авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Питательные среды для культивирования чумного микроба на основе сухого автолизата пекарских дрожжей, полученного по усовершенствованной технологии

На правах рукописи

АНТОНЫЧЕВА Марина Владимировна ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА НА ОСНОВЕ СУХОГО АВТОЛИЗАТА ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ, ПОЛУЧЕННОГО ПО УСОВЕРШЕНСТВОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ 03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Саратов – 2012

Работа выполнена в ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный ин ститут «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

Кандидат медицинских наук, доцент Никифоров Алексей Константинович Официальные оппоненты доктор медицинских наук, доцент ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», заведующий отделом образовательных программ и подготовки специалистов Бойко Андрей Витальевич кандидат медицинских наук, доцент ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития Российской Федерации, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Пронина Елена Александровна Ведущее учреждение: ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противо чумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита диссертации состоится «_»_2012 г. в _ часов на заседа нии диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских дис сертаций при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский науч но-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан «_»2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Возбудитель чумы Yersinia pestis по-прежнему представляет реальную опасность и угрозу жизни людей в связи с существованием активных природных очагов чумы во всем мире (Евразии, Африке, Северной и Южной Америке) и высоким уровнем мигра ции населения. Недостаточный объем мониторинга в природных очагах обуславливает возможность возникновения вспышечных заболеваний. В настоящее время (1990– гг.) отмечают растущий уровень заболеваемости на о. Мадагаскар, с регистрацией в 2010–2011 гг. значительного числа случаев легочной чумы [Кутырев В.В. и соавт., 2011;

WER, 2010]. Кроме того, необходимо учитывать возможность использования возбудителя чумы в целях биотерроризма [Онищенко Г.Г. и соавт., 2003].

Для успешного мониторинга природных очагов чумы необходимо решение ком плекса задач, связанных с разработкой и внедрением новых диагностических и профи лактических средств (Приказы Роспотребнадзора № 774 от 17.11.2005 г. и № 152 от 08.05.2008 г.).

Питательные среды, относящиеся к средствам диагностики, при проведении эпи демиологического надзора в природных очагах чумы на территории Российской Феде рации должны соответствовать нормативным требованиям [МУК 4.2.2316, 2008;

МУ 3.3.2.2124, 2006;

Стандарты качества лекарственных средств. № 91500.05.001, 2000].

При производстве МИБП1 к питательным средам предъявляют дополнительные требо вания. Они должны быть эффективными по выходу целевого продукта, а полученные с их применением лекарственные средства – безопасными для человека. Кроме того, про изводство питательных сред должно быть также экономичным и конкурентоспособным [Онищенко Г.Г., Меджидов М.М., 2001].

В производстве МИБП наибольшее распространение получили среды, приготов ленные из мясных и казеиновых гидролизатов. Однако это сырье является пищевым или технически ценным, к тому же может содержать в своем составе термоустойчивые ан тибиотики, прионы и другие «неконтролируемые факторы» [Телишевская Л.Я., 2000;

Раевский К.К., 2007;

Himedia, 2003]. В связи с этим, фирмы-производители микробиоло гических питательных сред, расширили ассортимент сред на основе растительного и дрожжевого белка [Himedia, 2003].

Таким образом, при производстве микробиологических сред актуальными зада чами остаются как поиск сырья для белковых основ, не уступающих мясным по пита тельной ценности и удовлетворяющих требованиям стандартности и безопасности, так и разработка способов его эффективной переработки.

В обзорных работах, посвященных питательным средам, дрожжевая биомасса выделена как перспективный вид сырья для приготовления белковых основ [Равилов А.З. и соавт. 1999;

Телишевская Л.Я., 2000]. Работы по получению питательных основ МИБП – медицинские иммунобиологические препараты (диагностические и профилактические) из биомассы, в основном кормовых дрожжей, и конструированию из них микробиоло гических сред были развернуты в 70 - 80-е годы ХХ века. Полученные экстракты и авто лизаты применяли в составе питательных сред как пептидные и витаминные добавки, а после более глубокого автолиза или гидролиза – в качестве белковых основ питатель ных сред для культивирования различных микроорганизмов, в том числе и чумного микроба [Борисенко Е.Г.,1967;

Bridson Е., Brecker А., 1970;

Бендас Л.Г., 1971;

Шеремет О.В.,1979, 1991;

Бобрышев В.И. и соавт. 1980;

Милютин В.Н. и соавт., 1982;

Раскин Б.М., 1985]. Однако на III съезде Общества биотехнологов (2005 г.), было отмечено, что в нашей стране прекращено промышленное производство кормовых дрожжей, и доступ ным сырьем остаются пекарские и пивные дрожжи. По своему составу наиболее близки к мясу говядины пекарские дрожжи, содержащие протеины до 52–56%. Автолизат пе карских дрожжей по физико-химическому составу близок к триптическому перевару по Хоттингеру [Козлов Ю.А., 1950;



Биргер М.О., 1982].

Способность дрожжевой клетки к автолизу предопределяет выбор экономичного способа биоконверсии этого белкового сырья. Известно, что создание определенных ус ловий индуцирует и ускоряет течение этого процесса [Шкляр Б.Х., 1977;

Эль-Регистан Г.И., Бабаян Т.Л., 1987;

Кислухина О.В. и соавт., 1990;

Белоусова Н.И. и соавт., 1995;

Плакунов В.К., 2001].

На основе автолизатов пекарских или пивных дрожжей сконструированы среды для культивирования широкого круга микроорганизмов [Альпер-Юльчевская Б.Я., 1940;

Козлов Ю.А., 1950;

Дятлов И.А. и соавт., 1998;

Тимербаева Р.Х. и соавт., 2000;

Иванова Н. Г. и соавт. 2001]. В литературе, кроме пилотной работы сотрудников РосНИПЧИ «Микроб», использовавших для получения автолизата способ индукции процесса натри ем хлорида [Авдеева Н.Г. и соавт., 2000], нами не найдено данных об использовании для культивирования чумного микроба питательных сред, сконструированных из автолизата пекарских дрожжей, в качестве единственного источника аминокислот. Однако извест ны работы по применению сред из панкреатического перевара пекарских дрожжей для диагностики возбудителей чумы и холеры [Мазрухо А.Б. и соавт., 2004;

2005;

2009;

2011]. Таким образом, конструирование питательных сред на основе дрожжевого авто лизата для культивирования чумного микроба остается актуальной задачей.

Цель работы – конструирование новых микробиологических сред для культи вирования чумного микроба на основе сухого автолизата пекарских дрожжей, получен ного усовершенствованным способом.

Задачи исследования:

Изучить возможность индукции автолиза пекарских дрожжей химическими 1.

веществами и ферментными препаратами. Определить оптимальный комплекс методов контроля эффективности процесса автолиза.

Усовершенствовать технологию аппаратного способа получения сухого дрож 2.

жевого автолизата при масштабировании процесса.

Провести анализ химического состава и физико-химических свойств сухого ав 3.

толизата пекарских дрожжей в соответствии с требованиями, предъявляемыми к качест ву белковой основы микробиологических сред.

Сконструировать оптимальные по составу плотные и жидкие питательные сре 4.

ды для культивирования чумного микроба на монооснове – сухом автолизате пекарских дрожжей и оценить свойства сконструированных сред по биологическим показателям.

Испытать среды на основе сухого дрожжевого автолизата при эксперименталь 5.

но-производственном культивировании чумного микроба.

Обосновать экономическую целесообразность использования питательных сред 6.

на основе дрожжевого автолизата.

Научная новизна Впервые для культивирования чумного микроба сконструированы питательные среды на монооснове – сухом автолизате пекарских дрожжей, сохраняющие стабильны ми культурально-морфологические, биохимические свойства микроорганизма и его чув ствительность к бактериофагу Л-413С.

Сконструированные экономичные жидкие и плотные питательные среды впервые использованы в производстве экспериментальных серий бактериофага диагностического чумного Л-413С.

Процесс изготовления автолизата оптимизирован применением индукторов фер ментной природы в условиях направленного изменения рН гидролизуемой среды. В ка честве индуктора автолиза дрожжевых клеток был впервые использован новый ком плексный ферментный препарат микробного происхождения – протеовибрин, выделен ный ранее из ультрафильтрата культуральной жидкости производственного штамма Vibrio cholerae М 41 серовара Огава [Кузьмиченко И.А. и соавт., 2002;

2003;

2010]. При оритетность выполненных исследований по стимулированию автолитической активно сти дрожжей протеовибрином с целью получения эффективной и экономически выгод ной питательной основы, пригодной для микробиологических целей, подтверждена па тентом «Способ получения питательной основы и питательная среда для культивирова ния микроорганизмов» (№ 2360962, приоритет от 15.02.2007).

Предложен комплексный подход в выборе методов контроля эффективности ав толиза и впервые для этих целей рекомендовано использовать метод кондуктометрии.

Практическая значимость Сконструированы жидкая и плотная питательные среды для культивирования чумного микроба и его бактериофагов, отвечающие требованиям контроля по биологи ческим и физико-химическим показателям. Питательные среды, приготовленные на ос нове сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба, ис пользованы в производстве экспериментальных серий бактериофага диагностического чумного Л-413С. Доказана экономическая целесообразность внедрения этих сред в про изводство МИБП.

Предложен новый способ получения белковой основы питательных сред автоли зата пекарских дрожжей, отличающийся от аналогов тем, что в качестве индуктора в процессе автолиза использован ферментный препарат протеовибрин и оптимизирована рецептура питательных сред для культивирования чумного микроба. Методические ре комендации «Приготовление автолизата пекарских дрожжей и конструирование на его основе питательных сред для культивирования чумного микроба» одобрены Ученым со ветом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 5 от 24.11.09 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Определен комплекс методов, позволяющий определить эффек тивность процесса автолиза. Методические рекомендации «Оценка эффективности ав толиза пекарских дрожжей комплексом физико-химических методов» также одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 7 от 27.06.06 г.) и утверждены ди ректором РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Автолиз пекарских дрожжей, индуцированный протеолитическим ферментом в условиях щелочной среды, эффективнее способа, основанного на применении натрия хлорида.

2. Усовершенствованный технологический процесс производства автолизата пекарских дрожжей позволяет получить полноценную сухую питательную основу для микробиологических сред, соответствующую требованиям НД по физико-химическим свойствам и составу.

3. Сконструированные питательные среды на основе сухого автолизата пекарских дрожжей обеспечивают питательные потребности чумного микроба с сохранением стабильными его культурально-морфологических, биохимических свойств, чувствительности к бактериофагу Л-413С и соответствуют требованиям НД, предъявляемым к питательным средам.

4. Сконструированные питательные среды на основе сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба по эффективности не уступают средам, приготовленным из мясного сырья, и пригодны для масштабированного культивирования штаммов чумного микроба.

Апробация работы Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены и обсуж дены на ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фунда ментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (2005–2011 гг.). В ви де тезисных работ материалы были представлены на: VI Межгосударственной научно практической конференции «Санитарная охрана территории государств-участников со дружества независимых государств: Проблемы биологической безопасности и противо действия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005);

II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обуслов ленные иерсиниями» в НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург, 2006);

научно практической конференции ГИСК им. Тарасевича «Вакцинология 2006». Совершенст вование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болез ней» (Москва, 2006);

VIII Межгосударственной научно-практической конференции го сударств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007);

совещании и проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2008);

международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвященной 50-летию НИИ проблем биобезопасности НЦБ МОН РК (Ал маты, 2008);

V международной конференции «Проблемы обращения с отходами лечеб но-профилактических учреждений» (Москва, 2009);

международной конференции «Раз витие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» в ФГУН НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора (Санкт-Петербург, 2010).

Публикации По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 6 статей, 4 из них в из даниях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России для публи кации основных научных результатов, представляемых на соискание искомой ученой степени, и одно изобретение (Пат. 2360962 РФ МПК С12N1/20).





Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста, состоит из введе ния, одной главы обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключе ния, выводов, приложения и списка литературы. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 15 рисунками. Список литературы содержит 279 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Штаммы микроорганизмов. При конструировании сред для культивирования чумного микроба использованы тест-штаммы, рекомендуемые для контроля качества сред по биологическим показателям [МУ 3.3.2.2124, 2006]: Yersinia pestis ЕV НИИЭГ, полученный из лаборатории препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377, Y.

pseudotuberculosis И-199 и Y. pestis КМ 277 (ЕV 11М pFSK 3) (рFra- pCad- pPst- pFSK-3;

Kmr), полученные из Госколлекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб».

Методы.

Микробиологические методы: тинкториальный метод [Шкляр Б.Х., 1977;

Кова ковская С.С., 1978];

культуральный метод [ГФ РФ ХII, 2008];

определение чувствитель ности и скорости роста на питательной среде [МУК 4.2.2316, 2008;

МУ 3.3.2.2124, 2006];

определение эффективности питательной среды по накоплению биомассы [МУК 4.2.2316, 2008;

МУ 3.3.2.2124, 2006;

Дятлов И.А. и соавт., МР, 1991];

определение эф фективности питательной среды по биосинтезу капсульного антигена методы РНГА2 и РНГА – реакция непрямой гемагглютинации ИФА3 [МУ 3.3.2.2124, 2006;

Наумов А.В., Самойлова Л.В., 1992], РИД4 [Зильбер Л.А., 1968];

определение показателя прорастания [МУК 4.2.2316, 2008;

МУ 3.3.2.2124, 2006];

определение показателя стабильности основных биологических свойств микроорганиз мов [МУК 4.2.2316, 2008;

МУ 3.3.2.2124, 2006];

метод Грация [ТУ 9386-020-01898109 2008].

Биохимические методы: определение протеолитической активности на плотных тест-средах [Шкляр Б.Х., 1977];

определение наличия низкомолекулярной фракции бел ка [МУК 4.2.2316, 2008];

определение пептидов [МУК 4.2.2316, 2008];

колориметриче ский метод определения белка по Лоури [ГФ РФ ХII, 2008];

фенол-сернокислый метод определения содержания углеводов [Dubois М. et al, 1956];

метод ВЖЭХ [ГФ РФ ХII, 2008].

Химические методы: метод формольного титрования [МУК 4.2.2316, 2008];

опре деление сульфатной золы [Ф РФ ХII, 2008];

определение общего азота [МУК 4.2.2316, 2008];

аргентометрическое определение хлоридов [МУК 4.2.2316, 2008];

колориметри ческое определение общего фосфора в присутствии восстановителя [Фердман Д.Л., Со пин Е.Ф., 1957];

метод Фиске-Суббароу [Фердман Д.Л., Сопин Е.Ф., 1957];

метод де Ва арда [Неменова Ю.М., 1972];

метод Гадиента [Петрунькина А.М., 1961];

метод колори метрии с роданистыми солями для определения железа [Фердман Д.Л., Сопин Е.Ф., 1957];

качественное определение наличия тяжёлых металлов [ГФ РФ ХII, 2008].

Физические методы: потенциометрическое определение активности ионов водо рода [МУК 4.2.2316, 2008];

турбидиметрический метод [Кислухина О.В., и соавт., 1990];

кондуктометрическое определение удельной электропроводимости [МР, Иркутск, 2003];

колориметрическое определение цветности [ГФ РФ ХII, 2008];

колориметрическое оп ределение количества тирозина по стандартной кривой [Алексеенко Л.П., 1968];

арео метрическое измерение относительной плотности автолизата [Азевич З.Ф. и соавт., 1990];

определение массовой доли влаги [МУК 4.2.2316, 2008];

метод визуального опре деления прозрачности и цветности [МУК 4.2.2316, 2008];

определение растворимости [МУК 4.2.2316, 2008].

Обработку результатов проводили с применением методов вариационной ста тистики [Ашмарин И.П., Воробьёв А.А., 1962;

Лакин Г.Ф., 1990] и рассчитывали: сред нее арифметическое (М);

среднее квадратическое отклонение ();

среднюю ошибку среднего арифметического (m);

степень достоверности различий по Стьюденту (p).

Все исследования проведены самостоятельно или при активном участии автора, за исключением работы по определению содержания аминокислот в сухих сериях авто лизата, выполненной по договору о научно-исследовательском сотрудничестве в ИБФРМ РАН (г. Саратов) с использованием метода ВЭЖХ на хроматографе Knauer Smartline 5000.

ИФА – иммуноферментный анализ РИД-реакция иммунодиффузии Материалы и оборудование для приготовления сухого автолизата пекар ских дрожжей. Оптимизацию процесса автолиза проводили в условиях лабораторного эксперимента и масштабированного производства. При приготовлении сухого автоли зата пекарских дрожжей (САПД5) –основы микробиологических сред – использовали дрожжи хлебопекарские прессованные (ГОСТ 171-81) в виде водной суспензии.

Для протеолитического воздействия на дрожжевые клетки применяли коммерче ские препараты: трипсин (Serva), проназу (Serva), пепсин (Spofa) и экспериментальный ферментный комплекс – протеовибрин с известной активностью ферментов [Кузьми ченко И.А. и соавт. 2002, 2003, 2010]. Шестичасовой автолизат пекарских дрожжей ис пользовали как самостоятельный полиферментный препарат, внося его в дозе 1, 3 и 5% к объему исходной дрожжевой взвеси. В лабораторных условиях автолиз проводили в объеме до 10,0 л при периодическом перемешивании и температуре (49+1) оС. В качест ве бактериостатического и плазмолизирующего вещества использовали хлороформ (до 1–2%). Через 4 ч после приготовления взвеси дрожжей и инициации процесса автолиза проводили коррекцию рН среды (8,0+0,5) натрием двууглекислым, натрия гидроокисью или аммонием углекислым. Длительность процесса составляла 18–30 ч. Пробы отбирали через каждые 2 ч. Ферментативный процесс останавливали прогреванием биомассы при режиме 110 оС (0,5 кгс/см2) в течение 30 мин. После отстаивания взвеси в течение 1 сут, надосадочную жидкость декантировали, фильтровали и сушили на сублимационной ус тановке (LZ 9 W Frigera). Лабораторным способом получено 79 серий автолизата пекар ских дрожжей, из них 23 серии в лиофилизированной форме.

Для масштабирования процесса автолиза (объем дрожжевой взвеси 500 л) и про изводства экспериментальных серий САПД реакторным способом использовано обору дование и технологическая линия, состоящая из реактора (РЗРЯ-100), сепаратора (АСЭБ 3000), аппарата для фильтрации (ЭПВ.СЦ-300/080), вакуум-выпарной установки (УВВ 50), емкостей для сбора супернатанта (РЗРЯ 600 и РЗРЯ-100), а также установки для вы сушивания препарата (КЯУЛ 101325.002).

По оптимизированной технологической схеме произведено 5 серий САПД. При анализе физико-химических свойств и определении химического состава использован САПД, приготовленный по предложенной ранее [Дятлов И.А. и соавт., 1998] исходной технологической схеме реакторным способом с индукцией автолиза натрием хлори стым. Препаратом сравнения был экстракт автолизированных пекарских дрожжей Autolizate Yeast exract, «SERVA» (Германия), также была использована эксперимен тальная серия автолизата пивных дрожжей «Авимин», ООО «БИТРА», Москва).

Материалы и оборудование для приготовления питательных сред и диагно стические препараты. Плотные и жидкие питательные среды на основе серий САПД, полученных реакторным и лабораторным способом, готовили по общепринятой мето дике [Биргер М.О., 1982]. В качестве контрольных питательных сред были использова сухой автолизат пекарских дрожжей;

ны среды лабораторного изготовления для культивирования чумного микроба на осно ве гидролизата по Хоттингеру, предварительно прошедшие контроль. Среды, исполь зуемые для культивирования Y. pestis Р-1680, дополнительно содержали тиамин (0, мг/л), для культивирования Y. pestis КМ 277 – канамицин (20 мкг/мл).

Диагностические препараты: Для определения стабильности культурально морфологических свойств чумного микроба применяли «Бактериофаг чумной диагно стический Л-413С» (РосНИПЧИ «Микроб», Россия). Для определения капсульного ан тигена использовали «Диагностикум чумной эритроцитарный антительный» (Казахский научный центр карантийных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева, Казахстан), «Диагностикум чумной эритроцитарный иммуноглобулиновый» (ФГУ ЦНИИ МО РФ, Киров) и для РИД по Оухтерлони - специфические чумные сыворотки эксперименталь ных серий (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Оптимизация индуцированного автолиза пекарских дрожжей. В ходе экспе риментов изучены условия автолиза пекарских дрожжей и возможность индукции этого процесса химическими веществами и ферментными препаратами. Для оценки автолити ческой активности дрожжей использованы методики, основанные на различных прин ципах действия: турбидиметрический метод, ориентированный на изменение оптиче ской плотности автолизируемого субстрата;

метод определения конечных продуктов ав толиза (аминного азота или тирозина);

потенциометрический метод регистрации изме нения реакции среды и метод кондуктометрического измерения удельной электропро водимости среды.

На основании проведенных исследований, был выбран оптимальный комплекс методов контроля эффективности процесса. Для определения качества сырья – оценки эффективности автолиза пекарских дрожжей, впервые был применен метод кондукто метрии. В качестве контрольных параметров I стадии процесса предложено применять комплекс методов до стабилизации показателей: турбидиметрическое определение сте пени лизиса дрожжевых клеток по изменению экстинкции взвеси после инкубации и формольное титрование для определения аминного азота. Методы доступные, простые в исполнении и позволяют оперативно оценить эффективность автолиза.

На этом этапе исследований был определён гидромодуль – оптимальное соотно шение разводящей жидкости (воды) и биомассы дрожжей в реакционной смеси. Анализ результатов, полученных в каждом объёмно-весовом соотношении, свидетельствует об увеличении степени лизиса клеток, росте содержания низкомолекулярных азотсодер жащих веществ с разбавлением суспензии дрожжевых клеток и подтверждает данные литературы [Белоусова Н.И. и соавт., 1995]. Однако значительное разбавление суспен зии, на наш взгляд, создает дополнительные трудности при концентрировании суперна танта и приводит к увеличению энергозатрат при масштабировании процесса. Таким об разом, экспериментально доказано, оптимальным соотношением дрожжей и воды явля ется 1:4.

При обосновании способа индукции процесса автолиза было изучено действие протеолитических ферментных препаратов (трипсина, пепсина, проназы, протеовибрина и собственно автолизата пекарских дрожжей). Предварительно определяли активность ферментов при температуре (37+1) оС на плотной тест-среде с обезжиренным молоком и дозы, выравнивали по активности (табл. 1).

Таблица 1 – Влияние ферментов различного происхождения на показатели автолиза пекарских дрожжей через 24 ч инкубации Вариант автолиза Прирост* Степень автолиза Nамин,% М+m Nамин, % М+m % М+m Трипсин 16000 усл.ед./л, n=10 0,182+0,01 62,5+1,5 49+0, Трипсин 80000 усл.ед./л, n=14 0,186+0,01 66,2+1,4 50,99+0, Протеовибрин 16000 усл.ед./л, n=10 0,180+0,01 60,7+1,6 51+0, Протеовибрин 80000 усл.ед./л, n=14 0,196+0,01 75,4+1,5 52,63+0, Пепсин 80000 усл.ед./л, n=10 0,130+0,0015 40+4 49,30+0, Проназа 80000 усл.ед./л, n=10 0,168+0,0035 60+2 45,16+0, До 1% автолизата, n=10 0,129+0,015 15,2+1,8 38,0+0, До 3% автолизат, n=10 0,152+0,015 36,1+1,5 45,0+0, До 5% автолизат, n=14 0,168+0,01 40,0+1,6 45,1+0, Контроль, n=14 0,112+0,02 100+1,6 32,7+0, *Уровень аминного азота в контроле условно приняли за 100%;

разница с контролем статистически достоверна (0,05) Было изучено воздействие на автолиз клеток пекарских дрожжей минимальных доз ферментов (16 и 80 и 120 тыс. усл.ед./л). Также изучено действие шестичасового свежеприготовленного автолизата, в качестве комплексного ферментного препарата, в концентрации 1, 3 и 5% в автолизируемой взвеси дрожжей. Автолитический процесс протекает эффективнее в присутствии ферментов трипсина, протеовибрина и шестича сового автолизата (3 и 5%), что отмечено по уровню накопления аминного азота, уже через 12 ч автолиза. Их применение позволяет повысить в автолизате содержание амин ного азота через 24 ч на 62,5–75,4%. Статистически значимы и результаты, свидетельст вующие об эффективности автолиза с применением минимальных доз фермента (до 80000 усл.ед./л), однако при масштабировании процесса не удалось воспроизвести ре зультат малообъемного эксперимента.

Таким образом, доказано, что применение трипсина и протеовибрина в дозах (80– 100 тыс. усл.ед./л) сокращает время автолиза на 6 ч и увеличивает в 1,5–1,7 раза выход водорастворимой части автолизата (по аминному азоту до 0,196 %). Использование ферментов трипсина и протеовибрина в дозах более 120 тыс усл.ед./л создает условия для протеолитического гидролиза дрожжевой биомассы. Впервые в качестве индуктора автолиза дрожжевых клеток был использован ферментативный комплекс – протеовиб рин, выделенный из отходов производства холерной вакцины, и доказана перспектив ность его применения.

Подтверждены данные литературы о протеолитической активности шестичасово го автолизата пекарских дрожжей. Отмечено его индуцирующее действие на автолиз при добавлении к свежеприготовленной дрожжевой взвеси в концентрации 3–5%. Одна ко автолизат в качестве индуктора значительно уступает трипсину и протеовибрину, так как способствует повышению в автолизате содержания аминного азота только на 35– 40%, по сравнению с контролем.

При изучении автолитического процесса установлено, что создание щелочной или кислой реакции способствует активации ферментной системы дрожжевой клетки.

Направленное изменение реакции среды (рН 8,0+0,5), через 4 ч с начала автолиза, по зволяет получить продукт – автолизат со средней степенью гидролиза в течение 20–24ч.

По уровню накопления аминного азота в реакционной смеси и степени лизиса дрожже вых клеток через 24 ч выявлены статистически значимые различия с контролем (р0,001). Концентрация аминного азота в автолизате выше контрольных показателей на 74–85%. Однако при сравнении показателей, свидетельствующих об эффективности ав толиза, таких как содержание аминного азота и степень лизиса дрожжевых клеток, не было выявлено статистически достоверного отличия между испытанными веществами (табл.2). В эксперименте при создании кислой реакции дрожжевой биомассы отмечено индуцирующее действие кислоты на автолиз (различие с контролем статистически зна чимое р0,05), однако прирост аминного азота составил 14,8% за 24 ч.

Таблица 2 – Влияние на автолиз пекарских дрожжей химических веществ Показатель Натрий гид- Натрий двууг- Аммоний Кислота Контроль эффективно- роокись лекислый углекислый соляная сти автолиза (n=18) M+m (n=18) M+m (n=12) M+m (n=12) M+m (n=18)M+m Содержание 0,188+0,001 0,192+0,001 0,200+0,006 0,124+0,005 0,112+0, Nамин,% Прирост* 74,1+1,0 77,7+1,0 85,1+1,4 14,8+1,3 Nамин,% Степень ав- 47+0,5 47,5+0,5 48+0,5 31,5+0,5 32,7+0, толиза, % *Уровень Nамин. в контроле условно приняли за 100%.

На следующем этапе было изучено сочетанное применение комплексного фер ментного препарата – протеовибрина и натрия двууглекислого. Этот способ позволил получить автолизат пекарских дрожжей с максимальной концентрацией аминного азота (до 0,23%) через 18–20 ч, что свидетельствует об интенсификации процесса в созданных условиях. В технологическом процессе получения автолизата пекарских дрожжей оп равдано применение натрия двууглекислого, относящегося к пищевым продуктам и не требующего особых условий хранения и применения.

Таким образом, для приготовления дрожжевой взвеси предложен гидромодуль 1: и способ двустадийного режима индуцированного автолиза, основанного на изменении реакции среды при добавлении в дрожжевую взвесь натрия двууглекислого (8 г/л).

Оптимизация этапов технологического процесса масштабированного полу чения сухого автолизата. Одной из основных наших задач было усовершенствование технологии производства САПД, для решения которой проведены мероприятия по су щественному изменению аппаратного обеспечения технологического процесса. Пред ложен способ двустадийного режима индуцированного автолиза, основанного на изме нении реакции среды при добавлении в дрожжевую взвесь натрия двууглекислого ( г/л). Применение этого индуцирующего автолиз способа, вместо ранее применяемого натрия хлорида (2%), позволило сократить продолжительность I стадии технологиче ского процесса с 30–34 ч до 20–24 ч. Затем была демонтирована система, используемая на стадии концентрирования полуфабриката, состоящая из теплообменника трубчатого, форсунки распыления и насоса импеллерного, и установлен вакуум-выпарной аппарат (УВВ-50). Это позволило сократить технологическую операцию с 96 до 15 ч. Для дос тижения заданной концентрации полуфабриката (упаривания в 4,5–5 раз) на ранее ис пользуемой системе требовалось до 4-5 сут. Расход энергии и пара при применении УВВ-50 снижен в 8 раз;

проточной воды в 4 раза. Эти мероприятия сокращают и веро ятность контаминации полуфабриката посторонней микрофлорой. Кроме этого, для ос ветления препарата предложено использовать соли кальция хлористого и натрия фос форнокислого двузамещенного, что обеспечивает образование геля фосфата кальция и фильтрацию на установке с фильтром марки ЭПВ.СЦ-300/080 вместо ранее используемой фильтрации на аппарате Сальникова.

Мероприятия по оптимизации масштабированного получения автолизата пекар ских дрожжей позволили в итоге получить САПД, соответствующий требованиям НД [МУК 4.2.2316, 2008] по физико-химической характеристике.

Характеристика показателей качества сухого автолизата пекарских дрожжей и питательных сред на его основе. Оценку качества питательных основ и микробиологических сред проводили с помощью совокупности физико-химических и биологических показателей [МУК 4.2.2316, 2008;

МУ 3.3.2.2124, 2006].

В соответствии с НД [МУК 4.2.2316, 2008, Стандарты качества лекарственных средств. № 91500.05.001, 2000], физико-химическая характеристика препарата должна содержать описательные сведения о внешнем виде, прозрачности, цветности, раствори мости, а также влажность, рН и количественное содержание пептидов, общего и амин ного азота, хлоридов, углеводов. Однако было бы целесообразно расширить спектр ха рактеристики питательных основ. Для роста микроорганизмов имеет значение и уровень содержания отдельных аминокислот, и их соотношение, а также минеральный состав среды и наличие тяжелых металлов. Поэтому нами были дополнительно определены со держание аминокислот, общего и неорганического фосфора, железа, кальция, магния, солей тяжелых металлов и индола.

Сухие образцы автолизатов – аморфные порошки светло-кремового цвета с при ятным хлебным запахом. Исключение – «Авимин» и автолизат пекарских дрожжей, по лученный с использованием натрия хлористого, у которых отмечен темно-коричневый цвет. Это свидетельствует о наличие меланоидов в основе, что характерно для пита тельных основ низкого качества. Все образцы хорошо растворимы и имели нейтральные значения рН в пределах 7,0+0,3. Растворы – прозрачные, однако отмечена опалесценция растворов, приготовленных из темных по окраске автолизатов. По содержанию пепти дов (1,2–1,8 %) дрожжевые автолизаты близки к гидролизату по Хоттингеру. Следы “непереваренного” белка определены только в препарате «Авимин».

По показателю влажности образцы автолизата, полученные по оптимизированной технологии – 2,7–3,5%, соответствовали нормативному показателю (не более 5%). От мечена недопустимо высокая влажность до 7,5% и высокая степень гигроскопичности у препаратов в лиофилизированной форме. Во всех исследованных нами образцах содер жание хлоридов в допустимых пределах – 0,65–0,7%, кроме серий САПД, приготовлен ных с использованием натрия хлористого, где содержание хлоридов – 1,5%, что превы шает нормируемый показатель (1%). Подтверждены данные литературы о высоком со держании в автолизатах дрожжей углеводов (12,1+1,0%), что конкретизирует область их применения в качестве основы сред для культивирования микроорганизмов, исключая использование в составе дифференциально-диагностических сред.

При анализе содержания кальция (г/кг), магния (г/кг) и железа (мг/кг) в образцах автолизата, полученного нами по оптимизированной технологии и в образце автолизата «SERVA» получены сопоставимые результаты – 1,6;

6,5;

99,0 и 1,5;

2,0;

100,0 соответст венно. Содержание этих катионов значительно выше в образцах серий САПД, получен ных с применением натрия хлористого, где в технологической схеме использована во допроводная вода и близко к содержанию в автолизате «Авимин», соответственно 10,0;

8,5;

225,0 и 9,2;

5,8;

150,0. Во всех образцах автолизатов отсутствуют тяжелые металлы и индол, отрицательно влияющие на ростовые свойства питательных сред.

При исследовании автолизатов, полученных с использованием разных фермент ных препаратов, выявлено, что применяемый фермент влияет на профиль аминокислот ного состава автолизата. Выявлена зависимость содержания глютамина, аргинина, ала нина и лизина от метода индукции автолиза пекарских дрожжей. Уровень этих амино кислот выше в образцах, полученных с применением ферментного препарата – протео вибрина. Определен полный набор аминокислот, содержание которых отличается ста бильностью. По сумме содержания свободных аминокислот образцы можно отнести к основам со средней глубиной расщепления белка.

Таким образом, результаты исследований физико-химического состава САПД, приготовленного по оптимизированной схеме, свидетельствуют о соответствии требо ваниям НД (МУК 4.2.2316, 2008) по физико-химической характеристике, его стандарт ности и полноценном составе микро- и макроэлементов и аминокислот.

Определение качества питательной основы САПД по биологическим показателям было осуществлено в процессе конструирования питательных сред.

Конструирование питательных сред на основе сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба. Оптимизация состава плотных и жидких дрожжевых сред (ДС) была проведена как по содержанию в них количества белковой основы (САПД), так и по составу солей. Прототипом по минеральному соста ву явились среды для культивирования чумного микроба на основе гидролизата по Хот тингеру по прописи, модифицированной в РосНИПЧИ «Микроб». В результате работы по оптимизации состава сред предложены варианты плотной и жидкой сред на моноос нове САПД, которые приведены в сравнении с составом контрольных сред (К) по Хот тингеру. Были также испытаны жидкая и плотная комбинированные среды (КС), приго товленные на основе гидролизата по Хоттингеру с добавлением САПД до 2,5%, с амин ным азотом в среде 0,8 и 1,0 г/л соответственно (табл.3).

Таблица 3 – Состав экспериментальных дрожжевых сред Жидкая питательная среда Состав среды К (г/л) ДС (г/л) КС (г/л) Питательная основа/Nамин в среде Хоттингер/0,8 САПД/0,15-0,3 Хоттингер+САПД/0, Натрий хлористый 3,0 3,0 3, Аммоний молибденовокислый 0,5 0,5 0, Натрия метабисульфит 0,05 0,05 0, Плотная питательная среда Состав среды К (г/л) ДС (г/л) КС (г/л) Питательная основа/Nамин в среде Хоттингер/1,0 САПД/0,25-0,5 Хоттингер+САПД/1, Натрий хлористый 3,0 3,0 3, Натрий фосфорнокислый двузаме- 2,0 2,0 2, щенный Калий фосфорнокислый двузаме- 2,0 2,0 2, щенный Аммоний молибденово-кислый 1,0 0,5 1, Натрия метабисульфит 0,1 0,05 0, Железо сернокислое (II) 7/в 0,006 0,006 0, Агар 18-20 18-20 18- Ростовые качества сред были проконтролированы при температурных режимах о и 37 С. Определены чувствительность, показатель прорастания, скорость роста, эффек тивность среды и способность сохранять стабильные морфологические и биохимиче ские свойства микроорганизмов при культивировании и многократном пассировании (МУ 3.3.2.2124, 2006). Результаты, полученные при культивировании Y. pestis ЕV НИИЭГ, представлены в табл.4. Штаммы Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377, Y. pestis КМ 227, Y. pseudotuberculosis И-199 растут на всех испытанных экспериментальных средах и сохраняют типичную морфологию при аналогичных значениях аминного азота.

Штаммы чумного микроба, выросшие на экспериментальных средах, сохраняют типичную морфологию. Плотная дрожжевая среда незначительно уступает агару по Хоттингеру по показателю эффективности – выходу биомассы, однако, что важно для производственных питательных сред, позволяет чумному микробу синтезировать кап сульный антиген (по данным РНГА) аналогично результату на контрольной среде. Ком бинированная плотная среда способствует более интенсивному накоплению биомассы, что в 1,2–1,3 раза больше результата, полученного на контрольной среде по Хоттингеру.

Используя прием поэтапного исключения из среды солей, и их двойного умень шения или увеличения, нами установлено, что содержание натрия сульфита и аммония молибденовокислого в дрожжевой среде может быть уменьшено в два раза по сравне нию с контрольной средой, соответственно до 0,05 и 0,5 г/л.

Таблица 4 – Ростовые свойства плотных питательных сред (рН 7,2) при культивировании Y.pestis EV НИИЭГ Показатель Плотная питательная среда / Nамин, % (n=15) ДС/ ДС/ ДС/ ДС/ ДС/ КС/ К/ ДС/ 0,015 0,020 0,025 0,030 0,050 0,060 0,1 0,1-0, Чувствительность (из 3+1,0 8+2,0 7,5+1,0 8+2,2 8+2,0 8+2,1 8+2 8+2, разведения 10-7) М+m Прорастание (из разве- 30+5,0 47+3,2 49+3,4 55+3,8 65+2,8 60+4,1 65+2,5 55+2, дения 10-6), % М+m Эффективность:

концентрация биомас- 1 1,5+0,2 1,8+0,25 2,6+0,5 3,5+0,5 4,0+0,5 6,6+0,2 5,2+0, сы (млрд м.к./мл) М+m синтез АГ (37оС), титр –* 1:64 1:512 1: 1024 1: 1024 1: 1024 1:2048 1: РНГА Диаметр колоний, (мм) Точеч- 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,2+0,1 1,1+0, М+m ные Характер роста Ати- Ати- Типич- Типич Типич- Ати- Типич Типич пичныйпичный ный пич- ный пичный пич- ный ный ный *Прочерк – нет роста при 37 оС Заключительным этапом работы по конструированию плотных питательных сред для культивирования чумного микроба было определение способности сред на основе САПД длительно сохранять стабильными основные биологические свойства при много кратном пассировании штамма. Культура чумного микроба на примере Y. pestis ЕV НИИЭГ после десяти пассажей на плотной среде (ДС/0,05) сохраняла основные биоло гические свойства.

Аналогичным образом были испытаны жидкие среды, приготовленные на моно основе САПД (Nамин 0,015;

0,02;

0,025;

0,03;

0,05%), и среда, комбинированная с исполь зованием САПД в виде ростостимулирующей добавки (Nамин 0,08%). Жидкие дрожже вые среды (Nамин 0,015–0,03%) обеспечивали полноценный рост всех тест-штаммов чум ного микроба. В табл. 5 представлены основные характеристики роста Y. pestis EV НИИЭГ при культивировании на жидких питательных средах. Все жидкие среды при посеве чумного микроба из разведений 10-6 и 10-5 (посевное число 100 и 1000 м.к.) ока зались высокочувствительными, обеспечивали рост во всех трех пробирках. Характер роста Y. pestis ЕV НИИЭГ на ДС/0,015–0,05 был типичным, но по показателю эффек тивности – концентрации биомассы, контрольной среде соответствовали среды ДС/0,025;

ДС/0,03;

ДС/0,05. Достоверно значимое различие с контролем (0,05) по вы ходу биомассы при культивировании Y. pestis ЕV НИИЭГ было получено на средах ДС/0,03, ДС/0,05 и КС.

Таблица 5 – Ростовые свойства жидких питательных сред (рН 7,2) при культиви ровании Y.pestis EV НИИЭГ Показатель Жидкая питательная среда / Nамин, % (n=15) ДС/0,01 ДС/0,02 ДС/0,02 ДС/0,03 ДС/0,05 КС/0,08 К/0, 5 Концентра ция биомас сы (млрд 0,75+0,2 1,55+0,15 1,7+0,2 1,8+0,15* 1,9+0,2* 2,5+0,2* 1,65+0, м.к./мл) М+m Характер Типич- Типич- Типич- Типич- Атипич- Типич- Типич роста ный ный ный ный ный ный ный *0, Однако жидкая экспериментальная среда ДС/0,05 не обеспечивала стабильности основных биологических свойств чумного микроба. При высеве на плотную среду после инкубации в бульоне, колонии чумного микроба в диаметре были (1,6+0,2) мм и не име ли характерной кружевной периферической зоны, отмечалась диссоциация – рост в виде S- и R-форм. Эффективность среды с моноосновой САПД (Nамин 0,03%) достоверно вы ше, чем среды по Хоттингеру на 15%. Культивирование штамма Y. pestis ЕV НИИЭГ на комбинированной жидкой среде доказало высокую эффективность среды, достоверно превосходящую контрольную среду по Хоттингеру на 50% и дрожжевую среду – 32%.

Таким образом, в результате проведенной работы по оптимизации состава сред показано, что плотная (Nамин0,025–0,05%) и жидкая (Nамин0,015–0,03%) среды на основе автолизата пекарских дрожжей по биологическим показателям соответствуют требова ниям, предъявляемым к средам культивирования чумного микроба, и позволяют накап ливать АГ аналогично результату на контрольной среде. Плотная и жидкая комбиниро ванные среды, с использованием автолизата в качестве ростостимулирующей добавки, также по биологическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам культивирования чумного микроба и по эффективности (концентрации биомас сы) превосходят контрольную среду на 27 и 50%.

Применение питательных сред на основе дрожжевого автолизата для мас штабированного культивирования чумного микроба. Практический интерес пред ставляло применение сред культивирования чумного микроба на основе САПД в произ водстве МИБП. Среды были использованы для экспериментального производства диаг ностических средств – произведено 6 серий бактериофага чумного диагностического Л 413С. Для сред культивирования штамма Y. pestis ЕV НИИЭГ использован САПД в виде моноосновы и в качестве ростостимулирующей добавки (2,5%) в составе комбиниро ванных сред на основе гидролизата по Хоттингеру.

Все среды как приготовленные на основе автолизата пекарских дрожжей, так и содержащие автолизат в виде добавки оказались пригодными для воспроизводства чум ного бактериофага Л-413С. Они обеспечивали высокую концентрацию фаговых частиц на этапе размножения, хорошую выживаемость после лиофилизации, а также стабиль ность свойств в процессе хранения. Однако более эффективными, на наш взгляд, явля ются среды, в которых дрожжевой автолизат является питательной белковой моноосно вой. Среды на монооснове САПД с минимальным содержанием азота (0,025%) обеспе чивали наиболее высокую специфическую активность, превышающую в 2,4 раза резуль тат, полученный на контрольной среде по Хоттингеру, соответственно – 20,0107 и 8,4107 фаговых частиц (табл. 6).

Таблица 6 – Физико-химические и биологические показатели бактериофага Л-413С Требова- САПД –добавка Бульон по Хот Показатель САПД – монооснова ния к Хоттингеру тингеру НД* ДС/1 ДС/2 ДС/3 КС/4 КС/5 К/1 К/ Растворимость, мин 3 1 1 1 1 1 1 рН 6,5-7,5 6,96 7,0 7,1 6,43 7,1 6,45 6, Потеря в массе при 3 1,75 0,6 0,5 1,73 0,4 1,3 0, высушивании, % Специфическая ак тивность частиц:

n106 20,0107 4,65107 4,6107 4,0107 2,59107 8,4107 5, до лиофилизации n105 8,0106 1,6106 1,0106 1,9107 1,0106 3,8106 1, после лиофилизации Спектр литической Типич- Типич- Типич- Типич- Типич- Типич- Типич- Типич активности ный ный ный ный пич- ный ный ный ный НД*- ТУ 9386-020-01898109- Тенденция преимущества сред на основе САПД с минимальным содержанием аминного азота сохранялась как при лиофилизации чумного бактериофага, так и в про цессе хранения в течение срока наблюдения при разных температурных режимах. Ре зультаты изучения свойств препаратов в процессе хранения свидетельствуют о стабиль ности таких показателей, как растворимость и потеря в массе при высушивании в тече ние срока годности (3 года), а также через 1 год после его истечения.

Экономически целесообразным является и использование САПД в качестве рос тостимулирующей добавки. Способ комбинированного использования основ позволяет использовать мясной перевар в значительно меньшем количестве (на 30%),что обеспе чивает в сочетании с азотистыми основаниями САПД содержание в готовой жидкой среде аминного азота 0,08%. Комбинированная среда способна полностью обеспечивать питательные потребности чумного микроба и способствует выживаемости чумного бак териофага на этапе лиофилизации и хранения.

Опыт использования жидкой экспериментальной среды для масштабированно го выращивания чумного микроба. Для изучения возможности применения сухого авто лизата пекарских дрожжей в производстве диагностических и препаратов, в условиях масштабированного эксперимента в качестве объекта для экспериментально производственного культивирования были использованы штаммы: Y.pestis EV НИИЭГ и Y. pestis КМ 277 при режиме культивирования 28 и 37 оС.

Установлено, что глубинное культивирование штаммов чумного микроба (Y.pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ) на жидкой среде (N амин. 0,015%), сконструи рованной на основе САПД, при 28 оС и 37 оС позволяет накапливать как биомассу, так и капсульный антиген (дот-ИФА). Эффективность экспериментальной жидкой среды со поставима по результатам контрольной среде по Хоттингеру. При культивировании Y.pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ на плотных дрожжевых средах (при 28 оС) полу чены результаты, не уступающие результатам с контрольной среды по Хоттингеру. Оп ределено, что штамм Y.pestis КМ 277 при культивировании на экспериментальных сре дах с основой САПД при температурном режиме 28 оС (до 24 ч) по способности синтеза в среду капсульного антигена превосходит штамм Y. pestis EV НИИЭГ.

В следующей серии экспериментов для культивирования штаммов чумного мик роба (Y.pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ) использована серия жидкой питательной среды на основе САПД (N амин. 0,015 %). Инкубацию до 24 ч осуществляли при 28 оС в реакторе У-6 с объемом питательной среды 125 л. Определение ФI было проведено ме тодом РИД. Анализируя данные, полученные при культивировании Y.pestis КМ 277 при температуре 28 оС, следует отметить высокий уровень секреции в среду Ф1 – 5,0 мг/мл, и в то же время небольшой выход биомассы с единицы объема питательной среды – 14109 м.к./мл. Соответственно результаты, полученные при культивировании в тех же условиях Y.pestis EV НИИЭГ – 2,5 мг/мл и 35 109 м.к./мл. На основании сравнения дан ных, полученных при масштабированном выращивании штаммов чумного микроба на экспериментальной среде и среде по Хоттингеру [Никифоров А.К., 2011], можно заклю чить, что разработанная жидкая среда на основе САПД не уступает по эффективности традиционно применяемой среде.

Учитывая, что современное производство питательных сред должно быть эко номически эффективным, было проведено сравнение стоимости основ, приготовленных из разного сырья. Установлено, что применение в составе питательных сред культиви рования моноосновы – автолизата пекарских дрожжей может снизить себестоимость МИБП. Рассчитанная стоимость автолизата меньше, чем стоимость гидролизата по Хот тингеру и гидролизата казеина соответственно в 3,3 и 1,3 раза.

Экономический эффект связан и с уменьшение количества основы, используе мой для приготовления жидкой среды культивирования, так как дрожжевые среды обес печивают питательные потребности чумного микроба и способствуют накоплению це левого продукта (бактериофага или капсульного антигена) при содержании в них мини мального количества аминного азота (0,015–0,025%). При приготовлении питательных сред для культивирования штамма-продуцента бактериофага, дрожжевой основы расхо дуется меньше в 2 и 1,8 раза, чем гидролизата по Хоттингеру и казеинового гидролиза та. Следовательно внедрение жидких сред на основе автолизата пекарских дрожжей в производство может существенно (в 5,3 раза) снизить себестоимость МИБП.

Таким образом, в результате оптимизации производства автолизата пекарских дрожжей предложены технологические способы, позволяющие получить сухую стан дартную основу питательных сред полноценную по аминокислотному составу и со стабильным содержанием микро- и макроэлементов.

При выращивании тест-штаммов доказана пригодность жидкой и плотной сред, сконструированных на монооснове – сухом автолизате пекарских дрожжей для культивирования чумного микроба. Доказана эффективность применения дрожжевых сред при экспериментальном производстве чумного бактериофага Л-413С, для накоп ления биомассы и ФI при глубинном культивировании штаммов чумного микроба.

ВЫВОДЫ 1. Индуцированный протеовибрином автолиз пекарских дрожжей в условиях ще лочной среды (рН 8,0+0,5) сокращает продолжительность процесса в 1,7 раза и повыша ет выход азотсодержащих веществ до 20% по сравнению со способом, предложенным ранее с применением натрия хлорида.

2. Предложенный комплекс оперативных методов контроля, включающий опреде ление концентрации аминного азота в реакционной смеси и степени лизиса дрожжевых клеток на стадии технологического процесса, а также измерение удельной электропро водимости на стадии входного контроля сырья, позволяет определить эффективность автолиза.

3. Усовершенствованный технологический процесс производства автолизата пекар ских дрожжей с применением направленного изменения рН среды, способа фильтрации, концентрирования на вакуум-выпарной установке и распылительного высушивания по зволяет получить полноценную сухую питательную основу для микробиологических сред, соответствующую требованиям НД по физико-химическим свойствам и химиче скому составу.

4. Плотная и жидкая среды на основе автолизата пекарских дрожжей по биологиче ским показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам для культиви рования чумного микроба.

5. Комбинированные плотная и жидкая среды с использованием автолизата в каче стве ростостимулирующей добавки (аминный азот 0,1 и 0,08% соответственно) по био логическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к средам культи вирования чумного микроба, и по накоплению биомассы (при 37 и 28 оС) превосходят контрольную среду по Хоттингеру (на 27 и 50% соответственно).

6. Сконструированные дрожжевые среды обеспечивают при масштабированном культивировании питательные потребности чумного микроба и способствуют накопле нию целевого продукта (бактериофага или капсульного антигена) при содержании в них минимального количества аминного азота (0,015-0,025%).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Антонычева М.В., Шульгина И.В., Базлов Г.В., Вахрушина Н.И., Нижегородцев С.А., Астафьева С.В., Дятлов И.А. Применение питательных сред на основе сухого ау толизата дрожжей для культивирования чумного микроба // Санитарная охрана терри тории государств-участников содружества независимых государств: Матер.VI Межгос.

науч.-практ. конф. – Волгоград, 2005. – С. 206-208.

2. Антонычева М.В., Шульгина И.В., Вахрушина Н.И., Нижегородцев С.А., Волох О.А., Астафьева С.В., Дятлов И.А. Использование сухого автолизата дрожжей для сред культивирования чумного и псевдотуберкулезного микробов // Инфекции, обусловлен ные иерсиниями, НИИЭМ им. Пастера: Матер. II Всеросс. науч.-практ. конф. с между народ. участием. – СПб, 2006. – С. 32-34.

3. Аленкина Т.В., Зинина О.С., Антонычева М.В., Шульгина И.В., Вахрушина Н.И.

Изготовление бактериофага диагностического чумного Л-413С на жидких средах из ау толизата пекарских дрожжей // Инфекции, обусловленные иерсиниями, НИИЭМ им.

Пастера: Матер. II Всеросс. науч.-практ. конф. с международ. участием. – СПб., 2006. – С. 27-29.

4. Антонычева М.В., Шульгина И.В., Аленкина Т.В., Зинина О.С., Вахрушина Н.И., Нижегородцев С.А. Применение сухого автолизата дрожжей в производстве медицин ских иммунобиологических препаратов // Вакцинология 2006. Совершенствование им мунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней: Матер.

науч.-практ. конф. ГИСК им. Тарасевича. – М., 2006. – С. 15.

5. Пат. 2360962 Российской Федерации МПК С12N1/20 Способ получения питатель ной основы и питательная среда для культивирования микроорганизмов возбудителе чумы и холеры / Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Киреев М.Н., Плотников О.П., Граче ва И.В., Виноградова Н.А., Солодовников Н.С., Нижегородцев С.А., Антонычева М.В.

– №2007122604;

заявл. 15.02.2007;

опубл. 10.07.09 // Бюлл. 2009. – №19.

6. Крушельницкий Р.В., Антонычева М.В., Нижегородцев С.А., Вахрушина Н.И., Шульгина И.В., Белоусов А.Д. Использование отходов производства автолизата пекар ских дрожжей для приготовления белковой питательной основы // Международные ме дико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгос. науч.-практ. конф. го суд. - участ. СНГ. – Саратов: ООО «Приволжское изд-во», 2007. – С. 236-237.

7. Кузьмиченко И.А., Громова О.В., Киреев М.Н., Плотников О.П., Грачева И.В., Вино градова Н.А., Червякова Н.С., Нижегородцев С.А., Антонычева М.В. Питательные сре ды для культивирования возбудителей холеры, чумы, псевдотуберкулеза, приготовлен ные с использованием ферментативного комплекса холерного вибриона – протеовибрина // Холера и патогенные для человека вибрионы: Матер. совещ. и пробл. комиссии.

– Ростов-н/Д, 2008. – Вып. 21. – С. 126-127.

8. Базлов Г.В., Щербаков Д.А., Антонычева М.В., Васин Ю.Г., Строганов В.В., Шуль гина И.В., Никифоров А.К., Вахрушина Н.И., Нижегородцев С.А. Концентрирование ав толизата пекарских дрожжей в процессе производства сухой питательной основы // Био технология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития: Матер.

междунар. науч.-практ. конф., посв. 50-летию НИИ проблем биобезопасности НЦБ МОН РК. – Алматы, 2008. – С. 57-61.

9. Антонычева М.В., Шульгина И.В., Никифоров А.К., Кузьмиченко И.А., Нижего родцев С.А. Безотходные технологии в производстве медицинских иммунологических препаратов // Проблемы обращения с отходами лечебно-профилактических учреждений:

Сб. матер. V междунар. конф. – М., 2009. – С. 34-35.

10. Антонычева М.В., Кузьмиченко И.А., Никифоров А.К., Волох О.А., Шульгина И.В. Эффективность автолиза пекарских дрожжей, индуцированного ферментными препаратами // Пробл. особо опасных инф. – 2009. – Вып. 3(101). – С. 62-65. (из пе речня ВАК) 11. Зинина О.С., Аленкина Т.В., Антонычева М.В., Вахрушина Н.И., Никифоров А.К.

Перспективы применения питательных сред на основе аутолизата пекарских дрожжей в производстве чумных бактериофагов // Актуальные проблемы предупреждения и ликви дации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: Матер. X Межгос. науч.-практ.

конф. государств – участников СНГ (5-6 октября, г. Ставрополь).

– 2010. – С. 188-189.

12. Аленкина Т.В., Зинина О.С., Антонычева М.В., Вахрушина Н.И., Никифоров А.К.

Эффективность применения сред на основе аутолизата пекарских дрожжей в производст ве бактериофага диагностического чумного Л-413С // Журн. инф. патол. – Иркутск, 2010.

Вып. 3. – С. 15-17.

13. Аленкина Т.В., Зинина О.С., Антонычева М.В., Вахрушина Н.И., Никифоров А.К. Оптимизация стадии репродукции в технологии производства бактериофага диагностического чумного Л-413С // Пробл. особо опасных инф. 2011. Вып. 2(108). – С. 79-82. (из перечня ВАК) 14. Жулидов И.М., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Антонычева М.В., Шульгина И.В., Лобовикова О.А., Вахрушина Н.И., Белоусов А.Д., Еремин С.А., Киреев М.Н., Шарапова Н.А., Савицкая Л.В., Михеева Т.А., Минаева Л.Н., Галкина М.В., Свин цов Р.А., Аленкина Т.В., Васин Ю.Г., Базлов Г.В. Безотходные технологии в произ водстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина // Пробл. особо опас ных инф. 2011. В. 4 (111). – С.80-84. (из перечня ВАК) 15. Базлов Г.В., Комиссаров А.В., Никифоров А.К., Антонычева М.В., Белоусов А.Д. Совершенствование технологии получения экстракта автолизата пекарских дрожжей // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – 2012. – № 1. – С. 11-14. (из перечня ВАК) Подписано в печать 19.01.2012. Формат 6084 1/16. Бумага офсетная.

Печать офсетная. Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт “Микроб” Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.