Компонентов пищи

На правах рукописи УСКОВА МАРИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПРОБИОТИЧЕСКИХ  МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ КАК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ  КОМПОНЕНТОВ ПИЩИ Специальность 03.01.04 – «Биохимия» Автореферат диссертации на соискание ученой степени  кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно­исследовательском институте питания РАМН  доктор медицинских наук, профессор, Научный руководитель:  академик РАМН Тутельян Виктор Александрович заслуженный деятель науки РФ, Официальные оппоненты:  доктор биологических наук, профессор Спиричев Владимир Борисович  доктор биологических наук, профессор Коничев Александр Сергеевич Ведущая организация:  Учреждение   Российской   академии   медицинских   наук   Научно­ исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича  РАМН Защита состоится 19 апреля 2010 г. в 14­00 на заседании  Диссертационного   Совета   Д001.002.01   в   Учреждении   РАМН   НИИ   питания  РАМН по адресу:

Москва, Устьинский проезд, д. 2/ С   диссертацией   можно   ознакомиться   в   библиотеке   Учреждения   РАМН   НИИ  питания РАМН.

Автореферат разослан _ марта 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор                          В.М.Коденцова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Полезные   для   здоровья   человека   свойства   молочнокислых   бактерий  (МКБ),   впервые   описанные   И.   И.   Мечниковым,   спустя   столетие   вновь   стали  объектом   интенсивного   изучения.   В   настоящее   время   широко   используется  понятие   «пробиотик»   для   обозначения   живых   микроорганизмов  (преимущественно   МКБ),   употребление   которых   с   пищей   в   достаточных  количествах оказывает благоприятное действие на здоровье [Reid  G., 2001]. К  пробиотикам  относятся  главным  образом  представители  родов  Lactobacillus  и  Bifidobacterium,   а   также   отдельные   штаммы   некоторых   видов  Streptococcus,  Lactococcus,  Enterococcus,  Bacillus  и  Saccharomyces  [Шендеров   Б.   А.,   1998;

  Holzapfel W. H. et al., 2001].

Наиболее хорошо документированы положительные эффекты пробиотиков  и   пробиотических   продуктов   при   профилактике   и   лечении   хронических  воспалительных   и   инфекционных   заболеваний   желудочно­кишечного   тракта  [Шендеров Б. А., 1998;

 Бондаренко В. М. и соавт., 2004;

 Alvarez­Olmos M. I. et  al.,   2001;

  Agarwal  K.  N.  et  al.,   2002].   В   то   же   время   накапливаются  доказательства   их   значительно   более   широкой   функциональной   активности:  наряду   со   способностью   нормализовать   функции   кишечной   микрофлоры  пробиотики   могут   способствовать   усилению   иммунитета,   ослаблению  проявлений пищевой аллергии, облегчать симптомы непереносимости лактозы,  оказывать   гипохолестеринемическое,   антиканцерогенное   и   антимутагенное  действие [De Vrese M. et al., 2001;

 Isolauri E. et al., 2001;

 Pereira D.I. et al., 2002;

  Gill H.S. et al., 2004].  В последнее время появляются сообщения об обнаружении у некоторых  МКБ   антиоксидантных   свойств,   которые   сохраняются   и   даже   усиливаются   в  составе пищевых продуктов, ферментированных или обогащенных ими [Kaizu H.  et  al., 1993;

 Wang  Y.  C.  et  al., 2006;

 Virtanen  T.  et  al., 2007;

 Mikelsaar  M.  et  al.,  2009]. В ряде исследований была показана способность различных штаммов МКБ  подавлять   процессы   перекисного   окисления   липидов   (ПОЛ)   микросом   и  липопротеидов низкой плотности, захватывать свободные радикалы, усиливать  экспрессию   генов   ферментов   антиоксидантной   защиты   в   различных   тканях   и  повышать их антиоксидантную емкость [Kaizu  H.  et  al., 1993;

 Lin  M.  Y.  et  al.,  1999;

 Stecchini  M.  L.  et  al., 2001;

 Saide  J.  A.  O.  et  al., 2005;

 Aoi  W.  et  al., 2007;

  Mikelsaar M. et al., 2009].  Не менее актуальной тематикой является исследование ферментативной  активности   пробиотических   штаммов,   включая   ферменты   антиоксидантной  защиты   и   гидролитические   ферменты.   Некоторые   виды   микроорганизмов,  используемых   в   качестве   пробиотиков   и   йогуртных   заквасок,   могут   являться  «носителями» гликозил­гидролаз, отсутствующих или недостаточно активных у  человека [Шендеров Б. А., 1998;

 Pedrosa M. C. et al., 1995;

 Honda H. et al., 2007].  Увеличение   активности   ­галактозидазы,   обеспечивающей   гидролиз   ­ галактоолигосахаридов, но отсутствующей у млекопитающих, и ­галактозидазы  (лактазы),   недостаточность   которой   приводит   к   явлениям   непереносимости  лактозы, обнаруживали в содержимом кишечника людей в период употребления  кисломолочных   продуктов   [Marteau  P.  et  al.,   1990;

 De  Vrese  M.  et  al.,   2001;

  LeBlanc  J.  G.  et  al.,   2005].   Бактериальным   гликозил­гидролазам   микрофлоры  желудочно­кишечного   тракта   отводится   важная   роль   в   метаболизме   многих  биологически активных соединений растительного происхождения (флавоноиды,  изофлавоны)  [Шендеров  Б.  А.,  1998;

 Nemeth  K.  et  al.,  2003;

 Crozier  A.  et  al.,  2009].

Исследование   проводили   в   соответствии   с   планом   НИР   НИИ   питания  РАМН по теме № 093 «Изучение роли некоторых минорных  компонентов пищи  в формировании адаптационного потенциала организма» (2008­2010 гг.).  Цель и задачи исследования Целью работы являлось изучение характера антиоксидантного действия и  ферментативных свойств пробиотических штаммов молочнокислых бактерий и  йогуртных заквасок.

Задачи исследования:

1. Провести   сравнительное   изучение   антиоксидантных   свойств  молочнокислых бактерий различных таксономических групп в модельных  системах in vitro;

2. Изучить   влияние   штамма   пробиотических   молочнокислых   бактерий  Lactobacillus casei 114001 и содержащего его кисломолочного продукта на  антиоксидантный статус крыс;

3. Изучить антиоксидантные и гепатопротекторные свойства L. casei 114001   в условиях индуцированного окислительного стресса;

   4. Оценить   спектр   энзиматической   активности   молочнокислых   бактерий  различных таксономических групп;

  5. Изучить   влияние  L.  casei  114001  на   формирование   энзиматической  активности слизистой оболочки кишечника и микробиоты толстой кишки  при внутрижелудочном введении пробиотика лабораторным животным;

   6. Изучить   влияние  L.  casei  114001  на   биологическую   активность   рутина  (кверцетин­3­О­­глюкозо­­L­рамнозида).  Научная новизна работы Впервые дана характеристика антиоксидантных и энзиматических свойств  ряда штаммов МКБ. Установлено, что штаммы  L.  casei  и штамм  L.  fermentum  ME­3 обладают выраженной способностью к подавлению свободнорадикального  окисления (СРО) люминола и ПОЛ микросом. Показано наличие высокой ­ и ­ глюкозидазной и  ­галактозидазной активности у штамма  L.  fermentum  ME­3  и  некоторых штаммов L. casei. Впервые обнаружено, что штамм L. casei 114001 и  молочнокислый продукт с его содержанием оказывают активирующее действие  на   систему   антиоксидантной   защиты   крыс,   проявляющееся   в   уменьшении  накопления  продуктов ПОЛ (МДА) в плазме крови крыс на фоне повышения  общей   антиоксидантной   емкости   плазмы   крови,   цитозоля   печени   и   слизистой  оболочки   тонкого   кишечника.   Впервые   выявлено   антиоксидантное   и  гепатопротекторное действие штамма  L.  casei  114001  на модели токсического  поражения   печени,   индуцированного   четыреххлористым   углеродом.   Показано,  что   штамм  L.  casei  114001  подавляет   ­глюкуронидазную   активность  микрофлоры толстого кишечника. При совместном поступлении с пищей L. casei  114001  усиливает   вызванное   рутином   улучшение   антиоксидантного   статуса  крыс.  Практическая значимость работы Сформированный   и   апробированный   в   работе   комплекс   биохимических  показателей   может   быть   использован   при   поиске,   селекции   и   оценке  эффективности штаммов МКБ для промышленного применения при разработке  заквасок   и   пробиотических   профилактических   и   лечебных   препаратов   и  продуктов функционального питания. Полученные данные об энзиматической и  антиоксидантной активности штаммов МКБ могут быть использованы в научно­ исследовательской   работе.   Новые   экспериментальные   данные   об  антиоксидантных   и   гепатопротекторных   свойствах   штамма  L.  casei  114001,   а  также его модулирующему воздействию на активность ферментов кишечника и  микробиоты,   являются   дополнительным   подтверждением   его   полезных   для  макроорганизма свойств и пробиотического статуса.  Апробация работы Апробация работы состоялась 25 января 2010 года на межлабораторной  конференции НИИ питания РАМН. Материалы диссертации доложены на IХ, Х и  ХI Всероссийских конгрессах диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье»  (Москва,   2007,   2008,   2009),   3­м   Съезде   токсикологов   России   (Москва,   2008),  Научно­практической   конференции   молодых   ученых   и   специалистов  «Актуальные   вопросы   клинической   и   экспериментальной   медицины   –   2009»  (Санкт­Петербург,   2009),   Ежегодной   конференции   молодых   ученых   НИИ  питания  РАМН   (Москва,  2009),  V  Всероссийском  форуме   «Здоровье   нации   –  основа процветания России» (Москва, 2009).

Публикации По   теме   диссертации   опубликовано   11   работ,   в   том   числе   3   статьи   в  научных   рецензируемых   журналах,   рекомендованных   Высшей   аттестационной  комиссией Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста, состоит из  введения,   обзора   литературы,   описания   материалов   и   методов   исследования,  результатов   собственных   исследований,   заключения,   выводов,   включает   35  таблиц   и   иллюстрирована   40   рисунками.   Указатель   литературы   включает   43  отечественных и 280 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали штаммы Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,  Streptococcus   thermophilus  и  Lactobacillus  casei,   предоставленные  исследовательским центром Данон (Франция) и штамм  Lactobacillus  fermentum  ME­3, полученный из коллекции  Deutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen  und  Zellkulturen  (DSM  14241).   Штаммы   хранились   в   средах   с   добавлением   20%  глицерина или 5,3% ДМСО при ­70оС. Для исследований штаммы выращивали в  жидких   средах,   чистоту   суспензий   проверяли   микроскопически.   Процесс  получения   бесклеточных   экстрактов   включал   следующие   стадии:  центрифугирование   суспензии  бактериальных   клеток,   промывание   осадка,  ресуспендирование   и   стандартизацию   концентрации   (109  КОЕ/мл),   обработку  ультразвуком и центрифугирование. Бесклеточные экстракты хранили при ­70оС.

  Методы исследования       vitro   Для оценки антиоксидантной активности   in     .

бесклеточных   экстрактов   штаммов   МКБ   использовали   систему  Hb­H2O2­ люминол   [Теселкин   Ю.   О.   и   соавт.,   1997,   1998]   и   модель   НАДФН­Fe2+  –  индуцированного ПОЛ микросом, выделенных  из печени   крыс­самцов Вистар  [Владимиров   Ю.   А.   и   соавт.,   1972].  Fe3+  –   восстанавливающую   активность  бесклеточных   экстрактов   штаммов   МКБ   определяли   в   системе  FRAP  (ferric  reducing  antioxidant  power)   по   методу   [Benzie  F.  F.  I.  et  al.,   1990].  Супероксиддисмутазную   активность   исследуемого   материала   определяли   по  методу [Nishikimi M. et al., 1971].

Полуколичественную   оценку   энзиматической   активности   штаммов   МКБ  осуществляли   с   использованием   наборов  API  ZYM  (BioMerieux,   Франция).   В  бесклеточных экстрактах штаммов МКБ определяли активность  ­глюкозидазы  [Kim  K. Y.  et  al., 2008],  ­глюкозидазы [Djouzi  Z. et al., 1997],  ­галактозидазы  [Yoon  M.  Y.  et  al.,   2008],   ­галактозидазы   [Martini  M.  C.  et  al.,   1991],   ­ глюкуронидазы [Djouzi Z. et al., 1997].    Методы   исследования  in   vivo   Эксперименты  in  vivo  проводили   с           .

использованием   половозрелых   крыс­самцов   Вистар,   получающих   полноценный  полусинтетический рацион.  Для   изучения   влияния  Lactobacillus  casei  114001  на   показатели  антиоксидантного   статуса   крыс,   а   также   на   активность   гидролитических  ферментов слизистой оболочки тонкого кишечника и микробиоты слепой кишки,  крысам опытной группы в течение 14 дней вводили внутрижелудочно (в/ж) по 0,5  мл   суспензии   лактобацилл   в   физиологическом   растворе   (2109  КОЕ/крысу),  крысам   контрольной   группы   вводили   равное   количество   физиологического  раствора.

При   сравнительном   изучении   влияния   штамма  L.  casei  114001  и  кисломолочного   продукта,   его   содержащего,   на   интегральные   показатели  антиоксидантного   статуса   крыс   животным   1­й   опытной   группы   вводили   в  течение   21   дня   в/ж   ежедневно   по   0,5   мл   суспензии   лактобацилл   в  физиологическом   растворе   (108  КОЕ/крысу),   2­й   опытной   группы   –   0,5   мл  кисломолочного продукта «Актимель» (ООО «Данон Индустрия»), содержащего  L. casei 114001 (108 КОЕ/крысу) и йогуртную закваску. Животным контрольной  группы вводили равное количество физиологического раствора.  Для   оценки   антиоксидантных   и   гепатопротекторных   свойств  L.  casei  114001  в   условиях   индуцированного   окислительного   стресса   использовали  модель   токсического   поражения   печени   четыреххлористым   углеродом.   В  течение 8 дней крысам контрольной и 1­й опытной групп вводили в/ж 0,5 мл  физиологического   раствора,   2­й   опытной   группы   –   взвесь  L.  casei  114001  в  физиологическом   растворе   в   количестве   2,81010  КОЕ/крысу.   За   24   ч   до  умерщвления   животным   опытных   групп   вводили   однократно   внутрибрюшинно  (в/б) раствор  CCl4  в оливковом масле (1:1) в дозе 0,5 мл на 1 кг массы тела,  животным контрольной группы – равное количество масла. Предварительно на 5­ ти группах крыс проводили исследования по отработке модели окислительного  стресса. Несколько дней животные получали полусинтетический рацион. За 24  часа до забоя животным опытных групп вводили в/б однократно CCl4 в дозе 0,05,  0,10, 0,25 и 0,50 мл/кг массы тела в виде 2,5, 5, 12,5 и 25% раствора в оливковом  масле.  Для   изучения   влияния  L.  casei  114001  на   биологическую   активность  рутина  крысам  опытных   групп  вводили рутин  в  рацион  в количестве 0,4%.  В  течение 14 дней крысам контрольной и 1­й опытной групп вводили в/ж 0,5 мл  физиологического   раствора,   2­й   опытной   группы   –   взвесь  L.  casei  114001  в  физиологическом растворе в количестве 2109 КОЕ/крысу.

За 12 ч до умерщвления животных лишали пищи. Животных подвергали  декапитации,   для   исследований   отбирали   кровь,   печень,   тонкий   кишечник   и  содержимое слепой кишки.

В плазме крови определяли содержание МДА [Uchiyama  M.  et  al., 1978].  АОЕ   и   восстанавливающую   активность   плазмы   крови,   цитозоля   печени   и  слизистой оболочки тонкого кишечника определяли по методам [Теселкин Ю. О.  и соавт., 1997, 1998] и [Benzie F. F. I. et al., 1990], соответственно. АОЕ плазмы  крови   определяли   также   в   системе  TAS  (Total  Antioxidant  Status)   с  использованием   наборов  RANDOX  (Randox  Laboratories,   Великобритания).   В  цитозольной   фракции   печени   и   слизистой   тонкого   кишечника   определяли  активность каталазы [Aebi  H.  E., 1984], супероксиддисмутазы [Nishikimi  M.  et  al., 1971], глутатионпероксидазы [Flohe  L.  et  al., 1984], глутатионтрансферазы  [Habig  W.  H.  et  al.,   1974],   глутатионредуктазы   [Cai  Q.  et  al.,   1996],  хинонредуктазы   [Benson  A.  et  al.,   1980],   УДФ­глюкуронозилтрансферазы  [Burchell  B.  et  al., 1981], ксантиноксидазы [Lin  W.  et  al., 2005]. В гомогенате и  цитозоле печени определяли неседиментируемую активность ферментов лизосом  [Дингл   Г.,   1980]1.   В   цитозоле   слизистой   тонкого   кишечника   и   содержимом  слепой   кишки   крыс   определяли   активность   ­   и   ­глюкозидаз,     ­   и   ­ галактозидаз и  ­глюкуронидазы [Djouzi  Z.  et  al., 1997]. В содержимом слепой  кишки определяли содержание флавонольных метаболитов рутина [Manach C. et  al., 1995]. Содержание белка определяли по методу [Lowry O. H. et al., 1951].

Статистическую   обработку   данных   проводили   методом   дисперсионного  анализа  ANOVA  с   использованием  t­критерия   Стьюдента   при   помощи  компьютерной программы “Statistica”.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ  И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Скрининг антиоксидантной активности штаммов МКБ   in vitro   в различных модельных системах         Полученные   данные   показали,   что   все   изученные   штаммы   МКБ   в  определенной мере проявляли антиоксидантную активность in vitro (табл. 1). Все  штаммы   обладали   высокой   супероксиддисмутазной   и   восстанавливающей  активностью.   Способность   подавлять   СРО   люминола   и   индуцированное   ПОЛ  микросом   печени   крыс   у   штаммов   различных   таксономических   видов  существенно   различалась.   Бесклеточные   экстракты   штаммов  L.  casei  и  L.  fermentum  подавляли СРО люминола на 43 – 65,8% и ПОЛ микросом на 57,9 –  89,5%,   а  L.  bulgaricus  и  S.  thermophilus  –   не   более   чем   на   15,9   и   17,9%,  соответственно.  Табл. 1. Антиоксидантная емкость (АОЕ), восстанавливающая и   cупероксиддисмутазная активности бесклеточных экстрактов штаммов   молочнокислых бактерий Восстанавливающая  АОЕ, %  Подавление ПОЛ  Активность СОД,  Штамм активность, мМ Fe2+­экв. Ед/109 КОЕ подавления ХЛ микросом, % 0,337 5,7 4,9 21, L. bulgaricus  0,225 11,1 3,7 9, L. bulgaricus   Совместно с в.н.с., к.м.н. Кравченко Л.В. и ст.н.с., к.м.н. Авреньевой Л.И.

0,733 11,5 14,3 22, L. bulgaricus  0,248 14,4 17,90 16, L. bulgaricus  0,254 43,0 57,9 17, L. casei  0,390 62,1 88,5 5, L. casei  0,319 65,8 89,5 20, L. casei  0,260 53,3 72,8 24, L. fermentum МЕ­ 0,177 7,8 4,3 28, S. thermophilus  0,367 10,7 9,6 35, S. thermophilus  0,272 0,7 0 28, S. thermophilus  0,284 12,8 8,5 31, S. thermophilus  0,449 15,9 8,6 33, S. thermophilus  0,296 8,7 0 28, S. thermophilus    Изучение влияния штамма    .    L  casei    114001      на  антиоксидантный статус крыс Введение в/ж лабораторным животным в течение 14 дней L. casei 114001 в  количестве   2109  КОЕ/крысу   вызывало   достоверное   улучшение   показателей  антиоксидантного статуса крыс. В плазме крови крыс опытной группы (рис. 1)  повышалась АОЕ в системе  TAS  на 7% и снижалось содержание МДА на 30%,  что свидетельствует о подавлении процессов ПОЛ. В печени (рис. 2) обнаружено  значительное возрастание АОЕ  (на 92%)  и восстанавливающей активности  (на  56%),   что   сопровождалось   повышением   активности   глутатионпероксидазы   (на  21%) и хинонредуктазы (на 72%). У крыс, получавших L. casei, возрастала АОЕ и  восстанавливающая активность слизистой оболочки тонкого кишечника (рис. 3).

Полученные   результаты   свидетельствуют,   что   штамм  L.  casei  114001  сохраняет свои антиоксидантные свойства in vivo, и они проявляются не только  на   местном   уровне,   в   желудочно­кишечном   тракте,   но   и   носят   системный  характер.

  % от контроля b 110 Контрольная а а О пытная b FR AP TAS АОЕ, АОЕ, мкМ МДА подавление аскорбатных ХЛ экв.

Здесь и далее различия между значениями, обозначенными разными буквами статистически   достоверны,  p  0, Рис. 1. Восстанавливающая активность (FRAP), общий антиоксидантный статус   (TAS), общая антиоксидантная емкость (АОЕ) и содержание МДА в плазме крови   крыс получавших L.casei   b b b % от контроля Контрольная b Опытная а а а а а b FRAP АОЕ КАТ СОД ГП ГТ ХР УДФ-ГлТ   Рис.   2.  Восстанавливающая   активность  (FRAP),  АОЕ и  активность  ферментов   антиоксидантной защиты в печени крыс, получавших L. casei   а b % от контроля 110 а b Контрольная Опытная FRAP АОЕ, подавл. ХЛ АОЕ, мкМ АЭ Рис. 3. Восстанавливающая активность (FRAP) и АОЕ слизистой оболочки тонкого   кишечника крыс, получавших L. casei   Сравнительное изучение влияния    .    L  casei    114001    и кисломолочного    продукта, его содержащего, на показатели антиоксидантного статуса крыс Введение в/ж лабораторным животным в течение 21 дня L. casei 114001 в  количестве 108 КОЕ/крысу (1­я опытная группа) или кисломолочного продукта с  равным  количеством  L.  casei  114001  (2­я  опытная  группа),  вызывало  сходные  изменения интегральных показателей антиоксидантного статуса крыс (табл. 2).  АОЕ   плазмы   крови   крыс   1­й   и   2­й   опытных   групп   возрастала   на   28   и   32%,  соответственно,   при   снижении   в   плазме   содержания   МДА   на   26   и   18%,  соответственно. В печени крыс 1­й и 2­й опытных групп обнаружено возрастание  АОЕ на 29 и 15% (недостоверно) и восстанавливающей активности на 34 и 30%,  соответственно. АОЕ слизистой оболочки тонкого кишечника возрастала у крыс  1­й и 2­й опытных групп на 31 и 30%, соответственно.

Табл. 2. Показатели антиоксидантного статуса крыс, получавших  L. casei  (1­я   опытная группа) или кисломолочный пробиотический продукт (2­я опытная   группа) Группа животных Показатель Контрольная 1­я Опытная 2­я Опытная Плазма крови Восстанавливающая активность  (FRAP), 0,268 ± 0,005 0,267 ± 0,011 0,258 ± 0, мМ Fe2+ эквивалентов АОЕ, % подавления ХЛ 31,5 ± 2,6а 40,3 ± 1,3b 41,6 ± 0,9b МДА, нмоль/мл 4,11 ± 0,25a 3,05 ± 0,08b 3,35 ± 0,18b Печень Восстанавливающая активность  8,13 ± 0,46a 10,91 ± 0,27b 10,60 ± 0,39b (FRAP), мМ Fe2+ эквивалентов АОЕ, % подавления ХЛ 27,2 ± 2,6a 35,0 ± 1,7b 31,3 ± 3,2a Слизистая оболочка тонкого кишечника Восстанавливающая активность  (FRAP), 10,14 ± 0,42 9,83 ± 0,11 9,49 ± 0, мМ Fe2+ эквивалентов АОЕ, % подавления ХЛ 16,1 ± 1,8a 21,1 ± 1,9b 21,0 ± 1,3b Здесь и далее данные представлены в виде M ± m.

Полученные   результаты   позволяют   заключить,   что  L.  casei  114001  в  составе кисломолочного продукта сохраняет способность оказывать системное  влияние на антиоксидантный статус крыс.

Характеристика острого токсического действия четыреххлористого  углерода как модели окислительного стресса Однократное внутрибрюшинное (в/б) введение крысам  CCl4  в дозах 0,05,  0,10, 0,25 и 0,50 мл/кг массы тела приводило к дозозависимому возрастанию в  плазме крови активности аланинаминотрансферазы (до 475% от контроля при  максимальной дозе CCl4), активности арилсульфатазы (до 180% от контроля при  максимальной   дозе  CCl4)   и   уровня   МДА   (до   177%   от   контроля   при  максимальной дозе CCl4).

Однократное   введение   крысам  CCl4  приводило   к   зависимому   от   дозы  снижению   восстанавливающей   активности   цитозоля   печени   и   сопровождалось  * снижением   активности   ключевых   ферментов   антиоксидантной   защиты   –  каталазы,   СОД,   глутатионтрансферазы,   хинонредуктазы   и   УДФ­ глюкуронозилтрансферазы   (рис.   4).   Содержание   в   печени   восстановленного  глутатиона достоверно возрастало в зависимости, обратной от дозы. * * * * * % от контроля К нр л н я о то ь а 0 5 м /к м.

,0 л г.т 0 0 0 м /к м.

,1 л г.т ** * 0 5 м /к м.

,2 л г.т * * 80 * * 0 0 м /к м.

,5 л г.т ** * * * * * * FRAP КАТ СОД ГТ ХР УД -Г Т Фл GSH * здесь и далее ­  р  0,05 по отношению к контролю Рис. 4. Восстанавливающая активность (FRAP) и активность ферментов   антиоксидантной защиты в печени крыс через 24 часа после в/б введения CCl4 в дозе   от 0,05 до 0,50 мл/кг м.т.

Результаты   изучения   влияния  CCl4  на   общую   (в   гомогенате)   и  неседиментируемую   (в   цитозоле)   активность   ферментов   лизосом   выявили  зависимое   от   дозы  CCl4  снижение   общей   активности   ­глюкуронидазы   и  арилсульфатазы при одновременном возрастании неседиментируемой активности  (рис.   5),   что   свидетельствует   о   нарушении   стабильности   лизосомальной  мембраны в условиях окислительного стресса.  * * * Контрольная % от контроля * 0,05 мл/кг м.т.

0,10 мл/кг м.т.

0,25 мл/кг м.т.

0,50 мл/кг м.т.

Арилсульфатазы А и В -Глюкуронидаза Рис. 5. Неседиментируемая активность лизосомальных ферментов печени крыс   через 24 часа после в/б введения CCl4 в дозе от 0,05 до 0,50 мл/кг м.т.

Таким   образом,   результаты   исследований   показали,   что   однократное  введение CCl4 приводит к быстрому развитию токсического поражения печени и  окислительного   стресса,   которые   характеризовались   нарушением   целостности  лизосомальной   и   плазматической   мембран   и   значительными   изменениями  антиоксидантного статуса крыс. Для последующих экспериментов была выбрана  доза 0,05 мл CCl4/кг м.т.

Оценка антиоксидантных и гепатопротекторных свойств штамма    Lactobacillus     casei    114001    на модели токсического поражения печени,    индуцированного четыреххлористым углеродом Токсическое   действие  CCl4  (1­я   опытная   группа)   характеризовалось  потерей массы тела, увеличением относительной массы печени на 30%, а также  наличием   макроскопических   изменений   печени   у   8   из   8   крыс   в   группе,  снижением восстанавливающей активности и АОЕ плазмы крови.   Восстанавливающая   активность   и   АОЕ   цитозоля   печени   крыс   при   этом  снижались по сравнению с контролем на 56 и 40%, соответственно (рис. 6). Это  сопровождалось снижением активности каталазы на 23%, глутатионредуктазы на  15%, глутатионтрансферазы на 22%, УДФ­глюкуронозилтрансферазы на 35%. В  печени   крыс,   получавших  CCl4,   повышалось   содержание   восстановленного  глутатиона на 39%.  При   введении  CCl4  крысам,   получавшим  L.  casei  114001  (2­я   опытная  группа)   изменения   весовых   показателей   были   выражены   в   меньшей   степени,  видимые изменения печени наблюдались  только у 3 из 8 крыс в группе. АОЕ  цитозоля   печени   восстанавливалась   до   уровня   контроля,   частично  нормализовалась   сниженная  CCl4  активность   антиоксидантных   ферментов   в  печени   –   каталазы,   глутатионредуктазы,   глутатионтрансферазы   и  хинонредуктазы.   При   этом   уровень   активности   ГР   и   ГТ   статистически   не  отличался от контрольных значений.

  b b % от контроля a a a a a a a a a ab ab Контрольная b b b b 1-я опытная 2-я опытная b b bb FRAP АОЕ КАТ СОД ГП ГР ГТ ХР УДФ- GSH КсО ГлТ Рис.   6.   Восстанавливающая   активность   (FRAP),   АОЕ   и   активность   ферментов антиоксидантной защиты в печени крыс через 24 часа после введения   CCl4 (1­я опытная группа) или CCl4 + L.casei (2­я опытная группа) Особенно   стоит   отметить   достоверное   снижение   в   группе   животных,  b b получавших  CCl4  совместно с  L.  casei  114001, неседиментируемой активности  лизосомальных   ферментов,   по   сравнению   с   показателями   группы,   получавшей  только  CCl4  (рис. 7), что свидетельствует о снижении мембраноповреждающего  действия CCl4.

a b b с % от контроля Контрольная a a a 110 1-я опытная 2-я опытная Арилсульфатазы А и В -глюкуронидаза Рис. 7. Неседиментируемая активность лизосомальных ферментов печени   крыс через 24 часа после введения CCl4 (1­я опытная группа) или CCl4 + L.casei (2­я   опытная группа) Полученные результаты позволяют заключить, что пробиотический штамм  L.  casei  114001  уменьшает тяжесть индуцированного  CCl4  поражения печени и  значительно снижает степень выраженности окислительного стресса.  Скрининг активности конститутивных ферментов молочнокислых  бактерий Скрининг энзиматической активности штаммов МКБ проводили вначале  полуколичественным   методом   с   использованием   наборов  API  ZYM  (19  различных гликозил­гидролаз, пептидаз и эстераз), а затем данные уточняли при  помощи количественных методов с использованием специфических субстратов.  В результате проведенных исследований было обнаружено, что штаммы L.  casei  и  L.  fermentum  в   целом   обладают   более   выраженной   и   разнообразной  гликозил­гидролазной активностью по сравнению со штаммами L. bulgaricus и S.  thermophilus (табл. 3). L. fermentum ME­3 проявлял высокую  ­галактозидазную  активность,   что   является   ценной   характеристикой   при   селекции  микроорганизмов для ферментирования соевого молока. Штаммы  L.  casei  и  L.  fermentum ME­3 также обладали выраженной ­ и ­глюкозидазной активностью,  которая   участвует   в   расщеплении   гликозидов   разнообразных   биологически  активных   соединений,   включая   флавоноиды   и   изофлавоны.   В   то   же   время  способность   к   гидролизу   лактозы,   присутствующая   у   всех   исследованных  штаммов, была наиболее выражена у видов L. bulgaricus и S. thermophilus.  Табл. 3. Активность гликозил­гидролаз бесклеточных экстрактов штаммов  молочнокислых бактерий Фермент ­Галактозидаза, ­Галактозидаза, ­Глюкозидаза, ­ Глюкозидаза, ­Глюкуронидаза, Штамм нмоль/минмг  нмоль/минмг  нмоль/минмг  нмоль/минмг  нмоль/минмг белка  белка белка рН 7,0 белка рН 7,0 белка рН 7,4 рН 6, рН 6, L. casei 114001 0 0,6 77,7 6,3 0, L. casei 153 3,9 24,5 54,4 28,9 5, L. casei 154 3,8 23,3 7,5 32,1 3, 94,2 59,7 2,1 0,8 0, L. fermentum ME­ L. bulgaricus 100504 1,0 63,4 0,2 0 0, 0,6 61,8 0,2 0 0, L. bulgaricus  0,1 93,1 0,4 0 0, L. bulgaricus  0,1 108,4 0 0 0, L. bulgaricus  S. thermophilus  0 104,2 0 0 S. thermophilus  0 89,7 0,3 0 0,   casei    Изучение влияния    Lactobacillus     114001    на ферментативную активность   слизистой оболочки тонкого кишечника и микробиоты крыс При введении в/ж крысам в течение 14 дней L. casei 114001 в количестве  2109 КОЕ/крысу выявляли тенденцию к возрастанию активности ­глюкозидазы,  ­галактозидазы,   ­глюкуронидазы   и  УДФ­глюкуронозилтрансферазы   в  слизистой оболочке тонкого кишечника (рис. 8).  В микробиоте слепой кишки крыс, получавших L. casei 114001, изменения  активности   ­   и   ­галактозидаз   были   небольшими   и   статистически  недостоверными, в то время как активность  ­глюкуронидазы была снижена до  52%  от   контрольного   уровня  (рис.  9).  Поскольку  высокая   ­глюкуронидазная  активность в микрофлоре кишечника ассоциируется с высоким риском развития  рака толстой кишки, её снижение рассматривается многими исследователями в  качестве маркера антиканцерогенного действия МКБ [Gorbach  S.L.  et  al., 1990;

  Rowland I.R. et al., 1998;

 Karthik kumar V. et al., 2009].    140 130 а 120 % от контроля % от контроля 110 Контрольная 100 Опытная 90 80 b 70 60 -Глк -Гал -Глкр УДФ-ГлТ -Глк -Глк -Гал -Гал -Глкр     Рис. 8. Активность гидролаз гликозидов  Рис. 9. Активность гликозил­гидролаз и ­ и УДФ­глюкуронозилтрансферазы в   глюкуронидазы микробиоты толстого   слизистой оболочке тонкого   кишечника крыс, получавших L. casei  кишечника крыс, получавших L. casei    Изучение влияния    .    L  casei    114001    на биологическую активность рутина   Целью данного раздела явилось изучение влияния штамма L. casei 114001,  обладающего   антиоксидантной   активностью,   вырабатывающего   ряд   гликозил­ гидролаз   и   оказывающего   модулирующее   действие   на   ферменты   тонкого  кишечника   и   кишечной   микробиоты,   на   биологическую   активность   рутина  (кверцетин­3­О­­глюкозо­­L­рамнозида),   оцениваемую   по   его  антиоксидантным эффектам.

Введение   0,4%   рутина   в   рацион   крыс   приводило   к   возрастанию   общего  антиоксидантного статуса (на 10%) и АОЕ плазмы крови (на 27%) и к снижению  в   ней   продуктов   ПОЛ   (на   19%)   (рис.   10).   В   печени   при   этом   значительно  возрастала восстанавливающая активность (на 36%) и АОЕ (на 68%) (рис. 11).  Аналогичные   изменения   этих   показателей   выявлены   и   в   слизистой   оболочке  тонкого кишечника (рис.12).    b ab % от контроля bb Контрольная a a % контроля a 1-я опытная 2-я опытная b b FRAP TAS АОЕ, АОЕ, мкМ МДА подавление аскорбатных ХЛ экв.

Рис. 10. Восстанавливающая активность (FRAP), общий антиоксидантный статус   (TAS), АОЕ  и содержание МДА в плазме крови крыс получавших рутин (1­я   опытная группа) или рутин + L. casei (2­я опытная группа)   b b b b b % от контроля % контроля b b Контрольная b 1-я опытная bb bb 2-я опытная a a a a a bb a FRAP АОЕ КАТ СОД ГП ГТ УДФ-ГлТ ХР Рис. 11. Восстанавливающая активность (FRAP), АОЕ и активность ферментов   антиоксидантной защиты в печени крыс, получавших рутин (1­я опытная группа)   a или рутин + L.casei (2­я опытная группа)   b b b b аb % от контроля b b b b a aa a a a a a a % контроля b Контрольная a 1-я опытная c 80 2-я опытная ab b a FRAP АОЕ, АОЕ, КАТ СОД ГП ГТ ХР подавл. мкМ АЭ ХЛ Рис. 12. Восстанавливающая активность (FRAP), АОЕ и активность   ферментов антиоксидантной защиты в слизистой оболочке тонкого кишечника   крыс получавших рутин (1­я опытная группа) или рутин + L. casei (2­я опытная   группа) При   комбинированном   действии   рутина   и  L.  casei  прослеживается  усиление   антиоксидантных   эффектов,   наблюдаемых   у   животных,   получающих  только   рутин.   АОЕ   плазмы   крови   возрастала   до   45%   за   счет   усиления  антирадикальной   активности   и   на   21%   за   счет   усиления   подавления   СРО,  характерного   для   антиоксидантной   активности   штамма  L.  casei  114001.  Восстанавливающая активность печени возрастала до 61%, АОЕ – до 94%. При  этом   активность   антиоксидантных   ферментов   не   отличалась   от   активности  ферментов,   определяемой   в   печени   крыс,   получавших   только   рутин.   В  значительно большей степени, по сравнению с 1­й опытной группой, возрастала  восстанавливающая активность цитозоля слизистой тонкого кишечника (на 18%)  и АОЕ – как за счет  антирадикальной активности –  до 42% от контрольного  уровня, так и за счет усиления подавления СРО – на 13%.

В   слизистой   тонкого   кишечника   крыс,   получавших   рутин   или   рутин  совместно с  L.  casei  114001,  наблюдалось значительное возрастание активности  УДФ­глюкуронозилтрансферазы   до   уровня   176   и   200%   от   контрольного,  соответственно (рис. 13). Активность  ­глюкозидазы у крыс, получавших рутин  вместе   с   лактобациллами,   снижалась   по   сравнению   с   крысами,   получавшими  только рутин.  Результаты изучения активности гликозил­гидролаз в содержимом слепой  кишки (рис. 14) показали, что включение 0,4% рутина в рацион крыс  приводит к  достоверному  снижению активности  ­глюкуронидазы на 42% по  сравнению с  контролем. При комбинированном действии рутина и L. casei активность ­ и ­ галактозидаз в микробиоте слепой кишки крыс снижалась более чем в 2 раза, а  активность ­глюкуронидазы составляла всего 17% от уровня контроля.

b 190 b a a a % от контроля % от контроля аb 150 80 a Контрольная Контрольная b 130 1-я опытная 1-я опытная 60 b 110 a a a b 2-я опытная 2-я опытная 90 b с -Глк -Глк -Гал -Гал -Глкр -Глк -Гал УДФ-ГлТ -Глкр Рис. 13. Активность гликозил­ Рис. 14. Активность гликозил­гидролаз   гидролаз в слизистой оболочке   микробиоты слепой кишки крыс получавших   тонкого кишечника крыс,   рутин (1­я опытная группа) или рутин + L.   получавших рутин (1­я опытная   casei (2­я опытная группа) группа) или рутин + L. casei (2­я   опытная группа) Обнаружено снижение (на 37%) содержания рутина и его флавонольных  метаболитов в содержимом слепой кишки крыс, получавших рутин совместно с  L. casei., что может быть результатом повышения биодоступности рутина, либо  усиления   процесса   расщепления   флавонольных   соединений   под   действием  ферментов кишечной микрофлоры.  ВЫВОДЫ 1. Впервые   показано,   что   изученные   штаммы   молочнокислых   бактерий  различных   таксономических   групп   (Lactobacillus  delbrueckii  subsp.  bulgaricus,  L.  casei,  L.  fermentum,  Streptococcus  salivarius  subsp.  thermophilus)   обладают   высокой   супероксиддисмутазной   и  восстанавливающей   активностью,   но   только   представители  L.  casei  и  L.  fermentum  проявляют   выраженную   способность   подавлять   процессы  свободно­радикального окисления.  2. Внутрижелудочное   введение   крысам   пробиотического   штамма  молочнокислых бактерий L. casei 114001 и содержащего их кисломолочного  продукта   приводит   к   системному   улучшению   антиоксидантного   статуса  крыс   за   счет   возрастания   активности   антиоксидантных   ферментов   –  глутатионпероксидазы   (на   21%)   и   хинонредуктазы   (на   72%)   –   в   печени,  увеличения   антиоксидантной   емкости   и   восстанавливающей   активности  цитозоля   печени   и   слизистой   оболочки   тонкого   кишечника,   а   также  снижения в плазме крови уровня МДА (на 30%).

3. L.  casei  штамм  114001  снижает   степень   окислительного   стресса   и  тяжесть поражения печени крыс, индуцированные  CCl4. Это выражается в  полном   восстановлении   антиоксидантной   емкости   цитозоля   печени   и  частичном   восстановлении   в   печени   активности   антиоксидантных  ферментов   (глутатионредуктазы,   глутатионтрансферазы   и   УДФ­ глюкуронозилтрансферазы),   в   повышении   антиоксидантной   емкости   и  восстанавливающей активности слизистой оболочки тонкого кишечника, а  также   в   уменьшении   повреждающего   действия  CCl4  на   плазматические   и  лизосомальные мембраны.  4. Охарактеризован   ферментный   профиль   штаммов   молочнокислых  бактерий   видов  L.  bulgaricus,  L.  casei,  L.  fermentum,  S.    thermophilus.  Обнаружена высокая  ­ и  ­глюкозидазная и  ­галактозидазная активность  у представителей L. casei и L. fermentum.  5. Внутрижелудочное   введение  L.  casei  114001  сопровождается  возрастанием   активности   УДФ­глюкуронозилтрансферазы   (на   29%)   в  слизистой  оболочке тонкого  кишечника  и  снижением   “проканцерогенной”  активности микрофлоры толстого кишечника за счет снижения активности  ­глюкуронидазы (на 45%).  6. При   совместном   поступлении   штамм  L.  casei  114001  усиливает  антиоксидантное действие рутина, что проявляется в усилении вызванного  рутином возрастания антиоксидантной емкости плазмы крови и снижении в  ней   содержания   МДА,   возрастании   восстанавливающей   активности   и  антиоксидантной емкости печени и слизистой оболочки тонкого кишечника.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК 1.  Ускова   М.А.,   Кравченко   Л.В.  Антиоксидантные   эффекты  молочнокислых бактерий – пробиотиков и йогуртных заквасок. // Вопр. питания  – 2009. ­ № 2. – С. 18­23.  2.  Ускова   М.А.,   Васильева   М.А.,   Трусов   Н.В.,   Авреньева   Л.И.,   Гусева   Г.В.,   Аксенов   И.В.,   Кравченко   Л.В.  Оценка   антиоксидантных   и  гепатопротекторных   свойств   штамма  Lactobacillus  casei  114001  на   модели  токсического   поражения   печени,   индуцированного   четыреххлористым  углеродом. // Вопр. питания. – 2009. ­ № 5. ­ С. 24­30.

3.  Кравченко Л.В., Трусов Н.В., Ускова М.А., Аксенов И.В., Авреньева   Л.И.,   Гусева   Г.В.,   Васильева   М.А.,   Селифанов   А.В.,   Тутельян   В.А.  Характеристика   острого   токсического   действия   четыреххлористого   углерода  как модели окислительного стресса.// Токсикол. вестник – 2009. – №1. –С.12­18.

Материалы научных конференций 4.  Ускова   М.А.,   Авреньева   Л.И.,   Кравченко   Л.В.  Пробиотики   –  антиоксиданты?   //   Материалы  IX  Всероссийского   Конгресса   диетологов   и  нутрициологов «Питание и здоровье». Москва, 2007. – С.86.

5.  Ускова   М.А.  Оценка   антиоксидантной   активности   молочнокислых  бактерий   в   модельных   системах  in  vitro.   //   Материалы  X  Всероссийского  Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье». Москва, 2008. –  С.111­112.

6. Кравченко Л.В., Трусов Н.В., Ускова М.А., Аксенов И.В., Гусева Г.В.,   Васильева   М.А.,   Селифанов   А.В.  Характеристика   окислительного   стресса,  индуцированного   четыреххлористым   углеродом.   //   Материалы   3­го   Съезда  токсикологов России. Москва, 2008. – С. 154.

7.  Ускова   М.А.  Биохимические   свойства   молочнокислых   бактерий,  используемых   в   качестве   йогуртных   заквасок   и   пробиотиков.   //   Материалы  научно­практической   конференции   молодых   ученых   и   специалистов  «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины – 2009».  С.­ Петербург, 2009. ­  С.19­20.

8. Ускова М.А., Васильева М.А. Влияние пробиотических молочнокислых  бактерий на окислительный стресс, вызванный четыреххлористым углеродом. //  Материалы   ежегодной   конференции   молодых   ученых   НИИ   питания   РАМН.  Москва, 2009. – С.73­74.

9.  Кравченко   Л.В.,   Ускова   М.А.,   Авреньева   Л.И.  Влияние   пробиотика  Lactobacillus casei 114001 на активность гидролитических ферментов кишечника  и   кишечной   микробиоты   крыс.   //   Материалы  XI  Всероссийского   Конгресса  диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье». Москва, 2009. – С.78.

10.  Ускова М.А., Авреньева Л.И.,  Кравченко Л.В.  Влияние пробиотика  Lactobacillus casei 114001 на биологическую активность рутина. // Материалы XI  Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье».  Москва, 2009. – С.169­170.

11.  Ускова М.А., Васильева М.А., Авреньева Л.И., Гусева Г.В., Трусов   Н.В., Аксенов И.В., Кравченко Л.В. Новое в изучении биологической активности  молочнокислых   бактерий,   используемых   в   качестве   йогуртных   заквасок   и  пробиотиков.   //   Материалы   научно­практических   мероприятий  V  Всероссийского   Форума   «Здоровье   нации   –   основа   процветания   России».  Москва, 2009. – С.122­124.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АОЕ – общая антиоксидантная емкость  АЭ – аскорбатные эквиваленты ­Гал – ­галактозидаза ­Гал – ­галактозидаза ­Глк – ­глюкозидаза ­Глк – ­глюкозидаза ­Глкр – ­глюкуронидаза ГП – глутатионпероксидаза ГР – глутатионредуктаза ГТ – глутатионтрансфераза  ДМСО – диметилсульфоксид КАТ – каталаза  КОЕ – колониеобразующие единицы КсО – ксантиноксидаза  МДА – малоновый диальдегид МКБ – молочнокислые бактерии ПОЛ – перекисное окисление липидов СОД – супероксиддисмутаза  СРО – свободнорадикальное окисление УДФ­ГлТ – уридиндифосфат­глюкуронозилтрансфераза  ХЛ – хемилюминесценция ХР – хинонредуктаза FRAP – ferric reducing antioxidant power GSH – глутатион восстановленный TAS – total antioxidant status