авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Структурные изменения днк при действии низкоинтенсивной ионизирующей радиации в малых дозах

На правах рукописи

ЗАВАРЫКИНА ТАТЬЯНА МИХАЙЛОВНА СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ДНК ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКОИНТЕНСИВНОЙ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ В МАЛЫХ ДОЗАХ 03.00.01 – Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Научный консультант: доктор химических наук Жижина Галина Павловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Васильева Светлана Васильевна доктор биологических наук, профессор Гераськин Станислав Алексеевич

Ведущая организация: Московская Государственная Академия Ветеринарной Медицины и Биотехнологии им. К.И.Скрябина

Защита состоится « »_2008 г. в _ часов на заседании Диссертационного совета Д 006.068.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиоэкологии (ВНИИСХРАЭ) Россельхозакадемии по адресу: 249032, г.

Обнинск, Калужская обл., Киевское шоссе, 109 км.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « »_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.068. кандидат биологических наук Шубина О.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Ионизирующая радиация (ИР) на сегодняшний день тесно связана с жизнедеятель ностью человека и биоты за счет присутствия естественных радионуклидов, работы различных объектов атомной промышленности, аварий на них, использования ИР в ме дицинских целях и других источников излучения. Облучение биологических объектов зачастую не связано с высокими дозами ИР. Исследования влияния ионизирующей ра диации в малых дозах на геном, мембраны и ферментные системы клеток начаты срав нительно недавно. Однако уже становится ясно, что в условиях длительного низкоин тенсивного облучения неприменимы старые критерии ожидаемых эффектов (Бурлакова Е.Б., 1996). Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что такое влияние приводит к повреждениям генетического и мембранного аппарата, изменению метабо лической активности антиоксидантных (АО) ферментов и клеток в целом, экспрессии различных генов, вероятности индукции апоптоза (Шевченко В.А., 1996;

Зайнуллин В.Г., 1999, 2000;

Мазурик В.К., 2005).

Однако кроме сложных биохимических и генетических критериев слабых радиа ционных воздействий необходимо изучение изменений физико-химических свойств ДНК, хроматина, мембран с помощью более простых и доступных методов по критери ям, чувствительным к действию ИР в малых дозах. Одними из таких критериев является повреждение первичной структуры (образование разрывов) и изменения вторичной структуры ДНК (адсорбция на нитроцеллюлозных (НЦ) фильтрах).

В литературе дискутируется вопрос о возможных отрицательных биологических последствиях ионизирующего излучения в малых дозах, активно изучается вопрос не стабильности генома, индуцированной действием ИР (Безлепкин В.Г., Газиев А.И., 2000, 2001). Поэтому в настоящее время становится очевидной необходимость более глубокого исследования механизмов действия на биологические структуры ИР в малых дозах, а также методов защиты животных и человека. Данные проблемы еще далеки от разрешения, и некоторые актуальные задачи поставлены в настоящей работе.

Другим не менее важным вопросом является эффективность малых доз биологиче ски активных веществ, в том числе пероксида водорода (Н2О2). Это соединение служит важным компонентом, образующимся из молекул воды под действием ИР (Тарусов Б.Н., 1965), и играет существенную роль в формировании эффектов малых доз радиа ции, что подтверждается результатами данной работы.

Кроме того, проводятся обширные исследования в области радиационной индук ции и развития канцерогенеза (Дж. Гофман, 1994). В этой связи большой интерес пред ставляет изучение развития спонтанного лейкоза у мышей линии AKR при воздействии на процесс как ИР в малых дозах, так и действия антиоксиданта фенозана.

Большой интерес представляет изучение возможностей радиационной защиты в низкодозовой области. В связи с тем, что вещества, обладающие радиопротекторными свойствами при высоких дозах ионизирующих излучений неэффективны в области ма лых доз ИР, возникает необходимость поиска новых, возможно принципиально отли чающихся по механизму действия препаратов, активных в данной области (Кудряшов Ю.Б., 1997). С этой точки зрения в настоящей работе рассматривается группа веществ с нетрадиционным для классических радиопротекторов характером действия – 2,5 дифенил-1,3-оксазол (ДФО) и его производные.

Цель и задачи исследования Цель работы заключалась в изучении влияния низкоинтенсивной ионизирующей радиации (ИР) в малых дозах на структурное состояние ДНК селезенки мышей и лим фоцитов крови человека;

поиске возможных радиозащитных средств в этой области доз.

Основными задачами

исследования являлись:

1. Сравнение структурных изменений ДНК (разрывов и адсорбции на НЦ фильтрах) селезенки при облучении мышей с разной радиочувствительностью, а именно гиб ридов резистентной линии F1(CBAxC57Bl) и мышей радиочувствительной линии АКR при -облучении в дозе 1,2 сГр (0,6 сГр/сут). Проведение измерения эффектов через 1 и 30 суток после облучения.



2. Оценка влияния активных форм кислорода на структурные повреждения ДНК при облучении малыми дозами ИР.

3. Изучение изменения структурных характеристик ДНК селезенки мышей линии АКR при развитии спонтанного лимфоидного лейкоза и влияния облучения в дозе 1,2 сГр на скорость развития этого процесса.

4. Сравнение структурных характеристик ДНК лимфоцитов крови здоровых доноров (18 чел) и онкологических больных (18 чел).

5. Исследование радиозащитных свойств антиоксиданта фенозана по изменению структурных характеристик ДНК при его введении в концентрациях 10-4 и 10- моль/кг до облучения мышей линий F1(CBAx C57 Bl) в дозе 1,2 сГр.

6. Изучение потенциальных радиопротекторных свойств ДФО и его производных, способных поглощать энергию ионизирующего излучения, в области малых доз ИР.

Научная новизна работы При сравнении действия общего облучения ионизирующей радиацией в малых до зах на структурное состояние ДНК селезенки мышей трех линий с различной радиочув ствительностью было обнаружено изменение изученных параметров ДНК. Впервые вы явлена корреляция радиочувствительности мышей с направленностью изменений структурных характеристик ДНК по измерению адсорбции на НЦ. Получены данные, свидетельствующие о возможном участии пероксида водорода в изменении структур ного состояния ДНК при действии малых доз ИР. Впервые обнаружены изменения структурных характеристик ДНК после введения мышам Н2О2 в малой концентрации. В эксперименте in vitro выявлена зависимость эффекта воздействия пероксида водорода на структуру ДНК от исходного состояния биополимера. Эти различия выявлены как между ДНК мышей F1 и AKR, так и между ДНК интактных и облученных мышей AKR.

Исследование радиозащитных свойств антиоксиданта фенозана показало возмож ность модификации этим соединением влияния ИР в малых дозах на структуру ДНК.

Обнаружены пролонгированные радиозащитные свойства фенозана по отношению к структуре ДНК как в дозе 10-4 моль/кг, так и в малой дозе 10-14 моль/кг.

Впервые изучено действие ИР в дозе 1,2 сГр (0,6 сГр/сут) на структурные характе ристики ДНК при развитии лейкоза у мышей AKR и выявлены более ранние структур ные изменения ДНК, чем при спонтанном развитии заболевания. Введение фенозана, напротив, нормализует состояние структуры ДНК, что согласуется с известным фактом замедления этим препаратом развития лейкоза АКR.

В работе обнаружен более высокий уровень разрывов ДНК селезенки у мышей ли нии AKR по сравнению со здоровыми животными гибридами F1(CBAx C57 Bl) и ДНК лимфоцитов крови у онкологических пациентов по сравнению со здоровыми лицами. В связи с этим высказано предположение о повышенной степени поврежденности ДНК при канцерогенезе.

Изучение соединений группы 2,5-дифенилоксазола в качестве радиопротекторов с нетрадиционным характером действия показало наличие у них как радиопротекторных, так и радиосенсибилизирующих свойств в зависимости от используемых концентраций и уменьшения генотоксичности с помощью фенозана.

Научная и практическая значимость работы Результаты проведенных исследований имеют важное теоретическое и практиче ское значение для понимания роли повреждений ДНК в феномене радиочувствительно сти животных, влияния ИР в малых дозах на ДНК в организме животных, зависимости степени радиационного повреждения ДНК от ее исходного состояния. Полученные ре зультаты свидетельствуют о возможности модифицировать эффект облучения с помо щью соединений различных классов. Данные, полученные в работе, позволяют предло жить антиоксидант фенозан для дальнейшего исследования этого препарата в качестве радиопротектора пролонгированного действия в области малых доз ИР. Результаты сравнительных исследований состояния структуры ДНК онкологических пациентов и здоровых лиц позволили выявить информативные показатели для оценки фактора риска канцерогенеза.

Апробация диссертации и публикации.

Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 14 пе чатных работах, из них 3 - статьи в журналах и 11 - тезисов докладов.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались: III Международный сим позиум «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, декабрь 2002);

Международ ная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, ок тябрь 2003, ноябрь 2006);

III Съезд биофизиков России, (Воронеж, июнь 2004);

«Фун даментальные науки – медицине» (Москва, декабрь 2004, декабрь 2005, ноябрь 2006, декабрь 2007);

«Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимиче ской защиты» (Санкт-Петербург, май 2004);

V Съезд по радиационным исследованиям (Москва, 2006);

VII Международная конференция «Биоантиоксидант» (Москва, 2006).

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 168 стр., содержит 33 рисунка, 14 таблиц. Диссертация состо ит из введения, 3 глав (Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Резуль таты исследования и обсуждение) выводов и списка литературы, включающего ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Объекты, материалы и методы исследования Объектами исследования являлись препараты ДНК, выделенные из селезенок мышей линий AKR, Balb/c и гибридов F1(CBAxC57Bl), а также из лимфоцитов крови здоровых доноров (18 чел) и онкологических больных (18 чел).

Линии мышей. Работа выполнена на 3-месячных мышах-самках мышах трех линий: AKR (180 шт), Balb/c (400 шт) и гибриды F1(CBAxC57Bl) (200 шт). Мыши линии AKR являются носителями лейкозного вируса Гросса, у которых лейкоз развивается спонтанно. Для линий AKR и Balb/c характерна повышенная радиочувствительность.

Гибриды F1(CBAxC57Bl) не имеют отличительных особенностей. Животные были по лучены из Научного центра биомедицинских технологий РАМН и содержались в стан дартных условиях.

Образцы крови людей. Образцы крови были получены от здоровых лиц и онко логических пациентов с установленным раком верхних дыхательных путей до начала лечения. Венозная кровь отбиралась в пробирки системы BD Vacutainer ® с цитратом на трия 0,105 М (3,2%).

Изучение действия малых доз ионизирующей радиации на состояние структуры ДНК проводилось на трех линиях мышей: AKR, Balb/c и гибридах F1(CBAxC57Bl). Ис пользовались источники -излучения 137Cs (мощность дозы 0,6 и 6 сГр/сут) и рентге новских лучей (мощность дозы 44 сГр/мин):

Влияние внутрибрюшинного введения пероксида водорода в концентрации 10- М (конечная расчетная концентрация 10-12 моль/кг) на структурные свойства ДНК через 1 час после введения проводилось на мышах-гибридах F1(CBAxC57Bl). Использовали водный раствор Н2О2 (хч) с концентрацией 1,7 М (Е=43,6 м-1см-1, l=240 нм).

Опыты по изучению влияния препарата фенозана на структуру ДНК проводили на мышах линии АКR и гибридах F1(CBAxC57Bl). Фенозан вводили мышам внутрибрю шинно ежедневно в виде водного раствора в течение 4 дней в концентрациях 10-14 или 10-4 моль/кг. В опытах без облучения выделение препаратов ДНК проводили на 2-е и 30-е сутки после 4-го введения препарата. В опытах с облучением через сутки после 4 го введения животных облучали в дозе 1,2 сГр (0,6 сГр/сут, -излучение, 137Cs). ДНК выделяли сразу или через 30 сут после облучения.

Исследования влияния препаратов группы 2,5-дифенилоксазола (ДФО) проводи лись на мышах линии Balb/c. При изучении свойств препаратов группы ДФО без облу чения, их вводили внутрибрюшинно в четырех концентрациях (табл. 3) за 30 мин до за боя. При исследовании радиозащитных эффектов препараты вводились в тех же кон центрациях за 30 мин до облучения рентгеновскими лучами в дозе 12 сГр (44 сГр/мин), забивали мышей через 60 мин после облучения. Поскольку все препараты гидрофобны, они вводились в виде суспензии в смеси: твин 80-ацетон-вода = 0,3: 1,0: 8,7.

Выделение препаратов ДНК из селезенки мышей проводили модифицирован ным методом Мармура (Marmur J., 1961) с дополнительной ферментативной обработ кой.

Выделение ДНК из крови людей и мышей проводили с использованием набора реагентов “Diatom DNA Prep 400”, Лаборатория Изоген, Россия.

Измерение адсорбции ДНК на НЦ фильтрах. Тестом на наличие Z-участков в В спирали ДНК служила адсорбция (А) на нитроцеллюлозных (НЦ) фильтрах (“Millipore Co.”, d=25мм, размер пор 0.45µм) (Kuhnlein U., 1980). Фильтрование растворов ДНК в 0,15 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4 (“Sigma”) проводили при слабом разрежении, по 5 аликвот каждого образца ДНК (Жижина Г.П., 1992). Оптическую плотность рас твора ДНК при 260 нм измеряли на спектрофотометре “Genesis 10 UV” (США) до (D0) и после (D) фильтрования. Адсорбцию ДНК вычисляли по формуле: A = [(D0 – D)/ D0]x100%.

Метод гель-электрофореза ДНК. Наличие двунитевых разрывов (ДР) ДНК выяв ляли методом гель-электрофореза ДНК в нейтральном 0,7% агарозном геле “Serva”, в буфере ТАЕ, “Fermentas” (ЕС) при постоянном напряжении V=3.0 В/см. Определение однонитевых разрывов (ОР) ДНК проводили в 0,7% щелочном агарозном геле, в буфере для щелочного электрофореза (50 ммоль NaOH, 2 ммол/л Na2-ЭДТА), предварительно денатурировав ДНК с помощью 1/10 объема 1 М NaOH. Щелочной электрофорез про водили при постоянном напряжении V=4.0 В/см. Гели окрашивали раствором 1 µг/мл бромистого этидия и оцифровывали с помощью видеосистемы “Gel Imager 2”. Обработ ку изображений осуществляли с помощью программ Gel Imager и Scion Image Beta 4.0.2. Число N двунитевых или однонитевых разрывов на молекулу ДНК вычисляли по формуле: S/(S0 – S) = exp-N, где S0 – площадь всего пика, а S – площадь пика, ограни ченная ординатой максимума пика контрольной ДНК (Young J., 1965). Молекулярный вес фрагментов ДНК мышей-гибридов F1 составлял 15 МДа, мышей линии Balb/c – МДа, мышей линии AKR – 12 МДа. В качестве маркеров молекулярной массы (Мм) ДНК использовали рестрикты ДНК фага + ЕсоRI (“Serva”).

Статистическая обработка результатов производилась при помощи программ Excel XP и Statistica 6.0.





2. Результаты и их обсуждение 2.1. Влияние малых доз ИР на структуру ДНК мышей линий F1(CBAxC57Bl), Balb/c и AKR Были исследованы адсорбция на НЦ и количество ДР и ОР в ДНК органов трех линий мышей, различающихся по своим характеристикам: AKR, Balb/c и гибриды F1(CBAxC57Bl) (табл. 1, 2). При действии ИР в малых дозах наблюдалось изменение значений адсорбции ДНК селезенки всех трех линий мышей, причем у мышей-гибридов F1(CBAxC57Bl) выявлено повышение этого параметра, тогда как у мышей линий Balb/c и AKR – понижение (рис. 1).

Влияние изученных доз ИР на количество индуцируемых ДР ДНК линий Balb/c и гибридов F1 выражается в образовании одинакового количества ДР (в среднем – 0, ДР на молекулу). Выделяется среди прочих ДНК мышей линии AKR, в которой образу ется больше ДР, чем в ДНК других линий. Контрольная ДНК данных животных уже со держит значительно большее количество ДР ДНК по сравнению с другими ли ниями (0,20 ДР по сравнению с 0,05 ДР (в среднем), табл. 2).

Таблица 1. Сравнение некоторых характеристик различных линий мышей при облуче нии.

Линия мышей LD50, Вид излу- Мощность Доза, Адсорбция ДР ОР Гр чения дозы сГр ДНК, ДНК* ДНК* отн.ед.

F1(CBAxC57Bl) 6,0 Х-лучи 44 сГр/мин 12 1,1 0,20 0, Balb/c 4,0 Х-лучи 44 сГр/мин 12 0,6 0,17 0, F1(CBAxC57Bl) 6,0 ( Сs) 0,6 сГр/сут 1,2 1,35 0,22 0, AKR 3,0 ( Сs) 0,6 сГр/сут 1,2 0,7 0,41 0, * - разность количества ДР и ОР в контрольной и облученной группах мышей.

1, * А 1, Адсорбция ДНК, отн.ед.

Рис.1. Сравнение адсорбции на НЦ 1, без фильтрах ДНК селезенки самок мы 1, облучения шей разных линий:

после 0, облучения * 0, А – гибридов F1(CBAxC57Bl) и мы 0, шей линии Balb/c, выделенной на 1-е 0, сутки после общего воздействия облучения в дозе 12 сГр ( F1(CBAxC57Bl) Balb сГр/мин).

1, Адсорбция ДНК, отн.ед.

Б * 1, Б – мышей-гибридов F1(CBAxC57Bl) 1, и линии АКR, выделенной на 1-е и контроль 30-е сут после общего воздействия * * 0, -облучения в дозе 1,2 сГр (0, 1-е сут 0, сГр/мин).

30-е сут 0, * р 0,05 по отношению к 3-мес ин 0, тактному контролю соответствую щей линии.

АКR F1(CBAxC57Bl) Сравнение эффектов разных вариантов облучения на мышей F1(CBAxC57Bl) (табл. 2) показывает, что низкоинтенсивная ИР достоверно повышает этот параметр, причем обе дозы 1,2 сГр (0,6 сГр/сут) и 12 сГр (6 сГр/сут) дают одинаковый результат.

Это справедливо и для индукции ДР и ОР ДНК.

Высокоинтенсивная, но низкодозовая ИР (12 сГр, 44 сГр/мин) вызывает только тенденцию (10%) к увеличению адсорбции ДНК, а количество ДР и ОР (0,26 ДР и 0, ОР) не отличается от такового для низкоинтенсивной ИР (в дозах и 12 сГр, и 1,2 сГр).

Облучение мышей-гибридов F1(CBAxC57Bl) в дозе 245 сГр (44 сГр/мин) вызывает более выраженные эффекты: адсорбция ДНК падает до 0,2 отн.ед. относительно кон троля и образуется большое количество ДР и ОР (0,93 ДР и 1,75 ОР).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ИР в малых дозах влияет на изученные нами структурные характеристики ДНК селезенки мышей разных линий (как на адсорбцию ДНК на НЦ фильтрах, так и на количество разрывов ДНК). Изменение адсорбции ДНК на НЦ отчетливо связано с радиочувствительностью линий мышей.

Действие низкоинтенсивной радиации на чувствительные линии Balb/c и AKR вызыва ет снижение значения адсорбции ДНК, при облучении радиоустойчивых мышей гибридов F1(CBAxC57Bl) адсорбция ДНК повышается. При высокой интенсивности об лучения мышей F1 наблюдается тенденция к повышению адсорбции ДНК по сравне нию с необлученным контролем. Таким обр., показано разнонаправленное действие ра диации на адсорбцию ДНК в зависимости от радиочувствительности линии мышей.

Таблица 2. Влияние различных вариантов облучения на структурные характеристики ДНК мышей.

Связывание, % Связы- ДР, ОР, Вид излу- Линия Доза медиана вание, медиана медиана чения мышей (квартили) отн.ед. (квартили) (квартили) 20,79 0,05 0, F1 К 1, (20,79-20,83) (0,02-0,06) (0,10-0,17) 28,12 0,27 0, F1 обл 1, (28,06-28,12) (0,24-0,30) (0,46-0,52) 1,2 сГр, -лучи 0,6 сГр/сут 31,06 0,20 0, AKR К 1, (31,06-31,20) (0,18-0,22) (0,43-0,49) 21,60 0,61 0, AKR обл 0, (21,40-21,60) (0,56-0,63) (0,89-0,97) 20,20 0,04 0, F1 К 1, (20,00-20,35) (0,02-0,05) (0,15-0,20) 12 сГр, -лучи 6 сГр/сут 26,32 0,24 0, F1 обл 1, (26,28-26,36) (0,19-0,27) (0,42-0,46) 20,81 0,06 0, F1 К 1, (20,79-20,86) (0,03-0,07) (0,11-0,16) 22,82 0,26 0, 12 сГр, F1 обл 1, Х-лучи 44 сГр/мин (22,77-22,82) (0,21-0,29) (0,42-0,48) 20,24 0,08 0, Balb/c К 1, (20,20-20,24) (0,04-0,09) (0,17-0,22) Balb/c 11,53 0,25 0, 0, обл (11,53-11,73) (0,20-0,29) (0,49-0,54) 20,81 0,06 0, F1 К 1, 245 сГр, (20,79-20,86) (0,03-0,07) (0,11-0,16) Х-лучи 44 сГр/мин 3,61 0,93 1, F1 обл 0, (3,56-3,66) (0,89-0,97) (1,70-1,83) В работе Жижиной Г.П., (1992) показано, что величина адсорбции ДНК на нитро целлюлозе характеризует конформационное состояние спирали ДНК, увеличиваясь с повышением содержания участков, находящихся в Z-форме (которые закреплены бел ками и сохраняются в выделенных препаратах ДНК). Это, в свою очередь, тесно связа но с активностью процессов транскрипции. Доказано, что с увеличением количества ак тивно транскрибирующихся генов увеличивается количество участков ДНК, находя щихся в Z-форме (Wittig B., 1991;

Wolfl S., 1995, 1996). Следовательно, изменение ве личины адсорбции ДНК мышей под действием ИР в малых дозах отражает степень экс прессии их генома. Таким обр., радиочувствительные линии мышей реагируют на об лучение в малых дозах как низко- так и высокоинтенсивной ИР снижением транскрип ционной активности хроматина (понижением адсорбции ДНК на НЦ фильтрах). У мы шей-гибридов F1 наблюдается противоположный эффект – усиление процессов транс крипции, который зависит от интенсивности ИР: низкоинтенсивное облучение сильнее влияет на транскрипционную активность хроматина, тогда как высокоинтенсивное – незначительно.

Достоверных различий количества разрывов ДНК при низко- и при высокоинтен сивной ИР не выявлено. Данное наблюдение можно связать с нелинейной зависимо стью эффекта от дозы и интенсивности облучения, характерной, по мнению большого числа авторов, для области малых доз ИР. Эта закономерность наблюдается в низкодо зовой области для многих параметров клетки (Бурлакова Е.Б., 1990;

Бурлакова Е.Б., 1994;

Смотряева М.А., 1996;

Мальцева Е.Л., 1998;

Вартанян Л.С., 2000;

Климкина Л.А., 2007).

2.2. Действие пероксида водорода на структуру ДНК in vitro и in vivo При облучении организма ИР существенную роль играет косвенное действие ра диации, в процессе которого образуются свободные радикалы и другие высокореакци онные соединения. Одним из таких веществ является пероксид водорода, обладающий выраженными окислительными свойствами и участвующий в образовании поврежде ний под действием ИР. С другой стороны, имеется много литературных данных о пе роксиде водорода как о сигнальной молекуле, которая является одним из регуляторов экспрессии генов (Shibanuma M., 1988;

Murell G.A.C, 1990;

Wang L., 2008).

Было исследовано влияние малых концентраций этого соединения на структурные свойства ДНК in vivo. Мышам F1(CBAxC57Bl) вводили внутрибрюшинно Н2О2 в конеч ной концентрации 10-12 моль/кг и через 1 час забивали, извлекая селезенку и выделяли ДНК. Обнаружено, что действие Н2О2 в организме мышей влияет на конформационные свойства ДНК (рис.2), вызывая увеличение адсорбции ДНК в 1,5 раза, а также индуци рует ДР ДНК (ДР(опыт – контроль) = 0,55). Эти результаты согласуются с предполо жением о том, что в организме мышей малые концентрации Н2О2 кроме повреждающе го действия (индукция ДР ДНК) играют также и регуляторную роль, влияя на метабо лизм и функциональное состояние ДНК (адсорбция). В литературе имеются данные, что индукция пролиферации клеток ВНК-12/С13 обнаружена для Н2О2 в концентрации 10- М, а сестринские хроматидные обмены в культуре клеток китайского хомячка – для 10- М пероксида (Burdova K.H., 1995).

1, Контроль Рис.2.Влияние внутрибрю 1, шинного введения мышам 1, 1 Н2О2 на структуру ДНК по Введение 0,8 результатам связывания с пероксида 0, НЦ-фильтрами и расчета водорода 0, числа ДР разрывов ДНК.

0, Связывание, ДР на отн.ед. молекулу Таким образом, нами впервые обнаружен эффект влияния малой концентрации Н2О2 на структурное состояние ДНК в живом организме. Величина эффекта сопостави ма с действием ИР на эту же линию мышей F1 в дозах 1,2 или 12 сГр (табл. 2).

Для более подробного выяснения действия Н2О2 на структурные характеристики ДНК были проведены опыты in vitro. Раствор ДНК, выделенной из селезенок интактных мышей-гибридов F1(CBAxC57Bl), а также 3-месячных интактных или облученных (1, сГр, 0,6 сГр/сут) мышей линии AKR, инкубировали при 37оС с 1,4х10-7 моль/л Н2О2 в течение различного времени.

Полученные результаты согласуются с опытом in vivo и указывают на то, что на гревание и Н2О2 способствуют реализации скрытых повреждений ДНК, а пероксид, кроме того, индуцирует дополнительные окислительные повреждения ДНК.

Этот эффект можно связать с широко обсуждаемым в литературе феноменом ги перчувствительности биологических объектов к повторному облучению (Пелевина И.И., 1994;

Joiner M.C., 2001). Так как пероксид водорода участвует в косвенном дейст вии ИР в малых дозах, инкубацию ДНК с ним можно с некоторыми допущениями рас сматривать как повторное облучение ИР. При этом эффект отчетливее проявляется в ДНК облученных мышей.

2.3. Влияние низкодозовой низкоинтенсивной ИР на структурное состояние ДНК при развитии лейкоза мышей AKR Действие низкоинтенсивной ИР в малых дозах оказывает стрессовое воздействие на организм мышей, снижая их АО статус и усиливая процессы окисления липидов мембран (Шишкина Л.Н., 1999). В работе (Вартанян Л.С., 2001) показано, что развитие лейкоза AKR как в латентном периоде, так и на стадии развития лейкоза, сопровожда ется пониженным статусом АО систем организма. Окислительный стресс (эндогенный или экзогенный), влияя на активность экспрессии генома, вызывает изменение количе ства Z–сайтов и, следовательно, конформации ДНК (Жижина Г.П., 2001). Ранее было обнаружено повышение уровня связывания ДНК с НЦ при активации транскрипции в нормальных тканях и более высокое содержание Z-участков в ДНК опухолевых, чем в ДНК нормальных клеток и тканей (Жижина Г.П., 1983;

1986).

Развитие лейкоза у мышей линии АКR сопровождается существенными конфор мационными изменениями ДНК (изменением адсорбции) (рис. 3, кривая 1, Жижина Г.П., 2001). С возрастом мышей АКR (с развитием лейкозного процесса) величина ад сорбции ДНК на НЦ увеличивается, начиная с 6 месячного возраста, что соответствует началу гибели животных. Максимум на кривой адсорбции ДНК соответствует 8 месячному возрасту мышей, который совпадает со средней продолжительностью жизни животных (254,4±10,7 сут.) (Бурлакова Е.Б., 2001).

В данной работе исследовалось влияние ИР в дозе 1,2 сГр (0,6 сГр/сут) на струк турные характеристики ДНК 3-мес мышей линии АКR сразу после облучения и в дина мике. Облучение в дозе 1,2 сГр приводило к снижению А ДНК до 0,7 относительно контрольного уровня (рис.1Б). Последействие облучения у мышей АКR выражалось в сохранении этого значения А в течение месяца и 1,9-кратном его повышении через месяца (рис. 1Б, 3). Выделенная ДНК селезенки лейкозных мышей 3-мес возраста уже содержит некоторое количество ДР (0,2). При облучении количество ДР ДНК мышей АКR увеличивалось до 0,66 ДР. При изучении последействия облучения обнаружено, что максимум зависимости «адсорбция ДНК – возраст» появился на 1,5 месяца раньше, чем при спонтанном развитии лимфолейкоза (рис. 3). По-видимому, это связано с тем, что однократное облучение этих животных ускоряет развитие лейкоза, увеличивает частоту его возникновения и снижает среднюю продолжительность жизни на 37 дней (Бурлакова Е.Б., 2001а).

2, Адсорбция ДНК, отн. ед.

Рис.3. Динамика возрас 1, тных изменений адсорбции 1, ДНК, выделенной из селе без облучения 1, зенки мышей линии АКR в 0,75 контроле (кривая 1, Жижи после 0,5 облучения на Г.П., 2001) и после одно 0, кратного облучения в дозе 1,2 сГр (кривая 2).

2 3 4 5 6 7 8 9 Возраст мышей, мес 2.4. Структурные особенности ДНК лимфоцитов крови при канцерогенезе человека Как показано выше, структурные характеристики ДНК лейкозных селезенок мы шей линии AKR отличаются от таковых ДНК селезенки мышей-гибридов F1. Это вы ражается в повышенном уровне А и содержания ДР у мышей AKR.

Ранее структурные особенности раковой ДНК исследовали сотрудники ИХФ РАН (Жижина Г.П., Акифьев А.П., Шугалий А.В. и др.) и доказали, что ДНК при злокачест венных процессах содержит повышенное количество участков локальной денатурации (УЛД). Они были выявлены как у раковых животных, так и онкологических больных при лейкозах и других видах злокачественных новообразований. Затем Жижина и сотр.

доказали, что УЛД являются участками Z-формы и пограничными j-сайтами в основной физиологической В-форме ДНК эукариот (Жижина Г.П., 2001). При активации транс крипции содержание Z-участков повышается и в ДНК нормальных клеток и тканей (Жижина Г.П., 1983, 1986).

В настоящей работе усовершенствованный метод гель-электрофореза, регистрации гелей и цифровые методики расчета позволили выявить наличие повышенного количе ства ДР и ОР в ДНК селезенки лейкозных мышей AKR по сравнению со здоровыми мышами-гибридами F1(CBAxC57Bl). Для выяснения универсальности данного явления было исследовано количество разрывов ДНК лимфоцитов крови здоровых людей (до норов) и онкологических больных с установленным раком верхних дыхательных путей до начала лечения. Полученные результаты представлены на рис. 4. Сравнение количе ства разрывов ДНК доноров и онкологических больных выявило достоверные различия между этими группами людей как по ДР, так и ОР ДНК (рис. 4). Достоверность разли чий между группами «доноры» и «больные» определена по непараметрическому тесту Манна-Уитни: ДР: р=0,0001;

ОР: р=0,0023. Эти данные согласуются с результатами, полученными при сравнении количества разрывов ДНК здоровых мышей-гибридов F1(CBAxC57Bl) и мышей линии AKR со спонтанно возникающим лейкозом.

Основываясь на полученных результатах можно заключить, что в процессе канце рогенеза происходят изменения в метаболизме клетки, приводящие к увеличению коли чества повреждений ДНК. Известно, что трансформация клеток сопровождается повы шенным содержанием АФК в них (Athar M., 2002), что может быть одним из факторов, повреждающих первичную структуру ДНК.

0, Количество разрывов Рис. 4. Значения медиан для 0, ДР и ОР ДНК, выделенной 0, из крови здоровых доноров 0, (18) и онкологических 0,2 больных (18), а также мы шей-гибридов F1(CBAx 0, C57Bl) и мышей линии AKR.

ДР люди ОР люди ДР мыши ОР мыши Доноры Больные Контрольные мыши Контрольные мыши F1(CBAxC57Bl) AKR Доноры Больные Параметр ДР ОР ДР ОР Медиана 0,109 0,300 0,315 0, (нижний-верхний квартили) (0,038-0,162) (0,171-0,451) (0,171-0,380) (0,360-0,670) Так как данное явление наблюдается в клетках разных организмов с различными видами рака, можно высказать предположение, что в процессе канцерогенеза происхо дит накопление повреждений первичной структуры ДНК. По мнению Brooks A.L.

(2005), современные взгляды на канцерогенез претерпели значительные изменения: ес ли до недавнего времени возникновение рака связывали с хромосомными аберрациями и повреждениями ДНК в клетке, то на сегодняшний день выяснено, что неопластиче ская трансформация происходит в клетках с измененным функциональным состоянием генома (нестабильностью генома). Некоторые исследователи связывают возникновение нестабильности генома и хромосомных поломок, таких как транслокации, с наличием в клетке неканонических форм ДНК, в том числе Z-формы. Содержание таких форм ДНК в клетке меняется в зависимости от функционального состояния генома. Wang et al.

(2006) показали, что Z-ДНК-формирующие последовательности вызывают высокий уровень генетической нестабильности как в бактериальных клетках, так и в клетках млекопитающих и индуцируют ДР ДНК в непосредственной близости от них, что в 95% случаев приводит к образованию больших делеций.

2.5. Действие фенозана на структуру ДНК селезенки мышей-гибридов F1(CBAxC57Bl) и линии AKR Фенозан (1-4-окси-3,5-дитретбутил-фенил-1-пропионат калия) – это синтезиро ванный в ИБХФ РАН экранированный фенол. В результате ряда исследований выясне но, что он вызывает определенные положительные эффекты в органах и тканях живот ных, препятствуя перекисному окислению липидов (Хохлов А.П., 1988а), проявляет ра диопротекторные, ноотропные и антимикробные свойства (Petrykina Z.M.1992;

Гендель Л.Я., 1996;

Fleck S.L., 1997;

Бурлакова Е.Б., 1999). Применение данного препарата спо собно вызывать изменение структуры мембран (Гендель Л.Я., 1996), влияя на актив ность мембранно-связанных ферментов. Обнаружено защитное действие фенозана по интенсивности окислительных процессов в липидах при пролонгированном облучении мышей в дозе 15 сГр и введении препарата как до, так и после облучения (Шишкина Л.Н., 1999).

В данной работе было проведено изучение эффекта введения фенозана в физиоло гической (10-4 моль/кг) и малой (10-14 моль/кг) дозах на изменения структуры ДНК мы шей F1(CBAxC57Bl) и лейкозной линии АKR. Показано, что введение фенозана вызыва ет однотипное изменение структурных характеристик ДНК у мышей F1(CBAxC57Bl) и AKR. Величина адсорбции ДНК селезенки мышей F1 повышалась в большей степени, чем А ДНК мышей AKR (рис. 5, 6). Количество ДР ДНК селезенки мышей AKR, напро тив, уменьшалось как на 2-е, так и на 30-е сутки по сравнению с ДНК контрольной группы мышей AKR (рис. 7).

Оба эффекта фенозана могут быть связаны как с непосредственной инактивацией метаболических АФК, так и с изменением активности транскрипции генов, регулирую щих внутренний гомеостаз. Известно, что в процессе нормального метаболизма клетки происходит образование разрывов ДНК, большая часть которых затем репарируется (De Bont R., 2004). По-видимому, введение фенозана предотвращает образование части раз рывов, которая обусловлена наличием свободнорадикальных процессов в клетке.

2, Рис. 5. Величина показателя * Адсорбция ДНК, отн. ед.

адсорбции ДНК, выделенной контроль 1, из селезенки мышей– 1, гибридов F1(CBAxC57Bl) на 2 1, 10 - 1, фенозана е и 30-е сутки после четырех кратного введения фенозана в 10 - 0, дозах 10-14 и 10-4 моль/кг. * р фенозана 0, 0,4 0, 0, 2-е сут 30-е сут 1, * 1, Адсорбция ДНК, отн.ед.

Рис. 6. Величина показателя * * * 1,4 Контроль адсорбции ДНК, выделенной 1, из селезенки мышей линии 1 10 - АКR на 2-е и 30-е сутки по фенозана 0, сле четырехкратного введе 0,6 10 - фенозана ния фенозана в дозах 10-14 и 0, 0, 10-4 моль/кг. * р 0,05.

2-е сут 30-е сут 1,2 Рис. 7. Количество двуните вых разрывов в ДНК, выде Число ДР ДНК,отн.ед.

Контроль ленной из селезенки мышей 0, линии АКR на 2-е и 30-е су 10 - тки после введения фенозана 0,6 фенозана мышам в дозах 10-14 и 10- 0,4 10 - моль/кг.

фенозана 0, 2-е сут 30-е сут При параллельном измерении содержания белка р53 в сыворотке крови при введе нии фенозана мышам линии АКR было зарегистрировано его повышение по сравнению с уровнем у низкораковой линии мышей (Миль Е.М., 2005;

Жижина Г.П., 2007). Сопос тавление наших результатов с данными по содержанию белка р53, любезно предостав ленными д.б.н. Е.М.Миль, выявило корреляцию уровня белка р53 в сыворотке крови с изменением адсорбции ДНК селезенки мышей линии АКR (рис. 8) (Жижина Г.П., 2007) как под влиянием облучения, так и введения фенозана (уравнение корреляции у = 0,195 + 0,887х, r=0,917, p=0,004). Этот факт может свидетельствовать о закономерной взаимосвязи между экспрессией генов и изменением конформации хроматина.

Известно, что белок р53 является одним из основных регуляторных белков клетки, увеличение его содержания вызывает комплексный клеточный ответ, который проявля ется в активации транскрипции десятка генов, связанных с защитой стабильности кле точного генома. При этом активируются гены, кодирующие белки остановки клеточно го цикла в сверочных точках, ферменты репаративной системы и наиболее важные бел ки АО статуса клетки (Polyak K., 1997;

Fornace A.J. Jr., 2002;

Amundson S.A., 2003).

Можно предположить, что введение фенозана мышам линии АКR на стадии ин дукции лейкоза стабилизирует состояние структуры ДНК. С этим, по-видимому, связа но отчетливое тормозящее действие препарата на развитие лейкоза у мышей данной линии, что выражалось в увеличении максимальной продолжительности жизни живот ных на 15% после введение фенозана (Бурлакова Е.Б., 2001а).

Кроме того, нами было проведено изучение влияния антиоксиданта фенозана на структуру ДНК мышей-гибридов F1 при введении его перед облучением животных в до зе 1,2 сГр (0,6 сГр/сут). Эффект ИР в малых дозах, проявляющийся в организме живот ных состоянием окислительного стресса, указывает на возможность его предотвраще ния с помощью антиоксидантов. Препарат вводили мышам-гибридам F1 в дозах 10-14 и 10-4 моль/кг как без облучения, так и перед облучением животных. При совместном действии фенозана и радиации в малой дозе были обнаружены следующие эффекты. У животных, облученных после введения фенозана, через 1 сутки обнаружено повышение значения адсорбции ДНК до 1,35 отн.ед. при 10 -14 моль/кг и 1,2 отн.ед. после y = 0,19494 + 0,88728 * x r = 0, 1, 1, 1, Количество р53, отн.ед.

1, 1, 1, 1, 0, 0, 0, 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1, Связывание, отн.ед. 95% Рис. 8. Корреляция между относительными величинами содержания белка р53 в сыво ротке крови и показателем адсорбции на НЦ фильтрах ДНК, выделенной из селезенки после облучения или введения фенозана мышам линии АКR.

Коэффициент корреляции r = 0,917, Р= 0,004.

Рис. 9. Величина показателя ад 2, * Адсорбция ДНК, отн.ед.

сорбции ДНК, выделенной из контроль 1, селезенки мышей-гибридов ** 1, * 1,4 F1(CBAxC57Bl), после введения 10- 1, фенозана животным фенозана в концен трациях 10-14 и 10-4 моль/кг и 0,8 10- 0,6 фенозана общего облучения в дозе 1,2 сГр 0, на 1-е и 30-е сутки. * р 0,05 по 0, 0 отношению к интактному кон 30-е сут без облучения 1-е сут тролю.

Рис. 10. Количество ДР в препа ратах ДНК, выделенной из селе Количество ДР ДНК 0, контроль зенки мышей-гибридов 0, F1(CBAxC57Bl), после введения 10- 0, животным фенозана в концентра фенозана циях 10-14 и 10-4 моль/кг и общего 0, 10- облучения в дозе 1,2 сГр на 1-е и 0,1 фенозана 30-е сутки. * р 0,05 по отноше нию к интактному контролю.

без 1-е сут 30-е сут введения его в дозе 10-4 моль/кг. Через 1 месяц после облучения величина адсорбции ДНК облученного контроля снизилась до 0,8 отн.ед., а после введения мышам антиок сиданта в дозах 10-14 и 10-4 моль/кг и облучения мышей - до 1,0 отн.ед. и 1,1 отн.ед. от носительно необлученного контроля (рис.9). Образования ДР ДНК при облучении мы шей F1 на фоне предшествующего введения фенозана в обеих дозах не наблюдали ни сразу, ни 30 суток спустя.Через 1 месяц после облучения мышей без введения фенозана количество ДР в ДНК возросло с 0,30 до 0,54 (рис.10). Было обнаружено, что введение мышам фенозана до облучения снижало электрофоретическую подвижность выделен ных препаратов ДНК селезенки по сравнению с соответствующим облученным контро лем. Таким обр., фенозан уменьшал степень повреждения молекул ДНК (ДР) под дейст вием облучения. Увеличение значения адсорбции ДНК на НЦ (повышение количества Z-участков после введения фенозана может указывать на активацию процессов транс крипции в клетках. Активация транскрипции означает усиление синтеза белков, на пример р53. Действительно показано, что уровень белка р53 повышается при введении фенозана мышам-гибридам F1 (Жижина Г.П., Миль, 2007).

Совокупность этих данных позволяет предположить, что введение фенозана вызы вает усиление репаративного ответа клеток на воздействие радиации. Таким образом, впервые обнаружено, что антиоксидант фенозан проявляет радиопротекторные свойст ва в отношении структуры ДНК при облучении мышей ИР в малой дозе.

2.6. Действие ДФО и его производных на структуру ДНК селезенки мышей линии Balb/c Поиск возможных средств защиты организма от ИР в малых дозах является доста точно сложной, но актуальной задачей. В настоящее время исследуются радиопротек торы различных классов, но основное внимание в области малых доз ИР уделяется пре паратам природного происхождения и синтетическим антиоксидантам (Легеза В.И., 1998;

Кудряшов Ю.Б., 1999;

Шишкина Л.Н., 1999;

Гончаренко Е.Н., 1997;

Залашко М.В., 1997). Однако перспективными также могут быть препараты с нетрадиционным характером действия, способные трансформировать энергию ИР. К таким соединениям относятся вещества из группы оксазола, в частности 2,5-дифенилоксазол (ДФО) и его производные, которые были предложены сотрудниками ГОСНИИ ОХТ для изучения в качестве радиопротекторов с действием на основе способности поглощать энергию ио низирующего излучения. Диссипация энергии излучения под действием данных соеди нений обусловлена процессом образования множества каскадных переходов поглощен ной энергии в исходном, возбужденном и ионизированном состояниях молекулы. Дан ные препараты подверглись комплексному биофизическому исследованию перекисного окисления липидов и количества внеклеточной ДНК под их действием (Шишкина Л.Н., 2005), а также влияния на микровязкость липидов печени (Мальцева Е.Л., 2005).

В настоящей работе изучалось действие различных концентраций ДФО и его произ водных на структурное состояние ДНК селезенки мышей при введении их без облуче ния и при введении с последующим облучением в малой дозе ИР. Были исследованы четыре препарата этой группы, синтезированные в ГОСНИИ ОХТ (табл. 3).

Кривые адсорбции ДНК, выделенной из селезенок мышей после введения препара тов, представлены на рис. 11. Препарат ДФО в трех концентрациях (1, 10, 30 мг/кг), а также ДФОБ в концентрации 20 мг/кг без облучения повышали адсорбцию ДНК. Пре параты ДФОД и йодметилат ДФО во всем диапазоне использованных концентраций не влияли на связывание ДНК с НЦ фильтрами. Введение ДФО в дозе 60 мг/кг снижало адсорбцию ДНК приблизительно на 40% (0,65 отн.ед.). Следует отметить, что адсорб ция ДНК селезенки группы контрольных мышей с введенным растворителем (0, отн.ед.) достоверно не отличалась от значений адсорбции ДНК интактных мышей (1, отн.ед.).

Как показано в п. 2.1. (табл. 1, 2), облучение мышей в дозе 12 сГр вызывает повыше ние количества разрывов ДНК (0,29 ДР и 0,63 ОР) и снижение адсорбции ДНК на 40 50% по сравнению с необлученным контролем. После введения ДФОД, йодметилата ДФО и ДФО в концентрациях 30 и 60 мг/кг и последующего облучения мышей уровень адсорбции ДНК превышал диапазон значений облученного контроля (рис. 12). Исклю чение составляли ДФО в концентрациях 1 и 10 мг/кг и ДФОБ в трех концентрациях (2, 20, 60 мг/кг), значения адсорбции которых лежат ниже области необлученного контро ля. Таким образом, большинство препаратов достаточно эффективно сохраняют ад сорбцию ДНК селезенки на уровне, близком к показателям интактного контроля.

Таблица 3. Названия и дозы использованных соединений группы ДФО.

Мол. Концентрация, Концентрация, Препарат Химическое название вес мг/кг моль/л 4,5х10-6-2,7х10- ДФО 2,5-дифенил-1,3-оксазол 221 1, 10, 30, 1,4-ди[2-(5-фенилоксазолил)] 5,45х10-6-3,3х10- ДФОБ 366 2, 20, 60, бензол Иодметилат иодметилат 2,5-дифенил-1,3 4,5х10-6-2,7х10- 357 1,6;

16, 49, ДФО оксазола 4,5х10-6-2,7х10- ДФО-Д 2,5-дифенилоксодиазол 222 1, 10, 30, Рис. 11. Зависимость адсорбции 1, ДФО на НЦ фильтрах растворов ДНК 1, Адсорбция, отн.ед.

селезенки необлученных мы 1,4 ДФОБ шей от концентрации препара 1, йодметилат 1 тов (мг/кг). По оси ординат – ДФО 0,8 отношение адсорбции раствора ДФОД 0, ДНК в опыте к адсорбции ДНК 0, необлученного контроля. Вы 0, деленные полосы: диапазон ад сорбции контрольных необлу 0 1 2 ченных мышей.

lgC Рис. 12. Зависимость адсорбции 1, на НЦ фильтрах растворов ДНК 1,2 селезенки облученных мышей ДФО Адсорбция, отн.ед.

от концентрации препаратов (lg 1 ДФОБ C, мг/кг). По оси ординат – от 0,8 йодметилат ношение адсорбции ДНК в опы ДФО те к адсорбции раствора ДНК 0, ДФОД необлученного контроля. Выде 0, ленные полосы: сплошная линия 0,2 – диапазон адсорбции кон трольных необлученных мы шей, пунктирная линия – диапа 0 1 2 зон адсорбции контрольных lg C облученных мышей.

Табл. 4. Количество разрывов ДНК селезенки мышей Balb/c контрольных групп.

К интактный К+растворитель К+растворитель обл. К обл.

ДР ОР ДР ОР ДР ОР ДР ОР 0,05±0,02 0,18±0,04 0,12±0,02 0,36±0,05 0,24±0,04 0,77±0,06 0,29±0,03 0,63±0, При исследовании образования разрывов ДНК под действием препаратов обнару жено, что растворитель, в котором вводились препараты, повреждал структуру ДНК (табл. 4). Поэтому для изучения влияния самих препаратов контролем служили мыши с введенным растворителем.

Аналогично, для изучения образования разрывов ДНК при введении препаратов и облучении в качестве контроля брали мышей, облученных после введения растворите ля. Полученные результаты по количеству разрывов ДНК селезенки мышей без и после облучения с учетом соответствующих контролей приведены на рис. 13, 14.

Выяснено, что все препараты индуцируют ДР ДНК при введении мышам без по следующего облучения (рис. 13 А). Образование значительного количества ДР вызыва ли ДФО, ДФОБ и ДФОД в больших концентрациях, а йодметилат ДФО индуцировал значительное количество разрывов только в концентрации 16 мг/кг. Изученные препа раты повреждают первичную структуру ДНК, и их можно охарактеризовать как гено токсичные.

При облучении мышей после введения препаратов не наблюдалось аддитивности эффектов обоих воздействий (рис. 13 Б). Напротив, для препаратов ДФО (все концен трации), трех концентраций ДФОБ (2, 20, 60 мг/кг) и ДФОД (1, 30, 60 мг/кг), а также двух меньших концентраций (1,6 и 16 мг/кг) йодметилата ДФО количество ДР ДНК оказалось ниже, чем без облучения. Это справедливо для минимальных концентраций всех препаратов.

Значительное повышение количества ОР ДНК после введения препаратов без об лучения выявлено для ДФО во всех концентрациях;

для ДФОБ - в дозах 60 и 120 мг/кг;

для ДФОД – в дозах 10, 30 и 60 мг/кг;

для йодметилата ДФО наибольшая индукции ОР наблюдалась в дозе 16 мг/кг (рис. 14 А).

Сравнение рисунков 14 А и 14 Б показывает, что после облучения мышей наблю далось снижение количества ОР для минимальных концентраций всех четырех введен ных препаратов (1-2 мг/кг). Это свидетельствует о возможных радиопротекторных свойствах у этих соединений в малых дозах. Аналогичное уменьшение количества ОР наблюдалось и для других концентраций ряда препаратов, а для ДФОД в концентраци ях 30 и 60 мг/кг и ДФОБ в концентрации 120 мг/кг наблюдалось повышение числа ОР ДНК.

Таким обр., все четыре препарата (ДФО и производные) влияют на структурные характеристики ДНК селезенки мышей без облучения и модифицируют действие малой дозы радиации. Зависимости всех параметров от концентраций введенных препаратов 0, А Рис. 13. Влияние введения раз 0, Количество ДР 0,6 личных концентрации препара ДФО 0,5 тов группы ДФО на индукцию 0,4 двойных разрывов ДНК селе ДФОБ 0, зенки необлученных (А) и об 0,2 йодметилат лученных (Б) мышей. Указана ДФО 0, концентрация ДФО, концентра ДФОД ции остальных препаратов эк 1 10 30 Концентрация ДФО, мг/ кг вимолярны. Результаты полу 0,6 чены при вычитании соответст Б 0,5 вующих контролей: контроль с 0,4 введенным растворителем для Количество ДР ДФО 0,3 необлученных мышей и кон 0,2 ДФОБ троль, облученный с введенным 0, растворителем, для облученных йодметилат мышей.

ДФО ДФОД -0, -0, 1 10 30 Концентрация ДФО, мг/ кг Рис. 14. Влияние введения раз личных концентрации (мг/кг) препаратов группы ДФО на ин дукцию ОР ДНК селезенки не облученных (А) и облученных (Б) мышей. Указана концентра ция ДФО, концентрации осталь ных препаратов эквимолярны.

Результаты получены при вычи тании соответствующих контро лей: контроль с введенным рас творителем для необлученных мышей и контроль, облученный с введенным растворителем, для облученных мышей.

имеют нелинейный (часто экстремальный) характер. Выяснилось, что данные вещества обладают по отношению к ДНК генотоксическими (радиомиметическими) свойствами при введении их без облучения и противоположными им радиопротекторными свойст вами при облучении мышей в дозе 12 сГр для ряда концентраций препаратов.

Радиозащитные свойства препаратов уменьшаются в ряду ДФО – ДФОБ – йодме тилат ДФО – ДФОД. Дозовые зависимости имеют нелинейный характер, что согласует ся с данными опытов по изучению выживаемости мышей, а также микровязкости мем бран клеток печени мышей линии Balb/c (Мальцева Е.Л., 2005).

2.7. Изучение совместного действия фенозана и ДФО и его производных на струк турные характеристики ДНК мышей Balb/с С целью снижения генотоксического действия препаратов группы ДФО без облу чения было проведено изучение сочетанного действия антиоксиданта фенозана и ДФО на структурные характеристики ДНК селезенки мышей линии Balb/c. Фенозан вводили мышам в концентрациях 10-14 и 10-4 моль/л без и с последующим введением через мин препарата ДФО в концентрациях 1 и 60 мг/кг или йодметилата ДФО в концентра ции 16 мг/кг. Полученные результаты приведены в таблицах 5, 6 и на рис. 15. В данном опыте фенозан в концентрации 10-4 моль/л повышет адсорбцию ДНК, а в концентрации 10-14 моль/л не влияет на связывание ДНК с НЦ фильтрами. ДФО, как было показано ранее, также влияет на адсорбцию ДНК, причем эффект зависит от концентрации. По следовательное введение 10-14 моль/кг фенозана и обеих концентраций ДФО (1 и мг/кг), а также 10-4 моль/кг фенозана и 1 мг/кг ДФО нормализуют адсорбцию ДНК, приближая ее значение к уровню интактного контроля (табл. 5). В случае йодметилата ДФО и введения фенозана наблюдалась тенденция к повышению адсорбции ДНК селе зенки мышей.

Введение фенозана в обеих концентрациях снижает количество ДР ДНК, тогда как ДФО индуцирует разрывы ДНК, как было показано ранее. Все испытанные сочетания фенозана и ДФО уменьшали образование ДР ДНК (табл. 6А, рис. 15). Наибольший за щитный эффект (снижение количества ДР) и нормализация уровня адсорбции ДНК проявлялись при одних и тех же комбинациях введенных доз фенозана и ДФО. Обна ружено, что введение фенозана уменьшает образование ОР ДНК под действием ДФО в исследованных концентрациях, но не влияет на индукцию ОР ДНК йодметилатом ДФО (табл. 6Б). Эти данные указывают на то, что действие антиоксиданта фенозана, веро ятно, снижает образование активных продуктов метаболического окисления ДФО, ко торые, как мы предполагаем, повреждают структуру ДНК. В случае йодметилата ДФО, у которого атом N4 экранирован йодметильной группой, введение фенозана достоверно не изменяет ни адсорбцию ДНК селезенки, ни количество ДР ДНК.

На основании полученных данных можно охарактеризовать группу соединений ДФО и его производных как потенциально перспективную для исследования радиопро текторных свойств при условии их возможной модификации, снижающей их геноток сичность.

Таблица 5. Совместное влияние фенозана и ДФО, фенозана и йодметилата ДФО на ад сорбцию ДНК селезенки мышей линии Balb/c (адсорбция в отн. единицах).

2,5- дифенилоксазол йодметилат ДФО Ф Концентрация, 0 мг/кг 1 мг/кг 60 мг/кг 16 мг/кг Е моль/кг Н 0 1,0 1,96±0,18 0,65±0,04 1, О 10-14 0,94±0,03 1,14±0,06* 1,0±0,01* 1,16±0, З А 10-4 1,25±0,02 0,93±0,02* 0,78±0,01 1,14±0, Н Таблица 6 А. Совместное влияние фенозана и ДФО, фенозана и йодметилата ДФО на количество ДР ДНК селезенки мышей линии Balb/с.

2,5-дифенилоксазол йодметилат ДФО Ф Концентрация, 0 мг/кг 1 мг/кг 60 мг/кг 16 мг/кг Е моль/кг Н 0 0,09±0,03 0,40±0,05 0,80±0,09 0,45±0, О - 10 0,05±0,03 0,12±0,06 * 0,32±0,09* 0,51±0, З А 10-4 0,04±0,02 0,10±0,04 * 0,25±0,09 0,38±0, Н Таблица 6 Б. Совместное влияние фенозана и ДФО, фенозана и йодметилата ДФО на количество ОР ДНК селезенки мышей линии Balb/с.

2,5-дифенилоксазол йодметилат ДФО Ф Концентрация, 0 мг/кг 1 мг/кг 60 мг/кг 16 мг/кг Е моль/кг Н 0 0,19±0,06 0,77±0,06 1,09±0,07 0,75±0, О - 10 0,16±0,05 0,46±0,06 * 0,45±0,09* 0,56±0, З А 10-4 0,18±0,04 0,25±0,09 * 0,18±0,09* 0,67±0, Н А Б Рис. 15. Модифицирующий эффект фенозана на генотоксические свойства ДФО.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

А – адсорбция, АО – антиоксидант, АФК – активные формы кислорода, ДФО – дифенилоксазол, ДР – двунитевые разрывы ОР – однонитевые разрывы, ИР – ионизирующая радиация, НЦ – нитроцеллюлоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Работа посвящена изучению изменения структурных характеристик ДНК при дей ствии низкодозового облучения и влиянии потенциальных радиозащитных препаратов разных классов, а также пероксида водорода in vivo и in vitro. Также исследовано влия ние низкодозовой ИР на развитие лейкоза мышей AKR, изучены особенности индукции разрывов ДНК при канцерогенезе мышей и человека.

Показано, что воздействие низкодозовой ИР вызывает структурные повреждения ДНК при измерении как адсорбции ДНК, так и количества разрывов ДНК селезенки мышей. Выяснено, что пероксид водорода вызывает дополнительные повреждения ДНК in vitro подобно действию ИР, а его влияние на конформационное состояние ДНК зависит от исходных характеристик изученных групп мышей. В опыте in vivo получены результаты, свидетельствующие о важной роли малых концентраций пероксида водо рода в регуляции экспрессии генов в организме мышей, что согласуется с литератур ными данными.

Полученные разультаты позволяют заключить, что повреждения структуры ДНК под действием ИР в малых дозах сопровождаются изменением активности генома, так как облучение, вероятно, меняет его доступность для системы регуляции экспрессии генов. Кроме того, при действии низкодозовой ИР велика вероятность возникновения нестабильности генома клетки – стойкого, передающегося эпигенетически, функцио нального состояния генома клетки, ведущего к нарушению генетического контроля и являющегося важнейшим фактором в индукции рака. Нерепарированные повреждения ДНК являются одной из причин возникновения нестабильности генома. Так как ген р53, отвечающий за «сохранность» генома, в трансформированных клетках, как правило, имеет мутации, приводящие к его инактивации, такие измененные клетки не могут быть удалены путем апоптоза.

Действительно, обнаружена большая степень поврежденности ДНК как у мышей на стадии индукции рака, так и у людей с развившимся онкологическим процессом, на основе чего можно сделать предположение о большей поврежденности ДНК при канце рогенезе по сравнению со здоровым организмом.

В данной работе также выявлены изменения структурного состояния ДНК в ходе развития лейкоза мышей AKR при низкодозовом низкоинтенсивном облучении на ста дии индукции (3 мес), которые выражались в сдвиге максимума зависимости адсорбции ДНК от возраста мышей на более ранний срок, что согласуется с литературными дан ными об ускорении развития лейкоза и снижении средней продолжительности жизни мышей AKR при таком же варианте опыта. Противоположный эффект наблюдался при введении антиоксиданта фенозана на стадии индукции лейкоза (3 мес). Препарат уменьшал количество разрывов ДНК, с чем может быть связано полученное в литера туре увеличение продолжительности жизни мышей AKR в идентичном опыте.

Кроме того, обнаружена возможность модификации воздействия низкодозовой ИР с помощью антиоксиданта фенозана и производных оксазола. Фенозан проявлял радио защитные свойства при введении его до облучения мышей по всем исследованным ха рактеристикам структуры ДНК. Препараты из группы оксазолов обладают радиопро текторными или сенсибилизирующими свойствами в зависимости от применяемых концентраций. Она показали себя как перспективные радиозащитные вещества в облас ти малых доз ИР при условии снижения их генотоксичности, вероятно, с помощью ан тиоксиданта. Генотоксичные концентрации можно использовать при радиотерапии для сенсибилизации опухолей.

Т. обр., в данной работе проведено комплексное исследование воздействия раз личных факторов на структурные характеристики ДНК: низкодозовой ИР, препаратов различных классов в различных концентрациях, течения лейкозного процесса мышей и развившегося рака человека и обнаружен системный ответ генетического аппарата на эти воздействия.

ВЫВОДЫ 1. Впервые изучено действие малых доз ионизирующей радиации (ИР) на структуру ДНК при облучении мышей трех линий, различающихся по радиочувствительности.

Обнаружено изменение структурных характеристик ДНК – адсорбции на НЦ и раз рывов цепей, относительный уровень которых коррелирует с радиочувствительно стью данных линий мышей.

2. На примере воздействия малых концентраций пероксида водорода на структурные характеристики ДНК в растворе выявлена зависимость эффекта от исходного со стояния биополимера (более сильное повреждение ДНК, выделенной из лейкозных или облученных мышей). Получены данные, свидетельствующие о способности пе роксида водорода влиять на экспрессию генов при введении в организм мышей в концентрации 10-12 моль/кг.

3. Показана возможность модификации воздействия малых доз низкоинтенсивной ИР с помощью как физиологических, так и малых концентраций антиоксиданта фено зана, который обладает пролонгированным действием.

4. Обнаружена способность ИР в малой дозе 1,2 сГр (0,6 сГр/сут) индуцировать более ранние структурные изменения ДНК в ходе развития лейкоза у мышей АКR по сравнению со спонтанным ходом заболевания. Фенозан, напротив, нормализует со стояние структуры ДНК селезенки мышей АКR, что согласуется с известным фак том замедления препаратом развития этого лейкоза.

5. Выявлен достоверно повышенный уровень разрывов ДНК у онкологических паци ентов по сравнению со здоровыми донорами, а также у мышей лейкозной линии АКR по сравнению со здоровыми животными. Высказано предположение о повы шенной степени поврежденности ДНК при канцерогенезе.

6. Показано, что производные 2,5-ДФО, обладающие способностью диссипировать энергию ИР in vitro, проявляют в организме животных альтернативные дозо зависимые радиопротекторные или радиосенсибилизирующие свойства.

7. Основываясь на полученных данных, можно предположить наличие системного от вета генома клеток в организме животных на слабое действие внешних факторов, таких как малые дозы ИР, низкие и сверхнизкие концентрации радиозащитных или радиосенсибилизирующих соединений (фенозана, ДФО и его производных).

Основное содержание работы

изложено в публикациях:

1. Жижина Г.П., Палиевская Т.М. (Заварыкина Т.М.) Действие малых и сверхмалых концентраций пероксида водорода на ДНК в растворе и организме мышей. Тези сы докладов III Международного симпозиума «Механизмы действия сверхмалых доз». С.12. Москва, 3-6 декабря 2002 г.

2. Жижина Г.П., Палиевская Т.М. (Заварыкина Т.М.) «Действие малых и сверхма лых концентраций пероксида водорода на ДНК в растворе и организме мышей».

// Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т.43, № 2, с.147-149.

3. Заварыкина Т.М., Жижина Г.П., Бурлакова Е.Б. Генотоксические и радиопротек торные свойства производных 2,5-дифенилоксазола, проявляющиеся в измене нии структурного состояния ДНК.// Труды III Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», С. 86, Москва, 13- октября 2003 г.

4. Палиевская Т.М. (Заварыкина Т.М.), Жижина Г.П., Бурлакова Е.Б. Действие ио низирующей радиации в малых дозах на развитие спонтанного лейкоза мышей.

Тезисы 3 съезда биофизиков России. С. 114, Воронеж. 29 июня 2004 г.

5. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Гуревич С.М., Ерохин В.Н., Жижина Г.П., Зава рыкина Т.М. и др. Изучение влияния малых доз низкоинтенсивной ионизирую щей радиации и антиоксидантов на биомакромолекулы и супрамолекулярные структуры в процессе развития спонтанного лейкоза мышей с целью создания новых протекторных средств. Тезисы конференции «Фундаментальные науки – медицине», С.209-211, Москва, 2-3 декабря 2004 г.

6. Палиевская Т.М. (Заварыкина Т.М.), Жижина Г.П., Бурлакова Е.Б.. Генотоксиче ские и радиопротекторные свойства производных 2,5-дифенилоксазола, прояв ляющиеся в изменении структурного состояния ДНК. Тезисы Российской науч ной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противо химической защиты». С. 254-255, Санкт-Петербург, 21-23 мая 2004 г.

7. Жижина Г.П., Заварыкина Т.М., Бурлакова Е.Б, Носков В.Г., Духович Ф.С. «Ге нотоксические и радиопротекторные свойства производных 2,5 дифенилоксазола, влияющие на структурное состояние ДНК мышей.» // Радиаци онная биология. Радиоэкология. 2005. Т.45, №1, С.56-62.

8. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Гуревич С.М., Жижина Г.П., Заварыкина Т.М. и др. Противолучевой эффект антиоксиданта фенозана. Тезисы конференции «Фундаментальные науки – медицине», С. 221-223. Москва, 14-16 декабря 2005 г.

9. Жижина Г.П., Заварыкина Т.М., Ерохин В.Н., Бурлакова Е.Б. Структурные изме нения геномной ДНК при воздействии на мышей ионизирующей радиации в ма лых дозах. V Cъезд по радиационным исследованиям. Т.1. С.84. Москва, 10- апреля 2006 г.

10. Заварыкина Т.М., Жижина Г.П., Бурлакова Е.Б. Изменение структурных характе ристик ДНК под влиянием фенозана и низкоинтенсивной гамма-радиации в ма лых дозах.// Труды VI Международной молодежной конференции ИБХФ РАН ВУЗы «Биохимическая физика», С. 87, Москва, 24-27 ноября 2006 г.

11. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Гуревич С.М., Жижина Г.П., Заварыкина Т.М. и др. « О возможных радиозащитных свойствах фенозана в области низкоинтен сивной ионизирующей радиации». Тезисы конференции «Фундаментальные нау ки – медицине», С. 134-136, Москва, 27-29 ноября 2006 г.

12. Заварыкина Т.М., Жижина Г.П., Бурлакова Е.Б. «Изменение структурных харак теристик ДНК под влиянием фенозана и низкоинтенсивной гамма-радиации в малых дозах». Тезисы VII Международной конференции «Биоантиоксидант», С.

132-134, Москва, 25-26 октября 2006 г.

13. Жижина Г.П., Заварыкина Т.М., Миль Е.М., Бурлакова Е.Б. «Изменение струк турных характеристик ДНК под влиянием низкоинтенсивной гамма-радиации и фенозана в малых дозах».// «Радиац. биология. Радиоэкология». 2007. Т.47, №4, С.414-422.

14. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Гуревич С.М., Жижина Г.П., Заварыкина Т.М. и др. «Изменение ряда макромолекулярных характеристик крови человека как ве роятных биомаркеров отдаленных последствий низкодозового облучения». Тези сы конференции «Фундаментальные науки – медицине», С. 149-150, Москва, 3 4декабря 2007 г.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.