Гибель эпидермальных клеток в листьях гороха, вызванная хитозаном

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ Лев Анатольевич ГИБЕЛЬ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК В ЛИСТЬЯХ ГОРОХА, ВЫЗВАННАЯ ХИТОЗАНОМ 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Самуилов Виталий Дмитриевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Аверьянов Андрей Александрович доктор химических наук, профессор Вартапетян Андрей Борисович

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН

Защита состоится 20 апреля 2009 г. в 15 ч 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. ББА

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук М.В.Медведева Актуальность работы. Удаление исчерпавших свои возможности и невостребованных клеток необходимо для жизнедеятельности многоклеточных организмов. Контроль за пролиферацией и дифференцировкой клеток достигается путем их сбалансированного деления и элиминирования. Это достигается включением генетической программы, которая регулирует гибель клеток. Клеточная смерть не ограничена биологией развития и является ключевой в элиминировании трансформированных или инфицированных клеток. Программируемая клеточная смерть (ПКС) зависит от процессов метаболизма, транскрипции генов и синтеза новых белков.

ПКС можно вызвать либо подавить/приостановить разнообразными физическими и химическими факторами. ПКС может протекать по разным сценариям: 1)апоптоз, 2)аутофагия, 3)программируемый некроз и их сочетания.

Существует непрограммируемая гибель клеток – некроз.

Одним из индукторов ПКС является цианид. Для растений CN не является чужеродным и может образовываться из цианогенных гликозидов и в при синтезе этилена из 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты. У растений ПКС могут вызывать элиситоры. К эффективным элиситорам относится хитозан – продукт неполного дезацетилирования хитина, компонента клеточной стенки грибов. Хитозан вызывает гиперчувствительный ответ – защитную реакцию растений в форме локальной гибели клеток, зараженных патогеном, которая задерживает дальнейшее распространение инфекционного возбудителя.

Цель работы – исследовать хитозан-индуцированную гибель клеток у растений, сравнить хитозан с Н2О2 и CN– в качестве индукторов ПКГ.

Экспериментальные задачи:

1. Испытать CN в качестве индуктора ПКС у С3- и С4-растений. Исследовать действие CN на потребление и фотосинтетическое выделение О2 насечками листьев кукурузы, С4-растения.

2. Испытать хитозан в качестве индуктора ПКС у растений с применением световой и флуоресцентной микроскопии, электрофоретического анализа ДНК в эпидермисе листьев, выявлением активности протеинкиназ в эпидермисе.

Исследовать зависимость хитозановой гибели клеток от активных форм кислорода (АФК), влияние ингибиторов синтеза белка на рибосомах цитоплазмы (циклогексимида) и в митохондриях (линкомицина), а также ингибитора аутофагии 3 метиладенина на гибель клеток, вызванную хитозаном и Н2О2.

3. Испытать влияние ингибиторов цитохромной ветви и альтернативной оксидазы дыхательной цепи митохондрий, а также ингибиторов NADPH-оксидазы плазматической мембраны на хитозан-индуцированное разрушение ядер в эпидермальных клетках гороха. Сравнить их действие на гибель клеток, вызванную CN и Н2О2.

Научная новизна работы. Исследована хитозан-индуцированная гибель эпидермальных клеток в пленках эпидермиса из листьев гороха. Показано, что хитозан вызывает разделение ДНК на олигонуклеосомные фрагменты и увеличивает активность протеинкиназ в эпидермисе гороха. Хитозан-индуцированная гибель эпидермальных клеток гороха сопровождается генерацией АФК: супероксидного аниона-радикала (О2·), пероксида водорода (H2O2) и гидроксильного радикала (ОН·).

Ингибиторный анализ показал зависимость хитозановой гибели клеток от действия цитохромной ветви и альтернативной оксидазы дыхательной цепи митохондрий, NADPH-оксидазы плазматической мембраны клеток, синтеза белка в митохондриях и на рибосомах цитоплазмы. Полученные данные свидетельствуют о программируемом характере гибели эпидермальных клеток, включающей апоптоз и аутофагию.

Практическое значение работы. Результаты работы расширяют представления об участии биоэнергетических систем и АФК в программируемой гибели клеток растений. Они могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по биохимии, физиологии растений, биоэнергетике, клеточной биологии и цитологии. Поскольку ПКС играет важную роль в фитоиммунитете, исследования в этой области могут способствовать сортовыведению сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам.

Апробация работы. Результаты работы доложены на IX международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (2006), международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2007» (Москва, 2007), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), 12-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (2008), на биоэнергетическом семинаре, возглавляемом акад. В.П.Скулачевым (НИИ ФХБ МГУ, 2008), а также на заседаниях кафедры физиологии микроорганизмов МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, 1 находится в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 160 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и 2 таблицами. В обзоре литературы изложены современные представления о ПКС у растений, роли АФК и связи ПКС с биоэнергетикой клетки. Список литературы содержит 472 источника.

Объекты и методы исследования Объекты исследования – замыкающие клетки устьиц (устьичные клетки – УК, содержащие хлоропласты и митохондрии) и основные эпидермальные клетки (ЭК, содержащие митохондрии, но не хлоропласты) в эпидермисе из листьев гороха (Pisum sativum L.) сорта Альфа, подсолнечника (Helianthus annuus L.), фасоли (Phaseolus vulgaris L.) и кукурузы (Zea mays L.), а также клетки водных растений элодеи (Elodea canadensis Michx.) и валлиснерии (Vallisneria spiralis L.). Для проращивания семена гороха, подсолнечника, фасоли и кукурузы выдерживали в отстоявшейся (1–3 сут) водопроводной воде в течение 1 суток. Затем помещали на увлажненную фильтровальную бумагу в эмалированных кюветах на 1–2 сут (Самуилов и др., 2000).

Отобранные проростки выращивали методом гидропоники в сосудах с отстоявшейся (1–3 сут) водопроводной водой при периодическом освещении (свет – 18 ч, темнота – 6 ч) люминесцентной лампой интенсивностью света ~100 мкМ·м–2·с–1 и температуре 20–24°. В экспериментах использовали 14–17-суточные проростки. Опыты с элодеей и валлиснерией проводили с частями листьев с молодых веток на расстоянии 1–2 см от верхушки. Их листья представляют собой бислой, а по краям – даже монослой клеток, что создает удобство для наблюдения за клеточными ядрами с помощью светового микроскопа.

Поскольку хитозан (Fluka, Швейцария) малорастворим в воде, пленки эпидермиса обрабатывали его взвесью в дистиллированной воде (с содержанием мкг/мл) на магнитной мешалке в полипропиленовых сосудах в течение 30 мин.

Пленки помещали на поверхность взвеси поврежденной стороной.

По завершении инкубации образцы обрабатывали фиксатором Батталья 5 мин (смесь хлороформа, 96%-ного этанола, ледяной уксусной кислоты и 40%-ного формалина в соотношении 5:5:1:1) (Самуилов и др., 2000). Затем образцы отмывали этанолом 10 мин для удаления фиксатора, инкубировали 5 мин в воде и окрашивали ядерным красителем, гематоксилином Карацци, в течение 20 мин. Окрашенные эпидермальные пленки, отмытые водопроводной водой, использовали для микроскопии. Опыты проводили в двух, а в большинстве случаев в трех повторностях. В 300–500 обследованных клетках определяли долю клеток с разрушенными ядрами и лишенных ядер.

Для исследования действия CN на клетки мезофилла кукурузы насечки листьев помещали в 2,5 мМ раствор KCN, инкубировали на свету в течение 1 сут, фиксировали 3%-ным раствором глутарового альдегида в 0,1 М Na+, K+-фосфатном буферном растворе, pH 7,4, в течение 2 ч при 4°, затем дофиксировывали 1%-ным раствором четырехокиси осмия в том же буфере в течение 1,5 ч и далее обезвоживали в растворах этанола с возрастающей концентрацией от 5 до 96% (Барыкина и др., 2000). Материал заливали в эпоксидную смолу Эпон-812 (Fluka, Швейцария). В работе были использованы полутонкие срезы (~3 мкм), полученные на ультрамикротоме LKB III (LKB, Швеция).

Выделение и поглощение О2 насечками листьев кукурузы измеряли с помощью закрытого Pt-электрода Кларка. Среда инкубации насечек листьев (10 мг/мл) содержала 10 мМ HEPES-KOH, рН 7,0, 25 мМ KCl и 5 мМ NaHCO3. Насечки листьев освещали белым светом насыщающей интенсивности (~600 мкМ·м–2 ·с–1). Содержание хлорофиллов а и b в листьях определяли экстракцией 80%-ным водным раствором ацетона (Arnon, 1949).

ДНК для электрофоретического разделения выделяли из эпидермиса гороха методом, описанным в работе (Allen et al., 2006) с небольшими модификациями.

Ткань (50–100 мг) растирали в жидком азоте. ДНК экстрагировали 30 мин при 65о в 100 мM Tris-HCl-буферном растворе, pH 8,0, содержащем 20 мM EDTA, 1,4 M NaCl, 2% цетилтриметиламмония бромида, 1% поливинилпирролидона, 0,75% (v/v) 2 меркаптоэтанола, при постоянном перемешивании. Остатки клеток удаляли центрифугированием 10 мин при 15 000 g, надосадочную жидкость депротеинизировали смесью фенол : хлороформ : изоамиловый спирт в соотношении 25 : 24 : 1. ДНК, осажденную холодным изопропанолом, обрабатывали 100 мкг/мл РНКазы А (Sigma, США) 30 мин при 37о и вновь осаждали этанолом. Полученный препарат ДНК растворяли в 20 мкл 10 мМ Tris-HCl-буферного раствора, pH 8,0, содержащего 1 мM EDTA. Содержание ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, США). ДНК (1,2 мкг) разделяли электрофоретически (40 мин, 5 В/см) в 1,5%-ном агарозном геле, приготовленном в 40 мМ Tris-ацетатном буферном растворе, pH 7,4, содержащем 1 мM EDTA. ДНК окрашивали бромидом этидия, флуоресценцию которого регистрировали камерой GelDoc It Imaging System (UVP, США). Выделение и электрофорез ДНК проводили Н.В.Лобышева и Р.А.Зиновкин (НИИ ФХБ МГУ).

Активность протеинкиназ в геле определяли по включению [32P]фосфата из [32P]ATP. Пленки эпидермиса обрабатывали 30 мин взвесью хитозана в дистиллированной воде (100 мкг/мл) на магнитной мешалке, инкубировали 1 ч в темноте. Затем образцы помещали в буферный раствор с 10%-ным ДДС-Na и 1%-ным (v/v) меркаптоэтанолом и нагревали 15 мин при 95°, проводили электрофорез в 12% ном полиакриламидном геле (ПААГ) с 0,25 мг/мл основного белка миелина в качестве субстрата протеинкиназ. Гель отмывали 3 раза по 30 мин 0,25 мМ Tris-HCl буферным раствором, рН 7,5, содержащим 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), 5 мМ F– и 0, мМ VO42–, инкубировали в этом же буфере в течение ночи, 30 мин преинкубировали в реакционном буфере (25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 2 мМ EGTA, 12 мМ MgCl2, 1 мМ ДTT и 0,1 мМ VO42–), добавляли 50 мкCi(~15 пМ) [32P]ATP, инкубировали 1 ч.

Фосфорилирование основного белка миелина останавливали 5%-ным (w/v) раствором трихлоруксусной кислоты. Радиоактивную метку миелина в геле выявляли авторадиографией. Определение активности протеинкиназ проводила О.Ю.Фролова (каф. вирусологии МГУ).

Окисление NADH, катализируемое пероксидазой хрена, измеряли спектрофото метрически при 340 нм (340 = 6,22 мМ–1·см–1) при комнатной температуре.

Результаты и их обсуждение Вызванное CN разрушение клеточных ядер растений. CN вызывает программируемую гибель УК в изолированном эпидермисе листьев гороха, реализуемую через апоптоз (Самуилов и др., 2000;

Дзюбинская и др., 2006).

Разрушение ядер УК гороха и кукурузы усиливается на свету и подавляется редокс медиатором N,N,N,N-тетраметил-п-фенилендиамином (ТМФД) и антиоксидантом токоферолом, а также хинакрином, ингибитором флавиновых ферментов (рис. 1, а, б).

CN индуцировал разрушение ядер УК в эпидермисе из листьев подсолнечника и фасоли (рис. 1, в, г), а также клеточных ядер в листьях водных растений элодеи и валлиснерии (данные не представлены). Антиоксидант -токоферол и ТМФД, взаимодействующий с фотосинтетической цепью переноса электронов в хлоропластах и дыхательной цепью митохондрий, оказывают сходное действие на вызванное CN разрушение ядер разных растений. Освещение насечек листьев кукурузы вызывало выделение O2, связанное с переносом электронов от H2O к NADP+ в хлоропластах. Как и в опытах на горохе (Самуилов и др., 2006), фотосинтетическое выделение O2 насечками кукурузы тормозится CN, а при последующем добавлении феррицианида и п-бензохинона, проникающего через мембраны акцептора электронов в реакции Хилла, вновь возобновляется и ингибируется дихлорфенилдиметилмочевиной (DCMU), ингибитором переноса электронов от первичного хинона к вторичному в фотосистеме II хлоропластов (рис. 2). По данным оксиметрии насечки листьев кукурузы, растения с C4-фотосинтезом (фиксация СО2 на фосфоенолпирувате с образованием оксалоацетата), сходны с насечками гороха, растения с C3-фотосинтезом (фиксация СО2 на рибулозо-1,5-бисфосфате с образованием 3-фосфоглицериновой кислоты).

Рис. 1. Влияние различных агентов на CN–-индуцированное разрушение ядер УК в эпидермисе из листьев гороха, кукурузы, подсолнечника, фасоли в темноте (черные столбики) и на свету (светлые столбики). Добавки: 2,5 мМ КCN, 100 мкМ ТМФД или -токоферола, 50 мкМ хинакрина. Длительность инкубации – 24 ч.

Клетки листовой пластинки кукурузы. На рис. 3 представлены данные микроскопии продольного (а) и поперечного (б, в) срезов листа кукурузы:

проводящие пучки окружены плотным слоем крупных клеток обкладки (г), вокруг обкладки расположен рыхлый слой клеток мезофилла. Клетки обкладки проводящего пучка длиннее клеток мезофилла, поэтому вероятность попадания ядер клеток обкладки на поперечный срез листа невелика в сравнении с ядрами клеток мезофилла.

Цианид вызывал распад ядер в клетках мезофилла (рис. 3, в). С4-Растения фиксируют СО2, как уже отмечалось, путем карбоксилирования фосфоенолпирувата в клетках мезофилла. Образовавшийся оксалоацетат восстанавливается до малата при участии NADPH (рис. 4).

Рис. 2. Поглощение и выделение О насечками листьев (НЛ) кукурузы. Среда инкубации: 10 мМ Hepes-NaOH, pH 7,0, НЛ с содержанием хлорофилла 30 мкг/мл.

Добавки: 2,5 мМ КCN, 3 мМ феррицианида (FeCy), 100 мкМ п бензохинона (БХ), 20 мкМ DCMU. Вк – включение света. Исходные скорости поглощения и фотосинтетического выделения О2 (в отсутствие добавок составляли 7–8 мкмоль О2/мг хлорофилла за 1 ч.

Рис. 3. Светлопольная микроскопия срезов листа кукурузы при воздействии CN–: а – продольный, б, в – поперечный срезы листа. К насечкам листьев кукурузы добавляли 2,5 мМ КCN, инкубировали 24 ч на свету. а, б – контроль, в, г – КCN. Стрелками показаны ядра клеток мезофилла.

МФ – клетки мезофилла, ОПП – клетки обкладки проводящих пучков.

Малат переносится в соседние клетки обкладки проводящих пучков, где с участием малик-фермента подвергается NADP+-зависимому декарбоксили-рованию с образованием пирувата и СО2, вновь фиксируемого с участием рибулозо-1,5 бисфосфаткарбоксилазы. Цианид, инактивируя рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу (Ishida et al., 1998) в хлоропластах обкладки проводящих пучков, подавляя потребление NADPH в цикле Кальвина и тем самым вызывая дефицит NADP+ для малик-фермента, тормозит поступление пирувата в клетки мезофилла и усвоение в них СО2 по С4-пути, инициируя в них генерацию АФК и распад клеточных ядер.

Таким образом, цианид, инактивируя рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу, прекращает фотосинтетическое выделение О2 (рис. 2) не только клетками обкладки проводящих пучков, но и мезофиллом, который, будучи функционально связанным с обкладкой, испытывает дефицит NADP+ для нециклического переноса электронов от Н2О. Электронакцепторная пара феррицианид + БХ исправляет положение (рис. 2), включая перенос электронов от Н2О на БХ как в мезофилле, так и в обкладке проводящих пучков. Клетки обкладки проводящих пучков служат посредниками, через которые CN– настигает и клетки мезофилла, вызывая разрушение их ядер (рис.

3, в).

Рис. 4. С3- и С4-пути фиксации СО2 в листьях С4-растений.

Защитный эффект хинакрина (рис. 1) в сочетании с отсутствием его влияния на дыхание митохондрий и фотосинтетическое выделение О2 хлоропластами в насечках листьев гороха (Самуилов и др., 2006) показывает, что АФК для реализации апоптоза, по-видимому, генерируются NADPH-оксидазой плазматической мембраны клеток. У растений разных систематических групп, судя по полученным данным, ПКС, вызванная CN, протекает по сходному сценарию.

CN, оказывая множественное действие, выводит из строя митохондрии и хлоропласты. Целесообразнее применение иных индукторов ПКС.

Рис. 5. Данные светлопольной (а, д – изображения в проходящем свете) и флуоресцентной (б, в, г, е) микро скопии ЭК и УК (а, б, д, е) и ядер ЭК (в, г) в эпидермисе из листьев гороха: а, б – контроль (без добавок), 5 ч инкубации;

в – контроль (без добавок), 2 ч инкубации;

г – разные формы деструкции ядер ЭК, индуцированной хитозаном, 2 ч инкубации;

д, е – хитозан, 5 ч инкубации с хитозаном.

Пленки эпидермиса (~50 мкг белка) в мл дистиллированной воды дополняли хитозаном (100 мкг/мл), инкубировали 30 мин на магнитной мешалке и еще ч или 5 ч без перемешивания в темноте. По окончании инкубации фиксированные пленки эпидермиса окрашивали 4',6-диамидино-2-фенил индолом и микроскопировали.

Хитозан – индуктор гибели клеток у растений. Известны природные агенты, вызывающие гибель клеток растений. Это патогены и их сигнальные соединения – элиситоры. Вызванная ими гибель клеток – защитная реакция растений, направленная на прекращение жизнедеятельности патогена и получившая название гиперчувствительного ответа (ГО).

Информация о физиологических перестройках при ГО закодирована в ядерной ДНК клеток растений. В качестве элиситора использовали хитозан поли(14)-N ацетилглюкозамин, продукт неполного дезацетилирования хитина, компонента клеточной стенки грибов. Хитозан имитирует заражение растения патогенным грибом. В плазматической мембране клеток различных растений содержится рецептор, который с высоким сродством связывает хитиновые олигосахариды (Ito et al., 1997;

Day et al., 2001;

Okada et al., 2002). Это гликопротеин с молекулярной массой 75 кДа (Kaku et al., 2006).

Хитозан вызывал конденсацию и маргинацию хроматина с последующим исчезновением ядра (признаки апоптоза) в ЭК гороха, регистрируемые микроскопически (рис. 5). УК были невосприимчивы к воздействию элиситора, сохранялись неповрежденными даже по истечении 3 сут инкубации пленок эпидермиса с хитозаном, что можно объяснить присущими им функциональными особенностями.

АФК в хитозан-индуцированной гибели ЭК растений. АФК являются продуктами одно-, двух- и трехэлектронного восстановления O2: О2·, H2O2 и ОН·.

Обладая высокой реакционной способностью, АФК окисляют различные соединения клетки: белки, нуклеиновые кислоты и липиды, вызывая утрату их функциональной полноценности. Кроме того АФК участвуют в сигнальных путях, состоящих из сети многочисленных генов, регулирующих рост и развитие, клеточный цикл и программируемую гибель клеток у растений (Mittler et al., 2004). Поскольку элиситоры инициируют ГО, включающий образование АФК и апоптоз инфицированных клеток (Boller, 1995;

Dangl and Jones, 2001), следовало выяснить зависимость хитозановой гибели ЭК от АФК. Воздействие хитозаном на пленки эпидермиса в анаэробных условиях не приводило к разрушению ядер ЭК (рис. 6, а). В аэробных условиях разрушение ядер предотвращалось ловушкой для О2· нитросиним тетразолием (НСТ) (Auclair and Voisin, 1985), пируватом, котрый, взаимодействуя с H2O2, неферментативно распадается на ацетат, СО2 и Н2О (Мецлер, 1985), и ловушкой ОН· маннитолом (Аверьянов, Лапикова, 1989;

Shen et al., 1997) (рис. 6, б).

Рис. 6. Действие анаэробиоза (а), антиоксидантов и Н2О2 (б) на вызванное хитозаном разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха: а – для достижения анаэробиоза пленки эпидермиса в 2 мл дистиллированной воды с 50 мМ глюкозы, 0,1 мкг/мл глюкозооксидазы и 2 ед. активности/мл каталазы заливали подсолнечным маслом слоем 3–5 мм, инкубировали 30 мин, затем в водную фазу (под масло) вводили взвесь хитозана (100 мкг/мл) и инкубировали 30 мин на магнитной мешалке и еще 3 ч без перемешивания на свету, после этого пленки эпидермиса фиксировали и проводили подсчет разрушенных клеточных ядер;

б – к пленкам эпидермиса добавляли 0,2 мМ НСТ, 5 мМ К+-пирувата, 125 мМ маннитола или мкМ Н2О2, инкубировали 20 мин, затем добавляли хитозан (100 мкг/мл), инкубировали 30 мин на магнитной мешалке и еще 5 ч без перемешивания в темноте.

H2O2 (100 мкМ) вызывал разрушение ядер ЭК (рис. 6, б), чего на УК не наблюдалось даже при концентрации H2O2 10–50 мМ (Самуилов и др., 2006).

Существенно, что действие H2O2, как и хитозана или хитозана + H2O2, снималось НСТ или маннитолом. H2O2 действует, по-видимому, через дополнительный механизм образования АФК.

Хитозан и фрагментация ДНК. В ряде работ (Tada et al., 2001;

Iriti et al., и Zuppini et al., 2003) отмечается, что гибель клеток растений, вызываемая хитозаном, является программируемой. Биохимическим маркером апоптоза является разделение ядерной ДНК на олигонуклеосомные фрагменты, выявляемое электорофоретически («лестница» ДНК).

Рис. 7. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК из пленок эпидермиса листьев гороха, преинкубированных с хитозаном или KCN. Пленки эпидермиса обрабатывали взвесью хитозана (100 мкг/мл) в дистиллированной воде на магнитной мешалке 30 мин, затем инкубировали 1, 3, 6 или 48 ч без перемешивания в темноте. KCN в качестве индуктора ПКС использовали концентрации 2,5 мМ.

Одни исследователи наблюдали образование «лестницы» ДНК через 12 (Tada et al., 2001) или 48 ч (Iriti et al., 2006) после воздействия хитозаном, другие (Zuppini et al., 2003) не обнаруживали таковой. На рис. 7 представлены данные электрофореза ДНК из листьев гороха. Обработка пленок эпидермиса хитозаном приводила к проявлению «лестницы» ДНК через 48 ч инкубации (рис. 7). Для сравнения приведены данные о межнуклеосомной фрагментации ДНК при обработке цианидом.

Появление олигонуклеосомных фрагментов ДНК, свойственных апоптозной гибели клеток, при CN–-индуцированной ПКС было продемонстрировано ранее (Дзюбинская и др., 2006).

Рис. 8. Действие хитозана на активность протеинкиназ (ПК) в эпидермисе из листьев гороха: а – электрофорез в 12%-ном ПААГ белков эпидермиса, введенных для проведения ПК-ной реакции (окраска Кумасси);

б – активность ПК в ПААГ, определенная по включению [32Р]фосфата из [32Р]ATP авторадиографически;

в – удельная активность ПК – соотношение величин оптической плотности в рамках б и а, измеренных с применением компьютерной программы «TotalLab» (по параметру «Volume»). Активность ПК в контроле принята за 100% (в).

Влияние хитозана на активность протеинкиназ. ГО сопровождается активацией протеинкиназ. Ингибиторы протеинкиназ подавляют ГО и предотвращают гибель клеток (Levine et al., 1994;

Zhang et al., 2000). Кортикостероид дексаметазон, вызывая экспрессию протеинкиназ митоген-активируемого каскада (МАПК) у Nicotiana tabacum, усиливал образование АФК в хлоропластах, утилизируемых в ГО (Liu et al., 2007). Стауроспорин, ингибитор протеинкиназ, CN-индуцированное предотвращал разрушение ядер УК в изолированном эпидермисе гороха (Самуилов и др., 2002). МАПК, по-видимому, участвуют в CN– индуцированном апоптозе у растений. Активацию МАПК у растений вызывают микробные элиситоры, в т.ч. флагеллин (белок бактериальных жгутиков) и фрагменты хитина (Tena et al., 2001). Хитозан увеличивал активность протеинкиназ в пленках эпидермиса гороха почти в 2 раза (рис. 8). Это соответствует данным о протекании программируемой гибели клеток с участием МАПК (Cardinale et al., 2000;

Nhse et al., 2000;

Liu et al., 2007).

Влияние ингибиторов синтеза белка и аутофагии на гибель ЭК. ПКС чувствительна к ингибиторам синтеза белка. Нами были использованы циклогексимид, ингибитор синтеза белка на цитоплазматических рибосомах эукариот, и линкомицин, ингибитор синтеза белка в митохондриях и хлоропластах.

Линкомицин предотвращал хитозан- и H2O2-индуцированное разрушение ядер ЭК (рис. 9). Эффект циклогексимида был выражен слабее, чем эффект линкомицина или комбинации циклогексимида с линкомицином.

Рис. 9. Влияние циклогексимида (ЦГ), линкомицина (ЛМ) и 3-метиладенина (МА) на хитозан- (а) и Н2О2-индуцированное (б) разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха. Пленки из нижнего эпидермиса листьев обрабатывали взвесью хитозана в дистиллированной воде на магнитной мешалке 30 мин, инкубировали с добавками 3 ч в темноте. Добавки: 100 мкМ H2O2, 2 мМ ЛМ, 200 мкМ ЦГ, 5 мМ 3-МА и 100 мкг/мл хитозана.

Оба агента сами по себе не оказывали влияния на ядра ЭК. Особенностью действия циклогексимида на фоне CN является активация аутофагии в УК, в результате чего в вакуолях появляются ограниченные мембраной везикулы с цитоплазматическим содержимым (Дзюбинская и др., 2006).Подавляя синтез белков, кодируемых ядерной ДНК, циклогексимид, по-видимому, нарушает ход CN индуцированного апоптоза в УК и усиливает альтернативный путь ПКС аутофагию.

Поэтому мы испытали действие ингибитора аутофагии 3-метиладенина (Takatsuka et al., 2004) на разрушение ядер ЭК, вызванное хитозаном и H2O2. Сам по себе 3 метиладенин в концентрации 5 мМ вызывал значительное разрушение ядер ЭК, но предотвращал действие хитозана (рис. 9, а), оказывая меньшее влияние на действие H2O2 в качестве индуктора гибели ЭК (рис. 9, б). Подавление аутофагии 3 метиладенином или подавление синтеза белка в митохондриях дает один и тот же результат – предотвращение хитозан-индуцированной гибели ЭК. Хитозан как элиситор имитирует инфекционного возбудителя, и через аутофагию клетка пытается защититься от него путем саморазрушения неадекватных участков цитоплазмы.

Таким образом, взаимосвязь ПКС с системами синтеза белка на рибосомах цитоплазмы или митохондрий и с аутофагией различается с хитозаном и H2O2 (рис. 9) или CN в качестве индуктора ПКС (Дзюбинская и др., 2006).

Действие ингибиторов альтернативной оксидазы митохондрий на вызванную хитозаном и CN гибель ЭК гороха. Поскольку поставщиком АФК в ЭК могут быть митохондрии, было испытано действие ингибиторов дыхательной цепи. Цианид, ингибирующий цитохромоксидазу митохондрий, вызывал быстрое разрушение ядер ЭК (рис. 10). После 30-минутной инкубации эпидермиса с KCN количество безъядерных ЭК было больше, чем после 3-часовой инкубации с хитозаном. Разрушение ядер ЭК на фоне хитозана незначительно стимулировалось CN, но подавлялось пропилгаллатом (ПГ) и салицилгидроксаматом (СГ) (данные не представлены), ингибирующими устойчивую к CN альтернативную оксидазу (АО) митохондрий (Siedow, Umbach, 1995). Однако ПГ и СГ не оказывали защитного эффекта на цианидное разрушение ядер ЭК. АО в дыхательной цепи митохондрий растений ответвляется на уровне убихинона и восстанавливает О2 до Н2О, не транслоцируя Н+ через внутреннюю мембрану митохондрий (Siedow et al., 1995).

Защита ингибиторов АО от хитозана может быть обусловлена переходом митохондриального убихинона в форму убихинола, природного антиоксиданта, прерывающего цепные реакции перекисного окисления липидов в мембранах (Landi et al., 1984;

Frei et al., 1990). При ингибировании обеих терминальных оксидаз дыхательной цепи наблюдаются высокие скорости образования АФК (Rich et al., 1976;

Purvis, 1997).

Влияние ингибиторов флавиновых ферментов на ПКС в листьях гороха.

Образование АФК осуществляется также NADPH-оксидазой плазматической мембраны (NOX – NADPH oxidase) (Yoshioka et al., 2001;

Foreman et al., 2003;

Geiszt and Leto, 2004). Существуют двойные оксидазы DUOX (dual oxidases), составленные из NOX и пероксидазного домена на наружной поверхности плазматической мембраны (Lambeth, 2004).

Рис. 10. Действие дифени лениодония (DPI) и хинакрина CN–-индуци на хитозан- и рованное разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха: а – пленки эпидермиса после обработки хитозаном ( мкг/мл) на магнитной мешалке в течение 30 мин дополняли DPI (25 мкМ) или хинакрином ( мкМ) и инкубировали 4 ч без перемешивания в темноте;

б – пленки эпидермиса, преинкубированные с DPI 5 мин, дополняли 2,5 мМ KCN и инкубировали 30 мин в темноте.

Хинакрин и дифенилениодоний (DPI), известные как ингибиторы NADPH оксидазы плазматической мембраны клеток, подаваляли разрушение ядер ЭК в эпидермисе из листьев гороха, вызванное хитозаном (рис. 10, а). DPI и хинакрин в испытанных концентрациях не влияли на дыхание и фотосинтетическое выделение O насечками листьев, но предотвращали CN-индуцированную гибель устьичных клеток (Самуилов и др., 2006). Подобно хинакрину (Самуилов и др., 2006), DPI не оказывал влияния на цианидную гибель ЭК (рис. 10, б).

Действие ингибиторов флавиновых ферментов и KCN на активность изолированной пероксидазы хрена. Пероксидазы, играющие значительную роль в обмене АФК, у растений локализованы в пероксисомах и клеточных стенках (апопластная пероксидаза). Реакция с донором электронов DH2 в виде уравнения H2O2 + DH2 2H2O + D не исчерпывает возможностей этих гемопротеинов. Применительно к изолированной пероксидазе хрена и пероксидазам клеточных стенок растений продемонстрированы (Yokota and Yamazaki, 1977;

Halliwell, 1978;

Liszkay et al., 2003) реакции с фенольными соединениями (производными фенилпропана, например, с конифериловым спиртом), утилизируемыми в синтезе лигнина. При ГО апопластная пероксидаза может выполнять функцию генератора H2O2 (Allan, Fluhr, 1997).

Изолированная пероксидаза хрена катализирует окисление NADH и образование H2O2. Ингибиторы флавиновых ферментов DPI и хинакрин стимулировали окисление NADH с участием пероксидазы хрена, ингибитор гемовых ферментов CN, напротив, подавлял процесс (данные не представлены). Показано (Frahry and Schopfer, 1998), что CN подавляет образование H2O2 и в меньшей мере окисление NADH, тогда как DPI стимулирует окисление NADH, но ингибирует образование H2O2, катализируемые изолированной пероксидазой.

Выводы 1. Цианид вызывает разрушение ядер в клетках различных растений. Испытаны растения с С3- и С4-фотосинтезом. Инактивируя рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу (РБФК) в хлоропластах клеток обкладки проводящих пучков, CN прекращает фотосинтетическое выделение О2 в листьях кукурузы, приводя к гибели клеток не только обкладки (С3-фотосинтез), но и мезофилла, где РБФК отсутствует (С4 фотосинтез).

2. Хитозан вызывает конденсацию и маргинацию хроматина с последующим распадом и исчезновением ядер эпидермальных (но не устьичных) клеток листьев гороха и кукурузы, клеточных ядер водных растений. Электрофорез ДНК из эпидермиса гороха, обработанного хитозаном, показал наличие олигонуклеосомных фрагментов. Хитозан увеличивает активность протеинкиназ в пленках эпидермиса гороха, что свидетельствует об участии протеинкиназ митоген-активируемого каскада в гибели клеток. Анаэробные условия и антиоксиданты нитросиний тетразолий, пируват и маннитол подавляют гибель эпидермальных клеток (ЭК) гороха, вызванную хитозаном или добавлением H2O2. Линкомицин, ингибитор синтеза белка в митохондриях, и в меньшей степени циклогексимид, ингибитор синтеза белка на рибосомах цитоплазмы, подавляют гибель ЭК, вызванную хитозаном и H2O2.

Ингибитор аутофагии 3-метиладенин вызывает разрушение ядер ЭК, но предотвращает действие хитозана, не влияя на действие H2O2.

3. Ингибиторы альтернативной оксидазы дыхательной цепи митохондрий подавляют хитозан-индуцированное, но не CN-индуцированное разрушение ядер ЭК. Их защитный эффект может быть обусловлен снижением образования АФК вследствие перехода митохондриального убихинона в форму убихинола, природного антиоксиданта, прерывающего цепные реакции перекисного окисления липидов в мембранах. Хинакрин и дифенилениодоний (DPI), известные как ингибиторы флавиновых ферментов, включая NADPH-оксидазу плазматической мембраны, подаваляют разрушение ядер ЭК в эпидермисе листьев гороха, вызванное хитозаном.

Хинакрин и DPI не влияют на цианидную гибель ЭК.

4. Полученные данные показывают, что гибель эпидермальных клеток в листьях гороха, вызванная хитозаном, имеет программируемый характер.

Список цитированной литературы:

Аверьянов А.А., Лапикова В.П. // Биохимия, 1989, 54, 1646–1651. Барыкина Р.П. и др. М.:

Изд. каф. высш. растений биол. ф-та Моск. гос. ун-та, 2000, 127 с. Дзюбинская Е.В. и др. // Биохимия, 2006, 71, 493–504. Дзюбинская Е.В. и др. // Биохимия, 2006, 71, 1383–1391.

Самуилов В.Д. и др. // Биохимия, 2000, 65, 817–824. Самуилов В.Д. и др. // Биохимия, 2002, 67, 757–765. Allan A.C., Fluhr R. // Plant Cell, 1997, 9, 1559–1572. Arnon D.I. // Plant Physiol., 1949, 24, 1–15. Auclair C., Voisin E. // CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research., 1985, 123–132. Boller T. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1995, 46, 189–214. Dangl J.L., Jones J.D.G. // Nature, 2001, 441, 826–833. Day R.B. et al. // Plant Physiol., 2001, 126, 1162–1173. Foreman K.E., Tang J. // Exp. Gerontol., 2003, 38, 1251–1257. Frahry G., Schopfer P. // Phytochemistry, 1998, 48, 223–227. Frei B. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 1990, 87, 4879–4883. Geiszt M., Leto T.L. // J. Biol. Chem., 2004, 279, 51715–518. Halliwell B. // Planta, 1978, 140, 81–88. Iriti M. et al. // Plant Physiol. Biochem., 2006, 44, 893–900. Ishida H. et al. // Planta, 1998, 204, 305–309. Ito Y. et al. // Plant J., 1997, 12, 347–356. Lambeth J.D. // Nature Rev. Immunol., 2004, 4, 181–189. Landi L. et al. // Biochem J., 1984, 222, 463–466. Liszkay A.

et al. // Planta, 2003, 217, 658–667. Mittler R., Lam E. // Trends Microbiol., 1996, 4, 10–15.

Purvis A.C. // Physiol. Plant., 1997, 100, 165–170. Rich P.R. et al. // Biochem. Biophys. Res.

Commun., 1976, 71, 695–703. Shen B. et al. // Plant Physiol., 1997, 115, 527–532. Siedow J.N., Umbach A.L. // Plant Cell, 1995, 7, 821–831. Tada Y. et al. // Mol. Plant–Microbe Interactions, 2001, 14, 477–486. Umbach A.L. et al. // Biochim. Biophys. Acta, 2006, 1757, 135–142. Yokota K., Yamazaki I. // Biochemistry, 1977, 16, 1913–1920. Yoshioka H. et al. // Mol. Plant-Microbe Interact., 2001, 14, 725–736.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Васильев Л.А., Воробьев А.А., Дзюбинская Е.В., Несов А.В., Шестак А.А., Самуилов В.Д. Вызванная CN гибель клеток в листьях растений. // Биохимия, 2007, т. 72, вып.5, с.707-713.

2. Самуилов В.Д., Киселевский Д.Б., Шестак А.А., Несов А.В., Васильев Л.А.

(2008) Активные формы кислорода в программируемой гибели устьичных клеток гороха. // Биохимия, 2008, т. 73, вып.10, с.1344-1354.

3. Васильев Л.А., Дзюбинская Е.В., Зиновкин Р.А., Киселевский Д.Б., Лобышева Н.В., Самуилов В.Д. Вызванная хитозаном программируемая гибель клеток у растений. // Биохимия, 2009, в печати.

Васильев Л.А., Несов А.В., Дзюбинская Е.В. CN-индуцированная 4.

клеточная гибель в листьях растений // Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов2007».

Москва, 11-14 апреля 2007 г., с.162-163.

5. Васильев Л.А., Дзюбинская Е.В., Киселевский Д.Б., Самуилов В.Д. Ответ клеток в листьях гороха на воздействие хитозаном // Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 5–7 июня 2007 г., с.248-250.

6. Киелевский Д.Б., Шестак А.А., Несов А.В., Кузнецова Ю.Е., Васильев Л.А., Самуилов В.Д. Активные формы кислорода и их источники при программируемой гибели устьичных клеток гороха // Сборник трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов.

Новосибирск, 11–15 мая 2008 г., с.323.

7. Васильев Л.А., Дзюбинская Е.В., Зиновкин Р.А., Киселевский Д.Б., Лобышева Н.В., Фролова О.Ю., Самуилов В.Д. Вызванная хитозаном гибель эпидермальных клеток в листьях гороха // Сборник тезисов 12-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 10–14 ноября 2008 г., с.76.

8. Vasil'ev L.A., Dzyubinskaya E.V., Samuilov V.D. Programmed cell death of plants induced by cyanide // Proceedings of I(IX) Conference of Young Botanists in Saint-Petersburg. St.-Petersburg, 2126 May 2006, p.229-230.