Экология зеленых лягушек (rana esculenta complex) пензенской области: распространение, популяционная изменчивость, влияние антропогенных факторов
На правах рукописи
ЗАКС Михаил Михайлович ЭКОЛОГИЯ ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК (Rana esculenta complex) ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ: РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ПОПУЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ, ВЛИЯНИЕ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ Специальность 03.02.08 – экология (биология)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пенза – 2013 1
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образова тельном учреждении высшего профессионального образования "Пензенский государственный университет" на кафедре "Зоология и экология".
Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Ермаков Олег Александрович.
Официальные оппоненты: Лада Георгий Аркадьевич, доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Тамбовский государствен ный университет имени Г.Р. Державина», заведующий кафедрой биологии;
Ручин Александр Борисович, доктор биологических наук, доцент, ФГБУ «Мордовский государственный природный заповедник имени П.Г. Сми довича», директор.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт экологии Волжского бассейна Российской академии наук», г. Тольятти.
Защита состоится 26 июня 2013 г. в 16 часов на заседании диссертацион ного совета ДМ 212.337.02 при Пензенской государственной технологической академии по адресу: 440039, г. Пенза, пр. Байдукова / ул. Гагарина, д. 1а/11, корпус 1, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО "Пензен ская государственная технологическая академия".
Автореферат разослан 23 мая 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Яхкинд Михаил Ильич
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Одно из актуальных и перспективных направ лений исследований современной экологии – изучение закономерностей популя ционной изменчивости животных под воздействием факторов среды, позволяю щее оценить его эволюционные последствия в пространстве и времени. Кроме того, основой стабильного функционирования биосферы является сохранение биологи ческого разнообразия, что определяет необходимость изучения различных групп организмов на региональном уровне. Удобной моделью для подобных исследова ний являются виды с широкой экологической пластичностью, к числу которых относятся бесхвостые амфибии. До настоящего времени комплексного изучения амфибий с применением как традиционных (морфологических), так и современ ных (биоакустических и молекулярно-генетических) методов на территории Пен зенской области не проводилось. Между тем регион исследования расположен в лесостепной зоне и характеризуется широким диапазоном биотопов, как естествен ных, так и измененных человеком, что позволяет на примере амфибий решать воп росы, связанные с экологическим прогнозированием и мониторингом.
Комплекс среднеевропейских зеленых лягушек (Rana esculenta complex) яв ляется удобным объектом для изучения, так как его представители имеют высокую численность, широкое распространение и характеризуются значительным разма хом изменчивости. Комплекс включает в себя три вида, из которых озерная (R.
ridibunda) и прудовая (R. lessonae) лягушки являются обычными "менделевскими" видами, а съедобная (R. esculenta) лягушка представляет собой устойчивую гиб ридную между ними форму с уникальным типом наследования. В целом, комплекс среднеевропейских зеленых лягушек рассматривается как модель сетчатого (гиб ридогенного) видообразования (Боркин, Даревский, 1980;
Lada et al., 1995).
В эколого-фаунистическом плане батрахофауна Пензенской области изучена явно недостаточно. Сведения о ней представлены лишь в нескольких специальных публикациях, посвященных распространению амфибий (Ермаков и др., 2002), мор фологии отдельных видов (Ермаков, Ильина, 1999;
1999а) и фауне амфибий государ ственного природного заповедника "Приволжская лесостепь" (Павлов, 1999).
Цель работы – эколого-фаунистическая характеристика батрахофауны Пен зенской области и комплексное изучение группы зеленых лягушек, обитающих в различных экологических условиях, с использованием морфологических, био акустических и молекулярно-генетических подходов.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Изучить видовой состав и закономерности распределения амфибий и ис пользовать эти данные для составления кадастра земноводных Пензенской области.
2. Изучить межпопуляционную изменчивость морфологических, биоаку стических и молекулярно-генетических признаков зеленых лягушек для наибо лее полного выявления таксономического разнообразия комплекса.
3. Оценить состояние популяций зеленых лягушек в различных по антро погенной нагрузке биотопах.
4. Выявить редкие виды амфибий Пензенской области и предложить прак тические мероприятия по сохранению их разнообразия.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Видовое разнообразие и распределение амфибий на территории Пензен ской области зависят от неоднородности природных условий и степени изучен ности района исследований, что усиливает значение кадастровых работ.
2. Применение комплексного подхода, включающего широкий спектр ме тодов исследования (эколого-фаунистических, морфологических, биоакустиче ских, молекулярно-генетических), повышает эффективность изучения биораз нообразия земноводных путем выявления таксономических группировок, диаг ностика которых традиционными методами затруднена.
3. Частота проявления морфологических аномалий и уровень генетическо го полиморфизма в популяциях зеленых лягушек зависит от степени антропо генной трансформации мест обитания.
Научная новизна. Впервые изучено распространение и закономерности рас пределения батрахофауны в природно-территориальных комплексах Пензенской области. Впервые в Поволжском регионе для изучения группы зеленых лягушек ис пользован комплексный подход, включающий эколого-фаунистические, морфологи ческие, биоакустические и молекулярно-генетические исследования. Обнаружен но вый для фауны области вид – съедобная лягушка – и две криптические формы озер ной лягушки неясного таксономического уровня. Впервые в Пензенской области обнаружены особи с морфологическими аномалиями и определена частота их встре чаемости в трансформированных биотопах. Дана оценка генетического полимор физма популяций в зависимости от степени антропогенной нагрузки.
Научно-практическая значимость. Данные, изложенные в диссертации, рас ширяют представления об экологии и распространении земноводных на террито рии Пензенской области, поэтому могут быть использованы в целях сохранения биоразнообразия. На основании анализа данных по частоте встречаемости морфо логических аномалий и уровня генетического полиморфизма можно проводить био индикационную оценку степени загрязнения водоемов области. Материалы дис сертации, сформулированные в ней научные положения, выводы и результаты мо гут найти применение в работе природоохранных организаций при оценке состоя ния естественных биогеоценозов, организации многолетнего биомониторинга, со ставления региональных кадастров животного мира. Выявленные закономерности межпопуляционной изменчивости земноводных позволяют использовать эти дан ные в преподавании общеэкологических и зоологических курсов в вузах.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на международ ной научной конференции, посвященной 135-летию со дня рождения И.И. Спрыги на "Биоразнообразие: проблемы и перспективы сохранения" (г. Пенза, 2008), эколо гической конференции молодых ученых Поволжья (г. Тольятти, 2009), 14-й Пущин ской международной школе-конференции молодых ученых "Биология – наука ХХI века" (Пущино, 2010), IV съезде герпетологического общества им. А.М. Никольского (Казань, 2011), всероссийской научно-практической конференции "Региональные кадастры животного и растительного мира и Красные книги" (Тамбов, 2012).
Реализация и внедрение результатов работы. Материалы диссертации ис пользуются при выполнении работ по гранту Российского фонда фундаментальных исследований на тему "Изучение современного состояния и разнообразия животно го мира лесостепных ландшафтов на примере Пензенской области" (проект № 12 04-97073-р_поволжье_а). Данные диссертационного исследования использованы при экологическом мониторинге зоны защитных мероприятий объекта по уничтожению химического оружия (пос. Леонидовка), а также при подготовке второго издания Красной книги Пензенской области. Результаты, полученные в ходе исследования, используются в учебном процессе Пензенского государственного университета при подготовке бакалавров и магистров по направлению 020400 – "Биология".
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе статьи в изданиях, входящих в перечень рецензируемых научных журналов ВАК.
Личный вклад автора. Основные результаты, приведенные в диссертации, получены непосредственно самим автором в течение четырёхлетних экспедици онных работ на территории Пензенской области, а также камеральной обработки полученных материалов. Автор лично участвовал в сборе, обработке и анализе материала. В совместных публикациях вклад автора составил 40–60 %.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 125 страницах, со стоит из введения, 6 глав, выводов и приложения. Список литературы включает 152 источника, в том числе 65 – на иностранных языках. Работа иллюстрирова на 33 рисунками и 7 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ГЛАВА 1. АМФИБИИ ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ И КОМПЛЕКС ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК (RANA ESCULENTA COMPLEX) КАК МОДЕЛЬНАЯ ГРУППА ЗООЛОГИЧЕСКИХ И ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В первой части главы приведены сведения об истории изучения земновод ных, систематическом положении и состоянии изученности комплекса Rana es culenta. Во второй части дана всесторонняя характеристика трех видов комплек са, освещены вопросы таксономии, распространения, экологии, а также исполь зования земноводных для биоиндикации состояния окружающей среды. В тре тьей части дана краткая физико-географическая характеристика региона иссле дования. В четвертой части приводятся данные об изучении этой группы живот ных на территории Поволжья и Пензенской области, показана меньшая степень ее изученности по сравнению с соседними регионами.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проводились в период 2009 – 2012 гг. Отлов животных осу ществлялся с берега водоема при помощи рыболовного подсачека. После поим ки животные помещались в мешок из хлопчатобумажной ткани с влажной тра вой на дне, где содержались не более трех часов для проведения измерений и прижизненного отбора проб ДНК, после чего выпускались в водоем. Особи с морфологическими аномалиями фиксировались в 4 % растворе формальдегида для проведения дальнейших исследований.
2.1. Кадастровые исследования. Анализировались оригинальные точки на ходок амфибий, устные сообщения и литературные сведения. Координаты находок определялись при помощи Интернет-сервиса Google.карты с использованием про граммы SAS. Планета (http://sasgis.ru). Составлены 11 карт, включающих известные места находок каждого вида. Всего учтено 204 точки. Для анализа изученности бат рахофауны региона и ее территориального распределения использована карта облас ти, разбитая на квадратные выделы размером 20 20 км с указанием количества ви дов в каждом. Для ее создания применялся IDW-интерполятор, рассчитывающий регулярную поверхность, с использованием пространственных взаимоотношений случайно распределенных данных (программа MapInfo Professional v. 9.5).
2.2. Морфологический анализ. Измерения морфологических параметров производились непосредственно после поимки животных, на берегу водоема. Фик сировались следующие показатели: длина тела (L), длина головы (Lc), расстояние между глазами (Spoc), длина глаза (Lo), ширина головы (Ltc), длина бедра (F), дли на голени (T), длина первого пальца задней конечности (Dp), длина внутреннего пяточного бугра (Ci), длина плюсны (дополнительной голени) (Cs) (Таращук, 1989).
Полученные данные использовались для расчета относительных показателей – ин дексов пропорциональности: L/Ltc, L/T, L/Ci, Dp/Ci, T/Ci, Ltc/Ci, L/Lc, L/Spoc, L/F, L/Dp, L/Cs, F/T, Ix (индекс Таращука). Для дальнейшего анализа использовались относительные показатели, нивелирующие влияние возрастной изменчивости. Всего было проанализировано 268 особей из 16 локалитетов.
При обнаружении особей с отклонениями в развитии производилась макросъем ка аномального участка тела, а в случае полидактилии готовился скелетный препарат методом химической мацерации в 6 % растворе KOH с добавлением ализарина. Ча стота отмеченных аномалий подсчитывалась как отношение количества особей с аномалиями к общему количеству особей, отловленных в данной популяции.
2.3. Биоакустический анализ. Звуковые сигналы записывались в полевых условиях, при температуре воды 21–23 °С. Фиксировались как индивидуаль-ные, так и хоровые крики. В последнем случае отдельные звуки вырезались из общего хора с помощью программы Sound Forge 6.0. Для записи использовали магнито фон "SONY TC-D5M" и микрофон "BBK DM-100", а также mp3-плеер Samsung YP-U3. Запись производилась с берега водоема, микрофон располагался на рас стоянии 0,5–1,5 м от животных. Частотные и временные характеристики сигна лов получены с помощью программы SpectraLab 4.32.11 for Win. Для каждого звука измеряли общую длительность в миллисекундах (мс), промежуток между пиками (мс), количество пульсов, доминантную частоту в начале сигнала (Гц), доминантную частоту в конце сигнала (Гц), максимальную доминантную часто ту сигнала (Гц) и амплитуду сигнала (Гц). Таким образом, для каждого звука из меряли 7 параметров (Lode, 2001). Там, где точное снятие показателей было зат руднено, оно проводилось с использованием трехкратной повторности с после дующим вычислением среднего арифметического. Была записана и проанализи рована 141 серия звуков из 11 локалитетов. Для сравнения также использовались записи звуковых сигналов из популяций зеленых лягушек Германии (диск Heimische Froschlurchet, Rufe zur Paarungszeit).
2.4. Молекулярно-генетический анализ. В качестве образцов тканей для выделения ДНК использовалась часть пальца передней конечности амфибий, взятая прижизненно и зафиксированная в 96 % этаноле. Выделение ДНК осу ществляли по стандартной методике фенолхлороформной экстракции с предва рительной обработкой протеиназой К и SDS (Sambrook et al., 1989).
Для выявления разнообразия митохондриальных гаплотипов в исследуемых популяциях использовали метод ДНК-штрихкодирования (Ratnasingham, Hebert, 2007), основанный на определении нуклеотидной последовательности фрагмента митохондриального гена цитохром оксидазы (первая субъединица – COI) длиной 600 пар нуклеотидов (пн) при использовании универсальных праймеров VUTF и VUTR (Ivanova et al., 2007). Секвенирование фрагмента гена COI для 27 экз. из раз ных точек проводили на автоматическом секвенаторе ABI 3500 (Applied Biosystems).
Для реконструкции филогенетических отношений использовали метод максималь ного правдоподобия (ML) в программе MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011).
Для видовой диагностики и определения генетического полиморфизма у 62 экз. лягушек использовали два метода анализа ядерной ДНК – RAPD (Random Amplifiсation of Polymorphic DNA) и ISSR (Inter-Simple-Sequence-Repeats), осно ванные на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, име ющими множественную локализацию в геноме (Сулимова, 2004;
Wolfe, 2005).
Суть методов заключается в амплификации фрагментов ДНК с использованием одного короткого праймера, который связывается с геномной ДНК в двух различ ных участках инвертированных повторов. При электрофорезе ПЦР-продуктов образуются дискретные фрагменты (ДНК-паттерны), размер которых варьирует от 100 до 1500 пар нуклеотидов. Статистический анализ включал составление бинарных матриц, в которых отмечалось "присутствие" (1) или "отсутствие" (0) фрагментов с одинаковой молекулярной массой на электрофореграмме.
Для статистической обработки результатов применялись: стандартные ста тистические параметры (min-max, среднее арифметическое (M), ошибка сред него (m), стандартное квадратичное отклонение (SD)), при парном сравнении среднеарифметических показателей – параметрический t-критерий Стьюдента, при поиске дифференцирующих различий между двумя и более группами по ком плексу признаков – дискриминантный анализ. Для всех статистических тес-тов был установлен уровень значимости 0,05.Статистическая обработка данных про ведена в пакетах Microsoft Office Excel 2010 и STATISTICA 6.0.
ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ АМФИБИЙ НА ТЕРРИТОРИИ ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ На территории Пензенской области достоверно зарегистрировано обита ние 11 видов амфибий, два из которых относятся к отряду хвостатых (Caudata):
гребенчатый тритон Triturus cristatus (Laurenti, 1768), обыкновенный тритон Lisso triton vulgaris (Linnaeus, 1758) и девять – к отряду бесхвостых (Anura): красно брюхая жерлянка Bombina bombina (Linnaeus, 1761), обыкновенная чесночница Pelobates fuscus (Laurenti, 1768), серая жаба Bufo bufo (Linnaeus, 1758), зеленая жаба B. viridis Laurenti, 1768, озерная лягушка Rana ridibunda Pallas, 1771, прудо вая лягушка R. lessonae Camerano, 1882, съедобная лягушка R. esculenta Linnaeus, 1758, травяная лягушка R. temporaria Linnaeus, 1758, остромордая лягушка R.
arvalis Nilsson, 1842. В диссертации для каждого вида приводятся краткий очерк и аннотированная карта распространения, по образцу, приведенному ниже.
Озерная лягушка – Rana ridibunda Pallas, 1771 (рис. 1). Синонимы: Rana esculenta Linnaeus, 1758;
Bufo ridibundus Schneider, 1799.
Широко распространенный, местами многочисленный вид Пензенской об ласти, чаще встречающийся в открытых ландшафтах – водоемах, имеющих связь с речными долинами. В подходящих местах обитания может быть встречен прак тически повсеместно. Отмечен в 42 точках по всей территории области. Числен ность высокая – от 10 до 80 особей на 200 м береговой линии.
Рис. 1. Распространение озерной лягушки (Rana ridibunda) в Пензенской области:
Земетчинский р-н: 1 – окр. с. Пашково, 2001 (53°39' с.ш. 42°25' в.д.) … Неверкинский р-н:
42 – окр. с. Неверкино, Неверкинское лесничество, 2001 (52°47' с.ш. 46°45' в.д.) В Пензенской области на основе зоогеографического районирования (Де нисов и др., 1998) выделяют три природно-территориальных участка: Вадинский (I), Хоперский (II) и Сурский (III) (см. рис. 1). Два из них – Вадинский и Сурский – относятся к Европейской лесной провинции, один – Хоперский – к Степной про винции. По числу видов амфибий участки практически не различаются (10–11 ви дов), однако совокупности экологических факторов каждого участка приводят к неравномерному распределению видов на них (рис. 2). Максимальное число мест находок земноводных (128 точек, 63 %) – в наиболее облесенном и обводненном Сурском участке. В Вадинском и Хоперском участках общее количество точек на ходок одинаково (по 38 точек, по 18,5 %). Однако Вадинский участок характеризу ется более равномерным обнаружением разных видов, что может быть связано с более однородным распределением по территории биотопов, пригодных для оби тания амфибий. В Хоперском участке, расположенном в зоне с преобладанием от крытых биотопов, наблюдается доминирование двух видов: озерной лягушки – от носительно независимого от лесных биотопов вида и остромордой лягушки – засу хоустойчивого вида, который может комфортно обитать в степной зоне.
Остромордая лягушка 25 Озерная лягушка Травяная лягушка Обыкновенная чесночница Обыкновенный тритон Краснобрюхая жерлянка Обыкновенная жаба Гребенчатый тритон 5 Зеленая жаба Прудовая лягушка Съедобная лягушка Вадинский Хоперский Сурский Рис. 2. Соотношение числа мест находок (ось ординат) амфибий в трех природно территориальных участках Пензенской области Территориальное распределение видового богатства батрахофауны региона показано на рис. 3. Видно, что крайние западные, центральные и восточные части области по сравнению с периферийными районами (юго-западными, юго- и северо восточными) отличаются большим числом видов. Такой характер распределения так же может быть связан и со степенью изученности региона, так как районы макси мального видового богатства совпадают с местами проведения регулярных исследо ваний (окрестности г. Пензы, стационары ПГУ, участки ГПЗ "Приволжская лесо степь") и, соответственно, наибольшим объемом кадастровой информации.
Рис. 3. Распределение числа видов земноводных на территории Пензенской области по квадратным выделам 20 20 км (IDW-интерполяция) Таким образом, распределение амфибий по территории Пензенской облас ти соответствует их биотопической приуроченности и степени изученности рай она исследований.
ГЛАВА 4. ГИБРИДОГЕННЫЙ ВИД – СЪЕДОБНАЯ ЛЯГУШКА И КРИПТИЧЕСКИЕ ФОРМЫ ОЗЕРНОЙ ЛЯГУШКИ – "ЗАПАДНАЯ" И "ВОСТОЧНАЯ": КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ "Необходимость охраны природы не вызывает сомнений, но природоох ранная деятельность предполагает предварительное каталогизирование этой при роды" (Шнеер, 2009;
с. 296). Применение молекулярно-генетических методов, в том числе ДНК-штрихкодирования (Ratnasingham, Hebert, 2007) значительно ус коряет процесс инвентаризации живого мира. Однако для объективного изуче ния биоразнообразия необходим комплексный подход, включающий широкий спектр методов. Особенно это касается земноводных, которые, в отличие от дру гих классов позвоночных животных, имеют незначительное количество внешних признаков для идентификации видов (Боркин и др., 2004). В главе рассматрива ются результаты анализа морфологических, биоакустических и молекулярно генетических признаков зеленых лягушек, проведенного с целью обнаружения на территории области таксономических форм, диагностика которых традици онными методами затруднена, что может привести к занижению уровня реально го биоразнообразия и, соответственно, к ошибочной стратегии охраны.
4.1. Обнаружение съедобной лягушки (Rana esculenta L., 1758) в Пен зенской области. Съедобная лягушка (R. esculenta) – вид гибридного происхо ждения, широко распространенный в Центральной, Восточной Европе, на запа де и в центре Русской равнины (Лада и др., 2011). В соседних с Пензенской об ластью регионах – Тамбовской и Ульяновской областях, республиках Мордовия и Чувашия – известны достоверные находки вида, однако на территории Пензен ской области обитание съедобной лягушки лишь предполагалось, но не было под тверждено генетическими методами.
Изучена выборка зеленых лягушек, взятая в окрестностях нежилого пос.
Александровка Земетчинского р-на (53°40' с.ш.;
42°12' в.д.) и предварительно оп ределенная как "прудовая лягушка". Для сравнения, в качестве "модельных", ис пользовались выборки прудовой и озерной лягушек, морфологические и био-акус тические показатели которых были изучены нами ранее (Закс, 2008, 2012а, б).
Морфологический анализ показал, что по пяти индексам (L/Ci, Dp/Ci, T/Ci, Ltc/Ci, Ix) экземпляры из выборки "Земетчино" не имели достоверных отличий от прудовой лягушки, по двум (L/Ltc, L/Cs) – напротив, от озерной лягушки. Два индекса (L/T, F/T) оказались промежуточными, а один (L/Lc) достоверно отделял исследуемую выборку от двух "модельных". По средним показателям пропорци ональности характерными чертами экземпляров из выборки "Земетчино" явля ются относительно крупная голова и относительно длинный внутренний пяточ ный бугор. Мозаичность морфологических признаков выборки подтверждается дискриминантным анализом (табл. 1, рис. 4). Наибольший вклад в диагностику видов вносят факторы пропорциональности задней конечности, пяточного бугра и относительные размеры головы. Эллипсы рассеивания не перекрываются у "модельных" выборок, тогда как эллипс выборки "Земетчино" занимает проме жуточное положение, образуя зоны перекрывания.
Таблица 1. Результаты дис криминантного анализа по ин дексам пропорциональности трех выборок зеленых лягушек Факторные нагрузки Признак DF1 DF L/T 0,70 0, T/Ci -0,59 0, F/T 0,53 0, L/Ci -0,33 0, L/Ltc 0,07 0, L/Lc 0,18 0, Кум. (%) 86 14 Рис. 4. Размещение значений индексов пропорционально сти лягушек из трех выборок в пространстве двух дискри 143,5 39, минантных функций. Круглой обводкой выделены экзем Уил- пляры, для которых проведен молекулярно-генетический 0,05 0, анализ кса Сложная картина изменчивости морфологических признаков выборки позво лила нам предположить наличие среди исследованных экземпляров съедобной ля гушки. Однако известно, что к определению видов комплекса Rana esculenta только с помощью морфометрии надо относиться с большой осторожностью (Борисовский и др., 2000). Поэтому был проведен молекулярно-генетический анализ с использова нием ISSR-метода. Паттерны всех экземпляров из "модельных" выборок оказались видоспецифичными, однако одна из четырех особей выборки "Земетчино" имела гибридное происхождение, т.е. оказалась съедобной лягушкой. Гибридный экземп ляр наследует 5 из 11 фрагментов, специфичных для R. ridibunda, и 8 из 10 фрагмен тов, специфичных для R. lessonae (рис. 5). Причем эти данные коррелируют с резуль татами морфологического анализа, где у особей из выборки "Земетчино" также от мечено некоторое преобладание признаков прудовой лягушки.
Рис. 5. Электрофореграмма и схема паттернов ПЦР-фрагментов ядерной ДНК, полученных при ISSR-анализе с праймером (AG)8G (R.r. – озерная, R.e. – съедобная, R.l. – прудовая лягушка). Размеры фрагментов в парах нуклеотидов указаны слева Таким образом, результаты комплексного анализа позволили доказать оби тание на территории Пензенской области съедобной лягушки, и отнести изучен ную популяционную систему к LE-типу (смешанные популяционные системы из R. lessonae и R. esculenta). Учитывая относительную редкость прудовой лягушки в нашем регионе, ее биотопическую приуроченность и находки в соседних обла стях, дальнейшее обнаружение вида возможно в северо-западных и восточных облесенных районах области.
4.2. Криптические формы озерной лягушки – диагностика и распрост ранение в Пензенской области. Еще недавно было общепринято, что озерная ля гушка обитает на огромной территории от северо-западной Африки до восточного Казахстана. Однако исследования последнего десятилетия показали, что под этим названием скрывается целый "букет" морфологически сходных видов (Боркин и др., 2004;
Plotner et al., 2010). В Западной Европе уже различают 9–10 отдельных видов, ранее относимых к R. ridibunda (Боркин, 1998). На территории бывшего СССР этот комплекс изучен гораздо слабее, но по ряду различий физиологических и биохимических параметров были выделены две формы – "западная" и "восточ ная", уровень различий между которыми, возможно, соответствует видовому.
В ходе наших исследований обнаружено, что и на территории Пензенской области популяции R. ridibunda из различных локалитетов сильно различаются.
Многофакторный анализ морфологических признаков (рис. 6) и параметров зву кового сигнала (рис. 7) показал, что озерные лягушки распадаются на две обо собленные группы, одна из которых характеризуется относительно короткими дистальными отделами задних конечностей и меньшей длительностью криков и интервалов между ними, а другая – большими значениями этих параметров.
"ВОС ТОЧНАЯ " "ЗАП АДН АЯ" Ф ОРМА ФОРМА DF - - Солдатск ое озеро Барк ов ка -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 Чирч им DF Рис. 6. Распределение морфометрических индексов озерной лягушки из трех популяций в пространстве двух дискриминантных функций "ЗАПАДНАЯ" 4 ФОРМА "ВОСТОЧНАЯ" ФОРМА DF -2 Солдатск ое озеро Германия Чирчим Чувашия -4 Барковка -6 -4 -2 0 2 4 6 Засека DF Рис. 7. Распределение параметров звуковых сигналов озерной лягушки из шести популяций в пространстве двух первых дискриминантных функций Рис. 8. ML – дерево озерных (R.r.) и прудовых (R.l.) лягушек по данным секвенирования COI.
Обозначения 1, 2, 3 относятся к разным особям из одной выборки, GenBank – последовательности из базы данных NCBI. Звездочкой обозначены места совместного обитания (синтопии) "западной" и "восточной" форм. Индексы бутстреп-поддержки 70 % и внешняя группа не показаны По данным проведенного нами молекулярно-генетического анализа (ДНК штрихкодирование), различия между двумя формами озерных лягушек состави ли 5,2 % нуклеотидных замен, что практически соответствует видовому уровню.
На приведенной кладограмме (рис. 8) формы образуют два четко обособленных и статистически поддержанных кластера.
Из них к "западной" форме отнесены популяции лягушек Пензенской обл., гаплотипы которых минимально отличались от гаплотипов Польских лягушек (база данных NCBI), образуя с ними единую кладу с 95 % поддержкой. Гапло типы остальных популяций области отнесены нами к "восточной" форме, кото рая оказалась сестринской к экземплярам из Китая. Генетическая дифференциа ция двух форм озерной лягушки в пределах нашей области явно превышает тако вую между популяциями прудовой лягушки (R.l.), обитающими в Пензенской области и в Восточной Европе (см. рис. 8). Интересно, что нами выявлено два случая синтопии (совместного обитания) двух форм озерной лягушки, что пред полагает возможность существования между ними гибридизации. Пространствен но и биотопически "западная" форма отмечена в слабо трансформированных ме стообитаниях зоны смешанных и широколиственных лесов Сурского природно территориального участка. "Восточная" форма, по-видимому, экологически бо лее пластична, заселяет водоемы урбанизированных и селитебных ландшафтов, а также встречается в биотопах открытых пространств.
Таким образом, применение комплексного анализа позволило выявить но вый для фауны Пензенской области вид – съедобную лягушку, обнаружить в По волжье зону контакта ареалов двух криптических форм озерной лягушки – "за падной" и "восточной", и найти морфологические и биоакустические различия между ними. Это имеет важное значение как при рассмотрении теоретических вопросов биологии, например, микроэволюционных процессов, так и для реше ния практических задач изучения и сохранения биоразнообразия.
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК В УСЛОВИЯХ ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ Изучение влияния антропогенного фактора на диких животных, включая амфибий, представляет не только общебиологический, но и прикладной инте рес. Земноводные активно используются в качестве биоиндикаторов состояния антропогенно нарушенных экосистем в связи с высоким уровнем гетерогенно сти их популяций под влиянием стрессовых факторов – вплоть до проявления аномалий и изменения генетических характеристик.
5.1. Морфологические аномалии зеленых лягушек. В Поволжье и на со предельных территориях исследования, посвященные морфологическим аномали ям бесхвостых амфибий, проводились в Республике Татарстан (Замалетдинов, 2003), Самарской (Файзулин, 2005) и Тамбовской областях (Lada, 1999). Однако подобная информация по Пензенской области до настоящего времени отсутствовала.
У просмотренных экземпляров озерных лягушек зарегистрированы сле дующие случаи морфологических аномалий.
Эктромелия – уменьшение числа фаланг пальцев. У одного из 15 экз. (ру чей Круглый, Пензенское вдхр.) отсутствовали дистальные фаланги третьего и чет вертого пальцев левой задней конечности, и у одного из 15 экз. (дачный поселок "Сосновка", старица р. Суры) отсутствовала дистальная фаланга четвертого паль ца передней конечности. Микродактилия – уменьшение длины пальца. Отмечена у одного из 16 экз. (Солдатское озеро, г. Пенза) – укорочен четвертый палец правой передней конечности. Циклопия – врождённое отсутствие одного глаза. Анома лия встречена у одного экз. (Солдатское озеро). Поли-дактилия – многопалость, наличие лишних, дополнительных пальцев, а также раздвоение фаланг или мета тарзалий. В точке "Сосновка" у двух из 12 особей обнаружена полидактилия зад них конечностей. Кроме того, одна из этих особей имела дополнительные пальцы и на передних конечностях. На задних конечностях у обеих лягушек наблюдалось удвоение метатарзалий I пальца, дополнительный палец между I и II пальцами (рис. 9, а) и отсутствие пяточных бугров. На передних конечностях у одной из этих особей наблюдалось раздвоение проксимальных фаланг I пальца (рис. 9, б). Слу чай интересен тем, что полидактилия в нашем случае имеет симметричный харак тер, тогда как обычно подобные аномалии либо односторонние, либо двусторон ние, но не симметричные (Sas, Kovacs, 2006) (рис. 9).
Рис. 9. Скелет задних (а) и передних (б) конечностей самца Rana ridibunda с симметричной полидактилией (точка "Сосновка"). Римскими цифрами обозначены номера пальцев на левых конечностях У прудовых лягушек (г. Пенза, п. Согласие) встречен только один тип ано малий – асимметричная полидактилия задних конечностей (гексадактилия на пра вой, и гептадактилия на левой).
Из четырех точек, в которых были найдены особи с морфологическими ано малиями, две – "Сосновка" и "Солдатское озеро" – несут повышенную рекреацион ную нагрузку, одна – "Согласие" – сильно загрязнена бытовыми отходами, и одна – "ручей Круглый" – находится недалеко от мест прежнего уничтожения химического оружия открытым способом (Иванов, Панкратов, 2006). Возможно, находки в этих точках лягушек с аномалиями развития связаны именно с этими факторами.
Частота встречаемости аномалий у R. lessonae составила 9,5 %, у R. ridibunda в отдельных точках – 6,7 %, 12,5 % и 16,7 %. В целом по выборке зеленых лягу шек (n = 93), отловленных в водоемах г. Пензы и окрестностей, частота аномалий составила 8,6 %. Отметим, что особи с мальформациями не отмечены в водоемах с низкой антропогенной нагрузкой.
5.2. Генетическая изменчивость озерных лягушек в биотопах с разной антропогенной нагрузкой. Генетический полиморфизм озерных лягушек изучен с помощью RAPD-метода в трех биотопах с разной степенью трансформации лан дшафтов: фоновый биотоп с минимальным антропогенным влиянием – участок "Борок" заповедника "Приволжская лесосотепь", р. Кадада (точка "Контроль"), и два биотопа, находящихся под антропогенным влиянием. Первый – старица р. Суры в зоне защитных мероприятий объекта по уничтожению химического оружия (точ ка "ОУХО"), и второй – пруд в парковой зоне г. Пензы в микрорайоне Западная Поляна (точка "Город"). Анализ генетического полиморфизма популяций, вычис ленный по формуле: P = x/m, где x – число полиморфных локусов, m – общее число проанализированных локусов, показал, что его уровень в целом по выборке изме няется в пределах значений от 0,38 до 0,88. При межпопуляционном сравнении средних значений выявлено, что наиболее богатым спектром ПЦР-фрагментов, и, соответственно, высоким генетическим полиморфизмом (0,75) отличается выбор ка лягушек из наименее трансформированного биотопа "Контроль" (рис. 10).
У лягушек, обитающих в антропогенно трансформированных биотопах, уровень полиморфизма снижается, причем его наименьшее значение (0,55) об наружено у лягушек из селитебной зоны – точка "Город". Выборка из зоны за щитных мероприятий объекта по уничтожению химического оружия – точка "ОУХО" - имеет промежуточное значение. Достоверные отличия (p0,05) уровня генетического полиморфизма обнаружены только при сравнении выборки "Кон троль" и "Город". Таким образом, генетическая изменчивость популяций озер ных лягушек исследованных биотопов имеет обратную зависимость от степени антропогенной нагрузки.
Рис. 10. Электрофореграмма фрагментов амплификации с RAPD-праймером OPA-01 (слева) и уровень генетического полиморфизма (справа) экземпляров озерной лягушки из трех иссле-дованных биотопов с разной антропогенной нагрузкой ГЛАВА 6. СОСТОЯНИЕ ОХРАНЫ ЗЕМНОВОДНЫХ В ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ И РЕКОМЕНДАЦИИ ПО СОХРАНЕНИЮ ИХ РАЗНООБРАЗИЯ В настоящее время из 11 видов земноводных, обитающих в Пензенской об ласти, два включены в Красную книгу (2005) – прудовая лягушка и травяная ля гушка (R. temporaria). Этим видам присвоена категория 4 – неопределенный по статусу вид. Кроме того, в приложение к Красной книге занесены обыкновенный тритон (Lissotriton vulgaris) и обыкновенная, или серая жаба (Bufo bufo), как виды, нуждающиеся в особом внимании к их состоянию в окружающей среде. На терри тории участков заповедника "Приволжская лесостепь" отмечены десять видов ам фибий (Павлов, 1999), т.е. все земноводные области, за исключением съедобной лягушки. Другие меры охраны земноводных в регионе не применяются.
В ходе исследований мы оценивали редкость видов по показателю встре чаемости (Стрелков, Ильин, 1990), выраженному в процентах отношению мест находок каждого вида к общему количеству мест обнаружения земноводных. Та ким образом, были выделены 3 категории: "редкие" (0–7 %), "обычные" (8–14 %) и "часто встречающиеся" (15 %) виды (рис. 11).
Прудовая лягушк а 3% Зеленая Гребенчатый Съедобная жаба 4% тритон 6% лягушк а 1% О стромо рдая Обык новенная лягушка 22% жаба 7% Краснобрюхая ж ерлянк а 8% Оз ерная О быкновенный лягушка 21% трито н 8% Т равяная Обыкн овенная лягушка 13% чесночница 8% Рис. 11. Диаграмма встречаемости видов амфибий на территории Пензенской области Для сохранения разнообразия амфибий в регионе представляется целесо образным:
– создание зоологического заказника в Земетчинском районе Пензенской области, где отмечены редкие виды не только батрахофауны, но и других клас сов позвоночных животных, занесенных в Красную книгу области;
– проведение просветительской работы с населением, направленной на из менение негативного отношения к этой группе животных. Положительный эф фект подобной работы имел место в 2001 г. при осуществлении в ряде областей Поволжского региона, в том числе Пензенской, образовательного проекта "Ца ревна-лягушка" (Материалы…, 2002);
– включение в Красную книгу Пензенской области съе-добную лягушку с категорией 4 – неопределенный по статусу вид.
ВЫВОДЫ 1. Современная фауна амфибий Пензенской области представлена 11 видами, неравномерно распределенными по трем природно-территориальным участкам, что связано как с разнородностью биотопов, так и со степенью их изученности.
2. Результаты анализа межпопуляционной изменчивости морфологических, биоакустических и молекулярно-генетических признаков позволили обнаружить обитание на территории области гибридогенного вида – съедобной лягушки (Rana esculenta), а также криптических форм озерной лягушки ("западной" и "восточной").
3. Cлучаи морфологических аномалий (эктромелия, микродактилия, цик лопия, полидактилия) отмечены у зеленых лягушек только в черте г. Пензы с частотой аномалий 8,6 %.
4. Анализ генетического полиморфизма популяций озерной лягушки вы явил, что с повышением степени антропогенной трансформации биотопов гене тическое разнообразие снижается, не достигая, однако, уровня мономорфности.
5. Анализ кадастровой информации позволяет отнести к редким видам регио на (встречаемость 0–7 %) гребенчатого тритона, обыкновенную жабу, зеленую жабу, прудовую лягушку, съедобную лягушку;
к обычным видам (8–14 %) – обыкновенно го тритона, краснобрюхую жерлянку, обыкновенную чесночницу, травяную лягуш ку;
к многочисленным видам (15 %) – озерную и остромордую лягушек. Предло жен комплекс мер, направленных на сохранение разнообразия земноводных, вклю чающий создание особо охраняемых природных территорий, расширение списка охраняемых видов и проведение просветительской работы с населением.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых научных журналах из перечня ВАК 1. Закс М.М., Симонов Е.П., Ермаков О.А. Распространение земноводных (Amphibia) на территории Пензенской области // Известия ПГПУ им. В.Г. Белин ского. 2011. № 25. С. 181–190.
2. Закс М.М. К вопросу о морфологических различиях популяций озер ной лягушки (Pelophylax (Rana) ridibundus) Пензенской области // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2012. № 29. С. 209–212.
3. Закс М.М., Ермаков О.А. Межпопуляционная изменчивость звукового сигнала озерной лягушки Pelophylax (Rana) ridibundus в Среднем Поволжье // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2012. № 29. С. 213–215.
Статьи в журналахи сборниках 4. Закс М.М. Биоакустический анализ звуковых сигналов зеленых лягу шек Rana kl. esculenta-комплекс (предварительные данные) // Известия ПГПУ им. В. Г. Белинского. 2008. № 10. С. 178–181.
5. Закс М.М. О морфологических аномалиях зеленых лягушек (Rana ridibunda, R. lessonae) г. Пензы // Известия ПГПУ им. В. Г. Белинского. 2008. № 14. С. 63–65.
6. Закс М.М. Морфометрия и аномалии развития зеленых лягушек Rana esculenta-комплекс Пензенской области // Экологический сборник – 2. Труды мо лодых ученых Поволжья. Тольятти: ИЭВБ РАН, 2009. С. 51–55.
7. Закс М.М., Рыжов М.К., Ермаков О.А. Съедобная лягушка (Rana esculenta, L., 1758) в Чувашии: биоакустические данные // Вопросы герпетоло гии: Матер. IV съезда герпетологического об-ва им. А.М. Никольского. СПб: Рус ская коллекция, 2011. С. 93–96.
8. Закс М.М. Материалы к кадастру земноводных (Amphibia) Пензенской области // Региональные кадастры животного и растительного мира и Красные книги: Матер. Всеросс. науч.-практ. конф. (24–25 сентября 2012 г., Тамбов - Гал дым). Тамбов: ТГУ, 2012. С. 28–33.
Тезисы конференций и совещаний 9. Закс М.М. История и перспективы изучения герпетофауны Пензенской области // Биоразнообразие: проблемы и перспективы сохранения: Матер. Меж дунар. науч. конф., посв. 135-летию со дня рождения И.И. Спрыгина (13–16 мая 2008 г., Пенза). Часть 2. Пенза: ПГПУ им. В.Г. Белинского, 2008. С. 246–247.
10. Закс М.М. Полидактилия у озерной лягушки Rana ridibunda как показа тель состояния водных биотопов // Биология – наука ХХI века: Сб. тезисов 14-й Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых. Т. 2. Пущино, 2010. С. 36.
Благодарности. Автор выражает благодарность О.А. Ермакову за руково дство работой на всех этапах ее осуществления, коллективу кафедры зоологии и экологии Пензенского государственного университета за плодотворное общение, РФФИ за финансовую помощь в проведении исследований (проект № 12-04 97073-р_поволжье_а).
ЗАКС Михаил Михайлович ЭКОЛОГИЯ ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК (Rana esculenta complex) ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ: РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ПОПУЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ, ВЛИЯНИЕ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Компьютерная верстка Д.Б. Фатеева, Н.Н. Зосимовой Сдано в производство 21.05.13. Формат 60х84 1/ Бумага типогр. №1. Печать трафаретная. Шрифт Times New Roman Cyr.
Усл. печ. л. 1,16. Уч.-изд. л. 1,18. Заказ № 2300. Тираж 100.
Пензенская государственная технологическая академия.
440605, Россия, г. Пенза, пр. Байдукова/ ул. Гагарина, 1а/11.