Нуклеозиддифосфаткиназа: особенности взаимодействия с наружной мембраной митохондрий и системой окислительного фосфорилирования
На правах рукописи
ВОИНОВА ВЕРА ВЛАДИМИРОВНА НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТКИНАЗА:
ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С НАРУЖНОЙ МЕМБРАНОЙ МИТОХОНДРИЙ И СИСТЕМОЙ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ 03.00.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2009
Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова
Научный консультант: доктор биологических наук Липская Татьяна Юрьевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна кандидат биологических наук Высоких Михаил Юрьевич
Ведущая организация: Российский университет дружбы народов минобрнауки РФ
Защита состоится 25 мая 2009 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В.
Ломоносова, д.1, стр. 12, Биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан апреля 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Медведева М.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В физиологических условиях нуклеозиддифосфаткиназа (НДФК, EC 2.7.4.6) катализирует реакции синтеза различных нуклеозидтрифосфатов (NTP) из ATP и соответствующих нуклеозиддифосфатов (NDP). Эти NTP служат непосредственным источником энергии для основных анаболических процессов и необходимы для построения молекул ДНК и РНК. Как следствие, НДФК принадлежит одна из центральных ролей в обеспечении нормальной жизнедеятельности живых организмов. В тканях обнаружены восемь изоформ НДФК, которые различаются тканевой специфичностью и внутриклеточной локализацией. В настоящее время известно, что НДФК участвует в регуляции таких важных процессов как клеточный цикл, подвижность и дифференциация клеток, метастазирование опухолей и апоптоз.
НДФК была одним из первых ферментов, для которых было показано, что каталитическая и регуляторная функции могут осуществляться независимо одна от другой.
В митохондриях гепатоцитов фермент был найден в наружном компартменте и в матриксе. В то время как физиологическая роль НДФК матрикса достаточно ясна, специфические функции НДФК наружного компартмента митохондрий до сих пор не известны, хотя активность этой НДФК достаточна для того, чтобы обеспечить близкую к максимальной скорость окислительного фосфорилирования.
Известно, что важнейшей функцией митохондрий в нормально функционирующих клетках является обеспечение клеток энергией. Однако наружная мембрана митохондрий представляет собой диффузионный барьер для заряженных молекул. Поскольку концентрация свободного ADP в цитоплазме клеток очень низка, потенциально наружная мембрана митохондрий могла бы лимитировать скорость внутриклеточного транспорта энергии.
Имеющиеся литературные данные свидетельствуют о том, что низкая проницаемость наружной мембраны для ADP в значительной степени преодолевается благодаря возникновению так называемого функционального сопряжения между активностью киназ наружного компартмента митохондрий и системой окислительного фосфорилирования. Для тканей с высоким уровнем энергетического метаболизма показано, что в функциональном сопряжении участвуют ферменты межмембранного пространства митохондрий – креатинкиназа и аденилаткиназа, а также ферменты, связанные на внешней поверхности наружной мембраны митохондрий - глицеринкиназа и гексокиназа (ГК). Благодаря возникновению функционального сопряжения, часть ADP, образованного в указанных киназных реакциях, прямо переносится в матрикс митохондрий, минуя стадию смешивания с ADP среды. Однако митохондрии печени не содержат креатинкиназу, а активности ГК и глицеринкиназы в них ничтожно малы по сравнению с активностью НДФК наружного компартмента.
Исследования, проведённые в нашей лаборатории ранее, указывают на локализацию НДФК на внешней поверхности наружной мембраны митохондрий (нмНДФК). Некоторые из процессов (например, злокачественный рост, апоптоз), в регуляции которых участвуют изоформы НДФК, протекают с участием ферментов, связанных с наружной митохондриальной мембраной. нмНДФК может быть одним из регуляторов этих и других процессов в наружном компартменте митохондрий.
Локализация на наружной митохондриальной мембране предполагает возможность обратимой солюбилизации нмНДФК. Очевидно, что солюбилизация фермента должна изменять его регуляторные свойства. Предыдущие исследования нашей лаборатории указывают на гетерогенность свойств нмНДФК.
В связи со сказанным изучение особенностей взаимодействия нмНДФК с наружной мембраной митохондрий и системой окислительного фосфорилирования представляется актуальной задачей.
Цель исследования: изучить особенности взаимодействия НДФК наружного компартмента митохондрий с наружной мембраной митохондрий и системой окислительного фосфорилирования.
Задачи исследования:
1. Получить дополнительные доказательства того, что все молекулы НДФК наружного компартмента митохондрий печени локализованы на внешней поверхности наружной мембраны митохондрий.
2. Выяснить природу сил взаимодействия НДФК наружного компартмента митохондрий с мембранами.
3. Выяснить, участвует ли НДФК наружного компартмента митохондрий печени в функциональном сопряжении с системой окислительного фосфорилирования.
4. Определить, какую долю от общей активности НДФК наружного компартмента митохондрий составляет активность молекул фермента, участвующих в функциональном сопряжении с системой окислительного фосфорилирования.
5. Исследовать природу гетерогенности свойств НДФК наружного компартмента митохондрий.
Научная новизна полученных результатов.
Доказана локализация НДФК наружного компартмента митохондрий на внешней поверхности наружной мембраны митохондрий.
Установлено, что нмНДФК связана с мембранами митохондрий преимущественно силами неионных взаимодействий.
Показано возникновение функционального сопряжения между активной нмНДФК и системой окислительного фосфорилирования.
Установлено, что в функциональное сопряжение вовлечено 22 – 24% активности всех молекул нмНДФК.
Установлено, что молекулы нмНДФК, не участвующие в функциональном сопряжении с окислительным фосфорилированием, могут обратимо солюбилизироваться с наружной мембраны митохондрий.
Установлено, что эта солюбилизируемая нмНДФК представлена двумя типами молекул, различающимися своими изоэлектрическими точками и молекулярной массой.
Практическая значимость работы. Настоящая работа является фундаментальным исследованием НДФК наружного компартмента митохондрий и открывает перспективы для выяснения роли нмНДФК во внутриклеточном транспорте энергии. Полученные нами результаты дают предпосылки к изучению механизмов, лежащих в основе участия НДФК наружного компартмента митохондрий в регуляции таких процессов, как диабет, программируемая клеточная смерть и канцерогенез.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2004» (Москва, 2004 г), 31 конгрессе Союза Европейских Биохимических Обществ (FEBS, Стамбул, Турция, 2006 г), XIV Европейской Конференции по Биоэнергетике (EBEC, Москва, 2006 г), XIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2006» (Москва, 2006 г), XVI Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (IT+M&Ec;, Гурзуф, Украина, 2008 г).
Публикации. Результаты исследования опубликованы в 3 статьях и тезисах научных докладов.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 219 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков и 15 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 570 источников.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение митохондрий. Митохондрии выделяли из печени белых крыс методом дифференциального центрифугирования (2000 – 10300 об./мин) так, как описано в работе (Липская Т.Ю., Воинова В.В., 2005).
Скорость дыхания митохондрий определяли полярографическим методом (Chance B., Williams G.R., 1955;
Estabrook R.W., 1967) с помощью полярографа LP 7e («Laboratorni Pristroje Praha», Чехословакия) и закрытого платинового электрода Кларка. Основная среда инкубации полярографического опыта содержала 85 мМ KCl, 110 мМ маннит, 0,1 мМ ЭГТА, 20 мМ Tris-HCl, pH 7,4, мМ фосфат калия, 3 мМ MgCl2, 5 мМ сукцинат калия.
Определение скорости окислительного фосфорилирования, а также активностей НДФК и гексокиназы полярографическим методом. Среда инкубации полярографического опыта дополнительно содержала: при определении активности НДФК 1 мМ АТР (субстрат CDP) или 300 мкМ АТР (субстрат UDP);
при определении активности ГК – 1 мМ АТР и 5 мМ глюкозу.
Киназную реакцию начинали добавлением 600 мкМ CDP, 300 мкМ UDP или ~0, единиц/мл ГК соответственно. Скорость фосфорилирующего дыхания в нг-ат.
О/мин на 1мг белка находили как разность скоростей дыхания сразу после добавления 170 мкМ ADP (или во время киназной активности) и после того, как весь ADP был фосфорилирован (или до начала киназной реакции). Скорость окислительного фосфорилирования, а также активности НДФК и ГК находили, умножая соответствующую скорость фосфорилирующего дыхания на величину отношения ADP/О. В наших экспериментах средняя скорость окислительного фосфорилирования ADP была равна 359 ± 37 (n = 49) нмоль ADP/мин на 1 мг белка.
В большинстве экспериментов активность НДФК (и других киназ) характеризовали процентным отношением скорости фосфорилирующего дыхания во время активности фермента (VNDP для НДФК) к скорости фосфорилирующего дыхания после добавления 170 мкМ ADP (VADP).
Удаление цитохрома с из митохондрий проводили по методу Jacobs и Sanadi (Jacobs E.E., Sanadi D.R., 1960).
Определение связанной с мембранами активности нмНДФК. Из хранившейся во льду исходной суспензии осадков митохондрий периодически отбирали пробы и центрифугировали. В суспензиях полученных осадков полярографическим методом определяли оставшуюся активность нмНДФК.
Полярографические эксперименты в присутствии креатинкиназы. Среда инкубации полярографического опыта дополнительно содержала 1 мМ ATP, 6, мМ креатинфосфат, а также: 20 мкМ AP5A (в опытах с активной НДФК);
20 мкМ AP5A и 5 мМ глюкозу (в опытах с активной ГК).
В полярографическую ячейку вносили 0 37,5 единиц/мл мышечной креатинкиназы (КК) и митохондрии, регистрировали скорость дыхания. Через 1, мин в пробы делали добавку, инициирующую соответствующую киназную реакцию, и регистрировали дыхание митохондрий ещё 1 мин.
Обработка проб после полярографического эксперимента. Из полярографической ячейки отбирали пробу, и останавливали реакцию добавлением HClO4. Через 60 мин хранения во льду пробу центрифугировали, супернатант нейтрализовали K2CO3 и определяли в нём содержание участников креатинкиназной реакции, глюкозо-6-фосфата и CTP.
Влияние рН на прочность взаимодействия нмНДФК с мембранами митохондрий. Получали несколько одинаковых осадков митохондрий. Каждый суспендировали в одной из сред, не различавшихся ионной силой и осмотической концентрацией, но имевших разную величину рН. Суспензии инкубировали 2 или 4,8 ч, затем центрифугировали. В суспензиях полученных осадков полярографическим методом определяли оставшуюся активность нмНДФК.
Обращение солюбилизации нмНДФК. Исходную суспензию осадка митохондрий делили на равные части. Через определённое время к одной из них добавляли 3,33 мМ MgCl2 или заранее подобранное количество Tris, которое повышало рН буфера с 6 до 8. Периодически в каждой суспензии определяли общую и связанную с мембранами активность нмНДФК.
Электрофорез белков. Исходный осадок митохондрий суспендировали в среде, содержащей 280 мМ маннит, 2,1 мМ HEPES, рН 7,4, инкубировали 1 – 10 ч, затем центрифугировали. Электрофорез белков, солюбилизированных с поверхности митохондрий, проводили в неденатурирующих условиях в аппарате Protean III (Bio-Rad). Изоэлектрофокусирование проводили в геле, содержащем 5% Т, 3,3% С и 2% амфолины (Servalite, рН 2 – 11). Нативный электрофорез проводили по методу Ornstein и Davis для кислых белков (Ornstein L., 1964;
Davis B.J., 1964). Градиентный электрофорез проводили в геле с градиентом плотности акриламида и метилен бисакриламида от 7% Т, 0,9% С до 30% Т, 0,7% С.
Отдельные дорожки гелей после окончания электрофореза окрашивали по активности НДФК. Реакционная среда объёмом 5 мл содержала 150 мМ HEPES, рН 7,4, 10 мМ MgCl2, 0,6 мМ ЭДТА, 6 мМ глюкозу, 0,5 мМ ADP, 0,6 мМ NADP+, 1 мМ CTP, ~1,3 единиц активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, ~16 единиц активности ГК, 0,004% (w/v) феназинметасульфат и 0,04% (w/v) нитросиний тетразолий. Окрашивание проводили в течение 40 мин при 37 в темноте.
Результаты статистической обработки представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка для указанного в подписях к рисункам и таблицам числа измерений (n).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Локализация НДФК в наружном компартменте митохондрий. Известно, что цитохром с (цит. с) связан с наружной поверхностью внутренней мембраны митохондрий электростатическими силами и легко солюбилизируется из митохондрий с повреждённой наружной мембраной в солевой среде. В митохондриях печени крысы цит. с участвует во всех реакциях электронного транспорта. Его солюбилизация приводит к снижению скорости дыхания, которая может быть восстановлена добавлением к среде цит. с в низкой концентрации. В настоящее время анализ эффектов добавленного цит. с на дыхание митохондрий является наиболее чувствительным и надёжным тестом на целостность наружной митохондриальной мембраны.
В эксперименте суспензию митохондрий в 0,28 М манните, 2,1 мМ HEPES, рН 7,4 инкубировали во льду в течение 10 ч. Затем суспензию центрифугировали для удаления активности НДФК, солюбилизировавшейся во время хранения.
Осадок промывали в 0,15 М KCl для удаления цит. с из митохондрий с повреждёнными наружными мембранами и подвергали полярографическому исследованию. Было найдено, что за 10 ч хранения из митохондрий солюбилизировалось более чем 90% активности НДФК (не показано). На рис. 1, а, б видно, что в присутствии FCCP цит. с не увеличивал скорость дыхания таких митохондрий, но он стимулировал дыхание митохондрий, наружная мембрана которых была повреждена в результате гипотонической обработки (рис. 1, в). Из этих опытов мы сделали вывод, что вся солюбилизированная активность НДФК была связана с внешней поверхностью наружной мембраны митохондрий.
Рис. 1. Солюбилизация цит. с во время хранения митохондрий. а) – Исходная суспензия митохондрий после 10 ч хранения во льду;
б) – суспензия митохондрий после 10 ч хранения и промывания в 0,15 М KCl;
в) – суспензия митохондрий после предварительной гипотони ческой обработки в 0,015 М KCl и промывания в 0,15 М KCl. Где указано, были добавлены 0,5 мкМ FCCP и мкг цит. с. Представлены результаты одного из двух аналогичных экспериментов.
Природа сил взаимодействия нмНДФК с мембранами. При изучении функционального сопряжения активности нмНДФК с окислительным фосфорилированием важно было иметь уверенность, что во время опыта нмНДФК прочно связана с наружной мембраной митохондрий. Для того чтобы найти условия выделения и хранения митохондрий, удовлетворяющие этому требованию, мы изучили природу сил взаимодействия нмНДФК с мембранами. С этой целью исследовали зависимость солюбилизации нмНДФК от концентрации KCl в среде промывания (рис. 2).
На рис. 2 видно, что повышение ионной силы среды промывания и хранения митохондрий увеличивало прочность связи нмНДФК с мембранами. Мы сделали вывод, что ионные взаимодействия не играют существенной роли в связывании фермента с мембранами митохондрий. Мы установили, что замена K+ на Na+ не влияла на прочность взаимодействия нмНДФК с мембранами (не показано).
Следовательно, влияние K+ и Na+ было обусловлено неспецифическим действием ионной силы на связывание фермента.
Рис. 2. Влияние концентрации KCl в среде промывания митохондрий на прочность связи нмНДФК с мембранами. Осадки митохондрий суспендировали в средах промывания, содержащих указанные количества KCl, 2,1 мМ HEPES, pH 7,4 и маннит до суммарной осмотической концентрации 280 мосМ. Через 1 ч суспензию центрифугировали и определяли в осадках оставшуюся активность нмНДФК.
За 100% принимали отношение VCDP/VADP, найденное для митохондрий, инкубированных в среде промывания, содержащей 140 мМ KCl (в этих опытах это отношение было равно 69,0 ± 0,9%). За 0% принимали отношение VCDP/VADP, найденное для митохондрий, инкубированных в среде с низкой ионной силой (это отношение было равно 34,5 ± 0,2%). n=2.
Присутствие Mg2+ в среде хранения митохондрий способствовало прочному связыванию нмНДФК с мембранами. Можно было предположить, что Mg2+ непосредственно участвует в связывании фермента. Однако промывание митохондрий при рН 8,0 в присутствии 1 мМ ЭДТА не вызывало дополнительную солюбилизацию нмНДФК (не показано). Мы сделали вывод, что Mg2+ не участвует напрямую в связывании нмНДФК с мембранами.
Солюбилизация нмНДФК из митохондрий, хранившихся в разных средах. Исследовали функциональные характеристики и скорость солюбилизации нмНДФК из митохондрий, хранившихся в средах, содержавших 2,1 мМ HEPES, рН 7,4, а также: 280 мМ маннит (среда с низкой ионной силой);
140 мМ KCl (среда с высокой ионной силой);
3,33 мМ MgCl2 и 270 мМ маннит (среда с Mg2+).
Основные функциональные характеристики митохондрий сразу после их получения и через 5 – 8 ч хранения практически не различались (не показано).
Следовательно, условия выделения и хранения митохондрий не оказывали какого-либо воздействия на их дыхательный аппарат. Однако прочность связи нмНДФК с мембранами в анализируемых препаратах существенно различалась (рис. 3, кривые 2). Из митохондрий, хранившихся в среде с низкой ионной силой, нмНДФК легко солюбилизировалась, в среде с высокой ионной силой солюбилизация фермента происходила медленнее, а в среде с Mg2+ 90% активности нмНДФК оставались связанными с мембранами в течение 6 ч. Суммарная активность солюбилизированной и связанной с мембранами нмНДФК практически не изменялась во времени (кривые 1), хотя исходно она была разной величины, поскольку часть нмНДФК солюбилизировалась в процессе выделения митохондрий. Доля Рис. 3. Солюбилизация нмНДФК при утраченной при выделении хранении митохондрий в разных средах.
Митохондрии промывали и хранили: (а) - в активности нмНДФК определялась среде с низкой ионной силой;
(б) - в среде с высокой ионной силой;
(в) - в среде с Mg2+.
солюбилизирующим эффектом среды Относительная активность нмНДФК: (1) общая;
(2) – связанная с мембранами. (а, б) - промывания.
Результаты отдельных экспериментов;
(в) средние результаты трёх независимых экспериментов.
Поскольку в среде с Mg2+ связанная с мембранами активность нмНДФК оставалась на постоянном высоком уровне в течение 6 ч (рис. 3, в, кривая 2), мы использовали этот препарат в опытах по изучению функционального сопряжения активности нмНДФК с окислительным фосфорилированием.
Функциональное сопряжение активности нмНДФК с окислительным фосфорилированием. На рис. 4. представлены схемы трёх ферментных систем, использованных в опытах. В первой системе (рис. 4, а) донором ADP для окислительного фосфорилирования служила нмНДФК, связанная на внешней поверхности наружной мембраны митохондрий, а в двух других системах – не способные связываться с мембранами дрожжевая гексокиназа (дГК) (рис. 4, б) и дрожжевая НДФК (дНДФК) (рис. 4, в). Роль внешней ADP-потребляющей системы, конкурирующей за ADP с системой окислительного фосфорилирования, играла мышечная КК.
Рис. 4. Три экспериментальные модели, использованные в работе. ВМ и НМ – внутренняя и наружная мембраны митохондрий соответственно, ММП – межмембранное пространство. Кр – креатин, КрФ – креатинфосфат, Гл – глюкоза, Гл-6-Ф – глюкозо-6 фосфат, дГК – дрожжевая ГК, дНДФК – дрожжевая НДФК.
На рис. 5 представлены результаты измерения скорости дыхания митохондрий в присутствии возрастающих количеств КК в двух ферментных системах: с нмНДФК (рис. 4, а) и с дГК (рис. 4, б). В отсутствие КК добавление 600 мкМ CDP вызывало такую же стимуляцию дыхания, как и добавление предварительно подобранного количества дГК, то есть активности нмНДФК и дГК в экспериментальных системах были равны (рис. 5). Однако при увеличении количества добавленной КК скорость дыхания в системе с активной нмНДФК снижалась медленнее, чем в системе с активной дГК (рис. 5, кривые 1 и 2 соответственно). В присутствии 20,5 ед./мл КК скорости дыхания митохондрий в обеих системах достигли минимума и далее практически не менялись. В этих условиях активность КК в 60–100 раз превышала максимальную скорость окислительного фосфорилирования.
Рис. 5. Зависимость скорости дыхания митохондрий печени от активности КК.
Среда инкубации полярографического опыта дополнительно содержала 1 мМ ATP, 6,2 мМ КФ, 20 мкМ AP5A (кружки), а также 5 мМ глюкозу (треугольники). (1) – скорость дыхания после добавления CDP;
(2) – скорость дыхания после добавления дГК;
( и 4) – скорости дыхания митохондрий до добавления CDP или дГК соответственно.
n=3.
Трудность работы с нмНДФК заключалась в том, что в состав сопряженной ферментной системы, используемой для определения концентрации ADP спектрофотометрическим методом, входит пируваткиназа, которая не обладает строгой субстратной специфичностью по отношению к нуклеотидам и может, наряду с ADP, потреблять другие присутствующие в среде субстраты нмНДФК. По этой причине мы не могли напрямую определить концентрацию ADP в пробах, содержащих CDP, спектрофотометрическим методом. Однако применение КК в полярографическом опыте позволило нам решить эту проблему.
Поскольку креатинкиназная реакция легко обратима, в пробах полярографического опыта при условии избытка активности КК по сравнению с активностью другой киназы и скоростью окислительного фосфорилирования устанавливалось квазиравновесие креатинкиназной реакции. В системе с дГК мы определяли концентрации всех участников креатинкиназной реакции и находили величину отношения их действующих масс (Г = [ADP] · [КФ] / [ATP] · [Кр]) (табл. 1) которая при активности КК 20,5 ед./мл была равна кажущейся константе равновесия этой реакции. Найденная величина кажущейся константы равновесия креатинкиназной реакции хорошо соотносится с данными литературы (например, Lawson J.W., et al., 1979;
Lipskaya T.Yu., et al., 1989). В наших опытах активности дГК и нмНДФК были равны, следовательно, в условиях квазиравновесия креатинкиназной реакции отношение действующих масс её участников в этих системах также должно было быть одинаковым. В системе с нмНДФК определяли концентрации креатина, креатинфосфата и АТР, и, зная величину кажущейся константы равновесия, рассчитывали концентрацию ADP.
В наших опытах субстрат дыхания (сукцинат) и Pi присутствовали в избытке. В этих условиях скорость дыхания митохондрий зависела от концентраций ADP и ATP в среде (Kunz W., et al., 1981). В присутствии избытка активности КК во время работы нмНДФК остаточная скорость дыхания митохондрий была равна 21% исходной, а во время активности дГК – 7% (табл. 1), хотя наружная концентрация ADP и отношение ATP/ADP в обеих системах достоверно не различались (табл. 1).
Таблица 1. Параметры, характеризующие состояние квазиравновесия креатинкиназной реакции во время активности дГК и нмНДФК.
Скорость фосфорилирующего дыхания - КК + КК Активный Г = [ADP]·[КФ]/ ADP, нмоль О2/мин нмоль О2/мин фермент /[АТР]·[Кр] мкМ АТР/ADP на 1 мг белка % на 1 мг белка % дГК 0,0259 ± 0,002 (10) 3,22 ± 0,49 (11) 288 ± 36 (11) 73,3 ± 5,6 (3) 100 5,3 ± 0,5 (12) нмНДФК --- 3,16 ± 0,25 (10) 311 ± 0,25 (10) 72,4 ± 5,4 (3) 100 15,0 ± 0,8 (12) Примечание. Расчёт по результатам трёх опытов. В присутствии КК результаты усреднены для проб, в которых концентрация КК была равна 20,5 – 34,1 ед./мл. В скобках – число измерений.
При сравнении активности нмНДФК и дНДФК в присутствии избытка активности КК установлено, что остаточная скорость фосфорилирующего дыхания во время активности нмНДФК составила 23% исходной, а во время активности дНДФК – только 3% (в опытах с дНДФК нмНДФК была предварительно солюбилизирована с поверхности митохондрий).
Полученные результаты свидетельствуют о возникновении функционального сопряжения между нмНДФК и системой окислительного фосфорилирования во время их активности. Насколько нам известно, эти результаты для нмНДФК получены впервые.
Доля активности нмНДФК, сопряженной с окислительным фосфорилированием. Все ли молекулы нмНДФК принимают участие в функциональном сопряжении с окислительным фосфорилированием? На рис. видно, что в ходе хранения митохондрий в среде с высокой ионной силой за 5 ч доля активности связанной с мембранами нмНДФК значительно уменьшилась (рис. 6, кривая 2). Однако доля фосфорилирующего дыхания, нечувствительного к присутствию избытка активности КК, была постоянной и составила ~17% скорости окислительного фосфорилирования (рис. 6, кривая 3).
Рис. 6. Доля нмНДФК, участвующая в функциональном сопряжении с окислительным фосфорилированием. Среда инкубации полярографического опыта дополнительно содержала 1 мМ ATP, 20 мкМ АР5А (1 и 2), а также 6,2 мМ КФ, 22, ед./мл КК (3) и 5 мМ глюкозу (4). (1 – 3) – скорость дыхания после добавления CDP;
(4) – скорость дыхания после добавление дГК. (1, 3, 4) Исходная суспензия митохондрий;
(2) суспензия осадка митохондрий после переосаждения в среде хранения. (кривые 13) n = 6;
(кривая 4) n = 3. За 100% принимали исходную скорость фосфорилирующего дыхания VADP=85,3 ± 10,0 нмоль О2/мин на 1 мг белка.
Такая же доля нечувствительного к присутствию избытка активности КК фосфорилирующего дыхания была получена при хранении митохондрий в среде с Mg2+ (не показано), хотя в течение 5 ч хранения практически вся нмНДФК оставалась связанной с мембранами (рис. 3, в).
Мы сделали вывод, что в функциональном сопряжении участвует только небольшая доля наиболее прочно связанных с мембранами митохондрий молекул нмНДФК, активность которых составила 22 – 24% общей активности фермента. Мы предполагаем, что в функциональное сопряжение вовлечены те молекулы нмНДФК, которые локализованы в области контактных участков поверхностных мембран митохондрий, где они связаны с порином или находятся поблизости от него.
В наших опытах 10% декстран не влиял на функциональное сопряжение между активностью нмНДФК и окислительным фосфорилированием, хотя он увеличивал функциональное сопряжение между активностью мАК и окислительным фосфорилированием в митохондриях, хранившихся в среде без Mg2+ (не показано).
Обращение солюбилизации нмНДФК. Мы предположили, что солюбилизация молекул нмНДФК, не участвующих в сопряжении с окислительным фосфорилированием (см. рис. 6, кривая 2), функционально значима и может происходить in vivo. В таком случае солюбилизация нмНДФК должна быть обратимой. Добавление Mg2+ к митохондриям, хранившимся в течение 30 мин в среде с низкой ионной силой, вызывало обращение солюбилизации нмНДФК, при этом связанная с мембранами активность нмНДФК возрастала до 86% от максимальной. Однако обращение солюбилизации было неустойчивым, и доля мембраносвязанного фермента через короткое время снижалась (не показано). Мы предположили, что неполное обращение солюбилизации нмНДФК связано с активностью протеолитических ферментов – катепсинов. Для проверки этого предположения в среду промывания и хранения митохондрий добавили 50 мкМ лейпептин ингибитор сериновых и цистеиновых протеиназ (рис. 7). Контрольные опыты показали, что лейпептин не влиял на скорость солюбилизации нмНДФК во время хранения митохондрий (не показано).
На рис. 7 видно, что нмНДФК быстро солюбилизировалась (кривая 2).
Добавление 3,33 мМ MgCl2 к митохондриям, промытым и хранившимся в присутствии 50 мкМ лейпептина (кривая 3) приводило к устойчивому обращению солюбилизации нмНДФК, при этом мембраносвязанная активность фермента увеличилась до 90% максимальной.
Рис. 7. Влияние лейпептина на обращение солюбилизации Mg2+.
нмНДФК добавлением Одинаковые осадки митохондрий промывали и хранили в среде с низкой ионной силой (кружки) - без лейпептина;
(ромбы) - с добавлением 50 мкМ лейпептина. 3,33 мМ MgCl был добавлен к суспензиям с лейпептином через 1 ч после получения препарата митохондрий.
Относительная активность нмНДФК:
(1) - общая;
(2) – связанная с мембранами. Представлены результаты одного из трёх аналогичных экспериментов.
Обратимость солюбилизации нмНДФК позволяет предположить, что аналогичный процесс может также протекать in vivo. В таком случае нмНДФК можно отнести к группе так называемых «непостоянных» периферических мембранных белков (Goi F.M., 2002).
Прочность связи нмНДФК с мембранами зависела от рН среды хранения (рис. 8). При кислых значениях рН фермент был менее прочно связан с мембранами, чем при щелочных. При этом часть молекул нмНДФК, активность которых составила ~ 20 % максимальной активности нмНДФК наружного компартмента, оставалась нечувствительной к действию рН. Дополнительные эксперименты показали, что уменьшение доли ассоциированной с мембранами активности нмНДФК в средах с кислым значением рН не было следствием инактивации фермента при этих значениях рН (не показано) и действия катепсинов (рис. 8).
Мы предположили, что солюбилизацию нмНДФК под влиянием рН можно обратить смещением рН среды хранения митохондрий в щелочную сторону. В этих экспериментах для ингибирования катепсинов использовали Е-64 необратимый ингибитор цистеиновых протеиназ, суммарный заряд которого равен нулю. В качестве неспецифического субстрата для катепсинов к митохондриям добавляли БСА. На рис. 9, кривая 1, показана активность нмНДФК, связанная с мембранами митохондрий, промытых и хранившихся в среде с высокой ионной силой в присутствии 1 мМ MgCl2, при рН 8,0. В митохондриях, промытых и хранившихся в такой же среде при рН 6,0 в присутствии или без ингибиторов катепсинов, нмНДФК быстро солюбилизировалась (рис. 9, кривая 2).
Рис. 8. Влияние рН среды промывания и хранения митохондрий на солюбилизацию нмНДФК. Митохондрии промывали и хранили при указанных значениях рН в среде, содержащей 10 мМ MES (рН 6,0 – 7,0) или 10 мМ HEPES (рН 7,0 – 8,6), а также (1) – 140 мМ KCl, мМ MgCl2, 75 мкМ лейпептин, (2 - 4) – маннит до суммарной осмотической концентрации мосМ, KCl до суммарной ионной силы 0,009, (3) – 50 мкМ лейпептин.
(1 - 3) - Встряхивание в термомиксере – 2 ч;
(4) - 4,8 ч.
Кривые 1 и 2 - субстрат UDP, кривые 3 и 4 - субстрат CDP. На кривых 1 и разными значками обозначены результаты отдельных экспери ментов. (2 и 4) - Результаты одного эксперимента.
Через 2 ч хранения митохондрий при рН 6,0 к суспензиям добавили заранее подобранное количество 1М Tris, которое повышало рН среды хранения митохондрий до рН 8,0 (рис. 9, кривые 3 – 5). В присутствии смеси Е 64 и БСА обращение солюбилизации нмНДФК (рис. 9, кривая 5) происходило до уровня максимальной активности фермента при рН 8,0 (рис. 9, кривая 1).
Таким образом, мы установили, что нмНДФК, солюбилизированная при кислых значениях рН, не теряет способности обратно связываться с мембранами митохондрий в присутствии ингибиторов протеиназ и БСА (рис. 9).
Рис. 9. Обращение солюбилизации нмНДФК изменением рН среды хранения. Среда промывания и хранения митохондрий содержала 140 мМ KCl, 1 мМ MgCl2 и (1) – 10 мМ HEPES, рН 8,0;
(2 - 5) – 10 мМ MES, рН 6,0;
а также:
(треугольники) - 10 мг/мл БСА, (ромбы) – мкМ Е-64, (квадраты) – БСА и Е-64, (кружки) – без добавок. (3 – 5) - Через 2 ч после получения осадка митохондрий к суспензиям добавили Tris (черные символы). (1) – общая относительная активность нмНДФК, (2 – 5) – связанная с мембранами. Пояснения – в тексте.
Принято считать, что рН цитоплазмы клеток печени равен 7,1-7,2 (Shapiro J.I., et al., 1990;
Vidal G., et al., 1998). На рис. 8, кривая 1, видно, что при физиологических концентрациях ионов К+ и Mg2+ при указанных значениях рН связывание нмНДФК с мембранами митохондрий близко к максимально возможному. Следует, однако, учесть, что измерение рН цитоплазмы сталкивается с существенными трудностями. Некоторые авторы считают, что действительный рН цитоплазмы клеток ниже, чем это принято думать. Если это так, то во время протекания многих как физиологических, так и патологических процессов, например, интенсивной мышечной работе, голодании, гипоксии, ишемии, диабете, сопровождающихся ацидозом, изменения внутриклеточного рН могут эффективно изменять долю связанных с наружной мембраной митохондрий молекул нмНДФК.
Гетерогенность свойств солюбилизированной нмНДФК. Исследовали экстракт белков с поверхности митохондрий в среде с низкой ионной силой с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях. После окончания электрофореза отдельные дорожки геля окрашивали по активности НДФК.
После изоэлектрофокусирования трёхчасового экстракта белков с поверхности митохондрий в геле сформировался линейный градиент рН в диапазоне от 3,5 до 9 (не показано). При окрашивании по активности НДФК проявились две полосы с изоэлектрическими точками 5,1 (более интенсивная) и 5,5 (не показано).
Дальнейшие эксперименты показали, что число полос и соотношение интенсивности их окраски не зависели от присутствия лейпептина в среде промывания и хранения митохондрий, прединкубации белкового экстракта с субстратами НДФК (MgADP и MgATP) и времени экстрагирования белков с поверхности митохондрий (не показано). Полученные результаты позволили сделать вывод, что появление двух полос с активностью НДФК на электрофореграмме не было обусловлено действием катепсинов на молекулы нмНДФК и различной степенью фосфорилирования молекул фермента. Мы также сделали вывод, что две фракции нмНДФК, присутствующие в экстракте, солюбилизировались одновременно.
Рис. 10. Нативный электрофорез экстракта белков с поверхности митохондрий в градиенте плотности полиакрил амидного геля. (1) Маркёрные белки;
(2) экстракт белков с поверхности митохондрий, содержащий 0,19 ед. активности нмНДФК;
(3) - 0,19 ед. активности дНДФК. Окрашивание: (1) Coomassie brilliant blue R-250;
(2 и 3) - по активности НДФК.
Нативный электрофорез в линейном градиенте плотности полиакриламидного геля (рис. 10) показал, что кажущаяся молекулярная масса дНДФК (рис. 10, дорожка 3) была равна 126 кДа, что хорошо соотносится с литературными данными для гексамера НДФК (Lacombe M.L., et al. 2000). На электрофореграмме экстракта белков с поверхности митохондрий проявились две полосы (рис. 10, дорожка 2). Полоса с кажущейся молекулярной массой кДа имела более интенсивную окраску, чем полоса 132 кДа (дорожка 2).
Мы предположили, что в экстракте белков с поверхности митохондрий нмНДФК может находиться в виде свободного гексамера или в комплексе с белком с кажущейся молекулярной массой ~ 70 кДа.
ВЫВОДЫ 1. Получены доказательства того, что вся НДФК наружного компартмента митохондрий локализована на внешней поверхности наружной митохондриальной мембраны.
2. Установлено, что прочность связи нмНДФК с мембранами митохондрий повышается с увеличением ионной силы и рН среды хранения митохондрий, а также в присутствии ионов Mg2+ и не зависит от присутствия ЭДТА.
3. При изучении функционального сопряжения активности нмНДФК с системой окислительного фосфорилирования установлено, что в присутствии избытка активности мышечной КК нмНДФК более эффективно поставляет ADP для системы окислительного фосфорилирования, чем дНДФК и дГК.
4. Установлено, что в функциональном сопряжении с системой окислительного фосфорилирования участвует 22 – 24% активности нмНДФК.
5. Установлено, что солюбилизация из митохондрий нмНДФК, не участвующей в функциональном сопряжении, обратима. В зависимости от условий хранения митохондрий, солюбилизация может быть обращена добавлением Mg2+ или повышением рН среды хранения.
6. В экстракте белков с поверхности митохондрий присутствуют две фракции, обладающие нуклеозиддифосфаткиназной активностью и различающиеся кажущимися величинами молекулярных масс (132 и 204 кДа) и изоэлектрическими точками (5,1 и 5,5), соответственно.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Воинова В.В. (2004) Роль нуклеозиддифосфаткиназы наружного компартмента митохондрий печени в переносе ADP через наружную мембрану митохондрий. XI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2004», Москва, 12 - 15 апреля, издательство МГУ, 22-23.
2. Липская Т.Ю., Воинова В.В. (2005) Функциональное сопряжение между нуклеозиддифосфаткиназой наружного компартмента митохондрий и окислительным фосфорилированием, Биохимия, 70, 1646-1655.
3. Воинова В.В. (2006) Характер взаимодействия нуклеозиддифосфаткиназы наружного компартмента митохондрий с наружной митохондриальной мембраной и особенности её функционального сопряжения с системой окислительного фосфорилирования. XIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2006», Москва, 12 – 15 апреля, МАКС-пресс, 47-48.
4. Voinova V.V., Lipskaya T.Yu. (2006) The role of nucleoside diphosphate kinase in ADP transport across the outer mitochondrial membrane, 31st FEBS Congress Molecules in Health and Disease, Istanbul, Turkey, 24 – 29 June, FEBS journal, 273, supplement 1, 59.
5. Voinova V.V., Lipskaya T.Yu. (2006) Some characteristics of functional coupling between nucleoside diphosphate kinase of the outer mitochondrial compartment and oxidative phosphorylation, XIV European Bioenergetics Conference, Moscow, Russia, 22 – 27 July, BBA, EBEC 2006 short reports, 14, 353-354.
6. Липская Т.Ю., Воинова В.В. (2008) Нуклеозиддифосфаткиназа митохондрий: характер взаимодействия с наружной митохондриальной мембраной и доля активности, функционально сопряженной с окислительным фосфорилированием, Биохимия, 73, 395-407.
7. Воинова В.В, Липская Т.Ю. (2008) Особенности свойств и функций нуклеозиддифосфаткиназы наружного компартмента митохондрий, XVI Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" IT+M&Ec;, Гурзуф, Украина, 31 мая – 9 июня, издательство МЭСИ, 226 – 228.
8. Липская Т.Ю., Воинова В.В. (2009) Обратимость солюбилизации нуклеозиддифосфаткиназы с поверхности наружной мембраны митохондрий, Биохимия, 74, 710-720.