авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Диссипотрофные бактерии ксилотрофного сообщества в пресноводных экосистемах

На правах рукописи

Зайчикова Марина Викторовна ДИССИПОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ КСИЛОТРОФНОГО СООБЩЕСТВА В ПРЕСНОВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ Специальность 03.02.03-микробиология

Научный консультант:

д. б. н. Л. В. Васильева

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена в лаборатории реликтовых микробных сообществ Учреждения Российской академии наук института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научный руководитель: доктор биологических наук Л.В. Васильева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С.С. Беляев кандидат биологических наук Т.Г. Добровольская

Ведущая организация: Центр экологии и продуктивности лесов РАН

Защита диссертации состоится « » апреля 2011 г. в на заседании диссертационного совета Д 002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н.

Виноградского РАН по адресу 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, к. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан » марта 2011г.

«

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк Актуальность проблемы.

Большая часть территории России находится в бореальной зоне, для которой характерна обильная лесная растительность и гумидный тип климата с преобладанием осадков над испарением. В таких условиях происходит формирование лесо-болотных экосистем, являющихся областью водосбора для большей части пресноводных водоемов этой зоны (реки, озера, болота), со специфической для каждого водоема омброфильной микробиотой [Заварзин, 2009]. Микрофлора озер, которые представляют собой конечные внутриконтинентальные водоемы стока, подробно изучена сотрудниками лаборатории Кузнецова [Горленко, Дубинина, 1977;

Кузнецов, Дубинина, 1989].

Бактериальное разнообразие сфагновых болот, как важнейшего компонента гидрологической сети, интенсивно изучается многими исследователями [Добровольская, 2002;

Заварзин, Дедыш, 2008].

В лесо-болотных экосистемах основным источником органического вещества является древесина. Масштабы процесса разложения древесного отпада на территории России составляют, по данным Замолодчикова, 254.87 Мт Сорг, что соответствует ежегодному приросту леса по балансу углерода [Кудеяров и др., 2007]. Формирование водной среды в лесо-болотных экосистемах происходит на основе ультрапресной дождевой воды. В условиях избыточного увлажнения за счет дождевого питания и разложения органического вещества, образующегося в процессе деструкции древесины, формируются кислые темноокрашенные дистрофные воды.

Деструкцию древесины, представляющей собой сложный лигно-целлюлозный комплекс, осуществляют различные группы древоразрушающих грибов (ксилотрофов), которые гидролизуют ее с образованием CO2, а также различных органических соединений [Рипачек, 1967;

Рабинович, 2001]. В водных экосистемах основными деструкторами древесины являются аскомицеты и несовершенные грибы, относящиеся к группам Deutermycota, Ascomycota и Oomycota [Терехова, 2007].

В настоящее время неизвестно, какие группы диссипотрофных бактерий характерны для ультрапресных кислых дистрофных вод лесо-болотных местообитаний на начальной стадии разложения древесины, при которой концентрация легкодоступных питательных веществ невысока. Г.А. Заварзиным была предложена схема трофических взаимоотношений микроорганизмов в процессе деградации древесины, нуждающаяся в проверке. С этой целью были созданы лабораторные модели (микролизиметры), позволяющие смоделировать в условиях промывного режима твердофазный гидролиз древесины ели ксилотрофным сообществом грибов на начальной кислой стадии разложения [Заварзин, Заварзина, 2009].

Цель работы.

Изучение в лабораторной модели омброфильного микробного сообщества ультрапресной кислой дистрофной воды, формирующейся в процессе деструкции древесины ели ксилотрофными грибами, и выяснение роли бактерий в утилизации продуктов гидролиза.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

Выделение чистых культур омброфильных бактерий, характерных для 1.

ультрапресных кислых дистрофных вод.

Изучение морфо-физиологических особенностей и определение таксономического 2.

положения выделенных бактерий.

Определение экофизиологических характеристик бактерий промывных 3.

гумифицированных вод.

Выяснение функциональной роли выделенных микроорганизмов в трофической 4.

группировке омброфильных диссипотрофных бактерий дистрофных вод.

Научная новизна.

Установлено существование диссипотрофной группировки бактерий, которая использует продукты гидролиза древесины ксилотрофным сообществом, и определена ее роль в формировании дистрофных вод.

Выделены и исследованы диссипотрофные бактерии ультрапресных кислых гумифицированных вод, выявлены их основные характеристики.

Подготовлено полное таксономическое описание трех новых видов ацидотолерантных омброфильных диссипотрофных бактерий в составе родов Ancylobacter, Xanthobacter и Singulisphaera как представителей экофизиологической группировки омброфилов.

На основании экофизиологических особенностей микроорганизмов определено их положение в трофической системе ксилотрофного мико-бактериального сообщества.



Научно-практическое значение.

Создана коллекция омброфильных диссипотрофных бактерий, характерных для начальной стадии разложения древесины, включающая представителей класса Alphaproteobacteria и планктомицетов.

Установлено, что выделенные из сообщества новые виды бактерий родов Ancylobacter, Xanthobacter и Singulisphaera могут рассматриваться как потенциальные продуценты полисахаридов, перспективных для пищевой и медицинской биотехнологии. Выделен экзополисахарид, и проводится тестирование для определения возможности его практического применения в ветеринарии.

Установлена возможность использования ряда выделенных умеренно ацидофильных микроорганизмов в качестве индикаторных форм для определения первой стадии грибной сукцессии разложения древесины и формирования дистрофных вод.

Выявлен механизм деацидификации дистрофных вод: бактерии, используя метаболиты гидролитиков, способствуют переходу кислой стадии в нейтральную.

Апробация работы.

Материалы, вошедшие в работу, были представлены на следующих конференциях:

1. V Международная конференция «Вулканизм и биосфера и экологические проблемы» (Туапсе, октябрь 2009). «Диссипотрофные бактерии, развивающиеся в сообществе с грибами-ксилолитиками».

2. Всероссийская научная конференция с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», посвященная 75-летию со дня рождения основателя кафедры физиологии микроорганизмов профессора М.В.Гусева (Москва, май 2009);

«Бактерии диссипотрофы, развивающиеся в сообществе с грибами-ксилолитиками в ультрапресных условиях».

3. II международная конференция по природоведческой, промышленной и прикладной микробиологии «BioMicroWorld 2009» (Лиссабон, декабрь 2009);

«Dissipotrophic bacteria, which develop in community with xylolytic fungi in the ultrafresh conditions».

4. V Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, ИНМИ РАН ноябрь 2009).

«Диссипотрофные бактерии ксилотрофного сообщества в пресноводных экосистемах».

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ (из них статей – 4, тезисов на конференциях - 4).

Структура диссертации.

Диссертация состоит из разделов: Введение, Литературный обзор, Объекты и методы исследований, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы.

Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, включает 33 рисунка и таблиц;

список литературы содержит 122 наименования, из них 43 на русском и 79 на английском языке.

Место проведения работы и благодарности.

Работа выполнена в лаборатории реликтовых микробных сообществ на базе УРАН института им. С.Н. Виноградского с 2007 по 2010 годы под руководством д.б.н. Л.В.

Васильевой. Исследованные изоляты микроорганизмов выделены при участии д.б.н.

Л.В. Васильевой. Определение филогенетического положения изолятов проводилось к.б.н. В.Н. Акимовым (Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино).

Автор выражает благодарность д.б.н., академику РАН Г.А. Заварзину за постановку задачи и предоставление исходного материала, д.б.н. Л.В. Васильевой, к.б.н. Ю.Ю.

Берестовской и к.б.н. Т.А. Панкратову за поддержку и советы на протяжении всего процесса работы.

Работа выполнена при финансировании в рамках программ Президиума РАН «Научные основы сохранения биоразнообразия России»;

«Изменение окружающей среды и климата. Природные катастрофы» в направлении «Изменение природных вод под влиянием деятельности микроорганизмов»;

«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (госконтракт с Роснаукой № 02.740.11.0023).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Объект исследования Объектом исследования было микробное сообщество дистрофных вод, сформированных в процессе деструкции древесины ели в лабораторных моделях (микролизиметрах). Микролизиметры состояли из двух отделений. В верхней влажной камере находились куски древесины ели, а под пористой пластинкой дистиллированная вода. Основание древесины было погружено в воду.

Микролизиметры были закрыты крышками. В замкнутом пространстве микролизиметров, по мере осуществления твердофазной ферментации древесины ксилотрофными грибами, конденсационная влага стекала с древесины и захватывала продукты её гидролиза, что приводило к формированию под пористой пластинкой гумифицированной дистрофной воды.

Разложение древесины осуществляли грибы-ксилотрофы, среди которых были идентифицированы представители родов: Aspergillus ustus, Penicillium decumbens, Penicillium sp., Paecilomyces sp., Trichoderma harzianum, Cladosporium sp (определено к.б.н. Семеновой Т.А., МГУ).

Микроорганизмы выделены на ультрапресной агаризованной среде, содержащей: мл/л солей Хатнера в качестве минеральной основы [Cohen-Bazire, 1957], 10 мл/л культуральной жидкости грибов в качестве источника углерода и энергии и 0.05 г/л дрожжевого экстракта в качестве фактора роста. Для подавления роста грибов использовали нистатин в концентрации 500000 ед/л.

Микроскопические исследования Морфологию клеток изучали в световом микроскопе с фазовым контрастом (“Amplival”, Германия), а также электронном микроскопе (“JEM-100С”, Япония), используя негативно-окрашенные препараты клеток и ультратонкие срезы. Клетки контрастировали 1% раствором уранилацетата. Для получения ультратонких срезов клетки предварительно фиксировали глутаровым альдегидом с последующей дофиксацией осмиевой кислотой на какодилатном буфере. Образцы заливали в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB и окрашивали цитратом свинца с докрашиванием 3% водным раствором уранилацетата.

Определение экофизиологических характеристик Спектр субстратов, используемых микроорганизмами, определяли на жидкой ультрапресной разбавленной среде, содержащей 1, 5 или 20 мл/л раствора солей Хатнера. Электропроводность среды при этом составляла от 150-200 до 930 мкС соответственно. В качестве субстратов исследовали: сахара – арабинозу, ксилозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, маннозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, раффинозу, ксилан;

целлобиозу, рамнозу, трегалозу;

спирты – арабит, глицерин, сорбит, маннит;

соли органических кислот – формиат, ацетат, бутират, пропионат, пируват, фумарат, сукцинат, оксалат, оксалоацетат, цитрат, малат, бензоат;

первичные спирты - метанол, этанол;

аминокислоты:

- метилаланин, глутамат, лейцин, цистеин, аспартат;

метиламины.

Рост бактерий оценивали по изменению оптической плотности (ОП600) клеточной суспензии на спектрофотометре «UNICO 2100» и по интенсивности дыхания.

Интенсивности дыхания определяли по изменению количества углекислого газа в экспериментальных флаконах с использованием инфракрасного СО2-анализатора «INFRALIT-4» (GUNKALOR-DESAU), Германия.

Диапазон рН роста микроорганизмов исследовали в интервале значений 3.0–8.0. рН в пределах значений 3.0-4.8 получали, подкисляя основную среду 0.1 N раствором HCl до нужного рН, а значения 4.8-8.0 получали, добавляя 0.05 М растворы Na2HPO4 и KH2PO4.

рН измеряли на рН-метре-иономере «Эксперт 001» (Россия).

Температурные пределы роста изучали в интервале 2-42°С.

Зависимость роста выделенных бактерий от содержания NaCl в среде исследовали в пределах концентраций 0.2–30.0 г/л.

Электропроводность среды измеряли кондуктометром HI 8733(HANNA instrument Srl, Italy).

Способность к литоавтотрофному росту оценивали по изменению оптической плотности клеточной суспензии (ОП600) и потреблению водорода при культивировании клеток в жидкой среде с газовой фазой Н2 : О2 : СО2 в соотношении (7 : 2 : 1). Водород измеряли на газовом хроматографе «ЛХМ-80» с катарометром. Разделение проводили на колонке, заполненной молекулярным ситом 5А.





Нитрогеназную активность определяли ацетиленовым методом на полужидкой безазотистой среде NFb с малатом натрия (1 г/л) [Dobereiner, 1980].

Наличие гена nifH в ДНК проводили с использованием двух праймерных систем, разработанных для гена nifH: F1/R6 и PolF/PolR[Марусина и др 2001;

Poly et al., 2001].

Принадлежность пигмента штамма Z-0055 к группе каротинов или ксантофиллов определяли с помощью метода фазового разделения каротиноидов [Davis 1965].

Способность культур к росту на разных источниках азота проверяли с использованием неорганических солей: сульфата аммония, нитрата калия, нитрита, мочевины, а также аминокислот: фенилаланина, метионина, серина, тирозина, валина, лизина, аспартата, триптофана, глутамата.

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам: линкомицину, ампициллину, неомицину, гентамицину, стрептомицину (10 мкг), новобиоцину, хлорамфениколу, канамицину (30 мкг), устанавливали по размеру зоны отсутствия роста клеток вокруг тест-дисков с антибиотиками (“Oxoid”) на агаризованной среде.

О наличии каталазной активности судили по образованию пузырьков кислорода при воздействии на клетки 3% раствором перекиси водорода;

наличие оксидазы - по изменению цвета колонии при нанесении на нее реагента REF–55635, Merieux.

Состав жирных кислот (ЖК) в липидах бактерий определяли на хроматографе Microbial Identification System (Sherlok) фирмы “MIDI Inc.” (Newark, США) в соответствии с методикой [Stead et al, 1992]. Идентификацию разделенных ЖК проводили на масс-спектрометре Agilent Technologies AT-5971 SMART.

Молекулярно-генетические исследования Выделение и очистку ДНК, определение Г + Ц в составе ДНК проводили по стандартным методикам [Лысенко А.М. и др, 1988].

Для определения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК ДНК выделяли фенольным методом. Амплификацию гена 16S рРНК проводили с универсальными эубактериальными праймерами 27f и 1492r на приборе GeneAmp PCR System (“Applied Biosystems”, США). Секвенирование амплифицированного фрагмента гена 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (“Beckman Coulter”, США) в соответствии с инструкцией производителя. Для нахождения штаммов, близкородственных исследуемым, использовали банк генов национального центра биологической информации (NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Построение филогенетического дерева для каждого штамма производили с помощью пакета программ TREECON.

Результаты исследований 1. Бактериальное разнообразие дистрофных вод микролизиметра В процессе разрушения древесины ксилотрофным сообществом грибов формировались дистрофные кислые воды. Характеристика воды микролизиметра ко времени отбора проб (через 550 суток инкубации): цветность ОП450 - 0.144;

рН - 4.3;

электропроводность - 140 мкС (Рис. 1).

Увеличение электропроводности совпадало с появление неорганических солей:

хлоридов, сульфатов и фосфатов в количестве (мг/л) 2.16;

1.2;

4.5 соответственно.

Общее количество солей было на уровне единиц мг/л, что свидетельствовало об ультрапресности дистрофной воды. На этой стадии деструкции органические кислоты:

ацетат, пропионат, бутират, изо-бутират;

а также спирты: метанол, этанол, и бутанол не были обнаружены в водной фазе микролизиметра.

Прямое микроскопическое исследование образцов дистрофных вод из лабораторной модели позволило установить в них наличие микробного сообщества, состоящего из разнообразных по морфологии бактерий (Рис. 2).

Рис. 1. Изменение физико химических условий в микролизиметре в процессе деструкции древесины ели ксилотрофным сообществом грибов и формирование кислых дистрофных вод.

1- ОП450;

2 – рН;

3- электропроводность.

Из этого сообщества в чистые культуры были выделены 10 различных штаммов. Для выделенных чистых культур была определена нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК, и установлено, что штаммы принадлежат к 8-ми родам: роду Ancylobacter (штамм Z-0056), Xanthobacter (штамм Z-0055), Seliberia (штамм Z-0043), Methylobacterium (штаммы Z-0033 и Z-0046), Singulisphaera (штаммы Z-0071 и Z-0072), роду Spirosoma (штамм Z-0088), Hyphomicrobium (штамм Z-0045) и Pseudomonas (Z 0044). Из них штаммы Z-0055, Z-0056, Z-0071Т и Z-0072, как показано ниже, представляют собой новые виды.

Рис. 2. Разнообразие микроорганизмов дистрофной воды, сформированной на начальной стадии разложения древесины ели.

1.1. Характеристика новых видов бактерий, выделенных из исследуемого сообщества Ancylobacter abiegnus sp. nov. штамм Z- abiegnus. Gr. f abies – ель;

M.L. masc. abiegnus - еловый.

На основании анализа гена16S рРНК штамм Z-0056 отнесен к роду Ancylobacter (Рис.

3). Род Ancylobacter, входит в семейство Xanthobacteriaceae, порядка Rhizobiales, класса Alphaproteobacteria и к настоящему моменту включает 5 узаконенных видов: A.

aquaticus, A. rudongensis, A. polymorphus и A. vacuolatus и A. oerskovii.

Клетки штамма Z-0056 имеют кокковидную форму, неподвижные, плеоморфные, размером 0.65 - 0.9 мкм (Рис. 4а). Обладают фимбриями. Размножаются неравномерным делением. В процессе деления формируются палочковидные клетки длиной 1.35-1. мкм, которые распадаются на две неравные клетки. Спор не образуют. Газовые везикулы отсутствуют. Клеточная стенка грамотрицательного типа (Рис. 4б).

Колонии круглые, до 4 мм в диаметре, выпуклые, слизистые, плотные с ровным краем, молочного цвета.

Микроорганизм является облигатным аэробом. В качестве источника углерода и энергии использует органические кислоты: ацетат, сукцинат, цитрат, малат, оксалат, глюконат, а также ксилозу и ксилан. Не использует С1-соединения, моно- и дисахариды, аминокислоты, не растет хемолитоавтотрофно. Микроорганизм является олиготрофом.

Концентрация субстрата в среде, при которой сохраняется типичная морфология клеток, не превышает 0.25 г/л. Нуждается в дрожжевом экстракте (0.05 г/л).

Штамм Z-0056 рос в пределах температур 15-25С с оптимумом роста при 20С.

Организм является умеренно ацидофильным и растет в диапазоне рН 4.0-8.0 c оптимумом при рН 5.5.

Рис. 3. Филогенетическое 0. древо, показывающее A. polymorphus 85 положение Ancylobacter 65 abiegnus sp. nov. штамм Z A. aquaticus среди типовых 94 A.vacuolatus штаммов родов Starkeya и “A. dichloromethanicum” Ancylobacter A. rudongensis “A. oxalaticus” Ancylobacter abiegnus sp. nov.

(штамм Z-0056) S.sp. ORS S. novella S. koreensis Rhodoplanes roseus Бактерия чувствительна к NaCl: содержание NaCl в среде выше 1.0 г/л подавляло рост клеток. Типовой штамм устойчив к новобиоцину, хлорамфениколу, линкомицину и ампициллину, но чувствителен к стрептомицину, неомицину и гентомицину.

Каталазо- и оксидазоположителен. Не способен к фиксации молекулярного азота.

Основные жирные кислоты (%): С18:17 (11-октадеценовая) – 72.5;

С19cyc (циклопропан нонадекановая) – 15.86;

С16:0 (гексадекановая) – 7.91. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 66.8 мол. %.

Рис. 4. Электронно микроскопическая фотография (а) и ультратонкий срез (б) клетки Ancylobacter abiegnus sp. nov.

ф - фимбрии;

кс – клеточная стенка;

цпм – цитоплазматич.

мембрана.

Фенотипические особенности A. abiegnus sp. nov. Z-0056T: узкий температурный диапазон роста и более низкий температурный оптимум роста, чувствительность к содержанию NaCl в среде, ацидотолерантность, неспособность к метилотрофному росту, наличие в составе жирных кислот 9-октадеценовой кислоты (С18:19), показали его значительное отличие от других видов рода Ancylobacter и близкородственного ему рода Starkeya (Таблица 1). Наибольший уровень сходства нуклеотидной последовательности гена, кодирующего 16S pPHK – 98.3%, штамм Z-0056 продемонстрировал с видом A.

oerskovii, что позволило описать его в составе рода Ancylobacter, а наличие четких фенотипических отличий от A. oerskovii – в качестве нового вида этого рода с присвоением видового названия - A. abiegnus sp. nov. Z-0056T.

Типовой штамм Z-0056Т (ВКМ В- 2563).

Xanthobacter xylophilus sp.nov. штамм Z- xy.lo ’phi.lus. Gr. n. xylon wood;

Gr. n. philos friend;

M.L. masc. xylophilus friend of wood.

Семейство относится к порядку класса Xanthobacteraceae Rhizobiales Alphaproteobacteria. Род Xanthobacter объединяет в своем составе виды X. autotrophicus, X. flavus, X. agilis, X. tagetidis, X. aminooxidans и X. viscosus. Штамм Z-0055 имеет примерно одинаковые уровни сходства по 16S pPHK со всеми видами рода Xanthobacter - от 96.0 % до 97.0 %. Все виды в составе рода имеют между собой уровни сходства по 16S pPHK выше 96.0 %, а пары видов X. flavus и X. aminoxidans, а также X. autotrophicus и X. viscosus - выше 99 %. Т.о., штамм Z-0055 обособлен от других видов рода Xanthobacter и, возможно представляет собой новый вид в составе рода Xanthobacter (Рис. 5).

0. Рис. 5. Филогенетическое X. flavus положение штамма Z – 0055 в X. aminoxidans составе рода Xanthobacter.

X. agilis Xanthobacter xylophilus sp.nov (штамм Z-0055) X. tagetidis X. viscosus X. autotrophicus (X94201) Rhodoplanes roseus Клетки штамма Z-0055 имеют овальную форму, размером 0.4 х 0.7 мкм (Рис. 6а).

Размножаются неравномерным делением. Перед делением формируется подковообразная клетка размером 0.4-0.7х 0.8-1.2 мкм, распадающаяся на две овальные.

Клетки не образуют капсулы, неподвижны. Клеточная стенка грамотрицательного типа (Рис. 6б).

Бактерия образует мелкие колонии диаметром до 2-х мм, округлой формы, с ровным краем, выпуклые, слизистые, плотные, оранжевого цвета за счет наличия пигмента каротина.

Таблица 1. Дифференцирующие признаки для штамма Z-0056Т и представителей рода Ancylobacter и Starkey Штамм Z-0056 А. aguaticus А.rudongensi A.oerskovii A. polymorphus A.vacuolatus S.koreensis S. novella Т NS05T DSM 101T DSM 2457T DSM 1277T AS 1.1761T KCTC 12212T DSM 506T Форма клеток Кокки Палочки Палочки Палочки Палочки Палочки Палочки Палочки Размер клеток, мкм 0.65-0.9 0.5-0.6 0.9- 0.3-1 1-3 0.8-1.0 0.8-1.0 0.6-0.8 0.4-0.8 1.2-2.0 0.4-0.8 0.8-2. 1. Диапазон рН роста Н/о 4.8-8.0 6.8-7 4.5-11.0 5.5-11.0 5.5-10.0 6.5-8.5 5.7-9. рН опт н/о 5.5 7 7.0 7.0 6.8-7.0 7.0-8.0 7. Диапазон Т° С роста Выше 4 и ниже 15-25 40 5-43 4-37 4-45 4-40 10- Т°опт 20 30 22-37 28-30 28-30 28-30 28-30 25- Содержание Г + Ц, 66.8 68 66.3-67.7 65.5 65.5 68.2 69 67.3-68. мол. % Нитрогеназная - - - + + + - активность NaCl в среде, % Н/о 0-0.1 0-4.0 0-3.0 0-2.5 0-5.0 0-3. Автотрофный рост - - + - - - + + Рост на С1 - + + + + + + + соединениях Галактоза Н/о Н/о Н/о Н/о - + + + Фукоза Н/о Н/о - + - + - Арабиноза Н/о Н/о - + - - + + Манноза Н/о - + - - - - Глюкоза - + + + + + + + Мальтоза Н/о Н/о - - + + - Глицерин Н/о Н/о Н/о - + - + + Сорбит Н/о Н/о - + - + + + Ацетат Н/о Н/о Н/о Н/о Н/о Н/о Н/о + Ксилоза Н/о н/о + -/+ +\- + + + Штамм Z-0055 является облигатным аэробом. Для роста необходим дрожжевой экстракт (0,05 г/л). В качестве источника углерода и энергии использует сукцинат, цитрат, оксалат, глюконат;

из углеводов только ксилан и ксилозу. Не использует в качестве источников углерода и энергии моно-, ди-, полисахариды, сахароспирты, аминокислоты. Оптимальная концентрация субстрата в среде 0.025% (Рис. 7). Не растёт литоавтотрофно. Не способен к фиксации молекулярного азота.

0.5 мкм Рис. 6. Электронно микроскопическая фотография (а) и ультратонкий срез (б) клеток Xanthobacter xylophilus sp.nov (штамм Z-0055).

КС – клеточная стенка;

ЦПМ – цитоплазматическая мембрана;

Н– нуклеоид.

а б Растет в присутствии линкомицина, новобиоцина, ампициллина, хлорамфеникола, неомицина, гентомицина. Канамицин и стрептомицин подавляют рост.

Область роста рН 4.8 – 6.8 с оптимумом при рН 5.5. Мезофил с оптимумом роста при Т 200С и температурным интервалом роста 10 – 280С. Клетки выдерживают содержание NaCI в среде не выше 1.5 г/л. Каталазо- и оксидазоположителен. Содержание Г + Ц в ДНК для штамма Z-0055 составляет 63.6 мол.%.

Рис. 7.

Интенсивность дыхания клеток Xanthobacter xylophilus sp.nov.

штамм Z-0055 при росте на различных концентрациях сукцината У штамма Z-0055 обнаружены существенные отличия от других видов рода Xanthobacter по фенотипическим признакам, что позволяет описать его в качестве нового вида в составе рода Xanthobacter - X. xylophilus sp. nov. Типовой штамм Z-0055т (= ВКМ В-2535).

Экофизиологические особенности штамма Z–0055: преимущественное использование органических кислот-продуктов жизнедеятельности ксилотрофных грибов, низкие концентрации используемых субстратов, ацидотолерантность, чувствительность к низким концентрациям NaCl в среде, позволяют считать его представителем группы диссипотрофов, развивающихся в кислых дистрофных водах и относящихся к трофической мико-бактериальной группировке.

Singulisphaera mucilagenosa sp. nov. штаммы Z-0071Т и Z-0072.

Mu.ci.la.ge.`ge.no.sa – L. n. fem. mucilage слизь, genosa L. fem. adj. порождающая, mucilagenosa- N.L. fem. adj. производящая слизь.

Семейство Planctomycetaceae, входит в порядок Planctomycetales и в настоящее время содержит 9 родов: Planctomyces, Pirellula, Gemmata, Isosphaeara, Schlesneria, Singulisphaera, Zavarzinella, Rhodopirellula, Blastopirellula. Планктомицеты имеют ряд существенных цитологических отличий от других представителей домена Bacteria:

отсутствие пептидогликана в клеточной стенке, наличие гликопротеина;

цитоплазма разграничена на компартменты, окруженные мембраной [Ward et al., 2006].

Клетки штаммов Z-0071T и Z-0072 грамотрицательные, кокковидной формы, неподвижные, одиночные или в парах, размером 0.95-1.8 мкм (Рис. 8а). Обладают фимбриями, покрыты слизью (Рис. 8б). На поверхности клетки присутствуют кратеровидные структуры. Размножаются почкованием.

Колонии круглые, до 4 мм в диаметре, выпуклые, с ровным краем, слизистые, непрозрачные, гладкие, молочно-палевого цвета. Консистенция густая.

Микроорганизм является облигатным аэробом. Способен к росту в микроаэрофильных условиях. В качестве источника углерода и энергии использует N-ацетилглюкозамин, лактат и углеводы: арабинозу, фруктозу, глюкозу, маннозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, ксилозу, трегалозу. Не способен к росту на органических кислотах: ацетате, сукцинате, цитрате, малате, оксалате, глюконате. Не использует С1-соединения, не растёт хемолитоавтотрофно. Способен к гидролизу полисахаридов ксилана и целлюлозы (только штамм Z-0071T), но не пектина и декстрина. Нуждается в дрожжевом экстракте в качестве фактора роста (0.1 г/л). Штаммы не росли на безазотистой среде. В качестве источника азота бактерии использовали сульфат аммония, лейцин, глутамат, тирозин, треонин, серин, аланин, дрожжевой экстракт, пептон, N-ацетилглюкозамин. Нитрат, нитрит, мочевину, триптофан, монометиламин, триметиламин не использовали.

Оба штамма каталазо- и оксидазоположительны. Типовой штамм устойчив к новобиоцину, но чувствителен к канамицину, стрептомицину, неомицину, хлорамфениколу, линкомицину, гентомицину, ампициллину. Чувствительность к ампициллину необычна для планктомицетов, поскольку антибиотики пенициллинового ряда являются ингибиторами синтеза пептидогликановой клеточной стенки, которой планктомицеты не имеют, что объясняет их устойчивость к данному антибиотику.

Область рН роста 4.0–7.5 с оптимумом при рН 6.0-6.5. Мезофил с оптимумом роста при 25-28°С и температурным интервалом роста 4–30°С. Клетки выдерживают содержание NaCl в среде не выше 5 г/л.

Рис. 8. Электронно б а микроскопическая фотография (а) и ультратонкие срезы (б) КС – клеточная стенка;

ВЦМ – внутренняя цитоплазматиче ская мембрана;

П-парифоплазма;

Н – нуклеоид;

СК – слизистая капсула;

К – кратеровидные структуры.

Маркер – 0.5 мкм.

0. 92 Singulisphaera mucilagenosa sp. nov Т Рис. 9.

100 Singulisphaera acidiphila Филогенетическое “Nostocoida limicola” III древо, Isosphaera pallida (AJ231195) 100 показывающее Gemmata-like JW3-8s положение Gemmata obscuriglobus Singulisphaera Gemmata-like JW10-3f mucilagenosa sp.

Zavarzinella formosa nov штамм Z Rhodopirellula baltica 0071Тсреди Blastopirellula marina типовых и Pirellula staleyi X81946) референтных Planctomyces maris (AJ231184) Planctomyces brasiliensis штаммов, а также Planctomyces limnophilus некоторых других Schlesneria paludicola представителей “Phycisphaera mikrensis” семейства “Candidatus Kuenenia stuttgartiensis” Planctomycetaceae.

“Candidatus Brocadia anammoxidans” “Candidatus Scalindua wagneri” “Candidatus Scalindua brodae” Chlorobium limicola Основные жирные кислоты (%): С16:0, С18:19, С18:2 6с,12с. Основной хинон - менахинон МК-6. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 51.2 мол. %.

Штаммы Z-0071 и Z-0072 имеют идентичные нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и имеют по данному гену 94.3% сходства с типовым штаммом ближайшего вида Singulisphaera acidiphila MOB10T. По совокупности фенотипических и филогенетических признаков штаммы Z-0071 и Z-0072 описаны в качестве нового вида рода Singulisphaera - Singulisphaera mucilagenosa sp. nov. с типовым штаммом Z- (ВКМ В-2626) (Рис 9). Типовой штамм Z-0071Т (= ВКМ В-2626).

Несмотря на то, что новые организмы были выделены из ультрапресных условий, оба штамма продемонстрировали толерантность к содержанию минеральных солей в среде в широком диапазоне электропроводности 145-1760 мкС, а также способность к использованию как низких, так и высоких концентраций субстрата, что свидетельствует об их высокой адаптационной способности к разным условиям среды.

1.2. Другие представители бактериального сообщества дистрофных вод.

Seliberia sp. штамм Z-0043.

Из дистрофных вод микролизиметра был выделен штамм Z-0043, клетки которого по своей морфологии сходны с клетками олиготрофного обитателя пресных вод Seliberia stellata. Бактерия имеет характерный спиралевидный рельеф поверхности, клетки представляют собой грамотрицательные тонкие палочки размером 0.35-0.4 х 0.5-1. мкм. Штамм Z-0043 формирует розетки как обязательный этап жизненного цикла (Рис.

10б,в,г).

Микроорганизм размножается ассиметричным поперечным делением с образованием мелких клеток. Клетки не образуют капсулы, подвижны, имеют один субполярно расположенный жгутик (Рис. 10а). Адгезивный материал образуется на полюсе, противоположном жгутику (Рис. 10б). Цикл развития и морфология штамма Z- аналогичны морфологии и циклу развития Seliberia stellata.

Клетки формировали мелкие, 2-4 мм в диаметре, круглые колонии с ровным краем, выпуклые, слизистые, плотные, молочно-белого цвета.

Штамм Z-0043 является облигатным аэробом. Для роста необходим дрожжевой экстракт (0.05 г/л). В качестве источника углерода и энергии использует сукцинат, малат, ацетат пропионат, оксалат, формиат, из углеводов ксилан, ксилозу, арабинозу, лактозу, мальтозу, маннозу. Не использует другие моно-, ди- и полисахариды, сахароспирты, аминокислоты, азотистые соединения. Не растёт литоавтотрофно. Не способен к фиксации азота.

Штамм является ацидотолерантным с оптимумом роста при рН 5.5- 6.5 и пределами рН роста 4.3 – 7.0. Мезофил, с оптимумом роста при Т 250С и температурным интервалом роста 19 – 330С. Клетки выдерживают содержание NaCl в среде не выше 10 г/л. Каталазо- и оксидазоположителен. Содержание Г+Ц в ДНК для штамма Z-0043 составляет 61. мол.%.(Таблица 2).

Рис. 10. Морфология и жизненный цикл клеток Seliberia sp. штамм Z-0043. Маркер 0.5 мкм.

Анализ рРНК продемонстрировал сходства нуклеотидной 16S 99.9% Т последовательности гена с типовым штаммом CDC B91-007286 вида Afipia broomea.

Afipia broomea, условно патогенный микроорганизм, выделенный из слизистых оболочек человека, имеет существенные фенотипические отличия от штамма Z-0043 [Brenner et al., 1991]. Морфологически штамм CDC B91-007286Т представляет собой палочки, не образующие розеток. Оптимум температурного рота 28-30°С, способен к росту при 37°С. В отличии от штамма Z-0043 не используют ацетат, лактозу, мальтозу (Таблица 2).

Не является олиготрофом, оптимальный рН 6.8.

Таблица 2. Дифференцирующие признаки для представителей рода Afipia и Seliberia Признак Штамм Z- Afipia broomeae Seliberia stellata Источник Человеческая слюна, Пресноводные Пресноводные выделения лимфа. местообитания местообитания и почва Морфология палочки Спиралевидные Спиралевидные клеток палочки палочки Образование Не образуют Формирует розетки Формирует розетки как розеток как обязательный обязательный этап этап жизненного жизненного цикла цикла Топт. 28-30°С 20-25°С 20-25°С рН опт н/д 6.8 5.5-6. Рост при 37°С + - Олиготрофия - + + Г+Ц, мол.% 61.5 61.2 63- Субстраты ксилоза (+) + + лактоза - + + ацетат - + + мальтоза - + + Spirosoma sp. штамм Z- В соответствии с данными анализа последовательности гена 16S рРНК, штамм Z- наиболее близок к Spirosoma escalantus. Род Spirosoma входит в состав семейства Cytophagaceae, порядка Sphingobacteriales, класса Sphingobacteria. Сходство составляет 97.8 % (Рис. 11).

Рис. 12.

Электронная микрофотография (а, б) и ультратонкое строение (в) клеток Spirosoma sp. штамм Z-0088.

Обнаруженный уровень сходства последовательностей исследуемого штамма с видами S. navajo, S. linguale и S. escalantus, свидетельствует о том, что штамм Z-0088, возможно, является новым видом в составе рода Spirosoma.

Клетки штамма Z-0088 грамотрицательные, подковообразной формы, неподвижные, одиночные или в парах (Рис. 12). Могут образовывать спирально закрученные нити.

Обладают слизистой капсулой. Размножаются делением. Клетки образуют непрозрачные ярко-желтые колонии 4-5 мм в диаметре, слизистые, вязкой консистенции. Колонии имеют округлую форму, ровный край, плоский профиль.

Рис. 11.

Филогенетическое древо, показывающее положение штамма Z-0088 среди представителей рода Spirosoma.

Штамм использует узкий спектр органических субстратов для роста: ксилан, инулин, ксилозу, сахарозу, N-ацетилглюкозамин. Микроорганизм не способен к росту на органических кислотах: ацетате, сукцинате, цитрате, малате, оксалате, глюконате. Не использует С1-соединения, не растёт хемолитоавтотрофно. Оптимальная концентрация субстрата 0.05% (Рис. 13). Нуждается в витаминах и дрожжевом экстракте (0.1 г/л).

Штамм не рос на безазотистой среде.

Рис. 13. Интенсивность дыхания клеток Spirosoma sp. штамм Z 0088 при росте на различны концентрациях ксилозы.

Каталазо- и оксидазоположителен. Диапазон роста рН для Z-0088 составляет 4.3 -7.5.

Оптимальный рН - 5.5-6.5. Микроорганизм является мезофильным с температурным оптимумом роста 28°С, и диапазоном 13-35°С. Клетки чувствительны к NaCl и выдерживают его содержание в среде не выше 10 г/л.

Methylobacterium isbiliense штаммы Z-0033 и Z- Из мико-бактериального сообщества выделена факультативно метилотрофная бактерия Methylobacterium isbiliense. Организм представлен двумя штаммами: Z-0033 и Z-0046, которые продемонстрировали сходство 99% по последовательности гена 16S рРНК с типовым штаммом Methylobacterium isbiliense - AR24T Фенотипические особенности штаммов Z-0033, Z-0046 и AR24T представлены в Таблице 4.

Рис. 14.

Морфология клеток штаммов Z- (а,б) и Z-0046 (в) Маркер 0.5 мкм.

Клетки штамма Z-0033 крупные, размером 0.8-1.1 х 1.05-1.95 мкм, имеют форму коротких закругленных палочек, размножаются делением, подвижны за счет наличия жгутика, имеют газовые везикулы (Рис. 14а,б).

Капсулы отсутствуют. Клеточная стенка грамотрицательного типа. Клетки образуют мелкие, 2-4 мм в диаметре, кирпично-красные, округлые, с ровным краем, непрозрачные, выпуклые, блестящие колонии.

Таблица 3. Сравнительная характеристика штаммов Methylobacterium isbiliense, выделенных из ксилотрофного мико-бактериального сообщества, и типового штамма AR24T.

Штамм Z-0033 Штамм Z-0046 Methylobacterium isbiliense (AR24T) Наличие пигмента + - + Размер 1.05-1.95х 0.8-1.1 1.15-1.8х 0.95-1.27 1-1.3х2- Диапазон рН н/д 4.8-7.0 4- Подвижность + + + рНопт н/д 6.5 6- Температурный диапазон 15-28°С 19-33°С 20-37°С Топт 20°С 25°С 28°С Чувствительностьк NaCl 0.25% 0.7% 1% субстраты метанол - + + монометиламин н/д - + формиат + + + ацетат - - + сукцинат - - + лактат - - + глюконат + - + сахароза + - фруктоза + - глюкоза + + сорбитол + - глутамат - - + Г+Ц, мол.%. 69 67 69-69. Штамм Z-0033 является облигатным аэробом. В качестве субстрата для роста использует формиат, сахарозу, фруктозу, глюкозу, арабинозу, пируват, сахароспирты (манит, сорбитол), оксалат. Не растет на этаноле, метаноле, бутирате, бензоате, аминокислотах, мочевине, триметиламине и метиламине. Нуждается в витаминах.

Пределы роста рН от 4.8 – 7.0, оптимальный рН 5.5-6.0. Оптимальная температура роста 20°С, диапазон роста 15-28°С. Содержание NaCl в среде выше 2.5 г/л подавляет рост клеток. Оксидазо-, каталазоположительный.

Бактерия чувствительна к стрептомицину, но не к ампициллину, новобиоцину, неомицину, гентамицину, канамицину.

Содержание Г + Ц в ДНК для штамма Z-0033 составляет 69 мол.%.

Клетки штамма Z-0046 яйцевидные, размером 0.95-1.27 х 1.15-1.8 мкм, подвижны за счет жгутика (Рис. 14в). Клетки образуют круглые, до 5 мм в диаметре, выпуклые, слизистые, непрозрачные, гладкие колонии белого цвета с ровным краем. Консистенция густая.

Штамм Z-0046 является облигатным аэробом и факультативным метилотрофом. В качестве источников углерода использует C1–соединения: метанол, формиат, монометиламин, а также глюкозу. Не растет на органических кислотах, аминокислотах, углеводах. Оксидазо- и каталазоположительный. Температурный диапазон роста: 19 33°С, Т опт - 25°С. Выдерживает содержание NaCl в среде не выше 0.7 %. Содержание Г + Ц в ДНК – 67 мол.%.

Микроорганизм чувствителен к стрептомицину, но не чувствителен к ампициллину, новобиоцину, неомицину, гентамицину, канамицину.

Сравнение штаммов Z-0033 и Z-0046 с типовым штаммом Methylobacterium isbiliense AR24T показывает, что, в отличие от представителей рода Methylobacterium, обладающих красным пигментом, клетки штамма Z-0046 не имеют пигмента. К настоящему времени известен лишь один представитель рода Methylobacterium - Methylobacterium nodulans, в клетках которого отсутствует пигмент. Оба исследованных штамма, в отличие от AR24T, не используют органические кислоты, но способны к росту на некоторых углеводах, как на единственных источниках углерода и энергии.

Штамм Z-0033 не использует метанол и мелиламин. Таким образом, спектр используемых субстратов выделенных штаммов отличается от спектра штамма AR24T Methylobacterium isbiliense (Таблица 3).

Hyphomicrobium facile subsp tolerans штамм Z-0045.

Из дистрофной воды микролизиметра был выделен штамм Z-0045, клетки которого обладали характерной для гифомикробов морфологией. Анализ последовательности гена 16S рРНК показал, что штамм Z-0045 относится к виду Hyphomicrobium facile subsp tolerans (сходство 99%).

Клетки штамма Z-0045 эллипсовидной формы с полярно расположенными гифами.

Размножаются почкованием, почка формируется на вершине гифы. Клетки образуют круглые, выпуклые, слизистые, непрозрачные колонии молочного цвета, до 7 мм в диаметре, с ровным краем. Консистенция густая.

Бактерия является облигатно аэробной. Микроорганизм является факультативным метилотрофом, используя в качестве источников углерода и энергии С1 – соединения:

монометиламин и формиат, а также фумарат, маннит, глюкозу. Является олиготрофом (концентрация субстрата не выше 0.03%). Микроорганизм выдерживает содержание NaCl в среде до 25 г/л. Диапазон роста рН 4.3-7. Оптимальный рН 6.0. Штамм Z- является мезофиллом, Т опт для него 20-25°С. Оксидазо- и каталазоположителен.

Содержание Г + Ц в ДНК – 59.6 мол.%.

Таким образом, в кислых ультрапресных дистрофных водах установлено существование сообщества микроорганизмов, представленного большим видовым разнообразием. Бактерии адаптированы к местообитанию и относятся к группе омброфилов.

2. Гидролиз древесины бинарной культурой Pseudomonas sp. Z-0044 и Streptomyces pseudogriseolus Поскольку древесина ели на 27.3-28.2% состоит из лигнина, и основная доля гуминовых соединений в составе дистрофных вод формируется в процессе его деградации, нашей задачей было выделение микроорганизмов, которые используют лигнин в качестве субстрата.

Рис. 15. Схема выделения в чистые культуры Streptomyces pseudogriseolus и Pseudomonas sp.

штамм Z-0044.

На растворимом лигнине было выделено устойчивое микробное сообщество, которое в жидкой среде образовывало плотные шарообразные слизистые скопления размером до 1 см в диаметре (Рис. 15а). На агаризованной среде клетки формировали два типа колоний (Рис. 15б,в,д). После многократных рассевов были получены чистые культуры стрептомицета (Streptomyces pseudogriseolus) (Рис. 15е) и штамма Z-0044 (Рис. 15г), который, как показал анализ последовательности гена 16S рРНК, относится к роду Pseudomonas и имеет 97% сходства с Pseudomonas oryzihabitans.

Исследование бинарной культуры Streptomyces pseudogriseolus и Pseudomonas sp.

штамм Z-0044 показало, что она растет на измельченной (диаметр гранул 2 мм) нативной древесине ели в качестве субстрата. Было сделано предположение о существовании трофического взаимодействия между культурами Streptomyces pseudogriseolus и Pseudomonas sp. штамм Z-0044.

Предварительные исследования развития на древесине (0.2%) чистых культур Pseudomonas sp штамм Z-0044 и Streptomyces pseudogriseolus (критерием оценки роста служила интенсивность дыхания микроорганизмов) показали, что S. pseudogriseolus способен к развитию на древесине в качестве субстрата, в отличие от штамма Z-0044.

Рост S. pseudogriseolus на древесине сопровождался выделением СО2 со скоростью 0.04 мг СО2/л/ч. и значительным подкислением среды до рН 4.8 (Рис. 16). Использование древесины прекращалось к 210 часам.

При исследовании совместного использования древесины штаммом Z-0044 и S.

pseudogriseolus часть флаконов со стрептомицетом была инокулирована бактериями в конце логарифмической стадии роста (150 часов) а часть была оставлена в качестве контроля. После подсева бактерий скорость выделения СО2 увеличивалась в первые сутки в 9 раз, указывая на интенсивное разложения субстрата при совместном действии стрептомицета и псевдомонады (Рис. 16). В ходе разложения древесины бинарной культурой рН изменялся только на 0.4 единицы (с 6.4 до 6.0). В культуральной жидкости бинарной культуры кислоты не были зафиксированы, что указывает на деацидификацию, осуществляемую штаммом Z-0044. Таким образом, бинарная культура проявила качественные отличия от чистых культур.

Рис. 16. Развитие бинарной культуры Streptomyces pseudogriseolus и Pseudomonas sp. на древесине.

1 - чистая культура Streptomyces pseudogriseolus на среде с древесиной ( г/л).

2 - бинарная культура Streptomyces pseudogriseolus с Pseudomonas sp.

3. Положение выделенных представителей омброфильных диссипотрофов в трофической схеме мико-бактериального сообщества Выделенные бактерии принадлежат к диссипотрофной группировке, утилизирующей низкомолекулярные компоненты гидролиза древесины и продукты обмена грибов. По пищевым потребностям изученные организмы могут быть отнесены к следующим группам: ацидотрофы, использующие органические кислоты;

сахаролитики, использующие преимущественно углеводы и метилотрофы (Таблица 4).

Характеристика представителей ацидотрофной группировки 3.1.

К ацидотрофным представителям бактериального сообщества относятся Ancylobacter abiegnus sp.nov. штамм Z-0056, Xanthobacter xylophilus sp.nov. штамм Z-0055, Seliberia sp. штамм Z-0043 и Pseudomonas sp. Z-0044.

Они являются умеренно ацидофильными (оптимальный рН для роста составляет 5.0 5.5) и олиготрофными (оптимальная концентрация субстрата в среде не выше 0.03%).

Клетки выдерживают содержание NaCl в среде в пределах 0.1% - 1% и электропроводность среды 100-200 мкС. Основными источниками углерода и энергии для них служат преимущественно органические кислоты: сукцинат, ацетат, цитрат и оксалат.

Таблица 4. Трофические группировки в составе ксилотрофного мико-бактериального сообщества.

Xanthobacterxylophilus Ancylobacter abiegnus mucilagenosa Z-0071Т mucilagenosa.Z- Seliberia sp. Z- Methilobacterium Methilobacterium Hyphomicrobium isbiliense Z- isbiliense Z- sp. nov. Z- Singulisphaera Singulisphaerа Spirosoma sp.

facile Z- sp.nov.Z (Z-0088) Орг. кислоты + + + - - - - - Оксалат + + + + - - - - Формиат - - - + + + - - Метанол - - - - + + - - Монометиламин - - - - + + - - Мочевина - - - - + - + + Ксилоза + + + + - - + + + Моносахариды - - - + - - + + Дисахариды - - - + - - + + Ксилан + + + + + - - + + Полисахариды - - - + - - + + N-ацетил н/д - - - - - + + + глюкозамин рН оптим. 5.5 5.5 5.5-6.5 5.5 6.0 6.0 6.0 6.0 5.5-6. Конц. NaCl, г/л 0.1 1.5 10 2.5 7 25 5 5 Электропро- 80- 80 200 400 400 200 800 800 водность, мкС 100 Опт. конц.

0.025 0.025 0.025 0.1 0.1 0.03 1 1 0. субстрата, % Характеристика представителей сахаролитической группировки 3.2.

В группировку сахаролитиков входят: Singulisphaera mucilagenosa sp.nov. штаммы Z 0071 и Z-0072, Spirosoma sp. штамм Z-0088 и Methylobacterium isbiliense штамм Z-0033.

Основными субстратами для них являются моно- и дисахара, главным образом ксилоза, сахароза, глюкоза. Оптимальный рН для роста, в отличие от ацидотрофных бактерий, смещен в нейтральную область (6.0-6.5). Клетки выдерживают большую электропроводность среды (до 800 мкС), и менее чувствительны к содержанию NaCl в среде (Таблица 4). Оптимальная концентрация субстрата для представителей сахаролитической трофической группировки 1-10 г/л.

Характеристика представителей метилотрофной группировки 3.3.

Метилотрофные микроорганизмы в сообществе представлены штаммами Z-0033 и Z 0046, относящимися к виду Methylobacterium isbiliense, и штаммом Z-0045, относящимся к виду Hyphomicrobium facile subsp. tolerans. Основными субстратами для роста являются С1-соединения: формиат, метанол, метиламин.

Бактерии являются олиготрофными, и растут при концентрации субстрата в среде 0.03 0.1%. Оптимальный рН 5.5-6.0.

Выделенные нами представители микробного сообщества кислых дистрофных вод позволили частично подтвердить предложенную Г.А. Заварзиным схему трофических взаимоотношений и определить основных потребителей органических соединений, образующихся в процессе разложения древесины ксилотрофным сообществом (Рис. 17).

Рис. 17. Представители трофических групп омброфильных диссипотрофов в ксилотрофном мико бактериальном сообществе по Заварзину и Заварзиной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Анализ бактериального разнообразия ксилотрофного мико-бактермального сообщества ультрапресных дистрофных вод позволил выявить в его составе новые виды микроорганизмов, принадлежащие к известным родам: Ancylobacter abiegnus sp.

nov., Singulisphaera mucilagenosa sp. nov., Xanthobacter xylophilus sp.nov. В случае Z 0088 (Spirosoma sp.) и Z-0044 (Pseudomonas sp.) можно предположить существование новых видов.

Исследованным микроорганизмам свойственна ацидотолерантность. Оптимальный рН роста для всех исследованных бактериальных представителей мико бактериального сообщества лежит в пределах 5.0-6.5. Для представителей группы ацидотрофов оптимальный рН составляет 5.0-5.5, для сахаролитиков и метилотрофов – 6.0-6.5. Диапазон роста рН в среднем составляет от 3.5 до 7.0.

Микроорганизмы способны к росту в ультрапресной среде при концентрациях NaCl не выше 0.5-1% и низкой электропроводности среды: от 44 мкС (Ancylobacter abiegnus, Xanthobacter xylophilus, Seliberia sp. Z-0043) до 0.8 млС (Methilobacterium isbiliense штаммы Z-0033 и Z-0046, Singulisphaera mucilagenosa штаммы Z-0071T и Z 0072, Hyphomicrobium facile subsp tolerans, Spirosoma sp. Z-0088).

Большинству выделенных микроорганизмов свойственна олиготрофия.

Оптимальная концентрация субстрата для различных изолятов составляет 0.025-0.1%.

Все исследованные микроорганизмы можно разделить на три трофические группировки: cахаролитики, использующие в качестве источника углерода и энергии растворимые сахариды и полисахариды, в т.ч. ксилозу и ксилан, которые являются одними из самых значимых углеводов в составе древесины, а также N ацетилглюкозамин - продукт разрушения микотрофами отмершего грибного мицелия;

ацидотрофы, ориентированные на потребление продуктов обмена грибов (органических кислот);

метилотрофы, использующие С1-соединения.

Микроорганизмы утилизируют оксалат, наиболее распространенную в растениях нерастворимую органическую кислоту, в большом количестве высвобождаемую грибами при разрушении древесины. Представители пептолитической группировки не были выявлены.

Бактерии участвуют в трофических взаимоотношениях с грибными организмами гидролитиками. На примере бинарной культуры стрептомицета и псевдомонады показано участие прокариот в процессе совместной деструкции древесины и деацидификации среды.

ВЫВОДЫ В кислых, ультрапресных, дистрофных водах установлено существование 1.

сообщества микроорганизмов, представленного большим видовым разнообразием.

Наряду с известными видами микроорганизмов, в его составе выявлены новые, принадлежащие к описанным родам: Ancylobacter abiegnus sp. nov., Singulisphaera mucilagenosa sp. nov., Xanthobacter xylophilus sp.nov.

Исследованные бактерии принадлежат к диссипотрофной группировке и 2.

утилизируют низкомолекулярные компоненты, рассеиваемые при гидролизе древесины грибами, и занимают в сообществе определенные трофические ниши. Все изученные микроорганизмы можно разделить на три трофические группировки:

· Сахаролитики · Ацидотрофы · Метилотрофы Выделенные микроорганизмы имеют ряд особенностей, 3.

демонстрирующих их адаптацию к обитанию в кислых, ультрапресных, дистрофных водах, и могут быть отнесены к группе омброфилов. В число этих особенностей входит ацидотолерантность, олиготрофия и способность к росту в ультрапресных условиях.

Бактерии участвуют в трофических взаимоотношениях с организмами 4.

гидролитиками. На примере бинарной культуры стрептомицета и псевдомонады показано участие прокариот в процессе совместной деструкции древесины и деацидификации среды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи:

. Зайчикова М. В, Берестовская Ю.Ю., Акимов В.Н, Кизилова А.К., Васильева Л.В.

1.

xylophilus sp.nov- представитель ксилотрофного мико-бактериального сообщества Xanthobacter ультрапресных вод //Микробиология, 2010, Т. 79. № 1, с. 89-95.

Зайчикова М. В. Берестовская Ю.Ю. Акимов В.Н, Кизилова А.К. Васильева Л.В. Ancylobacter 2.

abiegnus sp. nov. -олиготрофный представитель мико-бактериального сообщества// Микробиология, 2010, Т. 79. № 4, с. 483-490.

Зайчикова М. В., Берестовская Ю. Ю., Акимов В. Н., Кострикина Н.А., Васильева Л. В.

3.

Singulisphaera mucilagenosa sp. nov – новый ацидотолерантный представитель порядка Planctomycetales // Микробиология, 2011, Т. 80. № 1, с. 105-111.

Куличевская И. С., Зайчикова М. В., Деткова Е. Н., Дедыш С. Н., Заварзин Г. А. Larkinella 4.

arboricola sp. nov. - новая спиралеобразующая бактерия филогенетической группы Bacteroidetes из микробного сообщества разлагающейся древесины // Микробиология, 2009. Т. 78. №6, с. 780-785.

Тезисы были представлены на следующих конференциях:

Зайчикова М.В., Берестовская Ю.Ю., Васильева Л.В. «Диссипотрофные бактерии, 1.

развивающиеся в сообществе с грибами-ксилолитиками». V Международная конференция «Вулканизм, биосфера и экологические проблемы». Туапсе, 2009, с. 110.

Зайчикова М.В., Берестовская Ю.Ю., Васильева Л.В. «Бактерии-диссипотрофы, 2.

развивающиеся в сообществе с грибами-ксилолитиками в ультрапресных условиях». Всероссийская научная конференция с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», посвященная 75-летию со дня рождения основателя кафедры физиологии микроорганизмов профессора М.В.Гусева. Бюллетень Московского общества естествоиспытателей природы, отдел Биологический. Москва, 2009, Т. 114. В. 2, с. 49-50.

Зайчикова М.В., Берестовская Ю.Ю., Васильева Л.В. «Диссипотрофные бактерии 3.

ксилотрофного сообщества в пресноводных экосистемах».V Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2009,с. 77-78.

4. M.V. Zaychikova, Ju.Ju. Berestovskaya, L.V. Vasilyeva. «Dissipatrophic bacteria, which develop in community with xylolytic fungi in the ultrafresh conditions». III международная конференция по природоведческой, промышленной и прикладной микробиологии «BioMicroWorld 2009». Portugae, 2009, p. 36.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.