Отходы производства концентрированных белковых продуктов из сои как сырьё для получения кормовых добавок
На правах рукописи
Смирнова Вероника Дмитриевна Отходы производства концентрированных белковых продуктов из сои как сырьё для получения кормовых добавок Специальность: 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук
Москва – 2012
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико технологического университета имени Д.И.Менделеева.
Научный консультант: кандидат технических наук, доцент Шакир Ирина Васильевна
Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Бирюков Валентин Васильевич Московский государственный университет инженерной экологии доктор технических наук, профессор Правдин Валерий Геннадьевич Научно технический центр биологических технологий в сельском хозяй стве
Ведущая организация: Тверской государственный технический университет
Защита состоится «14» февраля 2012 г. в 1030 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете имени Д.И.Менделеева по адресу:
125047, г. Москва, Миусская пл., д.9, в аудитории 443 (конференц зал)
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева.
Автореферат диссертации разослан «12» января 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 Шакир И.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из мировых проблем при постоянно увеличи вающемся населении Земли была и остается нехватка продуктов питания, в особенности белковой составляющей рациона человека. По данным ВНИИ пи тания РАМН за последние 20 лет дефицит пищевого белка в России превысил млн. т. в год. Современные подходы для решения данной проблемы направлены на использование в пищевых целях растительного соевого белка, служащего признанной альтернативой животному белку.
В связи с этим в 2003 году Министерством сельского хозяйства России была принята целевая программа «Развитие производства и глубокой перера ботки сои в Российской Федерации на 2003–2011 гг.», реализация которой при вела к увеличению производства данной культуры в нашей стране до 740 тыс.
тонн/год. К 2020 году планируется довести производство сои в России до млн. тонн [Устюжанин, 2011]. Однако, в рамках этой программы на сегодняш ний день 95 % сои отечественного производства перерабатывается на кормовые цели, что является нерациональным, поскольку потенциал переработки данного сырья гораздо выше. За рубежом активно развиваются технологии глубокой переработки сои с получением белковых продуктов: концентратов и изолятов, которые находят широкое применение в пищевой промышленности [Alibhai, 2006, Wang, 2004 и др.].
Для развития технологий глубокой переработки сои в России необходим комплексный подход, учитывающий как недостатки уже известных технологий, так и потребности страны в продуктах вторичной переработки сырья.
Анализ литературы показал, что основным недостатком технологий про изводства концентрированных белковых продуктов из сои является значитель ное количество отходов, требующих дальнейшей переработки [Paula, 2008, Ro drigues, 2006]. Так, при получении концентрата белка сои выделением безазоти стых экстрактивных веществ из 1 тонны обезжиренных соевых бобов образует ся в среднем 260 кг соевой мелассы. Получение изолятов экстракцией белка из 1 тонны соевого шрота сопровождается образованием около 6 тонн соевой сы воротки и 300 кг депротеинизированного соевого шрота.
Указанная проблема может быть решена традиционными приемами пере работки вторичного сырья микробной биоконверсией в продукты кормового назначения, что также является актуальным, поскольку в настоящее время рос сийское животноводство испытывает недостаток полноценных кормов. Стоит проблема низкого качества кормов - несбалансированность состава и недоста ток белка, что ведет к снижению генетического потенциала продуктивности животных.
Таким образом, использование отходов с целью обогащения их микроб ным белком позволит решить экологические проблемы, возникающие при реа лизации технологий переработки сои, а также расширит сырьевую базу для по лучения кормовых продуктов.
В связи с этим целью настоящей работы явилась оценка качества обра зующихся отходов в технологиях получения концентрированных белковых продуктов, а также экспериментальное обоснование возможности использова ния отходов производства соевых белковых продуктов для получения на их ос нове кормовых добавок. Для достижения цели поставлены следующие задачи:
• Провести оценку влияния технологических параметров получения концен трированных продуктов из сои на состав образующихся отходов;
• Разработать технологию переработки соевой мелассы с получением высо кобелковой кормовой добавки, для чего:
- провести скрининг микробных культур и выбрать микроорганизм, способ ный наиболее полно ассимилировать компоненты соевого углеводного экс тракта;
- интенсифицировать процесс биоконверсии соевой мелассы путем воздей ствия агентом окислительного стресса на микроорганизм;
- исследовать влияние режимов культивирования выбранного продуцента на параметры технологического процесса и качество микробной биомассы;
• Разработать технологию переработки твердого остатка депротеинизирован ного соевого шрота, образующегося при получении изолята белка сои, в белково-углеводную кормовую добавку, для чего:
- провести скрининг грибных культур по степени потребления субстрата и накоплению белка в биомассе при твердофазном культивировании на твер дом остатке отхода производства изолята белка сои;
- исследовать способы повышения биодоступности компонентов отхода для культивирования дрожжей при использовании кислотного и ферментатив ного гидролиза, определить оптимальные параметры обработки твердого отхода;
• Определить возможность использования соевой сыворотки в качестве пита тельной среды для культивирования дрожжей.
Научная новизна результатов исследований. Среди набора дрожжевых и грибных культур, способных развиваться на питательных средах, содержа щих нативные отходы переработки сои, выявлены штаммы, обладающие наи большей физиологической активностью (удельная скорость роста, максималь ное накопление биомассы, содержание белка в биомассе). При культивирова нии на питательной среде, содержащей соевую мелассу, штамм Endomycopsis fibuligera, способен ассимилировать до 87,5 % углеводов мелассы, биомасса при этом содержит не менее 35,7 % истинного белка. На питательной среде с соевой сывороткой штамм Rhodotorua rubra способен ассимилировать до 76, % углеводов, образующаяся биомасса содержит 48,0 % истинного белка. При твердофазном культивировании грибов на твердом отходе изолята белка сои оптимальными характеристиками обладает штамм Aspergillus niger - образую щийся продукт содержит до 36,4 % истинного белка. Подтверждены ранее вы явленные закономерности повышения ростовых характеристик микроорганиз мов при использовании инокулята, активированного под действием пероксида водорода (для культуры Endomycopsis fibuligera).Показано, что фильтрат куль туральной жидкости Endomycopsis fibuligera при культивировании на питатель ной среде на основе соевой мелассы, может использоваться в качестве пита тельной среды для культивирования молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum.
Практическая значимость.
Проведена оценка влияния параметров получения концентрированных белковых продуктов из сои на состав отходов, что позволило выявить потенци альную ценность данного сырья для получения микробных белковых продук тов. Разработана технология переработки соевой мелассы с получением био массы Endomycopsis fibuligera и жидкой пробиотической добавки на основе мо лочнокислых бактерий. Проведена технико-экономическая оценка эффективно сти реализации предложенной технологии при расчетной мощности производ ства 5000 т в год по перерабатываему сырью. Предложены варианты биокон версии депротеинизированного соевого шрота в белково-углеводные кормовые добавки на основе дрожжей с содержанием сырого протеина не менее 39,0 %, на основе грибной культуры Aspergillus niger с содержанием сырого протеина не менее 52,0 %.
Разработаны лабораторные регламенты на получение кормовых добавок на основе соевой мелассы и депротеинизированного соевого шрота.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представ лены в материалах IV и V Московских международных конгрессов «Биотехно логия: состояние и перспективы развития» (Москва, 2006 г.;
Москва, 2007 г.);
X и XII международных конференций «Окружающая среда для нас и будущих поколений»;
Всероссийской научно-техничеcкой конференции «Наука – произ водство – технологии – экология» (Киров, 2008 г).;
Киров, 2009 г., Киров, г.), студенческом конкурсе инновационных проектов (Москва 2008 г), Между народной химической ассамблее ISA-2008 (Москва 2008), 8-й Международной конференции «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков г.). Результаты исследования использованы в учебном процессе при подготовке студентов-биотехнологов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных ра бот, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введе ния, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, приложений. Работа изложена на 203 страницах текста. Работа содержит 36 рисунков, 42 таблицы и 5 приложений. Библиогра фия включает 210 наименований, из них иностранных источников – 92.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы представлен состав сои, проведен сравнительный анализ основных технологий получения концентрированных белковых продук тов из сои. Приведены данные об образующихся отходах и способах их перера ботки при использовании физико-химических и биотехнологических методов.
Описаны существующие способы интенсификации процессов микробной био конверсии с использованием предварительной обработки субстрата, а также при воздействии окислительного стресса на микроорганизмы. Показана пер спективность использования отходов сельского хозяйства и пищевой промыш ленности при получении кормовых добавок. На основании анализа литератур ного обзора обоснована необходимость разработки технологических решений по получению кормовых добавок на основе отходов глубокой переработки сои.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основным объектом исследования являлся соевый шрот с содержанием белка 50,0 %, индекс растворимости белка (NSI) 83,2 %, содержание общих углеводов 29,7 %.
В качестве микробных объектов были использованы культуры грибов, относящиеся к родам Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium, Phanero chaete, дрожжей – Saccharomyces cerevisiae штамм SL-100, а также промыш ленные расы “Я”, II, XII, S. carlsbergensis, Candida tropicalis, C. utilis и C. malto sa, Rhodotorula rubra, Torulopsis fumata и T. utilis, Yarrowia lipolytica, Endomy copsis fibuligera и бактерий Lactobacillus plantarum и Lactobacillus acidophilus, полученные из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева.
Глубинное культивирование дрожжей и грибов проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (100 мл среды) при инкубировании на качалках New Brunswick Scientific G10 (150 об/мин) при температуре 30-32С и 28-30С, соответственно, а также в лабораторном ферментере Фермус-3 НПО «Биоавто матика» (коэффициент массопередачи по кислороду – 800-850 ч-1) объемом 5 л с заполнением питательной средой на 70 % и постоянном перемешивании об/мин.
Накопление микробной биомассы определяли прямым подсчетом кле ток в камере Горяева, гравиметрическим методом и косвенно по содержанию белка. Рост молочнокислых культур и активность молочнокислого брожения оценивали по изменению рН среды при использовании рН-метра, а также при определении общей титруемой кислотности [Горбатова, 1997].
Пробиотическую активность молочнокислых бактерий, полученных при культивировании на соевой мелассе, устанавливали путем определения ус тойчивости культур к высокотемпературному воздействию (60-650С), к желчи, ферментам пищеварительного тракта - трипсину и пепсину, поваренной соли (NaCl), фенолу, к щелочной реакции среды [Банникова, 1975].
Содержание сырого протеина, истинного белка, общих углеводов и об щих жиров в исследуемом субстрате и продукте определяли в соответствии с ГОСТ 28178-89. Острую токсичность микробной биомассы – с помощью тест культуры инфузорий Tetrachymena pyriformis [ГОСТ 28178-89].
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ «Excel» и «Statistica 6.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оценка влияния технологических параметров получения концентриро ванных продуктов из сои на состав образующихся отходов Анализ опубликованных в литературе данных, касающихся способов по лучения концентрированных белковых продуктов из сои, показал, что наиболее перспективной является технология, Семена сои включающая предварительное обезжи ривание соевых бобов с получением Дробление очистка масла. В зависимости от целевого про дукта дальнейшая переработка развива- Жирный соевый лепесток ется в двух направлениях: в случае по лучения концентратов белка сои наибо- ОТХОД Экстракция Твердый масла лее распространенной и полно отве- Соевое масло остаток растворителем чающей требованиям качества конечно Спиртовая го продукта является спиртовая экс- Щелочная экстракция Соевый шрот тракция безазотистых соединений из экстракция углеводов белка соевого шрота. Отход – соевая меласса образуется на стадии регенерации экст рагента из полученного углеводного Концентрат Углеводный Белковый белка сои экстракт экстракт экстракта. В случае получения изолятов белка сои, наилучшими характеристи Регенерация Выделение ками обладает продукт, образующийся Спирт экстрагента белка в условиях щелочной экстракции белка из соевого шрота. При реализации этой ОТХОД Изолят ОТХОД технологии образуется два отхода: на Соевая белка сои Соевая меласса сыворотка стадии фильтрации суспензии соевого шрота образуется депротеинизирован- Схема. 1. Схема переработки соевых бобов ный твердый остаток, на стадии выде- с получением концентрированных белковых ления белка из экстракта образуется со- продуктов евая сыворотка (схема 1).
Основные параметры ключевого этапа – экстракции компонентов из со евого шрота – варьируются для различных предприятий в некотором диапазоне, не оказывающем выраженного влияния на характеристики основных продук тов. Однако, изменение условий экстракции в определенной степени может оказывать влияние на состав отходов, что является немаловажным при иссле довании дальнейших способов переработки вторичного сырья в кормовые до бавки. Поэтому первым этапом нашего исследования стала оценка влияния па раметров экстракции (температуры, продолжительности, концентрации экстра гента, содержания сухого вещества в суспензии) на состав образующихся отхо дов. При этом оценивали и качество целевого продукта – концентрата и изолята белка сои.
Извлечение безазотистых экстрактивных веществ из соевого шрота. В ре зультате исследования установлено, что оптимальными условиями получения соевого углеводного экстракта без потери качества целевого продукта - концен трата белка сои, являются: продолжительность 60 мин., концентрация этанола 70 % об., температура 600С, содержание сухого вещества в суспензии 14,5% (табл.1). Образующийся экстракт содержит 89,2 % углеводов в расчете на сухое Таблица Влияние параметров процесса экстракции углеводов из соевого шрота на состав обра зующегося отхода и концентрата белка сои Соевый углеводный экстракт Концентрат белка сои Время экстракции, Конц. экстрагента, Содержание сухо го вещества в сус экстракции, 0С Температура Содержание Содержание Степень экс белка сырого Содержание пензии, % тракции угле в экстракте, протеина, углеводов, % водов, % % об.
г/л % мин 90 69,0 - - 120 20 70,1 2,32±0,05 68,5±0,24 6,5±0, 60 75,3 - - 90 87,4 2,31±0,03 69,4±0,20 5,6±0, 14, 60 99,0 2,22±0,04 69,4±0,22 5,0±0, 90 99,0 2,22±0,04 69,4±0,22 5,0±0, 20 96 17,0 - - 60 17,0 2,30±0,05 57,5±0,25 17,0±0, 60 50 74,5 - - 90 85,0 3,4±0,07 63,2±0,23 9,5±0, 60 70 10 99,0 - - 90 99,2 1,5±0,06 68,8±0,25 3,6±0, 60 20 98,6 - - 90 98,6 1,65±0,04 69,0±0,26 6,6±0, вещество. При анализе состава основного продукта исследуемой технологии концентрата белка сои показано, что он содержит около 70 % белка и не более % углеводов.
Необходимой технологической стадией процесса является регенерация экстрагента, сопровождающаяся изменением химического состава упариваемо го экстракта. Варьирование кислотности экстракта позволило установить опти мальное значение рН - 5,5, что приводит не только к снижению пенообразова ния в процессе упаривания, но и к частичному гидролизу углеводов и повыше нию содержания редуцирующих веществ в составе экстракта.
Анализ состава экстракта различной степени концентрирования показал, что при достижении содержания 70% мас. СВ в готовой мелассе доли редуци рующих веществ и общих углеводов снижаются на 3,6 и 4,3 % соответственно, содержание белковых веществ (по сумме аминокислот) снижается на 30%, что свидетельствует о побочных реакциях при получении данного отхода (табл. 2.).
Кроме того, в ходе вакуум выпаривания подкисленного до рН 5,5 экстракта на блюдается инверсия около 40%-ов сахарозы в глюкозу и фруктозу.
Таблица Химический состав водно-спиртового экстракта и соевой мелассы Наименование отдельных Спиртовой экстракт Водный раствор Соевая ме- Соевая меласса показателей экстрагента после ласса удаления спирта Содержание СВ, % масс. 3,6 13,6 45,2 69, Общие сахара, % от СВ 89,2 89,0 88,0 84, РВ (по методу Бертрана- 70,4 70,4 70,0 66, Шорля), % от СВ Сырой протеин (Nх6,25) 3,1 3,1 3,1 3, Аминокислоты, % от СВ: 9,4 - - 6, Сроки хранения менее суток 2 месяца 6 месяцев Следовательно, наименьшие потери углеводов, ценных с точки зрения компонентов субстрата для микроорганизмов, наблюдаются при минимальной степени концентрирования экстракта, однако при установлении максимальных сроков хранения данных субстратов выявлена ограниченность их использова ния в концентрациях менее 70 %.
Таким образом, образующаяся соевая меласса представляет собой до вольно сложную смесь водорастворимых сахаров на фоне азотистых соедине ний. Наличие в ее составе значительного количества нередуцирующих веществ 18,1 % мас. может ограничить ее использование в качестве источника углерода в традиционных микробиологических производствах.
Извлечение белковых веществ из соевого шрота при производстве изолята.
При исследовании влияния параметров щелочной экстракции белка из соевого шрота на состав образующихся отходов установлено, что высокое содержание углеводов в депротеинизированном твердом остатке согласуется с максималь ной степенью экстракции белковых веществ в раствор. Оптимальными усло виями получения данного отхода являются продолжительность экстракции мин, рН экстракции 10, температура экстракции 250С, гидромодуль 1:10. Де протеинизированный остаток содержит 65,7 % углеводов. Вторым отходом данной технологии является соевая сыворотка, образующаяся при концентри ровании и осаждении белка из раствора при использовании стандартных мето дов выделения (табл. 3).
Таблица Состав отходов, образующихся при выделении белка из соевого шрота Твердый остаток Соевая сыворотка Общие углеводы - 65,7 ±1,0 % Содержание сухих веществ – 4,6 % - «Сырая клетчатка» - 16,4 ± 1,0 % от СВ Общие углеводы - 51,0, % от СВ - Экстрагируемые спиртом Редуцирующие вещества – 29,0, % от СВ сахара - 13,9 ± 0,2 % от СВ - полисахариды - 35,4 ± 1,0 % от СВ Олигосахара – 22,0 % от СВ Сырой протеин - 22,5±0,5 % от СВ Концентрация белковых веществ, 37,2 % от СВ Общий жир - 1,78 ± 0,5% от СВ ХПК – 100000 мгО2/л Зола - 10,0± 0,5 % от СВ Биоконверсия соевой мелассы в дрожжевую биомассу кормового назначения.
Как указывалось ранее, одним из отходов, образующихся при реализации технологии получения концентрата белка сои, является соевая меласса. Пред варительные эксперименты по использованию ее в качестве источника углеро да в процессах микробного синтеза показали, что наиболее целесообразной яв ляется аэробная биоконверсия данного отхода в белковую биомассу кормового назначения.
Отбор продуцентов белка проводили среди имеющихся в коллекции ка федры культур, используемых для получения белковых кормовых добавок.
Критериями выбора были максимальное накопление биомассы, содержание белковых веществ в биомассе и степень потребления общих углеводов соевой мелассы (табл. 4). В результате исследования установлено, что наиболее пер спективным штаммом, удовлетворяющим этим критериям, является Endomycop sis fibuligera. При культивировании на питательной среде, содержащей соевую ме лассу в количестве 20 г/л по общим сахарам, выход биомассы достигает 0,41 г/г, содержание сырого протеина в биомассе составляет 51,0 %.
Таблица Скрининг дрожжевых культур при культивировании на питательной среде, содержащей соевую мелассу (20,0 г/л по общим сахарам) Микроорганизм Максимальное Степень Удельная Содержание Экономи накопление потребления скорость сырого про ческий - биомассы, г/л углеводов, теина в био коэффици- роста, ч массе, % % ент, г/г S. cerevisiae II 4,5±0,48 82,4± 0,55 0,27 0,20 51,3 ±0, S. cerevisiae XII 4,3±0,40 78,9 ±0,68 0,27 0,19 50,6 ±0, S. cerevisiae SL100 4,1± 0,33 78,1 ±0,70 0,27 0,25 49,0 ±0, S. cerevisiae “Я” 4,5±0,48 74,6 ±0,73 0,30 0,17 48,9 ±0, S. carlsbergensis 3,9±0,20 72,2 ±0,75 0,27 0,18 47,2 ±0, 3,8± 0,18 74,9 ±0,72 0,26 0,18 49,8 ±0, Candida maltosa 4,4±0,45 82,4 ±0,52 0,27 0,18 54,2 ±0, Candida tropicalis 4,5 ±0,50 81,1 ±0,57 0,28 0,20 50,6 ±0, Candida utilis 2,6±0,11 49,4 ±0,90 0,26 0,10 43,5 ±0, Yarrowia lipolytica 4,2±0,36 79,0 ±0,65 0,27 0,20 48,9 ±0, Rhodotorula rubra 4,0± 0,22 74,6 ±0,72 0,27 0,16 45,7 ±0, Torulopsis utilis 7,4± 0,75 87,5 ±0,50 0,41 0,14 51,0 ±0, Endomycopsis fibuligera Влияние агентов окислительного стресса на эффективность биоконверсии соевой мелассы Проведенные исследования позволили установить, что степень потребления углеводов при культивировании Endomycopsis fibuligera на питательной среде, содержащей соевую мелассу, не превышает 88 %, что при повышенных началь ных концентрациях субстрата может существенно затруднить очистку обра зующихся сточных вод в случае применения данного углеводного экстракта в промышленности. Ранее, на других биологических объектах [Davies et al., 1995, Сорокодумов, 2005, Суясов, 2007] было показано, что пероксид водорода, как агент окислительного стресса, способен оказывать стимулирующее действие на ростовые характеристики микроорганизмов, повышая степень потребления компонентов субстрата. В связи с этим нами была исследована возможность повышения достигнутых ранее показателей при использовании пероксида во дорода в качестве окислительного агента на стадии подготовки посевного мате риала Endomycopsis fibuligera.
Результаты по установлению оптимальной концентрации пероксида во дорода, а также фазы роста культуры для внесения стрессового агента показа ли, что положительный эффект на биомасса, г/л блюдается при внесении стрессор удельная скорость роста, 1/ч 10 0, ного агента в концентрации 1 г/л на удельная скорость 8 0, биомасса, г/л 22 час культивирования, что соот роста, ч- 6 0, ветствует экспоненциальной фазе 4 0,1 роста культуры и согласуется с ли тературными данными. В этом слу 2 0, чае максимальная скорость роста 0 возрастает до 0,20 ч1 а максималь 0 1 2 3 45 6 7 концентрация перекиси водорода, г/л ное накопление биомассы увеличи вается на 9,5 % (рис.1.) Рис. 1. Влияние концентрации пероксида Для увеличения положитель водорода на ростовые характеристики ного влияния, наблюдаемого при Endomycopsis fibuligera однократном внесении пероксида накопление биомассы, г/л водорода в культуральную жид концентрация остаточ ных углевод ов, г/л кость, исследовали варианты много 8,6 концентрация биомассы, 8, кратного воздействия агентом окис 2, 8, углеводы, г/л лительного стресса на Endomycopsis г/л fibuligera в процессе пересевов как в 1, 7, оптимальных подобранных услови 7, ях, так и в условиях увеличиваю 0, 7, щейся концентрации пероксида во 7,2 0 1 2 3 4 пассаж 5 7 дорода, а также в варианте снижения возраста культуры. При этом уста Рис. 2. Адаптация Endomycopsis fibuligera к пероксиду водорода при более раннем вне- новлено, что наибольший эффект сении окислительного агента в каждом сле- наблюдается в случае многократ дующем пассаже ных пересевов (5 пассажей) с последующим более ранним внесением окисли тельного агента в количестве 1 г/л в каждом следующем пассаже. Максималь ное накопление биомассы в этом случае составляет 8,5 г/л, степень потребления углеводов повышается с 87,5 до 93,5 %.
Проведение комплекса мер при осуществлении аэробной биоконверсии углеводного экстракта сои с использованием инокулята Endomycopsis fibuligera, подверженного многократному воздействию пероксидом водорода, на стадии подготовки посевного материала, позволило сократить продолжительность ос новного процесса ферментации (на 6-8 часов), повысить выход биомассы на % и получить целевой продукт – дрожжевую биомассу, содержащую 48,6 % ис тинного белка.
Исследование режимов культивирования Endomycopsis fibuligera Ключевой стадией биотехнологического производства является стадия фер ментации. Поэтому на следующем этапе работы исследовали влияние режимов куль тивирования на эффективность биоконверсии соевой мелассы и качество продукта.
Предварительные исследования по подбору оптимальной концентрации соевой мелассы в среде при культивировании Endomycopsis fibuligera показали, что основные параметры процесса – максимальная удельная скорость роста, а также экономический коэффициент, остаются на высоком уровне при концен трации мелассы в среде не более 50 г/л по общим сахарам.
Отработку режимов культивирования осуществляли в лабораторном фер ментере (объем 5 литров, заполнение 70 %). Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что при использовании штамма Endomycopsis fibuligera для биоконверсии соевой мелассы оптимальным режимом культивирования являет ся непрерывный. Вымывания не наблюдается при скорости протока 0,22 ч-1, при этом содержание сырого протеина и истинного белка в биомассе составля ет не менее 58,0 и 45,0 % соответственно.
Таблица Характеристики процессов биоконверсии соевой мелассы культурой Endomycopsis fibuligera селективного к пероксиду водорода при различных режимах глубинного культивирования (А - периодическое;
Б –отъемно-доливное;
В – непрерывное, Г – периодическое с подпиткой) Характеристики А Б В Г Удельная скорость роста, ч-1 0,15* 0,22** 0,22 0, Накопление биомассы, г/л 21,0±0,25 17,4±0,22 24,5±0,20 45,0±0, Состав биомассы, % 61,5±0,95 60,4±0,75 58,7±0,80 50,5±0, • сырой протеин 48,6±0,50 47,2±0,43 48,3±0,15 36,2±0, • истинный белок * - доля отъема культуральной жидкости каждый час ** - скорость протока культуральной жидкости Повышение экономической эффективности процессов ферментации воз можно при использовании замкнутого цикла водопользования. Кроме того, ис пользование рециркуляции позволяет сократить объемы образующихся сточ ных вод. В связи с этим исследовали процесс культивирования дрожжей на пи тательной среде с содержанием соевой мелассы 50 г/л по общим углеводам с рециркуляцией фильтрата культуральной жидкости. Установлено, что при пол ном возврате фильтрата на стадию культивирования с учетом потерь при фильтрации, уже после 1 цикла степень потребления углеводов снижается до %. Оптимальным является возврат 60 % получаемого на стадии выделения биомассы фильтрата. В этом случае выраженного угнетения ростовых характе ристик не наблюдается, а концентрация остаточных углеводов с 5 цикла стаби лизируется на уровне 14,5 г/л.
Образующийся фильтрат отличается значительным содержанием оста точных углеводов. Одним из возможных способов повышения степени утили зации углеводных компонентов соевой мелассы, может являться последова тельное культивирование нескольких видов микроорганизмов. При культиви ровании микроорганизмов L. plantarum и L. acidophilus на культуральной жид кости, образующейся в ходе рецикла (60 %) при культивировании Endomycopsis fibuligera установлено, что максимальное накопление биомассы составляет 1, г/л для L. plantarum. Содержание остаточных углеводов при этом снижается в 1,8 раза. Кроме того, дополнительное введение в состав питательной среды азотсодержащих веществ приводит к повышению накопления биомассы в сред нем в 2,3 раза (табл.6).
Таблица Влияние дополнительного внесения источников азота в состав питательной среды на ос нове фильтрата культуральной жидкости Endomycopsis fibuligera на ростовые характери стики L. plantarum (начальное содержание общих сахаров – 14,5 г/л) Источник азота Концентра- Остаточные Степень ция биомас- углеводы, потребления сы, г/л г/л углеводов, % Дрожжевой экстракт – 0,5% 3,0 6,3 56, (NH4)2 SO4 – 4 г/л 2,7 7,7 46, Пептон – 0,2 % 3,3 6,7 53, (NH4)2 SO4 – 4 г/л + Пептон – 0,2 % 2,9 7,2 50, Без дополнительного источника азота 1,3 8,0 45, Таким образом, последовательное культивирование Endomycopsis fibuligera и Lactobacillus plantarum при биоконверсии соевой мелассы позволяет не толь ко повысить степень использования субстрата, но и получить дополнительный продукт - биомассу молочнокислых микроорганизмов, которая может быть ис пользована в качестве пробиотической добавки для животных. Проведенный анализ пробиотических свойств у исследуемой культуры при развитии на мо локе и на питательной среде, содержащей соевую мелассу, показал, что культу ра устойчива к воздействию температуры в диапазоне 60-650C, желчи и пище варительным ферментам.
На основе проведенных исследований разработана принципиальная блок схема переработки соевой мелассы в грибную биомассу и пробиотическую до бавку кормового назначения (схема 2, табл. 7).
Минеральные соли ТП.1. Приготовление и стери лизация питательной среды Технологическая вода Соевая меласса рецикл ТП.3. Ферментация Аммиачная вода ТП.2. Приготовление посевно- ТП.4. Фильтрация На ТП.5. Сушка го материала Endomycopsis биомассы fibuligera ТП.6. Приготовление и стери Пептон лизация питательной среды Минеральные. соли Кормовая добавка на основе Endomycopsis fibuligera Аммиачная вода ТП.8. Ферментация ТП.7. Приготовление посевного материала ТП. 9. Концентрирование L. plantarum биомассы бактерий Фильтр на слив Пробиотическая добавка на основе L. plantarum Схема.2. Принципиальная блок схема, включающая основные стадии технологического про цесса (ТП) переработки соевой мелассы Таблица Технико-экономические параметры биоконверсии соевой мелассы мощностью 5000 т/год по объему перерабатываемого сырья в белковую биомассу и пробиотическую кормовую добавку Наименование показателя Единица измерения Значение показателей 1. Годовой выпуск продукции а) в натуральном выражении • белково-углеводная кормовая добавка т 1443, м • жидкая пробиотическая добавка 3237, б) в оптовых ценах тыс. руб. за т 13, • белковая кормовая добавка тыс. руб. за м3 80, • жидкая пробиотическая добавка 2. Капитальные затраты тыс. руб. 42858, 3. Полная себестоимость годового выпуска тыс. руб. 126580, 4. Себестоимость единицы продукции • белково-углеводная кормовая добавка тыс. руб. за т 6, тыс. руб. за м3 37, • жидкая пробиотическая добавка 5. Стоимость годового выпуска продукции тыс. руб. 277722, 6. Прибыль годовая тыс. руб. 151142, 7. Рентабельность:
а) производственных фондов % 80, б) продукции % 51, 8. Срок окупаемости капитальных вложений год 1, Использование депротеинизированного соевого шрота для получения микробных кормовых добавок Одним из отходов производства изолята белка сои является депротеинизиро ванный соевый шрот, в составе которого содержится, как было показано ранее, до 67,5 % углеводов. Существует два принципиальных подхода к биоконверсии такого рода субстратов – либо использование грибных культур при твердофазном способе культивирования, либо использование дрожжевых культур при предварительной об работке сырья с целью повышения биодоступности субстрата.
Биоконверсия депротеинизированного соевого шрота в дрожжевую био массу кормового назначения В настоящей работе были исследованы два вида предобработки субстрата – кислотный и ферментативный гидролиз. Определение параметров кислотного гидролиза позволило установить оптимальные условия его проведения – рН 1,5, концентрация субстрата 30 г/л, температура 128оС, длительность 90 мин. Полу ченный гидролизат содержал - 506,7 г/кг общих сахаров.
При ферментативном Таблица способе предобработки де Содержание сахаров в гидролизате, предобработанном фермен протеинизированного соево тативным гидролизом № Время го шрота показано, что наи Концентрация углеводов Расход мента, Т, оС фер гидро- в гидролизате % больший эффект наблюда лиза, ется при воздействии фер г/л к/кг мин 1 1,0 40 90 1,0±0,05 33,3±1,7 ментным препаратом Цел 2 1,0 50 90 1,3±0,07 42,4±2, ловиридин Г3Х в течение 3 1,0 55 90 1,3±0,04 43,3±1, 1,5 часа при температуре 4 1,0 60 90 1,18±0,06 39,6±1, С на твердый отход, пред 5 1,0 55 20 0,45±0,05 15,0±1, 6 1,0 55 40 0,75±0,09 25,0±2,8 варительно подвергшийся 7 1,0 55 60 1,2±0,03 40,2±0, температурной обработке 8 0,5 55 90 0,75±0,07 25,0±2, при повышенном давлении в 9 2,0 55 90 2,2±0,04 73,3±1, автоклаве в течение 30 мин 10 3,0 55 90 2,9±0,09 96,7±2, (табл. 8). Оптимальная кон 11 4,0 55 90 3,5±0,10 116,7±3, 12 5,0 55 90 3,5±0,06 116,7±1,9 центрация препарата фер 13 4,0 55 90 8,1±0,10 200,0±3, мента Целловиридин Г3Х 14 4,0 55 90 9,1±0,15 303,3±5, при ферментативном гидро 15 4,0 55 90 4,4±0,11 147,7±2, лизе составила 4 % от массы 16 4,0 55 90 10,5±0,20 350,0±6, 17 4,0 55 90 9,8±0,15 326,7±5,0 загруженного субстрата.
1-12 без дополнительной обработки При изучении ферментатив 13 – измельчение субстрата до размера частиц 1,0 мм 14 – термообработка субстрата в течение 30 мин при ных гидролизатов, получен Т=1210С ных при комбинировании 15 – ультразвуковая обработка субстрата в течение 15 мин способов предобработки ус при Т=600С тановлено, что выход редуци 16 – совместная температурная обработка и измельчение рующих веществ увеличива 17 – совместная температурная и ультразвуковая обработка ется незначительно по срав нению с наиболее интенсивным способом обработки – термообработкой, и с эко номической точки зрения использование нескольких методов предобработки неце лесообразно.
Конечным этапом оценки полученных гидролизатов явилось исследова ние их доброкачественности при культивировании дрожжей. Наилучшие ре зультаты при культивировании на кислотном гидролизате получены для дрож жей Candida tropicalis - накопление биомассы составляет 293,0 г биомассы/ кг от хода, содержание сырого протеина в образующемся белково-углеводном продукте составляет 42,4 %. Лучшими ростовыми характеристиками при культивировании на ферментативных гидролизатах обладает штамм Saccharomyces cerevisiae II – на копление биомассы составляет 226,7 г/ кг отхода, содержание сырого протеина в продукте – 39,3 % (табл. 9).
Таблица Ростовые характеристики дрожжей при их глубинном культивировании на предобработанных пита тельных средах, содержащих 30 г/л субстрата (в числителе – характеристики для гидролизата, предобра ботанного ферментативным гидролизом (4 % ферментного препарата, Т – 550С, в знаменателе для суб страта, полученного в условиях кислотного гидролиза (рН 1,5, Т – 121 оС ) Степень по Максимальное Удельная ско- Сырой проте требления уг Микроорганизм накопление рость роста, ин в продукте, леводов, % ч- биомассы, г/л % 95,0/55,5 6,8/5,1 0,10/0,18 39,3/34, Saccharomyces cerevisiae II 88,2/37,1 1,5/1,0 0,06/0,17 23,8/27, Saccharomyces cerevisiae“Я” 83,3/48,0 4,5/4,5 0,08/0,19 28,6/34, Candida maltosa 80,3/90,5 5,2/8,8 0,07/0,19 29,7/42, Candida tropicalis 87,2/39,4 3,0/2,0 0,11/0,10 26,2/30, Candida utilis 83,3/46,2 4,7/5,8 0,08/0,11 28,9/31, Yarrowia lipolytica 79,4/34,5 4,5/5,6 0,07/0,17 28,6/35, Rhodotorula rubra 86,2/86,3 5,5/3,7 0,05/0,15 30,2/33, Torulopsis utilis 85,2/54,3 3,0/2,0 0,06/0,18 26,2/30, Endomycoopsis fibuligera Следует отметить, однако, что наиболее перспективной с точки зрения про мышленной реализации является термическая обработка депротеинизированного шрота, ферментативный гидролиз и последующее культивирование на ферменто лизате дрожжевой культуры Saccharomyces cerevisiae II.
Биоконверсия депротеинизированного соевого шрота в биомассу кормо вого назначения при твердофазном культивировании грибных культур Альтернативным способом использования целлюлозсодержащего сырья яв ляется прямая биоконверсию в микробный продукт с использованием грибных культур. Скрининг 12 грибных культур по показателям степени использования субстрата, а также содержанию белка в биомассе, позволил выделить шесть штаммов степень использования субстрата для которых превысила 55 %. При этом наиболее перспективным штаммом является Aspergillus niger, содержание сырого протеина в продукте превысило 50 % (табл. 10).
Таблица Ростовые характеристики некоторых грибных культур при их твердофазном культивировании (субстрат - твердый отход изолята белка сои) Микроорганизм Сырой проте- Накопление Общие Степень использо ин, % биомассы г/кг углеводы, % вания субстрата, % 52,6±0,35 510,3 25,2±0,38 67,6±0, Aspergillus niger 50,2±0,29 502,5 35,7±0,14 54,1±0, Penicillium chryzogenum 47,8±0,52 415,0 33,5±0,17 57,0±0, Penicillium funiculosum 38,1±0,40 162,1 34,8±0,12 55,3±0, Trichoderma harsianum 28,1±0,18 316,8 30,1±0,15 61,4±0, Trichoderma viride 49,4±0,40 407,6 26,8±0,30 65,6±0, Aspergillus flavus Таким образом, данные свидетельствуют о том, что для получения белко во-углеводной кормовой добавки в случае твердофазного способа биоконвер сии исследуемых отходов наиболее целесообразно использовать Aspergillus niger.
Разработка способов биологической конверсии соевой сыворотки, образующей при получении изолята белка сои Соевая сыворотка – отход производства изолята белка сои, который со держит большое количество белковых веществ и сахаров в соотношении 1:1, (г/л). При использовании соевой сыворотки в качестве питательной среды для глубинного культивирования дрожжей установлено, что максимальное накоп ление биомассы – 12,3 г/л составляет- для Rhodotorula rubra. При анализе со става дрожжевой биомассы максимальное содержание истинного белка также наблюдается для данной культуры и составляет 48,0 % (табл. 11).
Таблица Ростовые характеристики некоторых видов дрожжей при их глубинном культивировании на соевой сыворотке Остаточное Накопление содержание Степень по- Истинный Микроорганизм биомассы, углеводов. требления белок в био г/л г/л углеводов, % массе, % 12,3±0,50 4,9±0,22 76,8±0,25 48,0±0, Rhodotorula rubra 6,5±0,22 4,2±0,18 80,1±0,52 47,9±0, Saccharomyces cerevisiae SL- 3,4±0,12 7,3±0,31 65,4±0,25 46,0±0, Candida scotii 3,8±0,15 5,4±0,27 74,4±0,35 42,2±0, Torulopsis utilis 2,5±0,05 10,1±0,50 52,1±0,20 42,0±0, Endomycopsis fibuligera Поскольку соевая сыворотка содержит до 17 г/л белковых веществ, то считали целесообразным исследовать варианты обогащения ее углеводными компонентами. При определении ростовых характеристик микроорганизмов при культивировании на питательных средах, содержащих соевую сыворотку с дополнительным введением углеводов в количестве 5 г/л при использовании сахарозы и соевой мелассы, показано, что данные манипуляции приводят к по вышению скорости роста и экономического коэффициента.
Кроме того, использование дрожжевого экстракта и минеральных компо нентов для приготовления такой питательной среды является необязательным условием, поскольку все необходимые компоненты имеются в составе соевой сыворотки.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод, что со евая сыворотка может быть использована для получения высокобелковой био массы дрожжей Rhodotorula rubra, а также в качестве ингредиента комплекс ных сред как источник белковых и ростстимулирующих компонентов.
ВЫВОДЫ 1. Разработана технология переработки отхода производства концентрата бел ка сои (соевой мелассы) глубинным культивированием Endomycopsis fibuligera с получением продукта кормового назначения (содержание истинного белка не менее 45 %) и пробиотической добавки на основе молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum с содержанием КОЕ не менее 10 10 ед/мл.
2. Установлено, что предварительная обработка агентом окислительного стрес са (пероксидом водорода) культуры Endomycopsis fibuligera на стадии приго товления посевного материала позволяет повысить степень утилизации угле водных компонентов соевой мелассы до 93,5% на стадии ферментации.
3. Предложены три способа переработки отхода производства изолята белка сои (депротеинизированного соевого шрота - содержание белка 22,5 %) с полу чением кормовой белково-углеводной добавки:
- ферментативным гидролизом препаратом Целловиридин Г3Х термически об работанного депротеинизированного соевого шрота и последующим глубин ным гетерофазным культивированием на полученном ферментолизате дрожжей Saccharomyces cerevisiae II. Содержание белка увеличивается до 39,3 %;
- кислотным гидролизом депротеинизированного соевого шрота с последую щим глубинным гетерофазным культивированием на полученном гидролизате дрожжей Candida tropicalis, обеспечивающим повышение содержания белка в продукте до 42,4 %;
-твердофазным культивированием Aspergillus niger на нативном твердом остатке, обеспечивающим повышение содержания белка в продукте до 52,6 %.
4. Предложена технология переработки соевой сыворотки микробной биокон версией в кормовую добавку на основе биомассы дрожжей Rhodotorula rubra, реализация которой позволит снизить эколого-экономический ущерб от загряз нений водных объектов на 62,2 %.
Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:
1. Смирнова, В. Д. Биотехнологический путь переработки отходов производ ства соевого белка / В.Д. Смирнова, Р.Ю. Киселева, И. В. Шакир, В. И. Панфи лов // Экология и промышленность в России. 2010. № 5. С. 14-16.
2. Смирнова, В. Д. Интенсификация процесса биоконверсии отходов пищевой промышленности в дрожжевую биомассу кормового назначения / В.Д. Смирно ва, И.В. Балакирев, Е.В. Башашкина, Н.А. Суясов, И.В. Шакир // Химическая промышленность сегодня. 2010. № 8. С.10-15.
3. Смирнова, В.Д. Биоконверсия углеводного экстракта сои в кормовой про дукт белковой природы / В.Д. Смирнова, И.В. Шакир // Материалы Междуна родной научно-практической конференции «Биотехнология: вода и пищевые продукты». 2007. Москва,11-13 марта.ч.2 С.98.
4. Смирнова, В.Д. Исследование ферментативного гидролиза для интенсифи кации процесса биоконверсии отходов, образующихся при получении изолята белка сои / В.Д. Смирнова, Р.Ю. Учурова, В.И. Панфилов, И. В. Шакир // Мате риалы Международной научно-практическая конференция «Биотехнология: во да и пищевые продукты». 2008. Москва,11-13 марта.ч.1 С. 251.
5. Смирнова, В.Д. Получение белковой кормовой добавки на основе отходов производства изолята белка сои / В.Д. Смирнова, И.В. Шакир, Р.Ю. Киселева // Материалы Всероссийской научно-технической конференции «Наука Производство-Технологии-Экология». Киров. 2008. С. 237-239.
6. Смирнова, В.Д. Использование соевой мелассы в качестве субстрата для культивирования молочнокислых бактерий / В.Д. Смирнова, И.В. Шакир, Т.В.
Кузницова, В. И. Панфилов // Материалы Всероссийской научно-технической конференции «Наука-производство-Экология». Киров. 2010. С.106-108.
7. Смирнова, В. Д. Использование сухого остатка, образующегося после из влечения белка из соевого шрота, в качестве субстрата для глубинного гетеро фазного культивирования дрожжей / В.Д. Смирнова, Р.Ю. Учурова, И.В. Шакир // Труды ХП международной конференции «Окружающая среда для нас и бу дущих поколений» Самара, 4-10 сентября 2007 г. С. 58.
8. Смирнова, В.Д. Использование отходов производства изолятов белка сои для культивирования дрожжей / В.Д. Смирнова, Р.Ю. Учурова, В.И. Панфилов // Материалы ХШ международной конференции «Окружающая среда для нас и будущих поколений», Самара-Астрахань-Самара, сентябрь 2008 г. С.124.
9. Смирнова, В.Д. Биоконверсия отходов предприятий, перерабатывающих сою / В.Д. Смирнова, Т.В. Кузницова, П.А. Карпов // Тезисы V Международно го конгресса молодых ученых по химии и химической технологии «МКХТ 2009». С. 99-103.
10. Смирнова, В.Д. Влияние условий получения белковых продуктов из сои на состав и биологическую ценность образующихся отходов / В.Д. Смирнова, И.В.
Шакир, В. И. Панфилов // Материалы 8-й Международной конференции «Со трудничество для решения проблемы отходов». – Харьков, Украина. 2011. С.46.