Использование 3’-нетранслируемой области вируса некротического пожелтения жилок свеклы в качестве индуктора устойчивости к ризомании
На правах рукописи
Виноградова Светлана Владимировна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 3’-НЕТРАНСЛИРУЕМОЙ ОБЛАСТИ ВИРУСА НЕКРОТИЧЕСКОГО ПОЖЕЛТЕНИЯ ЖИЛОК СВЕКЛЫ В КАЧЕСТВЕ ИНДУКТОРА УСТОЙЧИВОСТИ К РИЗОМАНИИ 03.01.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА - 2012 1
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центре «Биоинженерия» Российской академии наук Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор Аграновский Алексей Анатольевич, кандидат биологических наук Камионская Анастасия Михайловна
Официальные оппоненты:
Карпова Ольга Вячеславовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова", биологический факультет, профессор кафедры вирусологии Долгов Сергей Владимирович, доктор биологических наук, Государственное научное учреждение Всероссийский научно исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук, заведующий лабораторией генной инженерии растений.
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Защита диссертации состоится “ ” 2012 года в час. мин. на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.
Автореферат разослан « 2012 года.
»
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И.А. Крашенинников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы В мировой практике рентабельность выращивания сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) во многом зависит от эффективности борьбы с болезнями и вредителями этой культуры. Сахарная свекла поражается рядом вирусных заболеваний, из которых наиболее экономически значимыми являются ризомания (вызываемая вирусом некротического пожелтения жилок свеклы Beet necrotic yellow vein benyvirus, BNYVV) и желтуха (Beet yellows closterovirus, BYV). Ризомания регистрировалась практически во всех районах возделывания культуры в Старом и Новом Свете (McGrann et al., 2009). При поражении ризоманией сахаристость корнеплодов снижается от 8% до 50-60% (Asher, 1993), а снижение урожайности может достигать 30-90% (Johanson, 1985).
Успех борьбы с ризоманией зависит от создания устойчивых сортов, гибридов и линий, в том числе полученных путем внедрения источников устойчивости к BNYVV генно-инженерными методами.
Экспрессия в растениях фрагментов 3’-нетранслируемой области (3’-НТО) вирусных РНК геномов имеет определенные преимущества, поскольку вирусные РНК стабильны в течение короткого времени и не являются иммуногенами. 3’-НТО BNYVV представляет интерес в качестве нового индуктора устойчивости к ризомании на основе посттранскрипционного умолкания генов или сайленсинга (post-transcriptional gene silencing, PTGS). Для индуцирования сайленсинга часто используют трансгенную экспрессию шпилечной или двунитчатой РНК (Hamilton et al., 1998;
Chuang and Meyerowitz, 2000;
Johansen and Carrington, 2001). Шпилечные конструкции, содержащие фрагменты вирусного генома, применялись ранее для создания трансгенных растений сахарной свеклы, томата, огурца и дыни, лайма (Lennefors et al., 2006;
Fuentes et al., 2006;
Pandolfini et al., 2003;
Leibman et al., 2011;
Lopez et al., 2010). Было показано, что устойчивость в этих случаях индуцируется благодаря PTGS, что подтверждается присутствием в трансгенных растениях siРНК. В настоящей работе мы сравнивали устойчивость модельных трансгенных растений Nicotiana benthamiana, экспрессирующих двунитчатую форму 3’-НТО генома BNYVV, и растений, экспрессирующих мРНК гена белка оболочки (БО) этого вируса.
Цель и задачи работы Целью работы было изучение 3’-НТО генома BNYVV в качестве индуктора PTGS и устойчивости к ризомании в трансгенных растениях.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. конструирование бинарных векторов, обеспечивающих экспрессию в растениях инвертированных повторов 3’-НТО BNYVV, формирующих шпилечную структуру (BNYVVsil), или мРНК гена БО (BNYVVcp);
2. оценка подавления транзиентной экспрессии «мишени» (ген GFP, несущий 3’-НТО BNYVV) за счет индукции PTGS транскриптом BNYVVsil в растениях N. benthamiana;
3. получение трансгенных растений экспрессирующих N. benthamiana, одновременно BNYVVsil (или BNYVVcp) и ген bar, обеспечивающий устойчивость к гербициду BASTA;
4. определение уровня устойчивости к BNYVV трансгенных растений гомозиготного поколения Т2.
Научная новизна Создана конструкция, несущая ген bar устойчивости к гербициду BASTA, и инвертированные повторы фрагментов 3’-НТО BNYVV (BNYVVsil), индуцирующие сайленсинг в растениях. Эффективность этой конструкции для индукции PTGS показана с помощью метода транзиентной коэкспрессии конструкций «мишени» (ген GFP, несущий 3’-НТО BNYVV) и «индуктора» BNYVVsil.
Впервые получены трансгенные растения N. benthamiana, в которых подтверждена экспрессия трансгенной вставки в поколениях Т0 и Т2. В трансгенных растениях Т2 доказана индукция PTGS при транзиентной экспрессии «мишени» (ген GFP – 3’-НТО BNYVV).
Проведена оценка устойчивости трансгенных растений поколения Т2 к механической инокуляции BNYVV. Растения Т2 BNYVVsil проявляли толерантность к инфекции BNYVV, симптомы вирусной инфекции развивались на них с задержкой. Таким образом, подтверждена возможность использования BNYVVsil как потенциального источника устойчивости к ризомании в растениях сахарной свеклы.
Практическая значимость На модели растений N. benthamiana показана возможность получения трансгенов, сочетающих признаки устойчивости к гербициду и вирусной инфекции. Толерантность к ризомании была основана на стабильной экспрессии в растениях двунитчатых форм 3’-НТО BNYVV. Экспрессия в модельных трансгенных растениях двух кДНК, введенных с помощью одного бинарного вектора, показывает возможность получения трансгенных растений сахарной свеклы, несущих два ценных признака – устойчивость к гербициду и к инфекции BNYVV.
Апробация работы Результаты работы были представлены на Международной конференции «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Москва-Звенигород, 2011), XXIV Зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2012 г), «9th International congress of plant pathology» (Турин, Италия, 2008), 4th International Conference and Exhibition «RNAi2009:
ncRNA: Bridging Biology and Therapy» (Оксфорд, Великобритания, 2009), 3rd International Symposium on Plant Protection and Plant Health in Europe (Берлин, Германия, 2009), Inernational Conference «Plant transformation technologies II» (Вена, Австрия, 2011), Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе две статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 56 рисунков и 5 таблиц.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы из 250 источников и приложения.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Конструирование бинарных векторов, содержащих кДНК фрагменты генома BNYVV Бинарные конструкции были задуманы таким образом, чтобы в трансгенных растениях экспрессировались две целевых вставки, каждая под контролем независимого 35S промотора. Во всех конструкциях использовали ген bar, обеспечивающий устойчивость к гербициду Конструкция BASTA.
pBI_BAR_BNYVVsil (Рис. 1А), содержала кДНК фрагмента 3’-НТО BNYVV (геномные позиции 4427-4613, GenBank X73476.1), в прямой и обратной ориентации, разделенные интроном ubi1. Конструкция pBI_BAR_BNYVVcp содержала ген БО BNYVV (Рис. 1Б). Секвенирование кассет экспрессии не обнаружило замен в нуклеотидной последовательности.
Рис. 1. Структура кассеты экспрессии плазмид pBI_BAR_BNYVVsil (А) и pBI_BAR_BNYVVcp (Б). RB и LB – правая и левая границы Т-ДНК;
35S – промотор вируса мозаики цветной капусты;
bar – ген фосфинотрицинацетилтрансферазы Streptomyces hygroscopicus;
NOS-T – терминатор гена нопалинсинтетазы;
BNYVVsil – кДНК 3'-НТО геномной РНК BNYVV;
INTR - интрон гена кукурузы ubi1;
BNYVVsil’ – кДНК комплементарной последовательности 3’-НТО BNYVV;
BNYVVcp – кДНК гена БО BNYVV.
Для оценки индукции сайленсинга экспресс-методом фрагмент 3’-НТО BNYVV был клонирован в конструкцию pNR_GFP (любезно предоставленную Н.В. Равиным). Полученная плазмида pNR_GFP_BNYVVsil (Рис. 2) содержала ген GFP, несущий на 3’-конце НТО BNYVV («последовательность-мишень» для сайленсинга).
Рис. 2. Структура кассеты экспрессии плазмиды pNR_GFP_BNYVVsil. RB и LB – правая и левая границы Т-ДНК;
35S – промотор;
NOS-T – терминатор гена нопалинсинтетазы;
BNYVVsil – кДНК 3'-НТО РНК BNYVV;
AMV – трансляционный энхансер РНК-4 вируса мозаики люцерны;
GFP – ген зеленого флуоресцентного белка;
INTR – последовательность интрона гена Psk7 из Petunia hybrida (GenBank AJ224165).
Экспресс-оценка индукции сайленсинга фрагментом BNYVVsil с помощью транзиентной экспрессии в растениях N. benthamiana дикого типа Для быстрой оценки эффективности созданных конструкций как индукторов сайленcига мы экспрессировали в растениях N. benthamiana дикого типа конструкцию-мишень (pNR_GFP_BNYVVsil) и конструкцию-индуктор (pBI_BAR_BNYVVsil). На третий день после агроинокуляции наблюдали значительное снижение свечения GFP при одновременной экспрессии мишени и индуктора PTGS (Рис. 3).
Рис. 3. Визуальная оценка транзиентной экспрессии мишени (pNR_GFP_BNYVVsil) и индуктора сайленсинга (pBI_BAR_BNYVVsil) по флуоресценции GFP в листе.
Снижение экспрессии GFP при совместной экспрессии мишени и индуктора было подтверждено Вестерн блот анализом (Рис. 4).
Рис. 4. Вестерн блот анализ суммарного белка, выделенного из областей листьев, инфильтрированных мишенью и индуктором (1, 3, 5) или только мишенью (2, 4, 6). Блот проявляли поликлональной антисывороткой к GFP (первичные антитела) и конъюгатом антикроличьих IgG с пероксидазой хрена.
Количественное измерение флуоресценции GFP показало снижение экспрессии примерно в 30 раз при одновременной инфильтрации мишени и индуктора (Рис. 5).
Рис. 5. Интенсивность флуоресценции GFP при транзиентной экспрессии мишени и индуктора сайленсинга (pNR_GFP_BNYVVsil + pBI_BAR_BNYVVsil) (1);
мишени pNR_GFP_BNYVVsil (2).
Результаты оценки экспресс-методом свидетельствуют о том, что конструкция-индуктор pBI_BAR_BNYVVsil имеет значительный потенциал как индуктор РНК сайленсинга in vivo.
Получение трансгенных растений N. benthamiana, несущих кДНК фрагменты генома BNYVV На первом этапе получения трансгенных растений подбирали концентрацию селективного агента в питательной среде для дальнейшей селекции трансформантов. В качестве селективного агента использовали фосфинотрицин (действующее вещество гербицида BASTA). Таким образом, ген bar устойчивости к гербициду, введенный в бинарный вектор, служил также для селекции трансформантов. Для отбора трансгенных растений оптимальная концентрация фосфинотрицина в питательной среде составила мг/л.
На следующем этапе осуществляли трансформацию N. benthamiana штаммом A. tumefaciens GV3101, содержащим вектор pBI_BAR_BNYVVcp или pBI_BAR_BNYVVsil. Через две недели после высаживания на селективную среду было отобрано 23 растения, трансформированных конструкцией pBI_BAR_BNYVVcp, и два растения, трансформированных конструкцией pBI_BAR_BNYVVsil.
Для идентификации растений, содержащих в геноме ген bar и BNYVV специфические кДНК, трансформанты N. benthamiana проверяли с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для кодирующей области гена bar, BNYVVsil и BNYVVcp. Наличие гена bar и BNYVVcp показано в геноме растений, а гена bar и BNYVVsil – в геноме двух растений, т.е. всех трансформантов, отобранных на первом этапе. Контаминация A. tumefaciens в этих растениях не выявлялась. Пять трансгенов со вставкой BNYVVcp (линии 4, 11, 16, 18, 19), и два со вставкой BNYVVsil (линии 126 и 139), отобрали для проведения дальнейшего анализа.
Анализ экспрессии трансгенной вставки в N. benthamiana поколения Т Трансгенные растения анализировали методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к BNYVVcp и BNYVVsil. Экспрессия трансгенной РНК была подтверждена в линиях 4, 11, 16, 18, 19 (bar – BNYVVcp), и в линиях 126 и 139 (bar – BNYVVsil) (Рис. 6).
Рис. 6. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к гену bar (трансформанты pBI_BAR_BNYVVsil) (А);
BNYVVsil (Б) и BNYVVср (В). 1 - маркер молекулярной массы;
2 – проба OT-ПЦР без РНК. А: 3, 4 – ОТ ПЦР с суммарной РНК из трансформантов 126 и 139;
5 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растений дикого типа;
6 - ПЦР с плазмидной ДНК pBI_BAR_BNYVVsil. Б: 3 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растения дикого типа;
4, 5 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из трансформированных растений линий 126 и 139;
6 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из инфицированного BNYVV растения;
7 – ПЦР с плазмидной ДНК pBI_BAR_BNYVVsil. В: – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растения дикого типа;
4-8 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из трансформированных растений линий 4, 11, 16, 18, 19;
9 – ПЦР с плазмидной ДНК pBI_BAR_BNYVVср.
Экспрессию фосфинотрицинацетилтрансферазы (РАТ;
продукт гена bar) в трансгенных растениях также анализировали с помощью иммуно биохимического теста. Экспрессия была подтверждена в пяти PAT трансформантах и в двух трансформантах pBI_BAR_BNYVVcp pBI_BAR_BNYVVsil (Рис. 7).
Рис. 7. Иммунохроматографический анализ экспрессии PAT в трансгенных растениях N. benthamiana поколения Т0. Экстракты листьев: (1) N. benthamiana дикого типа;
(2-6) трансформантов pBI_BAR_BNYVVср линий 4, 11, 16, 18, 19, соответственно;
(7 и 8) трансформантов pBI_BAR_BNYVVsil линий 126 и 139.
Оценка индукции сайленсинга фрагментом BNYVVsil с помощью транзиентной экспрессии в трансгенных растениях N. benthamiana поколения Т Для оценки эффективности BNYVVsil в качестве индуктора PTGS in vivo, трансгенные растения поколения Т0, несущие вставку BNYVVsil, агроинокулировали «мишенью» PTGS pNR_GFP_BNYVVsil. На третий день анализировали уровень экспрессии GFP методом Вестерн блот анализа. Было показано снижение экспрессии в трансгенных растениях Т0, GFP инфильтрированных конструкцией-мишенью, в 2,5-3 раза по сравнению с контрольными растениями дикого типа (Рис. 8).
Рис. 8. Определение уровня экспрессии GFP с помощью Вестерн блот анализа. (1-3) – разведения суммарного белка, выделенного после экспрессии «мишени» pNR_GFP_BNYVVsil в трансгенном растении (без разведения, 1:5;
1:20);
(4) – суммарный белок, выделенный после агроинфильтрации трансгенного растения pNR_GFP;
(5-7) – разведения суммарного белка, выделенного после экспрессии pNR_GFP_BNYVVsil в растении дикого типа;
(8) – белок, выделенный после агроинфильтрации растения дикого типа pNR_GFP. Блот проявляли поликлональной антисывороткой к GFP (первичные антитела) и конъюгатом антикроличьих IgG с пероксидазой хрена.
Получение и анализ трансгенных растений N. benthamiana поколения Т1 и Т От трансгенных растений BNYVVsil и BNYVVcp поколения Т0 получали семена Т1 и высаживали на селективную питательную среду. По расщеплению популяции Т1 определяли количество трансгенных вставок в поколении Т (Таблица 1).
Таблица 1. Расщепление популяции трансгенных проростков поколения Т Количество Количество устойчивых к неустойчивых к Предполагаемое 2 факт* Трансгенная линия фосфинотрицину фосфинотрицину расщепление проростков проростков 4 23 477 15:1 2, 11 29 471 15:1 0, BNYVVcp 16 39 461 15:1 2, 18 25 475 15:1 1, 19 9 491 63:1 0, 126 5 495 63:1 1, BNYVVsil 139 124 376 3:1 0, * 2 факт – фактическое значение критерия 2. Теоретическое значение 2 для каждой выборки 3,84.
Расщепление 3:1 в популяции поколения Т1 указывает на наличие одиночной трансгенной вставки в Т0, расщепление 15:1 – двух трансгенных вставок, трех трансгенных вставок. Таким образом, можно 63:1 – предположить, что линии BNYVVcp-4, 11, 16, 18 несут две трансгенных вставки, линии BNYVVcp-19 и BNYVVsil-126 – три вставки, а линия BNYVVsil-139 – одну вставку.
Растения Т1, устойчивые к фосфинотрицину, адаптировали к тепличным условиям и получали гомозиготное поколение Т2. Для дальнейшей работы были отобраны две гомозиготные линии со вставкой BNYVVsil – 126.4 и 139.17, и пять гомозиготных линий со вставкой BNYVVср – 4.15, 11.24, 16.5, 18.17 и 19.5.
Анализ экспрессии трансгенной РНК проводили методом ОТ-ПЦР. В линиях 126.4 и 139.17 была подтверждена экспрессия BNYVVsil (Рис. 9А), а в линиях 4.15, 11.2, 16.5, 18.17 и 19.5 – BNYVVср (Рис. 9Б).
Рис. 9. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к BNYVVsil (А) и BNYVVср (Б). 1 – маркер молекулярной массы;
2 – ПЦР в отсутствие матрицы;
3 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растений дикого типа;
А: 4, 5 – ОТ ПЦР с суммарной РНК из трансформантов 126.4 и 139.17, соответственно;
6 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растения, инфицированного BNYVV. Б: 4-8 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из трансформантов 4.15, 11.24, 16.5, 18.17 и 19.5, соответственно;
9 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из растения, инфицированного BNYVV.
Экспрессия PAT была подтверждена во всех трансгенных линиях поколения Т2 с помощью иммуно-биохимического теста (не показано).
Таким образом, нами были получены трансгенные растения N. benthamiana BNYVVsil и BNYVVcp поколения Т2, стабильно экспрессирующие вирус специфические РНК – 3’-НТО и ген БО BNYVV, соответственно – и ген РАТ.
Анализ устойчивости трансгенных растений N. benthamiana поколения Т к механической инокуляции BNYVV Устойчивость трансгенных растений изучали с помощью механической инокуляции BNYVV (изолят Je-09) 12 растений каждой линии. Через 7 дней после инокуляции (д.п.и.) проводили полуколичественное определение РНК BNYVV в трансгенах и растениях N. benthamiana дикого типа методом ОТ ПЦР, который позволил обнаружить растения с достаточно высокой концентрацией вирусной РНК (Рис. 10). Анализ этих растений с помощью сэндвич-ИФА с поликлональной антисывороткой к BNYVV не выявил вирус в экстрактах. Очевидно, низкие концентрации вируса, накапливающиеся через неделю после инокуляции, находятся вне пределов чувствительности ИФА.
Рис. 10. Электрофореграмма продуктов OT-ПЦР с праймерами, специфичными к геному BNYVV, на матрице суммарной РНК из трансгенных растений N. benthamiana поколения Т2. 1 - маркер молекулярной массы ДНК;
2 - проба OT-ПЦР без РНК;
(А) 3 – OT ПЦР с суммарной РНК из здорового растения N. benthamiana;
4-15 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из инокулированных BNYVV растений N. benthamiana дикого типа;
16 - OT-ПЦР с суммарной РНК из инфицированного BNYVV растения С. quinoa. (Б) 3-14 – ОТ-ПЦР с суммарной РНК из инокулированных BNYVV трансгенных растений N. benthamiana линии BNYVVsil 126.4;
15 - OT-ПЦР с суммарной РНК из инфицированного BNYVV растения С. quinoa. Электрофореграммы подвергались сканированию и обработке количественных данных по интенсивности полос с использованием программы TINA 2.0.
Результаты ОТ-ПЦР анализа эффективности заражения вирусом линий BNYVVsil-126.4 и BNYVVsil-139.17, а также нескольких трансгенных линий Т BNYVVcp приведены на Рис. 11. Подсчитывая процент инфицированных от общего числа инокулированных растений, условно незараженными считали растения, для суммарной РНК которых интенсивность специфичной полосы в ОТ–ПЦР была в четыре и более раз слабее, чем в инфицированном контроле.
Линии BNYVVsil-126.4 и BNYVVcp-4.15 показывали наиболее значительное снижение процента зараженных растений по сравнению с контролем (Рис. 11).
Среди остальных линий, экспрессирующих мРНК БО BNYVV, через неделю после инокуляции количество инфицированных растений было сравнимо с контролем (11.24, 16.15) или даже превышало контроль (линия 19.5) (Рис. 11).
Рис. 11. Количество зараженных растений трансгенных растений N. benthamiana на 7 д.п.и. BNYVV (% от общего количества инокулированных растений каждой линии) Через 14 д.п.и. растения анализировали методом сэндвич-ИФА с поликлональной антисывороткой к BNYVV (Рис. 12А). По результатам анализа можно выделить линию для которой наблюдали BNYVVsil-126.4, статистически достоверное снижение концентрации вируса по сравнению с контрольными растениями. Среднее значение титра вируса было приблизительно в два раза меньше в растениях линии BNYVVsil-126.4, чем в контроле (Рис. 12А). Количество инфицированных растений в этой линии было на 34% меньше, чем в контроле (Рис. 12Б). Инфицированными считали растения, при анализе экстракта которых в ИФА значения OD405 двукратно превышали OD405 для здорового растения. Количество инфицированных растений трансгенных линий BNYVVср-4.15, 11.24 и 19.5 было несколько меньше, чем в контроле (снижение на 9-25%).
Рис. 12. Анализ BNYVV в трансгенных растениях N. benthamiana поколения Т методом ИФА (14 д.п.и.). К – инокулированные BNYVV растения дикого типа;
126.4, 139. - инокулированные растения BNYVVsil;
4.15, 11.24, 16.5, 18.17 и 19.5 – инокулированные растения BNYVVcp. А: Столбец диаграммы соответствует значению OD405 для экстракта каждого инокулированного растения. Значения OD405 для экстрактов здоровых растений составляли 0,08-0,09. Б: Количество зараженных растений (% от общего количества инокулированных растений линии).
Визуальные симптомы инфекции BNYVV проявлялись на 18-21 д.п.и. (Рис.
13). Через 21 д.п.и. проводили визуальную оценку степени пораженности растений по двум критериям: гофрированность листа и мозаика листа.
Симптомы инфекции у трансгенных растений BNYVVsil были менее выражены, чем у контрольных растений. По сравнению с контролем, наиболее слабое развитие симптомов гофрированности и мозаики листьев наблюдалось на растениях линий BNYVVsil-126.4 и BNYVVcp-4.15 (Табл. 2). Выраженность симптомов на линиях BNYVVcp-11.24, 16.5 и 19.5 не отличалась от контроля (Табл. 2). Эти наблюдения не противоречат оценке титра вируса на 14 д.п.и.
(Рис. 12).
Рис. 13. Симптомы BNYVV на контрольных и трансгенных растениях N. benthamiana на 21 д.п.и. (1) здоровое BNYVV растение N. benthamiana дикого типа;
(2) инокулированное BNYVV растение N. benthamiana дикого типа;
(3-9) инокулированные BNYVV трансгенные растения: (3) BNYVVcp-16.5;
(4) BNYVVsil-139.17;
(5) BNYVVcp-4.15;
(6) BNYVVcp-18.17;
(7) BNYVVcp-11.24;
(8) BNYVVsil-126.4;
(9) BNYVVcp-19.5.
По результатам ИФА, на 21 д.п.и. тестируемые растения всех линий BNYVVsil и BNYVVcp содержали вирус (Рис. 14). При этом наименьший титр вируса по сравнению с контролем был в линиях BNYVVsil-139.17 и BNYVVcp 19.5 (Рис. 14).
Рис. 14. Анализ BNYVV в трансгенных растениях N. benthamiana поколения Т методом ИФА через 21 д.п.и. Столбец диаграммы соответствует значению OD405 для экстракта каждого инокулированного растения. Значения OD405 для экстрактов здоровых растений составляли 0,10-0,11. К – инокулированные BNYVV растения дикого типа;
126.4, 139.17 - инокулированные BNYVV трансгенные растения BNYVVsil;
4.15, 11.24, 16.5, 18.17, 19.5 – инокулированные BNYVV трансгенные растения BNYVVcp.
На 28 д.п.и. растения трансгенных линий BNYVVsil-126.4 и BNYVVsil 139.17 также показывали достоверно меньшее развитие симптомов (Табл. 2), однако вирус выявлялся в этих растениях с помощью ИФА (данные не показаны). Линии BNYVVср на 28 д.п.и. не отличались от контроля по интенсивности симптомов (Табл. 2). Эти растения также содержали вирус, выявляемый ИФА.
Суммируя данные наблюдений за инокулированными трансгенными растениями, можно выделить линию BNYVVsil-126.4, которая проявляла наибольшую устойчивость к инфекции BNYVV в условиях механической передачи вируса. Количество зараженных растений этой линии на 7 и 14 д.п.и.
было, соответственно, на 42% и 34% меньше, чем в контроле. Кроме того, в зараженных растениях BNYVVsil-126.4 титр вируса был примерно в два раза ниже, чем в контроле и в других трансгенных линиях. Из всех тестированных растений, симптомы вирусной инфекции были наиболее мягкими на растениях линии BNYVVsil-126.4 в течение 28 д.п.и. Линия BNYVVsil-139.17 также проявляла определенную толерантность к вирусной инфекции.
Таблица 2. Визуальная оценка симптомов инфекции BNYVV на 21 и 28 д.п.и.
21 д.п.и. 28 д.п.и.
Мозаика Гофрированность Мозаика Гофрированность Линия листьев листьев листьев листьев Контроль 0 / 10 / 2* 0 / 12 / 0 0/9/3 0/9/ 126.4** 8/3/1 7/5/0 5/7/0 0 / 12 / 139.17 2/8/2 1/7/4 2 / 10 / 0 0 / 12 / 4.15 7/3/2 3/9/0 4/7/1 1 / 10 / 11.24 4/8/0 1 / 10 / 1 2 / 10 / 0 0 / 11 / 16.5 0/4/8 0 / 10 / 2 0 / 11 / 1 0/8/ 18.17 0/3/9 0/5/7 0 / 11 / 1 0 / 11 / 19.5 2/3/7 0 / 12 / 0 1 / 11 / 0 0 / 12 / *Количество растений – без симптомов вирусной инфекции / со средне выраженными симптомами / с сильно выраженными симптомами.
**Клетки таблицы, выделенные фоном – наиболее выраженное ослабление симптомов по сравнению с контролем.
По-видимому, толерантность к BNYVV в линиях, экспрессирующих BNYVVsil, была обусловлена индукцией механизма PTGS. Различие степени толерантности BNYVVsil-126.4 и BNYVVsil-139.17 может отражать количество трансгенных вставок в этих линиях (Табл. 1). Ранее была показана зависимость уровня устойчивости трансгенных растений к различным вирусам от количества вставок в геноме и накопления трансгенного транскрипта в клетках (Goodwin et al., 1996;
Pang et al., 1996;
McDonald et al., 1997;
Tennant et al., 2001). Гемизиготные и однокопийные растения, как правило, менее устойчивы к вирусам, чем гомозиготные растения и растения с несколькими копиями трансгена.
При наблюдении за инфицированными BNYVV трансгенными линиями, экспрессирующими BNYVVср, была зарегистрирована задержка развития симптомов инфекции вируса. Однако, в отличие от трансгенов BNYVVsil, в трансгенах BNYVVср задержка была более короткой (до 7 дней). Конструкции, содержащие ген БО BNYVV, ранее были использованы для трансформации N. benthamiana (Andika et al., 2005). Однако 18 из 19 полученных трансгенных линий Т1 не отличались от контроля по проявлению симптомов, и лишь у одной линии наблюдали задержку развития симптомов инфекции.
Таким образом, нами были получены модельные трансгенные растения Nicotiana benthamiana, экспрессирующие ген устойчивости к гербициду BASTA и потенциальный источник устойчивости к вирусу ризомании, двунитчатую форму генома Созданная генетическая конструкция 3’-НТО BNYVV.
pBI_BAR_BNYVVsil может найти применение для получения трансгенных растений сахарной свеклы, сочетающих толерантность к ризомании и устойчивость к гербициду. Наличие в селекционной линии двух генов позволяет ускорить селекционный процесс, исключая необходимость проведения дополнительных скрещиваний или трансформаций для сочетания двух признаков в одном генотипе.
ВЫВОДЫ 1. Сконструирован бинарный вектор pBI_BAR_BNYVVsil, несущий под контролем двух независимых 35S промоторов кДНК двухцепочечных инвертированных фрагментов 3’-НТО BNYVV, разделенных интроном ubi1, и кДНК гена bar.
2. Сконструирован бинарный вектор pBI_BAR_BNYVVcp, несущий под контролем двух независимых 35S промоторов вставку кДНК белка оболочки BNYVV и кДНК гена bar.
3. Методом транзиентной экспрессии конструкции «индуктора» (BNYVVsil) и «мишени» в растениях N. benthamiana дикого типа показано 30-кратное снижение экспрессии GFP, что указывает на возможность эффективной индукции сайленсинга двунитчатой формой 3’-НТО генома BNYVV.
4. Получены трансгенные растения N. benthamiana, трансформированные вектором pBI_BAR_BNYVVsil. В трансгенных линиях наблюдали экспрессию транскрипта BNYVVsil и продукта гена bar, РАТ, обеспечивающего устойчивость к гербициду BASTA.
5. Получены трансгенные растения N. benthamiana, экспрессирующие транскрипт гена белка оболочки BNYVV и РАТ продукт гена bar.
6. В гомозиготном поколении Т2 выделена толерантная линия BNYVVsil 126.4, обладающая частичной устойчивостью к инфекции BNYVV в условиях механической передачи вируса.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
Виноградова С.В., Камионская А.М., Ракитин А.Л., Аграновский А.А., 1.
Равин Н.В., Атабеков И.Г., Скрябин К.Г. Использование 3’-нетранслируемой области РНК геномов вируса некротического пожелтения жилок свеклы и вируса желтухи свеклы в качестве индукторов посттранскрипционного умолкания генов. // Доклады Академии Наук. 2011. Т. 439. № 6. С. 831–834.
Виноградова С.В., Камионская А.М., Зиновкин Р.А., Аграновский А.А., 2.
Скрябин К.Г. Использование технологии экспрессии в растениях кДНК гена белка оболочки вируса желтухи свеклы для получения трансгенной устойчивости. // Доклады Академии Наук. 2012. Т. 443. №2. С. 240-242.
3. Vinogradova S., Rakitin A., Kamionskaya A., Agranovsky A., Ravin N.
Development of strategy for pathogen-derived resistance in Nicotiana benthamiana to beet yellows and beet rhizomania viruses. // 9th International congress of plant pathology. Torino (Italy). 2008. P. 263.
Виноградова С.В. Трансгенные растения 4. Nicotiana benthamiana, экспрессирующие 3’-нетраслируемые области РНК вирусов желтухи и ризомании сахарной свеклы в качестве мишеней для посттранскрипционного умолкания генов. // Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Звенигород. 2008. С. 74-75.
5. Vinogradova S., Rakitin A., Kamionskaya A., Agranovsky A., Ravin N.
Transgenic Nicotiana benthamiana plants, expressing the 3’-untranslated RNA regions of Beet yellows virus and Beet necrotic yellow vein virus as targets for post transcriptional gene silencing. // 4th International Conference and Exhibition «RNAi2009: ncRNA: Bridging Biology and Therapy». Oxford (England, UK). 2009.
P. 17.
6. Vinogradova S., Rakitin A., Kamionskaya A., Agranovsky A., Ravin N.
Strategy for pathogen-derived resistance in Nicotiana benthamiana to Beet yellows virus and Beet necrotic yellow vein virus. // Proceeding of the 3rd International Symposium on Plant Protection and Plant Health in Europe. Crop Plant Resistance to Biotic and Abiotic Factors: Current Potential and Future Demands. Berlin (Germany). 2009. P. 262.
7. Vinogradova S., Rakitin A., Kamionskaya A., Agranovsky A. Expressing the BYV and BNYVV sequences to Induce PTGS-based resistance. // Programme and abstracts of the Inernational Conference «Plant transformation technologies II».
Vienna (Austria). 2011. P. 69.
Виноградова С.В. Использование технологии вирус-зависимой 8.
устойчивости для создания трансгенных растений, устойчивых к ризомании. // Тезисы докладов II международной школы-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». Москва-Звенигород. 2011. С. 28.
Виноградова С.В. Экспрессия фрагмента 3'-нетранслируемой области 9.
вируса некротического пожелтения жилок свеклы для индуцирования устойчивости к ризомании. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии». Москва. 2012 г. С. 89.