Эндофитные грибы злаков

На правах рукописи

БЛАГОВЕЩЕНСКАЯ Екатерина Юрьевна ЭНДОФИТНЫЕ ГРИБЫ ЗЛАКОВ Специальность 03.00.24 – микология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в лаборатории иммунитета ГНУ ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Ю.Т. Дьяков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук И.Ю. Чернов кандидат биологических наук О.Б. Ткаченко

Ведущая организация: Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева.

Защита состоится 22 декабря 2006 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

факс: (095) 939-39- С диссертаций можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 20 ноября 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время ведется активное изучение эндофитов злаков, которые по большей части относятся к видам рода Epichlo и к их анаморфам, видам рода Neotyphodium (раньше – Acremonium). Эти грибы находятся в симбиотической ассоциации с различными злаками, не вызывая никаких внешних признаков заражения. Растение обеспечивает гриб питанием и стабильной средой обитания. Эндофиты, со своей стороны, выделяют алкалоиды, которые защищают растение как от насекомых-вредителей, так, частично, и от травоядных млекопитающих, и увеличивают устойчивость растения-хозяина к болезням и неблагоприятным условиям. Распространение эндофита происходит вместе с семенами растения-хозяина. Ассоциация «эндофит-растение» представляет прекрасную модель для исследования фундаментальных проблем симбиоза.

Изучение эндофитных грибов актуально и с прикладной точки зрения. В первую очередь это связано с кормовой отраслью сельского хозяйства. У скота, который кормят травой с высокой долей заражения эндофитами, начинают появляться симптомы отравления, вплоть до гибели. С другой стороны, растения без эндофитов растут хуже. Данная дилемма отсутствует в другой прикладной отрасли селекции газонных трав. В настоящий момент направление, связанное с использованием эндофитов для улучшения качеств газонных трав, считается очень перспективным.

Известно, что эндофитные грибы злаков широко распространены на пастбищах Европы, Северной Америки, Австралии и Новой Зеландии. Россия же, с точки зрения наличия каких-либо сведений о присутствии или отсутствии эндофитов в злаках на ее территории, представляет собой большое белое пятно.

Цель работы: поиск эндофитных грибов злаков на территории европейской части Российской федерации и изучение их биологии.

Задачи:

1. Поиск эндофитных грибов в различных географических областях;

2. Создание коллекции и идентификация культур эндофитных грибов;

3. Изучение морфологических особенностей полученных культур;

4. Подбор минеральной среды для культивирования эндофитов;

5. Оценка влияния эндофита на растение-хозяина;

6. Изучение распределения мицелия в растении-хозяине.

Научная новизна. Впервые изучена встречаемость эндофитных грибов злаков на территории Российской федерации. Подобран состав минеральной среды для культивирования эндофитных грибов.

Впервые обнаружено конидиальное спороношение гриба Neotyphodium uncinatum в природных условиях.

Впервые обнаружено, что в инфицированном эндофитом растении могут присутствовать как зараженные, так и незараженные побеги. На основании этого предложена новая модель динамики зараженности растений в природных условиях.

Практическая значимость. Результаты исследований показали, что на пастбищах центральной части России может встречаться потенциально опасное для крупного рогатого скота заражение растений. Развитие эндофитов стимулируется жаркой и сухой погодой. Это показывает необходимость мониторинга сельскохозяйственных угодий в целях предотвращения массовых отравлений скота, особенно при неблагоприятных погодных условиях.

Подобран состав минеральной питательной среды для культивирования эндофитных грибов. Использование минеральной среды, в отличие от естественных сред, позволяет проводить сравнения работ, ведущихся в различных исследовательских группах.

Обнаружение конидиального спороношения эндофита в природных условиях показывает принципиальную возможность горизонтальной передачи инфекции. Это необходимо учитывать при мониторинге зараженности пастбищ.

Предложенная новая модель динамики зараженности требует новых подходов к мониторингу и показывает возможность серьезных ошибок в предшествующих исследованиях.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2003);

VII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (2004);

международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН (Санкт-Петербург, 2005);

международной конференции «Грибы и водоросли в биоценозах - 2006», посвященной 75-летию Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2006);

I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ (в т.ч. 2 в рецензируемых журналах).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах, включает таблиц, графиков и рисунков. Она состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит наименований, в том числе на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Эндофитные грибы злаков (обзор литературы) Активное изучение эндофитов началось с 1977 года (Bacon et al., 1977).

Но существовали и более ранние сообщения (Vogl, 1898 по Chai, Sticklen, 1998;

Hoffmeister, 1892 по Ячевский, 1933). Первые выделенные штаммы сначала определили как анаморфу E. typhina, потом более тщательные исследования данных изолятов показали существенные их отличия. Эндофитные грибы отнесли к секции Albo-lanosa рода Acremonium (Morgan-Jones, Gams, 1982).

После того, как накопились новые данные, грибы из секции Albo-lanosa выделили в отдельный род Neotyphodium Glenn, Bacon et Hanlin (Glenn et al., 1996).

Данные по влиянию эндофитов на рост и развитие растений противоречивы (Latch et al., 1985b;

Baert et al., 1994;

Cheplick et al., 1989;

Rice et al., 1994). Присутствие в растении эндофита, вероятно, повышает устойчивость к засухе и жаре (Arachevaleta et al., 1989;

Malinowski et al., 1997), а также к некоторым другим абиотическим стрессам (Malinowski et al., 1999;

Zaurov et al., 2001). Зараженные растения меньше поражаются различными вредителями (Ahnad et al., 1986;

Richmond, Shetlar, 1999;

West et al., 1988).

Было показано, что концентрация алкалоидов в растениях коррелирует с присутствием в этих растениях грибного симбионта (Belesky et al., 1986).

Существует четыре основные группы алкалоидов, продуцируемых эндофитами (Siegel et al., 1990;

Bush et al., 1997).

Обычно эндофиты приурочены к надземным частям растений, к стеблям и влагалищам листьев (Hesse et al., 2004). По некоторым оценкам около 30% видов злаков имеют постоянного сожителя-эндофита (Leuchtmann, 1992 по Faeth, 2002). Оказалось, что эндофиты встречаются чаще, чем это могли предположить, и процент инфицированности ими растений в разных местах довольно высок (Long, Hilty, 1985;

Shelby, Dalrymple, 1987;

Lewis et al., 1997;

Baert et al., 1994;

Koga et al., 1995;

Lee et al., 1996;

Schberlein et al., 1995).

Зараженность полей и пастбищ может изменяться со временем, изменение зараженности объясняется конкурентным взаимодействием зараженных и незараженных растений (Clay, 1998).

Глава 2. Материалы и методы Общие методики. Для анализа зараженности растений готовили срезы тканей, которые окрашивали красителем хлопковым голубым. Из листьев и семян зараженных растений проводили выделение чистых культур эндофитных грибов. Для этого образцы поверхностно стерилизовали и после отмывания от стерилизующего агента помещали в чашки Петри на картофельно-глюкозный агар. Выделение грибов происходит на 4 – 6 неделю инкубации. Описание полученных штаммов проводили по стандартной схеме.

Для приготовления препаратов для трансмиссионного электронного микроскопа грибы выращивали на целлофанных дисках на чашках Петри.

Выращенный мицелий фиксировали перманганатом калия, окрашивали водным раствором уранил-ацетата, докрашивали реактивом Рейнольдса.

Изучение встречаемости эндофитных грибов. Было обработано более 200 образцов злаков, принадлежащих к 20 видам злаков: Festuca arundinaceae Schreber, F. rubra L., F. pratensis Huds., F. gigantea (L.) Vill., F. altissima All., F.

ovina L., Lolium perenne L., Festulolium loliaceum (Huds.) Fourn., Bromopsis inermis (Leiss.) Holub, Poa annua L., P. trivialis L., P. pratensis L., P. nemoralis L., Dactylis glomerata L., Agrostis tenuis Sibth., Phleum pratense L., Elytrigia repens (L.) Nevski, Alopecurus geniculatus L., A. pratensis L., Melica nutans L., Anthoxanthum odoratum L. Обследования проводились в Москве, на территории института кормов (Московская область), на территории Звенигородской биостанции (Московская область), Брянской сельхозакадемии (Брянская обл.), Беломорской биологической станции (Мурманская область) и Окского заповедника (Рязанская область). Для обнаружения эндофита готовили окрашенный препарат адаксиального эпидермиса влагалища листа;

обычно проверялось 20 побегов с образца.

Были проверены 26 проб семян как из коллекции института кормов (Festuca pratensis, сорт ВИК 5;

F. rubra, сорт Jasper;

F. arundinaceae, сорт Olga;

F. rubra, сорт Raymond;

Agrostis sp., сорт Cato;

F. rubra, сорт Franklin;

Lolium perenne, сорт Stadion, Lolium perenne, сорт Low Row), так и собранные из природных местообитаний (F. pratensis). Анализировали по 50 семян из пробы.

Пробы, зараженность которых была более 40%, были отобраны для выделения чистых культур эндофитных грибов.

Определение видового состава грибов, находящихся на поверхности листьев. В ходе работы может возникнуть следующий вопрос: являются ли выделенные грибы действительно эндофитами, или просто поверхностная стерилизация проведена недостаточно хорошо? Для прояснения данной ситуации был изучен видовой состав грибов, выделяемых с поверхности овсяницы луговой (F. pratensis). Работа проводилась на материале зараженного эндофитами семенного посева сорта ВИК 5 института кормов.

Изучение прорастания конидий Neotyphodium uncinatum. Прорастание конидий наблюдали в чашках Петри диаметром 55 мм, в которые тонким слоем была налита питательная среда (сусло-агар). Чтобы предотвратить высыхание среды, чашки помещали в эксикатор с притертой крышкой, на дно которого наливали стерильную воду.

Изучение роста эндофитных грибов в культуре. Проводили сравнение роста эндофитов на средах с различными источниками азота и углерода, и подбор концентраций, оптимальных для роста.

Искусственное заражение овсяницы луговой эндофитом. Для опыта использовали штамм Гар 1. В качестве растения-хозяина выбрали овсяницу луговую районированный сорт Вик 5. Искусственное заражение проводилось в стерильных условиях мицелием эндофита по стандартной методике. Через три дня после заражения проростки были пересажены в стаканчики в увлажненный грунт. Стаканы помещены в поддоны, которые поставлены в климатическую камеру на 16-часовой световой день и на температуру +200С. 4 недели спустя проводили анализ растений. К этому сроку растения в климатической камере уже достигли фазы кущения. Исследовали зараженность растений, измеряли их высоту и биомассу.

12 искусственно зараженных растений и 11 контрольных не анализировали, а высадили в грунт в июле 2003 года. С этими растениями связан цикл полевых опытов (рис. 1).

Рис. 1. Схема опытов с искусственно зараженными растениями У зараженных растений изучали распространение мицелия в различных органах;

изучали сезонную и многолетнюю динамику зараженности;

проводили структурный анализ урожая зараженных и незараженных растений. В августе 2005 года часть кустов клонировали и высадили на отдельный участок.

Изучение влияния внешних условий на зараженность растений эндофитом. Эксперимент проводился на базе лаборатории иммунитета института кормов. Из семян в стерильных условиях были получены проростки, которые пересажены в сосуды с пропаренной почвой. Растения выращивались при комнатной температуре и нерегулярном световом дне. По условиям полива было сделано два варианта. Половину растений держали в более засушливых условиях, и полив проводился при достижении почвой влажности завядания (т.е., когда листья растений теряют тургор и опускаются). В другом варианте поддерживалась влажность наименьшей влагоемкости, т. е. полив осуществляли с такой частотой, чтобы в поддоне постоянно присутствовала вода. Для анализа растения срезали и определяли зараженность каждого побега, что в подобного рода экспериментах никогда ранее не делалось. При этом фиксировали биомассу каждого растения. После отрастания растений анализ был повторен.

Глава 3. Результаты и обсуждение Встречаемость. Эндофитные грибы обнаружены, в основном, в овсянице луговой, в образцах, собранных на московских газонах, на опытных участках ВНИИ кормов (Московская область) и на территории Брянской сельскохозакадемии. Однократные находки отмечены для овсяницы красной и костреца безостого, и то и другое на опытных участках института кормов. На территории Звенигородской биологической станции (Московская область), Беломорской биологической станции (Мурманская область) и Окского заповедника (Рязанская область) эндофитов не обнаружено ни в одном из исследованных образцов. Из 26 исследованных образцов семян 12 оказались зараженными. Это 6 образцов овсяницы луговой сорт Вик 5 (от 11 до 41% зараженных семян в образце), овсяница луговая сорт Краснопоймская (42%), овсяница луговая сорт Павловская (8%), два образца семян овсяницы луговой, собранных в природных местообитаниях (53 и 64%), овсяница красная сорт Jasper (10%) и кострец безостый (13%).

Микофлора поверхности листьев. С поверхности листьев овсяницы луговой были следующие виды грибов: Alternaria alternata (Fr.) Keissler, Bipolaris cynodontis (Marig.) Shoem., Epicoccum purpurascens Ehrenb. ex Schlecht., Fusarium acuminatum Ell. & Kellern, F. avenaceum (Fr.) Sacc., F.

graminearum Schwabe, F. poae (Peck) Wollenw., F. sambucinum Fuckel, Phoma pomorum Thum., а также два гриба, не образующих спороношения (Mycelia sterilia). При стерилизации фламбированием были выделены штаммы Chaetomium cochlioides Pallister.

Таким образом, есть целый ряд видов грибов, приуроченных к зоне филлопланы овсяницы. Это грибы, характерные для растительных остатков, но способные паразитировать на злаках. В случае появления какого-либо из этих видов при попытке выделить тот самый гриб, чей мицелий наблюдается внутри растения, логично будет предположить, что поверхностная стерилизация была проведена недостаточно хорошо. Эти результаты оказались очень полезными на поисковой стадии работы, когда проверялись различные стерилизующие агенты и шли попытки выделить из листьев чистую культуру эндофита. В качестве побочного результата исследований было отмечено влияние близости к шоссе на видовой состав микромицетов, выделяемых с поверхности листьев.

Чистые культуры эндофитов. Сложность выделения эндофитных грибов в чистую культуру заключается в том, что даже если мицелий, находящийся в семенах жизнеспособен, то все равно мицелий часто развивается в тканях молодого проростка, но не переходит на питательную среду. Действительно, для сильно специализированных биотрофов, которыми, без сомнения, являются эндофиты, живое растение в качестве субстрата будет предпочтительнее. Другая сложность состоит в поддержании стерильности, так как выделение гриба происходит лишь на 4-ю – 6-ю неделю инкубации, а в некоторых случаях и позднее.

Все имеющиеся изоляты (38) получены из овсяницы луговой. Из них 6 не образовывали спороношения, а 32 отнесены к виду Neotyphodium uncinatum (Gams, Petrini et Schmidt) Glenn, Bacon et Hanlin (рис. 2).

Изоляты имели однородные, белые, ватообразные, не зональные колонии.

Край колонии ровный или слегка волнистый. Реверс не окрашен. Может присутствовать желтоватый экссудат. Скорости роста отличаются у разных изолятов;

за 40 дней роста на сусло-агаре диаметр колоний может достигать от 6 до 50 мм (при комнатной температуре). Воздушный мицелий плотный (иногда чрезвычайно плотный). При микроскопировании грибов обнаруживается наличие двух типов мицелия (рис. 3). Во-первых, нормальный ровный мицелий 1,2 – 2,4 мкм шириной (мицелий I). Иногда такой мицелий формирует тяжи из 2 – 4-х гиф. А во-вторых, имеется мицелий волнистый, толстый, до 5 мкм шириной, образующий структуры, напоминающие хламидоспоры 5 – 8 х 8 – 11 мкм (мицелий II). Часто мицелий II более выражен у стерильных штаммов. Вероятно, это связано с тем, что в отсутствие конидиального спороношения гриб переходит к вегетативному размножению хламидоспорами.

Фиалиды обычно образуются на мицелии I (в том числе на тяжах), одиночно или парами. Септа при основании, как правило, отсутствует, может иметься латеральная септа. Фиалиды 1,2 – 1,5 (до 2,4) мкм в ширину у основания, к вершине суживаются до 0,6 (1,8) мкм;

от 12 до 30 мкм в длину.

Зрелые конидии обычно располагаются перпендикулярно фиалиде, иногда образуя рыхлые головки. Конидии немного изогнутые, банановидные, 1,8 – 3, х 5,0 – 9,0 мкм, в редких случаях до 15 мкм в длину (рис. 2). Иногда встречаются различные пролиферации фиалид (рис. 3).

Рост эндофитных грибов на разных питательных средах. Показано, что эндофиты способны расти на средах с аммонийными источниками азота, но на средах с нитратным азотом рост отсутствует. Подобран состав минеральной среды (СДЭ) способной поддерживать рост эндофитных грибов: H2O дист. л;

глюкоза 40,0 г;

(NH4)2SO4 1,5 г;

KH2PO4 1,0 г;

KCl 0,5 г;

MgSO4*7H 0,5 г;

FeSO4 следы;

агар 12 г. Здесь за основу взята среда Чапека, но вместо сахарозы представлена глюкоза в концентрации 40 г/л и вместо нитрата натрия – сульфат аммония (1,5 г/л). На такой среде эндофиты растут сравнительно хорошо, но естественные среды все равно оказываются более благоприятными, особенно картофельно-глюкозный агар двойной концентрации.

Рис. 2. Neotyphodium uncinatum. Фиалиды и конидии Рис. 3. Пролиферации фиалид и вегетативный мицелий Neotyphodium uncinatum Искусственное заражение. Успешно проведено искусственное заражение овсяницы луговой эндофитным грибом. В дальнейшем получены семена искусственно зараженных растений, из семян реизолирован исходный штамм Гар 1. Молодые зараженные растения имели в среднем большую биомассу, чем незараженные, но гипотеза о равенстве средних отвергалась только с надежностью 90%. При изучении распределения массы растений заметно, что различие происходит, в основном, для "средних" растений. На очень жизнеспособные растения, так же как и на очень слабые, зараженность никак не влияет. И эти две группы («хвосты» распределения) занижают значимость положительного влияния эндофита на биомассу. Различий растений по высоте отмечено не было.

Зараженность отдельных растений. Часть растений, оставшихся после предыдущего опыта, была высажена в грунт, и за этими растениями велись многолетние наблюдения. Все контрольные растения остались незараженными, т.е. горизонтальной передачи инфекции не происходило. При анализе отдельных растений обнаружилось, что одно и то же растение может иметь как зараженные эндофитом побеги, так и побеги, свободные от мицелия. Результат этот, возможно, не неожиданный, но отмечен для этих грибов впервые.

Интересно и большое разнообразие результатов, которые получились.

Если у некоторых растений все побеги были зараженными, то у других могло быть заражено менее половины побегов или всего лишь несколько штук.

Зараженность растений менялась как от сезона к сезону, так и из года в год (табл. 1). Если сравнить результаты анализа за август 2004, август 2005 и август 2006 годов, то у одних растений наблюдаем увеличение зараженности (например, растение № 19.3 – 50, 79 и 100% зараженных побегов соответственно). У других этот показатель практически не меняется (например, растение № 48.2 – 100, 92 и 100% зараженных побегов). У третьих наблюдалось то увеличение числа зараженных побегов, то, напротив, уменьшение (растение № 35.2 – 22, 17 и 42%;

растение № 43.2 – 89, 100 и 33%;

растение №48.1 – 56, 44 и 100%). При рассмотрении сезонной динамики тоже получались очень неоднородные результаты. Например, в мае 2005 года у многих растений (№№ 19.4, 35.1, 35.2, 48.2, 48.4) вообще не было обнаружено зараженных побегов. В то время как у других зараженные побеги присутствовали в значительном количестве.

Таблица Процент зараженных побегов в растениях № авг 2004 май 2005 авг 2005 май 2006 авг растения 11.1 0,0 53,8 71,4 - 0, 16.2 50,0 81,3 33,3 100,0 100, 100,0 100,0 100,0 - 19.1* 19.3 50,0 72,7 78,9 81,8 100, 19.4 80,0 0,0 84,2 100,0 100, 100,0 33,3 42,9 - 24.3* 35.1 66,7 0,0 66,7 - 100, 35.2 22,2 0,0 16,7 26,7 41, 40.2 - 66,7 - - 75, 43.2 88,9 44,4 100,0 100,0 33, 43.4 88,9 66,7 33,3 - 21, 48.1 55,6 22,2 44,4 100,0 100, 48.2 100,0 0,0 91,7 30,0 100, 48.3 66,7 88,9 75,0 - 48.4 100,0 0,0 0,0 100,0 0, * растения, использованные для клонирования Структура урожая. В ходе наблюдений за растениями, описанными выше, исследовали не только их зараженность, но также проводили структурный анализ каждого куста. Измеряли число вегетативных побегов, число генеративных побегов, сырую и сухую массу обоих категорий побегов, а также массу россыпи. Растения показали крайне высокую изменчивость, независимо от наличия эндофита в растении или его отсутствия. В обоих случаях есть как очень высокие показатели, так и очень низкие. Например, зараженные растения в среднем имеют большее число генеративных побегов, чем незараженные (34,2 и 30,6 соответственно). Но этот показатель может принимать значения от 22 до 55 у первых и от 11 до 50 у вторых. В такой ситуации критерий Колмогорова-Смирнова не выявляет различия между выборками. Подобная ситуация и по другим показателям – значимых различий между зараженными и контрольными растениями нет.

Однако более тонкий статистический анализ с использованием метода бутстреп-моделирования показывает, что распределение биомассы зараженных растений более ассиметрично, чем у контрольных. Надежность различия в данном случае составляет более 99%.

При изучении клонированных растений оказалось, что зараженные растения от контрольных сильно отличали по зимостойкости. Суровую зиму 2005 года пережило 78% зараженных растений (21 из 27) и 50% контрольных (14 из 28). Гипотеза о равенстве долей при таком объеме выборок отвергается с 96%-ной надежностью. Структурный анализ тоже показал лучшее развитие зараженных растений (табл. 2.) Таблица Сравнение зараженных и контрольных клонированных растений по структуре урожая n1 n2 m1 m2 m3 m Вариант Статистики Среднее 5,4 11,6 8 8 12 Контрольные Стандартное 6,5 17,5 11 12 17 отклонение Среднее 10,2 48,3 26 36 12 Зараженные Стандартное 7,1 32,9 18 28 10 отклонение Вероятность того, что средние различны (по 0,949 0,999 0,998 0,999 0, критерию Стьюдента) Примечание. n1 – количество генеративных побегов, n2 – количество вегетативных побегов, m1 – масса генеративных побегов, m2 – масса вегетативных побегов, m3 – масса россыпи, m – суммарная биомасса;

количество в штуках, масса в граммах Влияние внешних условий на зараженность проростков. В этом опыте мы проверяли гипотезу о том, что доля зараженных проростков будет зависеть не только от жизнеспособности мицелия в семенах, но и от внешних условий. В качестве внешних условий был выбран полив, так как это один из самых удобных для контроля параметров. Для опыта брали пробу семян со 100%-ной зараженностью. Все контрольные растения были свободными от мицелия, это позволяет утверждать, что не происходило перезаражения растений. Среди анализируемых растений, как и ожидалось, были и зараженные растения и растения, в которых эндофитного мицелия обнаружено не было. Обычно это объясняется тем, что в некоторых семенах мицелий был нежизнеспособным (методика окрашивания не позволяет различать живой и мертвый мицелий). Но в разных вариантах опыта доля растений без мицелия оказалась значимо различной, см. табл. 3.

Таблица Сравнение количества зараженных растений при разных условиях полива Слабый полив Сильный полив Первый анализ Зараженные 56 Незараженные 37 Всего 93 99* Доля незараженных 0,40 0, Надежность различия долей – 0, Второй анализ Зараженные 55 Незараженные 38 Всего 93 Доля незараженных 0,41 0, Надежность различия долей – 0, * Побеги от двух растений при первом анализе не учитывали Анализ всех побегов каждого растения позволил обнаружить небольшое количество растений (24), которые имели как зараженные, так и чистые побеги.

Доля таких растений среди общего числа составляет немногим более 12%. У некоторых растений был лишь один зараженный побег (№№ 19, 49 и 91 в первом анализе). При повторном анализе два из этих трех кустов оказываются чистыми, но действительно ли они свободны от эндофитного гриба? Ведь, например, растения № 83 и № 166 в первом анализе казались незараженными, а при повторном анализе имели 3 зараженных побега из 13 и 4 из соответственно. Часть растений имела почти все зараженные побеги, но или при первом анализе, или при втором (или в обоих случаях) обнаруживали по одному незараженному побегу.

При первом анализе перед тем, как проверять зараженность, проводили измерение зеленой массы надземной части растений. Данные по средним значениям зеленой массы и количества побегов приведены в табл. 4.

Таблица Сравнение массы надземной части и количества побегов в разных вариантах опыта Показатели Вариант Инфицирован- Масса Статистики Количество Всего полива ность надземной побегов растений части, г Среднее 3,801 6, Зараженные Стандартное 1,373 1, отклонение Слабый Среднее 3,805 6, Незараженные Стандартное 1,573 2, отклонение Среднее 4,952 7, Зараженные Стандартное 2,207 2, отклонение Сильный Среднее 5,386 6, Незараженные Стандартное 2,439 3, отклонение В условиях более сильного полива растения, в среднем, имели большую биомассу при том же числе побегов (надежность – 0,97). Различий межу зараженными и чистыми растениями в этом опыте обнаружено не было (при сравнении биомассы и числа побегов у зараженных и незараженных растений, не учитывались те из них, которые имели как зараженные, так и незараженные побеги).

Распространение мицелия в растении. Для получения общей картины распространения мицелия эндофитного гриба в растении-хозяине использовали данные полевых опытов, отдельные наблюдения, сделанные как в природе, так и в лаборатории, а также результаты анализа молодых растений, выращенных в стерильных условиях. Из данных полевых опытов мы уже знаем, что в инфицированном растении могут присутствовать как зараженные, так и незараженные побеги. Рассмотрим, как происходит распределение мицелия в побеге.

Результаты распространения мицелии в молодых растениях, имеющих только два побега, представлены в табл. 5. Зараженность отдельных частей растений определяли как процент растений, у которых в данной области были обнаружены грибные гифы.

Таблица Зараженность отдельных частей растений, % Влагалище Пластинка Влагалище Пластинка Пластинка Стебель первого первого второго второго третьего листа листа листа листа листа Первый 100 100 50 100 83 побег Второй 100 100 89 НД 80 НД побег Мицелий всегда присутствует в стебле вегетативного побега, причем его гифы заходят в конус нарастания и в листовые зачатки (рис. 4). Из таблицы видно, что если мицелий в зараженном побеге заходит во влагалища всех листьев, то в листовой пластинке (рис. 5) он может быть, а может и не быть.

Эти результаты подтверждаются данными полевых наблюдений. Летом года при анализе растений с опытных делянок мицелий обнаруживался в большинстве проанализированных листовых пластинках зараженных побегов.

Летом же 2006 года ни в одном из зараженных растений не было зараженных листовых пластинок. Гифы были локализованы только во влагалищах листьев, не заходя дальше. С чем связаны подобные изменения распространения мицелия, неизвестно. Во всяком случае, оказывается, что эндофит не имеет жесткой приуроченности к определенному органу растения, а может развиваться по-разному в зависимости от каких-либо изменений в растении и/или в окружающей среде.

Рис. 4. Продольный срез стебля Рис. 5. Листовая пластинка вегетативного укороченного побега Кроме того, летом 2005 года дважды на листьях были обнаружены фиалиды с конидиями, типичные для рода Neotyphodium, см. рис. 6. Это совершенно уникальные данные, так как, хотя эндофиты и образуют конидиальное спороношение при выращивании на питательной среде, но в природе его никогда ранее не находили. Таким образом, наши наблюдения показывают принципиальную возможность горизонтальной передачи инфекции.

Неветвящиеся гифы также обнаружены в стеблях генеративных побегов.

У многих растений наряду с зараженными генеративными побегами появляются и побеги незараженные, продуцирующие незараженные семена.

Для изучения зараженности семян исследовали давленные препараты в анилиновом синем. В давленом препарате хорошо заметно густое сплетение грибных гиф среди клеток алейронового слоя (рис. 7.).

Рис. 6. N. uncinatum, фиалида с Рис. 7. Эндофитный мицелий среди конидией на поверхности листа клеток алейронового слоя семени Традиционно считается, что мицелий эндофитных грибов локализован исключительно в надземных органах растений. Действительно при анализе срезов корней растений, взятых из грунта, присутствия грибных гиф там не обнаружено. Однако, исследуя молодые проростки, выращенные на питательной среде из зараженных семян (поверхностно стерилизованных), мы обнаружили, что выделение гриба на питательную среду происходит не только из самого семени и в месте контакта листьев проростка с питательной средой, но и из корня. Корни при этом имеют небольшие утолщения. Срезы утолщенной части корня несут обильное сплетение гиф, которое располагается под эпидермисом, но не заходит в центральный цилиндр (рис. 8). В месте выхода мицелия на питательную среду происходит разрыв эпидермиса.

Это означает принципиальную возможность захождения эндофитных гиф в корень, по крайней мере, в условиях in vitro. Так как в предыдущих опытах нами было показано существенное разнообразие в распределении эндофитного мицелия в растении, то можно предположить, что при в определенных условиях грибные гифы могут заходить в корень и в природе. Для прояснения данного вопроса необходимо проводить не разовые проверки, а вести многолетнее систематическое изучение отдельных растений.

А Б Рис. 8. Поперечный срез корня проростка вблизи выхода мицелия на питательную среду. А – общий вид, Б – отдельные гифы между клеток корня.

Модель динамики зараженности. Полученные данные позволяют по новому взглянуть на динамику зараженности полей, газонов и пастбищ.

Зараженность поля определяется, как процент зараженных побегов среди всех проанализированных. При этом исследователями предполагалось, что все побеги в зараженном растении несут эндофитную инфекцию.

В настоящий момент изменение зараженности объясняют конкурентным взаимодействием зараженных и незараженных растений. Например, условия среды благоприятствуют зараженным растениям, те начинают вегетативно размножаться, в то время как «чистые» растения не выдерживают конкуренции и элиминируются. В результате доля зараженных растений на поле повышается. Схематичное изображение такой модели представлено на рис. 9.

Рис. 9. Модель динамики зараженности, основанная на конкурентном взаимодействии зараженных и незараженных растений Мы предлагаем другой возможный механизм изменения зараженности, основанный на изменении числа зараженных побегов в отдельном растении.

При изменении внешних условий среды или в ответ на определенный стимул растения-хозяина развитие мицелия может активизироваться. В злаке начинают образовываться зараженные побеги (рис. 10).

Рис. 10. Модель динамики зараженности, основанная на изменении зараженности отдельных растений Такая модель предполагает более быстрое реагирование на условия окружающей среды и объясняет появление эндофитов на полях, которые в предшествующих исследованиях были отмечены как незараженные.

ВЫВОДЫ 1. Присутствие эндофитных грибов обнаружено в Брянской области (в овсянице луговой), в Москве (в овсянице луговой) и в Московской области (в овсянице луговой, овсянице красной и костреце безостом).

2. Создана коллекция из 38 изолятов эндофитных грибов, из которых 6 не образуют спороношения, а 32 относятся к виду Neotyphodium uncinatum.

3. На основании опытов по изучению физиологии питания предложен состав минеральной среды, способной поддерживать рост эндофитных грибов.

4. Эндофитные грибы не оказывают отрицательного воздействия на рост и развитие растения-хозяина. Напротив, в некоторых условия присутствие эндофита может положительно влиять на биомассу растения, на число побегов и на зимостойкость молодых растений.

5. В инфицированном растении могут присутствовать как зараженные, так и незараженные побеги. Доля зараженных побегов может меняться со временем как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения. На степень развития мицелия в растении положительно влияет дефицит воды.

6. В растении эндофитный мицелий локализован преимущественно во влагалищах зараженных побегов;

показана возможность захождения грибных гиф в листовую пластинку и корень растения.

7. Впервые в природных условиях было обнаружено образование конидиального спороношения Neotyphodium uncinatum, что показывает принципиальную возможность горизонтальной передачи инфекции.

8. Предложена новая модель динамики зараженности, основанная на изменении числа зараженных побегов в растении. Она может быть использована для объяснения динамики зараженности полей и пастбищ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Благовещенская Е.Ю. К вопросу об обнаружении эндофитов злаковых трав// Тезисы докладов 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (14 – 18 апреля 2003 года). Пущино, 2003. С. 265 266.

2. Благовещенская Е.Ю. Выделение эндофитных грибов из семян овсяницы луговой//Материалы VII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (17 – 21 мая 2004 года). СПб: СПГУТД, 2004. С. 59.

3. Благовещенская Е.Ю., Дьяков Ю.Т., Костенко Н.Ю. Эндофитные грибы овсяницы: выделение и искусственное инфицирование растения-хозяина// Труды международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН (24 – 28 апреля 2005 года). Том 1. СПб, 2005. С. 60-64.

4. Благовещенская Е.Ю., Дьяков Ю.Т. Эндофитные грибы злаков// Микология и фитопатология. 2005. Т. 39. Вып. 3. С. 1-15.

5. Благовещенская Е.Ю., Костенко Н.Ю., Разгуляева Н.В. Искусственное заражение овсяницы луговой эндофитным грибом// Микология и фитопатология. 2005. Т. 39. Вып. 5. С. 64-72.

6. Благовещенская Е.Ю. Эндофитный мицелий в овсянице луговой// Материалы международной конференции «Грибы и водоросли в биоценозах 2006», посвященной 75-летию Биологического факультета МГУ им. М.В.

Ломоносова (31 января – 3 февраля 2006 года). М: МАКС Пресс, 2006. С. 29-30.

7. Благовещенская Е.Ю. Динамика зараженности овсяницы луговой эндофитными грибами// Материалы I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (21 – 26 мая 2006 года). СПБ: изд-во ГЭТУ, 2006. С. 287-288.