Евгений викторович исследование сезонных изменений в микросомальной фракции, обогащенной na,k-атфазой, из почек сусликов spermophilus undulatus

На правах рукописи

УДК 577.352.33 Басевич Евгений Викторович ИССЛЕДОВАНИЕ СЕЗОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В МИКРОСОМАЛЬНОЙ ФРАКЦИИ, ОБОГАЩЕННОЙ Na,K-АТФазой, ИЗ ПОЧЕК СУСЛИКОВ Spermophilus undulatus 03.01.04 – Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2010 Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

доктор биологических наук, профессор

Научный консультант:

Рубцов Александр Михайлович доктор физико-математических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Твердислов Всеволод Александрович доктор биологических наук Авдонин Павел Владимирович

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится 6 декабря 2010 года в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 1 ноября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Медведева М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Многие мелкие млекопитающие северных широт (грызуны, насекомоядные, рукокрылые) проводят зиму в состоянии глубокого оцепенения. Зимняя спячка таких животных (гибернация) является природным приспособлением, позволяющим выживать в условиях низких температур, недостатка кормов и воды [Lyman, 1982;

Калабухов, 1985]. Во время спячки наблюдается примерно стократное снижение уровня метаболизма относительно активного состояния [Galster, Morrison, 1970], сопровождающееся снижением потребления кислорода в 45– 140 раз [Ануфриев, 2008]. В результате замедления обмена веществ животные остывают, но и в таких условиях они продолжают контролировать температуру тела, не позволяя ей опускаться ниже точки замерзания биологических жидкостей [Ануфриев, Ахременко, 1990]. Замедление процессов обмена веществ при гибернации происходит вследствие сложного комплекса физиологических и биохимических перестроек, направленных на экономию энергетических запасов [Geiser, 1988;

Heldmaier, Ruf, 1992;

Geiser, Ruf, 1995]. В результате этого энергозатарты оказываются снижены на 80–90% (даже с учетом затрат на разогревание тела при периодических пробуждениях) по сравнению с энергозатратами на поддержание постоянной температуры тела при той же температуре окружающей среды [Калабухов, 1985;

Шмидт-Ниельсен, 1982].

При гибернации наблюдается замедление дыхания и частоты сердцебиения, торможение нервной деятельности и других физиологических процессов [Ануфриев, 2008]. Тем не менее, протекающий на низком уровне обмен веществ приводит к накоплению в крови метаболитов, однако в состоянии гипотермии образование мочи в почках не происходит [Попова, 1979].

Восстановление гомеостаза осуществляется только в процессе спонтанных кратковременных пробуждений между баутами спячки, во время которых обязательно происходит формирование и выведение мочи [Ануфриев, 2008]. В почках, где расход энергии на единицу массы больше, чем в любом другом органе, основным потребителем АТФ является Na,K-АТФаза, на работу которой в клетках почечных канальцев в норме тратится до 80% АТФ [Березов, Коровкин, 2002]. Толстые восходящие ветви петель Генле, сосредоточенные преимущественно в наружной медулле и частично в коре почек, особенно богаты Na,K-АТФазой, которая обеспечивает реабсорбцию ионов, метаболитов и воды в почечных канальцах [Березов, Коровкин, 2002]. В условиях гипометаболизма, когда подавлены как гликолиз [El Hachimi et al., 1990;

Brooks, Storey, 1992], так и окислительное фосфорилирование [Fedotcheva et al., 1985;

Bronnikov et al., 1990], продукция и, соответственно, расходование АТФ снижены, поэтому особый интерес представляет исследование особенностей функционирования Na,K-АТФазы в почках при гипо- и нормотермии зимоспящих животных.

Несмотря на то, что в проведенных ранее зарубежных работах показано, что при гибернации активность Na,K-АТФазы (при 37°C) из почек зимоспящих животных заметно снижается, причины падения активности фермента пока не ясны [Charnock, Simonson, 1978;

Bennis et al., 1995]. Регуляция активности Na,K-АТФазы может осуществляться посредством изменения содержания фермента или его изоформ, что описано для разных ферментов [Storey, Storey, 2004], а также в результате посттрансляционных модификаций фермента, таких как фосфорилирование [MacDonald, Storey, 1999] и глутатионилирование [Yakushev et al., 2010;

Petrushanko et al., in press].

Помимо этого поскольку Na,K-АТФаза является интегральным мембранным ферментом, ее активность зависит от липидного микроокружения [Grisham, Barnett, 1973;

Charnock et al., 1973;

Kimelberg, Papahadjopoulos, 1974;

Boldyrev et al., 1977], поэтому изменение свойств мембран (в частности, микровязкости липидного бислоя) при гибернации также может быть механизмом регуляции ферментативной активности.

Целью настоящей работы было определение сезонных изменений активности Na,K АТФазы в микросомах из почек типичных гибернаторов – сусликов Spermophilus undulatus, а также выяснение возможных причин этих изменений. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать сезонные изменения активности и содержания Na,K-АТФазы в микросомальных фракциях из почек активных и спящих сусликов.

2. Оценить уровень фосфорилирования и глутатионилирования Na,K-АТФазы.

3. Определить состав и свойства липидной фазы мембран микросом.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые доподлинно показано, что падение активности Na,K-АТФазы в микросомальных препаратах из почек сусликов при гибернации только отчасти обусловлено уменьшением содержания фермента.

Установлено, что во время зимней спячки остается стабильным изоферментный состав Na,K АТФазы в почках и не наблюдается глутатионилирования -субъединицы Na,K-АТФазы, а также изменения уровня ее фосфорилирования. Среди других фосфорилируемых белков не обнаружено потенциальных регуляторов Na,K-АТФазы. Установлено, что при гибернации в плазматических мембранах клеток почечных канальцев достоверно не изменяется соотношение липид/белок и степень ненасыщенности жирных кислот липидов. В то же время обнаружено, что во время зимней спячки увеличивается содержание холестерина в мембранах микросом, но это не влияет на их общую микровязкость, что определено с помощью спиновых и флуоресцентных зондов. Также впервые установлено, что при гибернации Na,K-АТФаза в почках находится в более агрегированном состоянии. Предполагается, что агрегация натриевого насоса во время зимней спячки является основной причиной снижения его активности в почках.

Проведенные исследования значительно углубляют имеющиеся знания о молекулярных механизмах регуляции активности Na,K-АТФазы в почках при гибернации. Полученные результаты свидетельствуют в пользу существующего представления о возможной роли агрегации ферментов в регуляции активности транспортных АТФаз, в частности, Na,K-АТФазы при гибернации.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных семинарах кафедры биохимии биологического факультета МГУ, XIII–XVII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006–2010), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), международных симпозиумах «Biological Motility» (Пущино, 2008, 2010), международных конференциях «Молекулярные механизмы адаптаций» (Махачкала, 2008, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы:

«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы».

Работа изложена на 190 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и 11 таблицами. Список цитированной литературы включает 370 отечественных и зарубежных печатных и Web-источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ длиннохвостых сусликов Spermophilus Взрослых Экспериментальные животные.

undulatus отлавливали в Якутии и содержали в виварии Института биофизики клетки РАН (Пущино) в индивидуальных клетках при 20–25°C в условиях естественной длины светового дня и стандартного кормления. В ноябре сусликов помещали в темную комнату и содержали при температуре 2–4°C. Активных сусликов (температура тела 37°C) использовали в экспериментах в апреле-июле, а спящих (температура тела 2°C) – в феврале-марте в середине баута спячки [Игнатьев и др., 2001;

Захарова и др., 2008]. Для транспортировки почки сусликов замораживали в жидком азоте и хранили при –80°C до использования. Материал был любезно предоставлен к.б.н.

Н.М. Захаровой (Институт биофизики клетки РАН, Пущино).

получали из наружного Микросомальную фракцию плазматических мембран медуллярного слоя почек сусликов методом дифференциального центрифугирования [Jorgensen, 1974;

Charnock et al., 1977] с добавлением в соотношении 1:100 (по объему) коктейля ингибиторов протеаз (Amresco M221).

Концентрацию белка в микросомах определяли по методу Лоури в присутствии 1% дезоксихолата натрия [Lowry et al., 1951], используя в качестве стандарта БСА.

Активность Na,K-АТФазы измеряли с помощью сопряженных ферментативных реакций [Norby, 1988] в среде, содержавшей 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 50 мМ имидазола-HCl, pH 7,2, 2,5 мМ АТФ, 2 мМ фосфоенолпирувата, 0,3 мг/мл НАДH, 5 ед./мл пируваткиназы, 10 ед./мл лактатдегидрогеназы, 1,5 мкг/мл белка микросом, 10 мкг/мл каналообразователя аламетицина. Измерения проводили на спектрофотометре Ultrospec 2100 pro с термостатом Multitemp III (GE Healthcare) в диапазоне температур от 2,5° до 37°C.

Электрофорез в ПААГ проводили по методу Лэммли [Laemmli, 1970], используя 5% концентрирующий и 8–20% градиентный разделяющий гели [Shorina et al., 1997]. В качестве белков-маркеров использовали набор PageRuler, содержавший предварительно окрашенные белки с молекулярными массами от 10 до 250 кДа (Fermentas SM1811).

Иммунохимическое окрашивание белков [Долгова и др., 2007], иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране по методу Тоубина [Towbin et al., 1979], проводили с использованием моноклональных антител мышей, специфичных к 1-субъединице Na,K-АТФазы (Clone C464.6, Millipore 05-369), к актину (JLA20) и к глутатиону (Clone D8, Millipore MAB5310), а также поликлональных антител кроликов к 2-субъединице Na,K-АТФазы (Millipore AB9094) и вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma A0168 и A0545).

Степень агрегации Na,K-АТФазы в микросомах оценивали посредством метода ковалентных сшивок. Для этого проводили обработку препаратов сшивающим агентом фенантролином в комплексе с ионами меди при 37°C. При приготовлении образцов для электрофореза в ПААГ использовали буфер, не содержавший -меркаптоэтанол [Shorina et al., 2004].

Нативный уровень фосфорилирования белков микросомальных препаратов оценивали c помощью флуоресцентного красителя для фосфобелков в геле Pro-Q Diamond (Invitrogen). Для этого гель фиксировали в растворе 50% метанола и 10% уксусной кислоты (30 мин, 2 раза), отмывали в воде и окрашивали в десятикратном по отношению к объему геля объеме красителя в течение 1 ч во избежание яркого фона. Полосы фосфобелков визуализировали с помощью системы BioSpectrum (UVP) при верхнем УФ-освещении, регистрируя флуоресценцию в области 570–640 нм (диафрагма 1,2, выдержка 3,5 с). После этого краситель удаляли из гелей выдерживанием в растворе 50 мМ Na2CO3, pH 4,0, 20% ацетонитрила (3 раза по 30 мин), гели отмывали в воде и прокрашивали Кумасси R-250 для контрольной оценки содержания белка [www.invitrogen.com].

изучали методом Фосфорилирование белков эндогенными протеинкиназами авторадиографии. Для этого препараты инкубировали 10 мин при 37°C в среде, содержавшей мМ Tris-HCl, pH 7,4, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ЭГТА, 5 мМ MgCl2, 0,1 мМ Na3VO4, 5 мМ NaF, 1 мМ п НФФ, 1:100 (по объему) коктейля ингибиторов протеаз (Amresco M221), 1 мг/мл белка, 1 мМ [ P]АТФ (5 МБк/мкмоль) [Hawkins et al., 1994;

Пелози, Донелла-Деана, 2000].

Идентификацию белков методом тандемной масс-спектрометрии, сопряженной с ВЭЖХ с нанопотоками (LC-MS/MS), с предварительной обработкой трипсином проводили на хроматографе Ultimate Plus (LC Packings), соединенном с масс-спектрометром Esquire 6000 (Bruker Daltonic). Эксперименты были любезно выполнены к.х.н. Р.Х. Зиганшиным в лаборатории протеомики Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН (Москва).

Жирнокислотный состав липидов и содержание холестерина в мембранах микросом определяли методом масс-спектрометрии, сопряженной с газовой хроматографией (GC-MS). Для этого 15 мкл микросомальной фракции (в среднем 85 мкг белка) высушивали после добавления равного объема метанола и подвергали кислому метанолизу (1 М HCl в метаноле, 400 мкл) в течение 1 ч при 80°C. Далее проводили экстракцию образовавшихся метиловых эфиров жирных кислот, альдегидов и стероидов гексаном (400 мкл) в течение 5 мин. Гексановый экстракт высушивали, и сухой остаток обрабатывали N,О-бис-(триметилсилил)-трифторацетамидом ( мкл) в течение 15 мин при 80°C для получения триметилсилильных эфиров. К смеси эфиров добавляли 80 мкл гексана и 1–2 мкл полученного раствора вводили в инжектор установки для GC MS [Осипов, 2010]. Эксперименты были любезно выполнены д.б.н. Г.А. Осиповым в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН (Москва).

Спектры ЭПР спиновых зондов 5-доксилстеарата и метилового эфира 16-доксилстеарата, встроенных в мембраны микросом, регистрировали на спектрометре ЭПР Varian E-4 с постоянной рабочей частотой 9,2 ГГц в диапазоне температур от –60° до 40°C. Регистрацию проводили при ширине развертки постоянного магнитного поля 40 Э, амплитуде модуляции 2 Э, мощности СВЧ излучения 10 мВт, скорости записи 2 мин, постоянной времени 0,1 с. Среда для измерений содержала 25 мМ имидазола-HCl, pH 7,0, 250 мМ сахарозы, 5 мг/мл белка микросом и 0,1 мМ зонда. По спектрам ЭПР 5-доксилстеарата рассчитывали параметр порядка S, по спектрам ЭПР метилового эфира 16-доксилстеарата вычисляли время вращательной корреляции зонда c (нс) [Marsh, 1981;

Fung, Johnson, 1984]. Эксперименты проводили на кафедре биофизики физического факультета МГУ при любезном содействии к.ф.-м.н. Ю.А. Кокшарова.

Флуоресценцию гидрофобных зондов АНС и пирена измеряли на спектрофлуориметре Varian Cary Eclipse с термоприставкой (ширина щелей составляла 5 нм). Титрование микросом различными концентрациями АНС (10–100 мкМ) проводили в среде, содержавшей 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 20 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 мг/мл белка микросом. Флуоресценцию АНС возбуждали при 375 нм и регистрировали при 480 нм при температурах 12°, 25° и 37°C. Среда для измерения флуоресценции пирена содержала 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 30 мМ PIPES-NaOH, pH 7,0, 0,2 мг/мл белка микросом, 7 мкМ пирена. Флуоресценцию зонда возбуждали при 285 нм («вызванная» флуоресценция) или при 335 нм (собственная флуоресценция), регистрировали флуоресценцию мономеров пирена при 394 нм, а эксимеров при 470 нм. Измерения проводили в диапазоне температур от 5° до 40°C [Владимиров, Добрецов, 1980].

Математическая обработка результатов. Все эксперименты, представленные в работе, были проведены не менее трех раз не менее чем на 3 разных препаратах микросом, после чего были рассчитаны средние значения и стандартные ошибки. Для оценки достоверности различий данных двух выборок (активные суслики, спящие суслики) использовали двухвыборочный t критерий Стьюдента для независимых выборок с неравными дисперсиями с двусторонним распределением. При этом исходили из предположения, что данные имеют нормальное распределение. Достоверными считали различия с уровнем значимости p0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика микросомальных препаратов из почек сусликов. При выделении микросомальных фракций из наружного медуллярного слоя почек сусликов, в котором содержится наибольшее количество Na,K-АТФазы с высоким уровнем активности [Katz et al., 1979;

El Mernissi, Doucet, 1984], было получено примерно по 20 препаратов из почек активных и спящих животных. В препаратах была определена концентрация белка (в среднем ~5,5 мг/мл) и рассчитан выход белка микросомальных фракций (табл. 1). Согласно полученным данным выход белка в расчете на вес почек (а также отдельно на ткань наружной медуллы, составляющей примерно 20% массы почек) не изменяется в зимний период у спящих сусликов. При этом также остается стабильным вес почек, что может свидетельствовать об отсутствии морфологических изменений в органе при гибернации.

Таблица.1. Вес пар почек активных и спящих сусликов и выход белка микросомальных фракций в расчете на вес почек и ткань наружной медуллы.

Выход белка из ткани, мг/г ткани * Животные Вес пары почек, г * целые почки наружная медулла Активные (n=14) 2,85 ± 0,12 4,38 ± 0,46 16,65 ± 1, Спящие (n=13) 2,75 ± 0,12 4,24 ± 0,50 16,77 ± 1, * p0,5.

Относительный белковый состав микросомальных фракций из почек сусликов был проанализирован при электрофоретическом разделении белков в ПААГ. На полученных электрофореграммах можно выделить более 30 белковых полос (рис. 1). При расчете содержания индивидуальных белков по интенсивностям полос было установлено, что содержание 5 белков достоверно увеличивается при гибернации, а содержание других 6 белков наоборот достоверно уменьшается (табл. 2). Полоса с кажущейся молекулярной массой 95 кДа соответствует по электрофоретической подвижности каталитической -субъединице Na,K-АТФазы [Yamaguchi, Tonomura, 1979], что подтверждено с использованием моноклональных антител к данной субъединице фермента (данные представлены и обсуждаются ниже). При гибернации содержание этого 95 кДа-белка в микросомальных фракциях из почек сусликов достоверно падает на 21% – на столько же, на сколько и содержание белка с кажущейся молекулярной массой 60 кДа, соответствующего по электрофоретической подвижности регуляторной -субъединице Na,K АТФазы [Yamaguchi, Tonomura, 1979]. Расчет показал, что в микросомальных фракциях из почек как активных, так и спящих сусликов относительное содержание - и -субъединиц (оцененное по интенсивностям соответсвующих белковых полос) не демонстрирует сезонных различий: их доли составляют 60,8 и 39,2% соответственно. Эти значения существенно не отличаются от теоретических (61,3 и 38,7%), что указывает на то, что во фракциях микросом каталитическая и регуляторная субъединицы Na,K-АТФазы присутствуют в эквимолярном соотношении. Доля взятых вместе - и -субъединиц в микросомальных препаратах составляет более 10% от общего количества белка – таким образом, Na,K-АТФаза является основным белком во фракциях микросом из почек сусликов.

Рис..1. Электрофореграмма микросомальных препаратов из почек активных и спящих сусликов, прокрашенная Кумасси R-250.

Сезонные изменения АТФазной активности в препаратах микросом из почек сусликов. Поскольку большая часть мембран микросом образует замкнутые везикулы [Walter, 1975], непроницаемые для АТФ и ионов, измерения активности Na,K-АТФазы проводили в присутствии каналообразователя аламетицина, добавление которого увеличивало активность фермента в 2–3 раза. В таких условиях активность Na,K-АТФазы при 37°C в микросомах из наружной медулы почек активных и спящих сусликов составляла 146 ± 9 и 82 ± 4 мкмоль/ч на 1 мг белка микросом соответственно (p0,00001). В отсутствие аламетицина значения активности Na,K-АТФазы в препаратах микросом из почек активных и спящих сусликов достоверно не различались (около 45 ± 3 мкмоль/ч на 1 мг белка микросом, p0,1). Аламетицин практически не влиял на уабаин-нечувствительную Mg-АТФазу, активность которой с повышением концентрации ионофора падала на 5–6%.

Сезонные изменения содержания белков в Таблица.2.

микросомальных препаратах из почек сусликов, определенные по электрофореграммам.

Содержание белка во фракции, Белковая мкг/мг общего белка полоса, Спящие/Активные кДа Активные (n=8) Спящие (n=8) 365 31,3 ± 2,1 42,0 ± 0,7 +34% ** 245 8,2 ± 0,1 10,9 ± 0,6 +33% * 165 15,2 ± 0,9 18,6 ± 0,8 +22% * 95 86,5 ± 3,2 68,7 ± 1,4 –21% ** 67 47,9 ± 0,9 69,8 ± 3,3 +46% * 60 55,8 ± 2,3 44,3 ± 3,5 –21% * 54 27,7 ± 1,6 23,7 ± 0,9 –14% * 47 53,1 ± 1,7 44,4 ± 2,5 –16% * 33 39,7 ± 2,2 29,8 ± 3,9 –25% * 15 22,3 ± 0,7 19,1 ± 0,9 –14% * 13 16,1 ± 0,7 22,1 ± 1,9 +37% * * p0,05, ** p0,005.

Рис..2. Графики Аррениуса 6 для активности Na,K-АТФазы Активные (n=14) (A, мкмоль/ч на 1 мг белка) в препаратах микросом из почек ** * 5 активных и спящих сусликов.

* Спящие (n=16) ** Стрелка указывает на * критическую температуру, * в области которой происходит 4 * структурный переход.

* ln(A) * p0,0005, 3 ** ** p0,05, *** p0,5.

** 20°C *** *** *** 3,2 3,3 3,4 3,5 3, 1 0 /T Температурная зависимость активности Na,K-АТФазы в исследуемых препаратах, представленная в координатах Аррениуса, имеет характерный вид с перегибом в области 20°C (рис. 2). Такая зависимость хорошо известна для многих мембранных ферментов, в частности для Na,K-АТФазы, а перегибы на графиках Аррениуса обычно связывают со структурными перестройками мембран [Болдырев, 1982]. Было установлено, что при температурах выше 20°C активность Na,K-АТФазы в микросомах из почек спящих сусликов в 1,8–2,0 раза ниже по сравнению с микросомами из почек активных сусликов. Графики Аррениуса в этом диапазоне температур практически параллельны, то есть энергия активации Na,K-АТФазы из почек активных и спящих сусликов в этих условиях одинакова (около 11,5 ккал/моль). При понижении температуры с 20° до 2,5°C различия в активности Na,K-АТФазы становились менее выраженными. В этих условиях энергия активации Na,K-АТФазы в препаратах из почек спящих сусликов примерно на 7 ккал/моль меньше по сравнению с препаратами из почек активных животных (27,9 и 35,0 ккал/моль соответственно). Такое снижение энергии активации Na,K АТФазы при гибернации, по всей видимости, имеет особое значение, позволяя ферменту быстрее включиться в работу почек пробуждающихся сусликов, которым необходимо быстро восстановить гомеостаз. Активность Mg-АТФазы в препаратах была существенно ниже активности Na,K-АТФазы почти во всем диапазоне температур и уменьшалась при гибернации лишь в 1,3–1,6 раза. Графики Аррениуса для Mg-АТФазы линейны, то есть Mg-АТФаза не реагирует на структурные перестройки мембранных липидов в области критических температур.

Рис..3. Иммунохимическое окрашивание 1-субъединицы Na,K-АТФазы (95 кДа) и актина (43 кДа) в микросомальных фракциях из почек сусликов с использованием моноклональных антител.

Содержание Na,K-АТФазы в микросомальных фракциях из почек сусликов. Одной из причин снижения активности Na,K-АТФазы в микросомах из почек сусликов при гибернации может быть уменьшение содержания фермента в плазматических мембранах [Charnock, Simonson, 1978;

Bennis et al., 1995]. Для оценки содержания Na,K-АТФазы в препаратах микросом было проведено иммунохимическое окрашивание каталитической субъединицы Na,K-АТФазы (95 кДа) с использованием антител к 1-изоформе фермента (рис. 3). Было установлено, что при гибернации содержание Na,K-АТФазы в микросомах из почек сусликов уменьшается лишь на 25% (p0,0015), поэтому такое уменьшение содержания Na,K-АТФазы в почках сусликов не может быть единственной причиной почти двукратного падения активности фермента. Также в качестве внутреннего контроля с помощью специфичных антител были визуализированы полосы мембраносвязанного актина (43 кДа), содержание которого не показало сезонных различий (p0,15).

С использованием антител к 2-субъединице Na,K-АТФазы было установлено, что в микросомах из почек как активных, так и спящих сусликов эта изоформа фермента отсутствует (данные не представлены). Это согласуется с тем, что во всех сегментах почек 1-изоформа каталитической субъединицы Na,K-АТФазы является единственной [Mobasheri et al., 2000].

Ингибирование уабаином Na,K-АТФазы в препаратах, выделенных из почек сусликов. Известно, что разные изоформы -субъединицы Na,K-АТФазы характеризуются различной чувствительностью к уабаину [Bennis et al., 1997]. Исследование ингибирования фермента уабаином в препаратах показало, что чувствительность Na,K-АТФазы в почках сусликов к этому ингибитору при гибернации не изменяется (IC50 = 1,2·10–5–1,3·10–5 М). Это означает, что при гибернации в почках сусликов не изменяется субпопуляционный состав фермента, а также не противоречит данным литературы о моноизоферментном (1, 1) составе Na,K-АТФазы из почек [Mobasheri et al., 2000]. Также установлено, что низкие концентрации уабаина (от 10–10 до ~10–7 М) активируют Na,K-АТФазу из почек активных и спящих сусликов (AC50 = ~10–9 М), что отмечалось и ранее [Котлобай, 1989].

Посттрансляционные модификации белков микросомальных фракций из почек сусликов. Известно, что изменение активности многих ферментов при гибернации связано с их фосфорилированием протеинкиназами [Storey, 1997]. Результатом такого фосфорилирования белков плазматических мембран скелетных мышц сусликов является снижение активности Na,K АТФазы в зимний период [McDonald, Storey, 1999]. Фосфорилирование же самой Na,K-АТФазы (-субъединицы) различными протеинкиназами (A, C и G) может сказываться на ее ферментативной активности [Chibalin et al., 1998;

Муртазина и др., 2001;

Eklof et al., 2001].

Рис..4. Идентификация фосфорилированных белков в геле с помощью флуоресцентного красителя Pro-Q Diamond.

Для сравнения приведены фрагменты электрофореграммы, прокрашенной Кумасси R- (2 средние дорожки и дорожки с белками-маркерами).

Точками отмечены наиболее интенсивные полосы.

Нативный уровень фосфорилирования белков в препаратах микросом из почек сусликов определяли с помощью флуоресцентного красителя для окрашивания фосфобелков в геле Pro-Q Diamond (Invitrogen). Из всех белковых полос на электрофореграммах этим красителем прокрасились лишь 10 полос, а наиболее интенсивно 5 полос, включая -субъединицу Na,K АТФазы (рис. 4). Поскольку интенсивность флуоресценции красителя, связавшегося с фосфобелком, зависит от содержания белка в полосе, было рассчитано отношение интенсивностей «Pro-Q/Кумасси» (табл. 3). Достоверных сезонных различий по этому параметру для полос фосфобелков обнаружено не было (p0,2), за исключением одной полосы высокомолекулярного белка (365 кДа), уровень фосфорилирования которого при гибернации увеличивался на 16% (p=0,05).

Таблица.3. Относительный уровень фосфорилирования белков в препаратах микросом из почек активных и спящих сусликов.

Белковая Pro-Q/Кумасси, усл. ед.

полоса, Спящие/Активные Активные (n=8) Спящие (n=8) кДа 365 19,7 ± 1,3 22,9 ± 0,7 +16% * 270 14,9 ± 1,4 14,7 ± 1,4 –1% ** 230 18,3 ± 4,7 19,0 ± 1,7 +4% ** 95 15,7 ± 0,3 14,7 ± 0,6 –6% ** 67 15,6 ± 0,5 13,6 ± 1,7 –12% ** 51 12,3 ± 1,0 12,6 ± 0,7 +3% ** 43 4,7 ± 0,3 4,8 ± 0,4 +3% ** 24 15,2 ± 0,9 12,9 ± 1,2 –15% ** 15 16,0 ± 1,4 13,5 ± 1,2 –15% ** 14 10,9 ± 2,6 8,1 ± 2,0 –26% ** * p=0,05, ** p0,2.

Авторадиографическое исследование фосфорилирования белков микросом эндогенными протеинкиназами в присутствии [-32P]АТФ не выявило фосфорилирования -субъединицы Na,K АТФазы in vitro (рис. 5). Белки, дающие наиболее интенсивные полосы на авторадиограммах и в гелях, окрашенных Pro-Q Diamond, были подвергнуты масс-спектрометрическому анализу, который не выявил среди фосфорилируемых белков потенциальных белков-регуляторов Na,K АТФазы (данные не представлены). В полосе 365 кДа был идентифицирован белок мегалин (гликопротеид 330, gp330), принадлежащий семейству рецепторов к ЛПНП и участвующий в обмене липидов и процессах эндоцитоза [Christensen, Birn, 2002].

Известно, что во время спячки суслика Spermophilus tridecemlineatus нарушается баланс окисленного и восстановленного глутатиона (GSSG и GSH) в сторону увеличения его окисленной формы GSSG, что может быть следствием циркуляторной гипоксии и характерно для окислительного стресса. При этом общий пул свободного глутатиона снижается во время баутов спячки и возрастает при периодических пробуждениях [Carey et al., 2003]. Также известно, что в условиях гипоксии в почках кроликов (а также в солевых железах уток) происходит неферментативное глутатионилирование Na,K-АТФазы, приводящее к ингибированию ее активности [Yakushev et al., 2010;

Petrushanko et al., in press]. Поэтому можно предположить, что при гибернации в почках сусликов также происходит глутатионилирование Na,K-АТФазы, защищающее фермент от необратимого окисления активными формами кислорода и различными свободными радикалами, содержание которых в таких условиях может возрастать.

Рис..5. Авторадиограмма микросомальных белков, фосфорилированных эндогенными протеинкиназами.

Для сравнения приведен фрагмент электрофореграммы, прокрашенной Кумасси R- (2 средние дорожки).

Точками отмечены полосы, наиболее отличающиеся по уровню включения фосфата.

Для определения спектра глутатионилированных белков было проведено иммунохимическое окрашивание микросомальных белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране, с использованием моноклональных антител к глутатиону. В микросомальных препаратах из почек активных и спящих сусликов не было выявлено глутатионилирования Na,K-АТФазы (данные не представлены), а модифицированными глутатионом оказались две белковые полосы с кажущимися молекулярными массами около 43 и 250 кДа.

Таким образом, сезонная регуляция активности Na,K-АТФазы в почках сусликов не связана с фосфорилированием и глутатионилированием молекул этого фермента.

Состав липидной фазы микросомальных мембран из почек сусликов. Поскольку активность Na,K-АТФазы зависит от липидного микроокружения [Болдырев и др., 1985], изменение микровязкости мембран при гибернации может быть механизмом регуляции натриевого насоса. Известно, что микровязкость мембран, являясь интегральным показателем, возрастает при повышении содержания в мембранах насыщенных жирных кислот и холестерина, а также с увеличением содержания в них белка [Горошинская и др., 1999]. Методом GC-MS был исследован жирнокислотный состав липидов и содержание холестерина в мембранах микросом из почек сусликов (табл. 4). Было установлено, что в наибольшем количестве в мембранных липидах присутствуют 5 жирных кислот, типичных для липидов из плазматической мембраны [Лапинский, Невретдинова, 1987], на долю которых приходится более 85%. Было также установлено, что мольные доли некоторых жирных кислот при гибернации незначительно уменьшаются (16:0, 18:0, 20:4, 20:3), а мольные доли других незначительно увеличиваются (14:0, 18:2, 18:1). Расчеты показали, что суммарная мольная доля жирных кислот с двойными связями в препаратах из почек спящих сусликов по сравнению с препаратами из почек активных животных выше всего лишь на 3,3%, при этом общая степень ненасыщенности жирных кислот при гибернации достоверно не изменяется (табл. 4).

Таблица.4. Жирнокислотный состав липидов и содержание холестерина в микросомальных препаратах из почек активных и спящих сусликов.

Активные (n = 8) Спящие (n = 8) Параметр Мольные доли жирных кислот и альдегидов, % 16:0 Пальмитиновая * 23,5 ± 0,4 21,1 ± 0, 18:2 Линолевая * 15,0 ± 0,8 17,7 ± 0, 18:1 Олеиновая * 12,3 ± 1,0 15,7 ± 0, 18:0 Стеариновая * 17,6 ± 0,4 16,0 ± 0, 20:4 Арахидоновая ** 18,0 ± 1,1 15,6 ± 0, 14:0 Миристиновая * 0,7 ± 0,1 2,0 ± 0, 16:1 Гексадеценовая ** 2,6 ± 0,5 3,1 ± 0, 16a Пальмитиновый альдегид * 1,5 ± 0,2 1,0 ± 0, 18a Стеариновый альдегид ** 3,1 ± 0,5 3,4 ± 0, 20:3 Эйкозатриеновая ** 1,9 ± 0,3 1,1 ± 0, Другие в совокупности * 3,8 ± 0,2 3,2 ± 0, Ненасыщенные в совокупности * 50,7 ± 3,3 54,0 ± 1, Общая степень ненасыщенности жирных кислот, количество двойных 1,22 ± 0,03 1,20 ± 0, связей на молекулу жирной кислоты ** Липид/белок, мг/мг ** 1,10 ± 0,37 1,44 ± 0, Холестерин/липид, мг/г * 40,1 ± 10,2 75,2 ± 3, * p0,05, ** p0,1.

По результатам анализа GC-MS было рассчитано соотношение липид/белок в исследуемых препаратах (табл. 4). При гибернации наблюдается тенденция к уменьшению содержания белка в микросомах из почек сусликов. Однако из-за большого разброса данных сезонные различия в соотношении липид/белок недостоверны, поэтому уменьшение содержания белка в препаратах из почек спящих сусликов по сравнению с препаратами активных животных вряд ли может быть причиной существенного изменения микровязкости мембран при гибернации. В то же время установлено, что содержание холестерина в мембранах микросом из почек спящих сусликов в 1, раза выше, чем в препаратах активных животных (p0,05). Таким образом, из трех факторов, способных влиять на микровязкость мембран (степень ненасыщенности жирных кислот, содержание белка и холестерина), при гибернации достоверно изменяется только содержание холестерина.

Анализ структурного состояния липидной фазы микросом из почек сусликов. Чтобы выяснить, влияет изменение содержания холестерина в микросомах из почек сусликов на микровязкость мембран, их структурное состояние было оценено с использованием спиновых и флуоресцентных зондов.

Рис..6. Графики Аррениуса 4,3 1 для величины Amax, 2 определенной по ЭПР-спектрам 5-доксилстеарата в мембранах микросом из почек сусликов.

4,2 Стрелки указывают на области структурных переходов.

–19°C 0°C 4, ln(Amax) 4, Активные (n=3) Спящие (n=3) 3, 3,0 3,4 3,8 4,2 4,6 5, 10 /T Спиновый зонд 5-доксилстеарат позволяет охарактеризовать свойства поверхностного слоя мембран, в котором, в частности, локализован холестерин. Графики Аррениуса для величин Amax и параметра порядка S, определяемых по положению экстремумов на ЭПР-спектрах 5 доксилстеарата, не выявили сезонных различий в подвижности зонда в мембранах микросом из почек активных и спящих сусликов. Графики Аррениуса для величины Amax характеризуются двумя перегибами при 0° и –19°C, обусловленными структурными переходами в мембранах (рис.

6). На графиках Аррениуса для параметра порядка S, характеризующего структурированность мембраны (рис. 7), выявляется еще один перегиб в области 20°C – в той же области, что и перегиб на графиках Аррениуса для активности Na,K-АТФазы (рис. 2). Таким образом, несмотря на более высокий уровень холестерина, в микросомах из почек спящих сусликов с помощью данного спинового зонда не обнаружено изменения структурного состояния мембран по сравнению с препаратами микросом из почек активных животных. По всей видимости, это связано с тем, что в мембранах микросом холестерин находится в кластерах (рафтах), недоступных для данного спинового зонда [Simons, Ikonen, 1997].

Рис..7. Графики Аррениуса для параметра порядка S, Активные (n=3) определенного по ЭПР-спектрам –0,2 5-доксилстеарата в мембранах микросом из почек сусликов.

Спящие (n=3) Стрелка указывает на область структурного перехода.

–0, ln(S) –0,4 20°C –0, 3,2 3,3 3,4 3,5 3, 10 /T Другой спиновый зонд – метиловый эфир 16-доксилстеарата, не имеет полярной группы и поэтому погружается вглубь липидного бислоя. Графики Аррениуса для времени вращательной корреляции c данного зонда в мембранах микросом из почек активных и спящих сусликов также имеют практически одинаковый вид (рис. 8) и характеризуются перегибом при –30°C. Только при температурах выше 0°C можно видеть недостоверное уменьшение времени вращательной корреляции зонда в препаратах из почек спящих сусликов, обусловленное более свободным вращением зонда относительно препаратов активных животных. Таким образом, при гибернации наблюдается незначительное снижение микровязкости мембран микросом, связанное, скорее всего, с некоторым уменьшением содержания белка в мембранах (табл. 4).

Рис..8. Графики Аррениуса 2 для времени вращательной корреляции c (нс), определенного по ЭПР-спектрам метилового эфира 16-доксилстеарата в мембранах микросом из почек сусликов.

Стрелка указывает на область –30°C структурного перехода.

ln(с) – Активные (n=3) Спящие (n=3) – 3,0 3,4 3,8 4,2 4,6 5, 10 /T Связывание гидрофильного флуоресцентного зонда АНС с поверхностью мембран обеспечивается за счет как электростатических, так и гидрофобных взаимодействий [Владимиров, Добрецов, 1980;

Лакович, 1986]. Параметры флуоресценции АНС при титровании зондом микросом из почек сусликов (табл. 5) не показывали достоверных сезонных различий (p0,1).

Значения константы диссоциации Kd комплекса АНС с микросомами практически не зависят от температуры (p0,25), однако с повышением температуры от 12° до 37°C достоверно уменьшаются значения Fmax (p0,0005), поскольку квантовый выход флуоресценции находится в обратной зависимости от температуры [Паркер, 1972]. Таким образом, отсутствие достоверных сезонных различий в значениях Fmax и Kd свидетельствует об одинаковых свойствах микроокружения участков связывания АНС на поверхностности микросом из почек активных и спящих сусликов.

Таблица.5. Параметры флуоресценции АНС в микросомальных препаратах из почек активных и спящих сусликов при разных температурах.

12°C (n=3) * 25°C (n=5) * 37°C (n=5) * Параметр Животные Активные 819 ± 46 633 ± 30 440 ± Fmax, усл. ед.

Спящие 884 ± 21 648 ± 16 439 ± Активные 54,7 ± 0,9 54,1 ± 1,4 53,2 ± 1, Kd, мкМ Спящие 52,3 ± 4,1 52,6 ± 2,0 50,1 ± 1, * p0,15.

Гидрофобный флуоресцентный зонд пирен встраивается в те области бислоя, где расположены жирнокислотные цепи липидов, и параметры его флуоресценции позволяют охарактеризовать микровязкость окружения зонда и гидрофобный объем мембраны [Владимиров, Добрецов, 1980;

Лакович, 1986]. Наиболее чувствительным параметром является степень эксимеризации пирена – соотношение интенсивности флуоресценции эксимерной (димерной) и мономерной форм зонда, так как образование димеров пирена при его фиксированной концентрации контролируется скоростью диффузии, т.е. напрямую зависит от микровязкости и гидрофобного объема мембраны. Кроме того, пирен позволяет оценить свойства аннулярного слоя липидов, непосредственно контактирующих с гидрофобными участками интегральных белков мембраны, так как между триптофаном и пиреном возможен безызлучательный индуктивно резонансный перенос энергии. При возбуждении флуоресценции остатков триптофана в гидрофобных доменах молекул белка часть энергии передается на расположенные в пределах радиуса Ферстера молекулы зонда, что приводит к появлению так называемой «вызванной» флуоресценции пирена [Владимиров, Добрецов, 1980;

Лакович, 1986;

Малышева и др., 2001].

Рис..9. Графики Аррениуса –0, для степени эксимеризации пирена (Ie/Im) в общих 20°C и аннулярных липидах мембран –0, микросом из почек сусликов.

Стрелка указывает на область структурного перехода.

–0, –0, ln(Ie/Im) Аннулярные Общие липиды липиды –1, –1, Активные (n=7) –1, Спящие (n=4) –1, 3,2 3,3 3,4 3,5 3, 10 /T Достоверных различий в степени эксимеризации пирена, встроенного в мембраны микросом из почек активных и спящих сусликов, как для общих, так и для аннулярных липидов, находящихся в пределах радиуса Ферстера от белков мембраны, обнаружено не было (p0,5).

Графики Аррениуса для степени эксимеризации пирена в микросомах из почек активных и спящих сусликов характеризуются перегибом при температуре около 20°С – той же, что и перегиб на графиках Аррениуса для активности Na,K-АТФазы (рис. 2). При этом в мембранах микросом как активных, так и спящих сусликов степень эксимеризации пирена в области аннулярных липидов на 20–25% меньше степени эксимеризации пирена для общих липидов мембраны, что, вероятно, обусловлено структурирующим действием белка на мембрану или тем, что белки находятся в так называемых рафтах, содержащих больше насыщенных жирных кислот и холестерина [Simons, Ikonen, 1997;

Dalskov et al., 2005].

Таким образом, по совокупности данных, полученных с помощью спиновых и флуоресцентных зондов, можно сделать заключение, что при гибернации в почках сусликов не происходит существенных изменений структурного состояния липидной фазы мембран, которые могли бы привести к значительному снижению активности Na,K-АТФазы.

Олигомерное состояние Na,K-АТФазы в микросомах из почек сусликов. При гибернации в мембранах могут происходить иные изменения, способные влиять на функционирование интегральных ферментов. В частности, к таким изменениям относится латеральное разделение белков и липидов при гибернации, описанное для плазматических мембран и мембран эндоплазматического ретикулума нервной ткани сусликов [Azzam et al., 2000].

Такое разделение мембранных компонентов должно сопровождаться кластеризацией и агрегацией белков, что ранее описано для Ca-АТФазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц сусликов, активность которой при гибернации снижается более чем в 2 раза [Малышева и др., 2001]. Образование агрегатов транспортных АТФаз может приводить к их ингибированию, предположения о чем высказывались и ранее [Mahaney, Thomas, 1991;

Voss et al., 1995].

Косвенным признаком агрегации белков в мембранах может быть снижение миграции энергии с остатков триптофана белка на пирен за счет безызлучательного переноса энергии, определяемой как отношение «вызванной» флуоресценции пирена (возбуждение через триптофан при 285 нм) к собственной флуоресценции (возбуждение при 335 нм), так как значительная часть белков в составе агрегатов становится «недоступной» для пирена. Действительно, было обнаружено, что миграция энергии с остатков триптофана белка на пирен в препаратах микросом из почек спящих сусликов достоверно ниже на 11–14% (p0,01), чем в препаратах из почек активных животных, что указывает на возможность агрегации белков и, в частности, Na,K АТФазы при гибернации.

Для оценки олигомерного состояния Na,K-АТФазы в микросомах из почек сусликов препараты обрабатывали сшивающим агентом -фенантролином в комплексе с ионами меди, катализирующим образование ковалентных связей по цистеиновым остаткам между близко расположенными молекулами белков [Geimonen et al., 1994;

Shorina et al., 1997]. При иммунохимическом окрашивании каталитической субъединицы Na,K-АТФазы в обработанных сшивающим агентом препаратах из почек сусликов наблюдалось прогрессивное уменьшение интенсивности полосы мономерной формы -субъединицы Na,K-АТФазы и появление полос олигомеров (рис. 10). При этом относительное количество сшитых за 1 ч молекул фермента в препаратах из почек спящих сусликов было в 1,7 раза больше (p0,001), чем в препаратах из почек активных животных (рис. 11).

Рис..10. Иммунохимическое окрашивание 1-субъединицы Na,K-АТФазы в микросомальных препаратах из почек сусликов, обработанных ковалентно сшивающим агентом -фенантролином в комплексе с ионами меди.

Рис..11. Убыль мономерной формы 1-субъединицы Относительная интенсивность полосы, % Активные (n=3) Спящие (n=3) Na,K-АТФазы (95 кДа) с течением времени инкубации препаратов со сшивающим агентом.

0 10 20 30 40 50 Время, мин Таким образом, при гибернации Na,K-АТФаза в почках находится в более агрегированном состоянии, что наряду с обнаруженным уменьшением на 25% содержания фермента в мембранах является, по-видимому, основной причиной снижения активности натриевого насоса в почках спящих сусликов.

ВЫВОДЫ 1. Проведен сравнительный анализ микросомальных препаратов, обогащенных Na,K-АТФазой, из почек активных и спящих сусликов.

2. Активность Na,K-АТФазы при гибернации снижается в 1,8–2,0 раза в диапазоне температур от 15 до 37°С. При более низких температурах различия менее выражены.

3. В препаратах присутствует только 1-изоформа каталитической субъединицы Na,K-АТФазы, содержание которой при гибернации уменьшается на 25%.

Чувствительность фермента к уабаину во время спячки не изменяется.

4. Не выявлено глутатионилирования -субъединицы Na,K-АТФазы и сезонного изменения уровня ее фосфорилирования.

5. Содержание холестерина в препаратах увеличивается при гибернации в 1,9 раза.

Содержание белка, степень ненасыщенности жирных кислот липидов и структурное состояние липидной фазы мембран во время спячки не изменяются.

6. При гибернации Na,K-АТФаза в мембранах находится в более агрегированном состоянии.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Басевич Е.В., Лопина О.Д., Рубцов А.М. (2010) Сезонные изменения в обогащенной Na,K ATPазой микросомальной фракции из почек сусликов Spermophilus undulatus. Биохимия, 75, 1601–1611.

2. Басевич Е.В., Лопина О.Д., Рубцов А.М. (2010) Исследование посттрансляционных модификаций белков в микросомах из почек эутермных и гипотермных сусликов. В сб.

Молекулярные механизмы адаптаций, ИПЦ ДГУ, Махачкала, в печати.

3. Basevich, E.V., Osipov, G.A., Lopina, O.D., Rubtsov, A.M. (2010) The composition of microsomal membranes hydrophobic area from kidney of active and hibernating ground squirrels detected by chromatography-mass spectrometry. In Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies, Synchrobook, Pushchino, 28–31.

4. Rubtsov, A.M., Basevich, E.V., Lopina, O.D. (2010) Seasonal changes of Na,K-ATPase activity in the kidney of ground squirrel. In Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies, Synchrobook, Pushchino, 228–229.

5. Басевич Е.В. (2010) Использование моноклональных антител к 1-субъединице Na,K АТФазы в исследованиях механизмов адаптации фермента в почках гибернирующих сусликов Spermophilus undulatus. Тез. докл. XVII междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов – 2010, секц. Биология, МАКС Пресс, Москва, 44–45.

6. Басевич Е.В. (2009) Использование Аламетицина и Луброла WX при определении активности Na,K-АТФазы в микросомальных фракциях из почек суслика Spermophilus undulatus. Тез.

докл. XVI междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов – 2009, секц.

Биология, МАКС Пресс, Москва, 38–39.

7. Басевич Е.В., Лопина О.Д., Гончарова Н.Ю., Рубцов А.М. (2008) Биохимические механизмы адаптации Na,K-АТФазы в почках гибернирующих сусликов Spermophilus undulatus к функционированию при низких температурах. В сб. Молекулярные механизмы адаптаций, ИПЦ ДГУ, Махачкала, 21–25.

8. Basevich, E.V., Lopina, O.D., Rubtsov, A.M. (2008) Seasonal changes in microsomal membranes enriched with Na,K-ATPase from kidneys of hibernating mammals. In Biological motility:

achievements and perspectives, Foton-Vek, Pushchino, 66–67.

9. Рубцов А.М., Лопина О.Д., Басевич Е.В., Кондрашев-Луговский А.С. (2008) Сезонные изменения активности мембранных ион-транспортирующих АТФаз в скелетных мышцах и почках гибернатора, суслика Spermophilus undulatus. Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Арта, Новосибирск, 157.

10. Басевич Е.В. (2008) Исследование фосфорилирования белков микросомальных препаратов, обогащенных Na,K-АТФазой, из почек суслика Spermophilus undulatus. Тез. докл. XV междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов – 2008, секц. Биология, МАКС Пресс, Москва, 29–30.

11. Басевич Е.В. (2007) Исследование сезонных изменений активности Na,K-АТФазы в микросомальных препаратах из почек суслика Spermophilus undulatus. Тез. докл. XIV междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов – 2007, секц. Биология, МАКС Пресс, Москва, 27.

12. Басевич Е.В. (2006) Исследование сезонных изменений физико-химических свойств микросомальных мембран, обогащенных Na,K-АТФазой, из почек суслика Spermophilus undulatus. Тез. докл. XIII междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов – 2006, секц. Биология, МАКС Пресс, Москва, 21–22.