетрад 4:0 3:1 2:2 1:3 0:4 аскоспор 19 Leu+/18 Leu SUP35S [psi-] х Д912 7 3 0 0 0 37/3 SUP35SP 19 MATa/ 18 MAT SUP35S [PSI+] х 12 Leu+/20 Leu Д914 4 4 2 0 0 32/8 SUP35SP 15 MATa/ 17 MAT SUP35S [PSI+] х 0 Leu+/48 Leu Д928 0 0 21 6 3 48/72 sup35SP-275 20 MATa/ 28 MAT 61 Leu+/67 Leu SUP35S [psi-] х Д929 18 14 7 0 1 128/32 sup35SP-275 63 MATa/ 65 MAT 6 Leu+/11 Leu SUP35S [psi-] х Д930 sup35SP-275 0 1 3 8 5 17/51 6 MATa/ 9 MAT/ + SP/S [PSI ] 2 NM Примечание: V- выжившие аскоспоры, L- погибшие аскоспоры;

выделены аскоспоры Leu+ Sup Генотип диплоидов:

MATa leu2 ade1-14 his3200 ura3-52 LYS2 trp1-289 SUP35SP(sup35SP-275)-LEU MAT leu2 ade1-14 his3200 ura3-52 lys2 trp1-289 SUP35S ВЫВОДЫ.

Химерный белок Sup35SP, объединяющий NM- домен белка Sup35 S.

1.

cerevisiae и С- домен белка Sup35 P. methanolica, способен эффективно выполнять функции терминации трансляции в дрожжах S.cerevisiae.

Мутация sup35SP-275, представляющая собой замену треонина на аланин 2.

в консервативном участке связывания с ГТФ, приводит к частичной инактивации химерного фактора терминации трансляции, и, как следствие, к повышенной эффективности нонсенс-супрессии в штаммах S.cerevisiae с геном sup35SP-275 в хромосоме.

Химерный белок Sup35SP способен образовывать два типа агрегатов – 3.

неприонные агрегаты возникающие спонтанно и [PIN]-независимо и прионные агрегаты, индуцируемые сверхэкспрессией гена SUP35SP в штаммах [PIN+].

Экспрессия гена SUP35SP с центромерной плазмиды в штаммах [PIN+] 4.

индуцирует появление гетероприона [PSI+]SP/S, при этом после потери индуцирующей плазмиды с геном SUP35SP не происходит конверсии [PSI+]SP/S в гомоприон [PSI+].

Сочетание в диплоиде химерного гена SUP35SP и фактора [PSI+SP/S] или 5.

[PSI+] вызывает нарушение расхождения хромосом в мейозе и повышенную частоту гибели аскоспор.

Взаимодействие между прионизующим и функциональным доменами 6.

белка Sup35, прямое или опосредованное другими белками, влияет на прионогенные свойства этого белка, в том числе на его способность к образованию агрегатов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

.

1. С.П.Задорский, Ю.В.Сопова, С.Г.Инге-Вечтомов. Прионизация продукта гена SUP35 Pichia methanolica в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.// Генетика, 2000, Т.36, N 10, с.1122 - 1139.

2. Задорский С.П., Борхсениус А.С., Сопова Ю.В., Старцев В.А., Инге Вечтомов С.Г. Супрессия нонсенс-мутаций и мутаций сдвига рамки считывания при различных способах инактивации фактора терминации трансляции eRF3 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. //Генетика, 2003, 39:

395-399.

3. Рябинкова Н.А., Сопова Ю.В., Полозков Г.В., Савелова М.В., Инге Вечтомов С.Г. Супрессия сдвига рамки считывания при подавлении терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Значение “локального” контекста.//Генетика, 2004, №7, 885- 4. S.P.Zadorsky, J.V.Sopova, S.G.Inge-Vechtomov. Nonsense supression through expression of SUP35 of Pihia methanolica in Saccharomyces cerevisiae XIX International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Rimini, Italy, 25-30 May, 5. С.П.Задорский, Ю.В. Сопова. Прионизация продукта гена SUP35 Pichia methanolica в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. 2-й съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. С-Петербург, 1 - 5 февраля 2000 г.

Т.2, с. 6. S.P. Zadorsky, J.V.Sopova, S.G. Inge-Vechtomov. Induction of [PSI]-like factor in Saccharomyces cerevisiae strains with substitution of SUP35 for its homologue from Pichia is in part PIN-independent. XX International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Prague, Czech Republic, 26- August, 7. S.G. Inge-Vechtomov, A.S. Borchsenius, S.P. Zadorsky, J.V.Sopova G.

Polozkov, V.V. Alenin, A.S. Zekhnov, I.Tribunskih.Nonsense and frameshift suppression by natural and genetically reconstructed yeast prions. XX International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Prague, Czech Republic, 26-31 August, 2001.

8. Задорский С.П., Ю.В. Сопова, Инге-Вечтомов C.Г.Прион-формирующие свойства рекомбинантного белка Sup35SP Тезисы 2-й конференции МОГиС “Актуальные проблемы генетики” 20-21 февраля 2003 г 9. Zadorskiy, S.P., J.V.Sopova, Inge-Vechtomov, S.G. Prion forming abilities of interspecies recombinant Sup35p Abstracts of the XXIst International Conference on Yeast Genetics and Molecular biology 2003 Yeast. 20 (S1): 10. Задорский С.П., Ю.В. Сопова, Инге-Вечтомов С.Г Прион-формирующие свойства рекомбинантного белка Sup35SP Генетика в XXI веке:

современное состояние и перспективы развития. Материалы III съезда ВОГиС. Москва, 6-12 июня 2004 г. С. 11. S.P.Zadorsky, A.S.Borchsenius, S.V.Zharkevich, J.V.Sopova, V.V.Alenin, Y.O.Chernoff, S.G.Inge- Vechtomov. Induction of a heteroprion by the chimeric Sup35N-Ade2 protein in the yeast Saccharomyces cerevisiae International conference “Chemical and biological problems of proteomics”. July 5-9, 2004.

Novosibirsk

Abstract

book and program, p.52.

12. J.V.Sopova, D. Akhmedov, S. Zadorsky, S. Inge-Vechtomov. Chimeric Sup35SP protein forms aggregates [PIN +] - independently in Saccharomyces cerevisiae.

XXII International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology.

August 7-12th, 2005. Yeast. 22(S1):