Разработка методических подходов для специфической индикации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией результатов
На правах рукописи
ЗИНЧЕНКО Ольга Викторовна РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ 03.02.03 – микробиология
Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Волгоград – 2010
Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
кандидат медицинских наук, доцент
Научный консультант:
Антонов Валерий Алексеевич доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Шуб Геннадий Маркович кандидат биологических наук Осина Наталия Александровна Федеральное государственное учре
Ведущая организация:
ждение «48 Центральный научно исследовательский институт Мин обороны РФ»
Защита состоится «20» апреля 2010 г. в 10 часов на заседании диссер тационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских дис сертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университет ская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Автореферат разослан «19» марта 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник А.А. Слудский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Патогенные буркхольдерии – B. mallei и B.pseudomallei относят к возбудителям особо опасных инфекционных забо леваний, а также к потенциальным агентам биотерроризма группы В [А.А.Воробьев, 2001;
В.В. Алексеев, 2003;
J.M. Rusnak, 2004]. Угроза воз никновения террористических актов, чрезвычайных ситуаций в результате техногенных катастроф, а также возможность завоза в Россию инфекций из эндемичных территорий путем миграции населения, ввоза больных живот ных, почвы, пищевых продуктов, контаминированных патогенными бурк хольдериями [В.И. Илюхин, 1999] диктует необходимость разработки высо кочувствительных методов специфической индикации и ускоренной иденти фикации этих возбудителей.
Для выявления различных микроорганизмов применяются специальные диагностические тест-системы и оборудование, которые позволяют обнару живать и идентифицировать ПБА в ПЦР, ИФА и МФА.
В последнее время для специфической индикации и ускоренной иден тификации возбудителей инфекционных заболеваний все более активно ис пользуют молекулярно-генетические подходы, позволяющие выявлять опре деленные участки генома микроорганизмов. Зарубежными и отечественными исследователями опубликованы данные о конструировании различных прай меров для идентификации патогенных буркхольдерий. В качестве ДНК ми шеней были рекомендованы гены 16S рРНК [T. Dharakul et al., 1996], 23S рРНК [A. E. Lew et al., 1994], спейсерные области 16-23S рРНК [M. Kunakorn et al., 1995], кластер генов LPS, кодирующий капсульный липополисахарид [A. Rattanathongkom et al., 1997], гены системы III-типа секреции (TTS1) [C.Winstanley et al., 2000;
L. Rainbow et al., 2002], флагеллярный ген [P. Son thayanon et al., 2002]. В большинстве работ использовался ПЦР-анализ с электрофоретической детекцией.
Применение классической полимеразной цепной реакции на этапе де текции предусматривает использование электрофоретического оборудования, что создает определенные трудности при идентификации микроорганизмов:
возможность перекрестной контаминации реакционных смесей специфиче скими ампликонами и получение ложноположительных результатов, трудо емкость, продолжительность этапа электрофореза, необходимость дополни тельного помещения и выполнение ПЦР силами нескольких сотрудников.
Использование реакции амплификации с флуоресцентной детекцией специфических ампликонов позволяет избавиться от вышеперечисленных недостатков [S. Tyagi et al., 1996]. Флуоресцентные технологии отличает безопасность и высокая чувствительность, благодаря чему они приобрели широкое распространение [R. Higuchi, 1993;
J.L. Versage, 2003;
E. M. Fykse et al., 2007].
Детекция в режиме реального времени позволяет наглядно отображать этапы ПЦР и количественно оценивать продукты реакции [C.A. Heid, 1996].
Кроме того, регистрация прибором флуоресценции разной длины волны по зволяет применять ДНК внутреннего контроля для подтверждения достовер ности отрицательных результатов.
Данный метод обнаружения возбудителей ООИ отличает высокая чув ствительность, специфичность, быстрота получения результатов, возможность автоматизации при минимальном объеме исследуемого материала.
Снижение требований к организации ПЦР-лабораторий, а также спо собность выполнения ПЦР-анализа силами одного сотрудника позволяет ис пользовать такие амплификационные тест-системы в условиях автономной мобильной ПЦР-лаборатории.
Цель работы: конструирование специфичных флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов и разработка методических подходов для специ фической индикации и ускоренной идентификации патогенных буркхольде рий с помощью ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов.
Задачи исследования:
Подобрать специфичные праймеры и олигонуклеотидные зонды 1.
на основе нуклеотидных последовательностей генов 23S рРНК, III типа сек реции (TTS I) и флагеллярного гена fliC для идентификации возбудителей са па и мелиоидоза.
Определить основные параметры ПЦР, обеспечивающие высо 2.
кую чувствительность и специфичность выбранных праймеров и олигонук леотидных зондов, на широком наборе гомологичных и гетерологичных ви дов микроорганизмов. Оптимизировать условия проведения ПЦР на прибо рах с детекцией «по конечной точке» и в режиме реального времени для вы явления патогенных буркхольдерий.
Провести анализ различных способов очистки и выделения ДНК 3.
патогенных буркхольдерий из биологического материала и объектов окру жающей среды для исследования методом ПЦР с гибридизационно флуоресцентным учетом результатов.
Оценить возможность использования магноиммуносорбентов на 4.
этапе подготовки проб из объектов окружающей среды и пищевых продуктов для исследования методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов на наличие ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза.
Оценить эффективность применения сконструированных прай 5.
меров и зондов для ускоренной идентификации возбудителей сапа и мелиои доза при экспериментальной инфекции.
Научная новизна. Для идентификации патогенных буркхольдерий впервые сконструированы олигонуклеотидные флуоресцентно-меченые зон ды, являющиеся фрагментами генов 23S рРНК, III типа секреции (TTSI) и флагеллярного гена fliC, на основе которых возможна разработка амплифи кационных тест-систем для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза с регистрацией результатов амплификации «по конечной точке» и в режиме реального времени.
Определена высокая эффективность использования ПЦР с флуорес центной детекцией результатов как при идентификации чистых культур па тогенных буркхольдерий, так и при выявлении ДНК возбудителей сапа и ме лиоидоза в пробах из объектов внешней среды, в пищевых продуктах, искус ственно контаминированных B. mallei и B. pseudomallei, а также в биологиче ском материале от экспериментально зараженных животных.
Впервые проведен сравнительный анализ эффективности олигонуклео тидных праймеров и флуоресцентных зондов с учетом результатов амплифи кации как «по конечной точке», так и в режиме реального времени для иден тификации возбудителей сапа и мелиоидоза. Показано, что ПЦР в режиме реального времени, в отличие от флуоресцентной детекции «по конечной точке», позволяет не только наглядно отображать этапы ПЦР, но и количест венно оценивать продукты реакции при выявлении ДНК патогенных бурк хольдерий.
Предложены эффективные способы подготовки проб различного ха рактера, инфицированных патогенными буркхольдериями, для анализа мето дом ПЦР. Впервые представлены доказательства использования магноимму носорбентов (МИС) с целью селективного концентрирования клеток возбу дителей сапа и мелиоидоза на этапе пробоподготовки и очистки ДНК от примесей веществ, ингибирующих ПЦР.
Показана возможность использования олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов для конструирования амплификационных тест систем с целью выявления патогенных буркхольдерий в условиях работы пе редвижной автономной ПЦР-лаборатории.
Практическая ценность. В результате проведенных исследований созданы экспериментальные серии тест-систем для ускоренной идентифика ции возбудителей сапа и мелиоидоза в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР с флуоресцентной детекцией.
По результатам работы составлены методические рекомендации, ут вержденные директором ВолгоградНИПЧИ (протокол № 10 от 26.12.07 г.), по использованию ПЦР с флуоресцентной детекцией для идентификации B.mallei и B. pseudomallei, выявления возбудителей сапа и мелиоидоза в про бах из объектов внешней среды и пищевых продуктов, контаминированных патогенными буркхольдериями, а также при различных экспериментальных формах сапа и мелиоидоза.
Показано, что разработанные олигонуклеотиды в составе диагностиче ских тест-систем, могут быть использованы для исследования проб из объек тов внешней среды, пищевых продуктов и биологического материала, подоз рительных на контаминацию B. mallei и B. pseudomallei, как в стационарной специализированной лаборатории, так и в условиях передвижной автономной ПЦР-лаборатории.
По результатам работы проведены межведомственные комиссионные испытания в соответствии с Программой, согласованной с генеральным ди ректором ЗАО НПФ «ДНК-технология» Д.Ю. Трофимовым и утвержденной директором Волгоградского научно-исследовательского противочумного ин ститута В.В. Алексеевым и генеральным директором ООО «РБ-спектр» А.А. Семенюком 16.01.2008 года.
Материалы диссертационной работы используются сотрудниками ин ститута в рамках учебных программ по первичной специализации и перепод готовке специалистов: Программы курсов повышения квалификации бакте риологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму, утвержден ной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 01.02.2001 г., Программы курсов повышения квалификации врачей – бактериологов общей медицинской сети, центров госсанэпиднадзо ра и противочумных учреждений по специфической индикации и лаборатор ной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения, утвержденной Главным государ ственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 28.09.1999 г., а также Программы курсов повышения квалификации меди цинских работников (с высшим и средним специальным образованием) сани тарно-карантинных пунктов и отделов (СКП и СКО), утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко.
Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.
Положения, выносимые на защиту:
1. Системы олигонуклеотидов, сконструированные на основе участков генов 23S рибосомальной РНК, orf13 из кластера генов III типа секреции (TTS1) и флагеллярного гена fliC, включающие прямые, обратные праймеры и гибридизационные зонды, меченые флуорофорами, обеспечивают как спе цифическую амплификацию фрагментов ДНК, так и регистрацию результа тов реакции по повышению уровня флуоресценции.
2. Гибридизационно-флуоресцентные олигонуклеотидные зонды трех ДНК-мишеней - участков генов 23S рРНК, fliC и orf13 увеличивают специ фичность реакции амплификации и повышают достоверность результатов при индикации и идентификации B. mallei и B. pseudomallei.
3. Системы олигонуклеотидов, разработанные для обнаружения генов 23S рРНК, orf13 и флагеллярного гена fliC, позволяют идентифицировать чистые культуры патогенных буркхольдерий при их концентрации 1 х 10 м.к./мл в условиях гибридизационно-флуоресцентной детекции «по конечной точке» и 1 х 102 м.к./мл с детекцией в режиме реального времени.
4. Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды пригодны для специфической индикации возбудителей сапа и мелиоидоза при исследо вании проб из объектов окружающей среды, пищевых продуктов, искусст венно контаминированных B. mallei и B. pseudomallei, а также биологическо го материала, полученного от экспериментально зараженных животных.
5. Использование магноиммуносорбентов на этапе подготовки проб из объектов окружающей среды и пищевых продуктов для исследования мето дом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов обеспечи вает выявление ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза при их концентрации не менее 1 х 102 м.к./мл (г).
Апробация работы Основные материалы диссертации были представлены на конференции к 100-летию Астраханской противочумной станции «Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (Астрахань, 2001);
на зарубежной научной конференции «Natu ral infectious diseases» (Монголия, 2001);
VIII съезде Всероссийского общест ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002);
VI Меж государственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества не зависимых государств: проблемы биологической безопасности и противо действия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005);
Рос сийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекцион ных болезней» (Новосибирск, 2005);
научно-практической конференции мо лодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной ме дицины» (Санкт-Петербург, 2006);
Межгосударственной научно VII практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные си туации международного значения в общественном здравоохранении в реше ниях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006);
XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), IX съезде Всероссийского научно практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007);
VIII Межгосударственной научно-практической конферен ции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные пра вила и реализация глобальной стратегии Борьбы с инфекционными болезня ми в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), V международном кон грессе по мелиоидозу (Thailand, 2007), IX Межгосударственной научно практической конференции государств-участников СНГ «Современные тех нологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными бо лезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008), 66-й юбилейной научно-практической кон ференции молодых ученых с международным участием «Актуальные про блемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2008), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Волгоградского НИП ЧИ.
Публикации По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 3 – в ре цензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций, 3 – в зарубежной печати.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 136 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6-ти глав собственных исследований, за ключения, выводов и списка использованных источников, включающего работы, в том числе 38 отечественных и 245 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 16 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы В качестве исследуемого материала использовали бактериальные взве си чистых культур микроорганизмов, пробы почвы и пищевых продуктов, искусственно контаминированные штаммами B. pseudomallei и B. mallei, и биологический материал от лабораторных животных, экспериментально за раженных возбудителями сапа и мелиоидоза.
Работа выполнена на 98 штаммах, из них – 43 штамма B. pseudomallei, 14 штаммов B. mallei, 10 штаммов Burkholderia cepacia, 5 штаммов Burkhol deria thailandensis, 2 штамма Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, по штамму Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella ovis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis, Shigella flexneri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Shigella zonne, Shi gella flexneri, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris.
Моделирование экспериментальной инфекции осуществляли на золо тистых хомячках внутрибрюшинным заражением штаммами B. pseudomallei 100 и B. mallei 10230. Кусочки внутренних органов (легких, печени, селезен ки) и кровь исследовали в ПЦР. Одновременно эти же образцы методом от печатков высевали на питательные среды.
Экстракцию и очистку ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза в экспе риментальном клиническом материале проводили с помощью коммерческого набора «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Москва) и методом нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата по методике, предложенной R. Boom [R.
Boom et al., 1990], с дополнительной отмывкой ацетоном.
Для выделения и очистки ДНК из объектов окружающей среды, искус ственно контаминированных патогенными буркхольдериями, использовали метод нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоционата [R.
Boom et al., 1990], метод гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депро теинизации с последующей очисткой ДНК нуклеосорбцией [Г.А. Ткаченко с соавт., 2007] и коммерческий набор «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Моск ва). Для концентрирования микроорганизмов и очистки проб почвы и пище вых продуктов от примесей, ингибирующих ПЦР, использовали магноимму носорбенты (МИС).
Подбор праймеров и олигонуклеотидных зондов проведены совместно с сотрудниками НПФ «ДНК-технология», г. Москва. Олигонуклеотидные праймеры синтезировали фосфоамидитным методом на автоматическом син тезаторе ДНК «АСМ-102 У» (АОЗТ «Биосан», г. Новосибирск).
В работе использовали ПЦР-буфер и Taq-полимеразу производства ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва.
Все манипуляции при постановке реакции амплификации проводили в соответствии с МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях ме тодом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп пато генности» (2003 г).
Реакцию амплификации и анализ продуктов ПЦР осуществляли на про граммируемом термоциклере «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г.
Москва) и детекторе флуоресценции «Gene» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», г. Москва) «по конечной точке» и в режиме реального времени - «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия) и «SmartCycler» («Cepheid», США) в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта». Наличие специфического ампликона определяли методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле с окраской фрагментов ДНК этидиум бромидом и визуализацией в УФ-свете.
Для проведения статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc.,США) Результаты исследований Для идентификации B. mallei и B. pseudomallei в качестве ДНК мишеней были выбраны участки гена 23S рРНК, гена orf13 из кластера генов III типа секреции (TTSI) и флагеллярного гена fliC исследуемых микроорга низмов. С помощью компьютерного анализа (программы Gene Runner 3.0 и Oligo 4.0) были проанализированы несколько пар праймеров и олигонуклео тидные зонды. Праймеры к гену 23S рРНК и флагеллярному гену fliC были сконструированы ранее сотрудниками Волгоградского НИПЧИ [В.А. Анто нов, 2004;
В.В. Алтухова, 2005]. Ген orf13 послужил основой для создания оригинальных праймеров. Флуоресцентно-меченые зонды, представляющие собой вариант «молекулярных маячков», получены нами на основе консерва тивных последовательностей амплифицируемых участков данных генов.
Сконструированные праймеры и зонды являлись группоспецифичными и де тектировали возбудителей сапа и мелиоидоза.
Нуклеотидные последовательности выбранных праймеров и зондов представлены в таблице 1. Размер фланкируемого фрагмента ДНК для прай меров b23s7/b23a7 составлял 243 п.н., для b23s7/b23a8 - 266 п.н., для b23s7/b23a9 - 313 п.н., для BTTS-s1/BTTS-as3 - 162 п.н., а для bfl-1s/bfl-2a – 376 п.н. В рамках совместной НИР с ЗАО НПФ «ДНК-технология» сконст руирован внутренний контроль, который использовали для всех амплифика ционных реакций. Размер ампликона внутреннего контроля составлял п.н. При использовании программ Gene Runner и BLAST была проанализиро вана структура выбранных зондов и пар праймеров и показана теоретическая пригодность олигонуклеотидных затравок для успешной инициации реакции амплификации.
В серии экспериментов с ДНК патогенных буркхольдерий и гетероло гичных микроорганизмов подобраны оптимальные параметры постановки реакции амплификации (температура отжига, количество циклов, реакцион ный буфер, концентрация флуоресцентного зонда).
Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зон дов и размер специфических ампликонов Праймеры Нуклеотидные последовательности Размер и ДНК- праймеров и ДНК-зондов ампли зонды кона Ген 23S рРНК b23s7 GСT GCG GAT GCG AGC TAG TCТ 243 п.н.
b23a7 GCA GGA ATA TTG ACC TGC TTC CCA burk23_f1p (FAM)-GCC TCG GTG AGT CGG CCC CTA AGG CGA GGC (BHQ1) b23s7 GСT GCG GAT GCG AGC TAG TCТ 266 п.н.
b23a8 CCC CCA TCG CAT CTA ACG AC burk23_f1p (FAM)-GCC TCG GTG AGT CGG CCC CTA AGG CGA GGC (BHQ1) b23s7 GСT GCG GAT GCG AGC TAG TCТ 313 п.н.
b23a9 GCA GCG ACC GGG ACT TCC AAC burk23_f1p (FAM)-GCC TCG GTG AGT CGG CCC CTA AGG CGA GGC (BHQ1) b23s7 GСT GCG GAT GCG AGC TAG TCТ 266 п.н.
b23a8 CCC CCA TCG CAT CTA ACG AC Pf-23S-1 (FAM)-GCC TCG GTG AGT CGG CCC CTA AGG CGA GGC (RTQ1) Ген orf BTTS-s1 GAC TGA CCG CGC TCA AAG CCG 162 п.н.
BTTS-as3 TCC GGC CTG ACA AAC GTT TGG BTTS-f1 (FAM)-CGC GCA CCG GCA GTG ATG AGC CAC GCG CG (BHQ1) BTTS-s1 GAC TGA CCG CGC TCA AAG CCG 162 п.н.
BTTS-as3 TCC GGC CTG ACA AAC GTT TGG Pf-TTS-1 (FAM)-CGC GCA CCG GCA GTG ATG AGC CAC GCG CG (RTQ1) Ген fliC bfl-1s ACG GTC TCC GTC GAC CTC AC 376 п.н.
bfl-2a CGT TGA TCT GCG CAA CCA TC Pf-Bfl-1 (FAM)-CGC TGT CGA CTT CGG CAA CCA GCG -(RTQ1) bfl-1s ACG GTC TCC GTC GAC CTC AC 376 п.н.
bfl-2a CGT TGA TCT GCG CAA CCA TC Pf-Bfl-2 (FAM)-CGC CCA CCG ATC AGA ACA ACC AGG CG-(RTQ1) В состав реакционных смесей входили комплементарные специфиче скому фрагменту и внутреннему контролю олигонуклеотидные зонды в кон центрации 6 пМ, меченые флуорофором FAM и гасителем флуоресценции (RTQ1, BHQ1), а также по 12 пМ праймеров, 0,2 мМ каждого дНТФ, буфер ный раствор, фермент Taq-полимераза и 3 мМ MgCl2. Для предупреждения испарения в процессе амплификации на мультициклере «Терцик» на поверх ность смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. В ПЦР с детекцией «по конечной точке» использовали 5 мкл образца, с детекцией в режиме реально го времени – 10 мкл. Программы термоциклирования реакционных смесей оптимизированы для приборов «Терцик», «Rotor-Gene 6000», «SmartCycler» (табл. 2).
Таблица 2. Программы термоциклирования для обнаружения генов 23S рРНК, orf13, fliC.
Номер «Rotor-Gene 6000» «SmartCycler» «Терцик» этапа Тем- Коли- Тем- Коли- Тем- Коли пера- Время чество пера- Время чество пера- Время чество тура, циклов тура, циклов тура, циклов С С С 23S рРНК 15 мин 95,0 15 мин 15 мин 1 95,0 1 1 95,0 5 сек 20 сек 20 сек 95,0 95,0 95, 2 5 10 15 сек 60 сек 30 сек 67,0 67,0 67,0* 1 сек 20 сек 20 сек 95,0 95,0 95, 3 40 35 15 сек 64,0* 60 сек 30 сек 67,0 64,0* orf 15 мин 15 мин 15 мин 1 95,0 1 95,0 1 95,0 5 сек 95, 20 сек 20 сек 95,0 95, 5 сек 2 64,0 5 10 40 сек 30 сек 64,0 64,0* 5 сек 67, 1 сек 95, 20 сек 95, 5 сек 3 64,0 40 35 - - 40 сек 64,0* 5 сек 67, fliC 15 мин 15 мин 15 мин 1 95,0 1 95,0 1 95,0 10 сек 95, 20 сек 20 сек 95,0 95, 10 сек 2 65,0 5 10 60 сек 45 сек 65,0 65,0* 10 сек 72, 10 сек 95, 20 сек 20 сек 95,0 95, 10 сек 3 60,0 40 35 60 сек 60,0* 60,0* 45сек 10 сек 72, Примечание: * - регистрация результатов при данной температуре.
Для сравнения эффективности тушения флуорофора зонды с идентич ной последовательностью метили гасителем BHQ1 и RTQ1. Выбор гасителей был обусловлен рекомендациями компании ЗАО «Синтол» (г. Москва). Ре зультаты исследования показали, что чувствительность ПЦР с использовани ем зонда burk23_f1p, меченного гасителем BHQ1, на амплификаторе «Тер цик» оказалась на порядок ниже чувствительности ПЦР с зондом Pf-23S-1, меченным гасителем RTQ1. Полученные данные позволили сделать выбор в пользу использования зонда, меченного гасителем RTQ1.
При проверке специфичности праймеров b23s7/b23a7, b23s7/b23a9, фланкирующих фрагмент гена 23S рРНК, выявлено, что они детектировали три штамма близкородственных буркхольдерий (B. cepacia 8235, 3181, 3189) в концентрации 1 х 107 м.к./мл. Полученные результаты свидетельствовали о наличии гомологичных нуклеотидных последовательностей данных микро организмов с ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза. Учитывая, что эти прай меры оказались неспецифичными для патогенных буркхольдерий, после дующая работа с ними не проводилась. Праймеры b23s7/b23a8, BTTS s1/BTTS-as3, bfl-1s/bfl-2a и зонды, направленные на обнаружение гена 23S рРНК, orf13, fliC, показали высокую специфичность в реакции амплифика ции (рис. 1), поэтому они были выбраны нами для разработки ПЦР с флуо ресцентной детекцией результатов, предназначенной для специфической ин дикации и ускоренной идентификации B. mallei и B. pseudomallei.
Рисунок 1. Результат ПЦР с детекцией на флуориметре «Gene» при анализе ДНК гетерологичных штаммов в концентрации 1 х 10 7 м.к./мл (праймеры b23s7/b23a8).
При анализе результатов ПЦР в режиме реального времени выявлено, что чувствительность реакции составила 1 х 102 м.к./мл. Следует отметить, что при детекции результатов «по конечной точке» на детекторе «Gene» чув ствительность реакции амплификации оказалась ниже на один-два порядка в сравнении с чувствительностью ПЦР в режиме реального времени (рис. 2).
Рисунок 2. Результат амплификации с праймерами b23s7/b23a8 и зон дом Pf-23S-1 на приборе «Rotor-Gene 6000».
1 – B.pseudomallei С141, 1 х 102 м.к./мл 2 – B.pseudomallei С141, 1 х 103 м.к./мл 3 – B.pseudomallei С141, 1 х 104 м.к./мл 4 – «-» контроль 5 – «+» контроль (B.pseudomallei 136, 1 х 108 м.к./мл) С целью оценки эффективности различных олигонуклеотидных систем и методов выделения ДНК, исследовали пробы из объектов внешней среды, продуктов питания и биологического материала, контаминированные B. mal lei и B. pseudomallei. В работе были использованы несколько технических подходов - метод R. Boom [R. Boom et al., 1990], гуанидинтиоцианат фенольная экстракция с последующей очисткой нуклеосорбцией на SiO [Г.А. Ткаченко с соавт., 2007] и набор «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Мо сква).
Показано, что при выделении ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза из проб воды и жидких продуктов питания (сок, молоко) с использованием ме тода нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата чувствительность ПЦР составила 1 х 103 м.к./мл, что совпадало с чувствительностью ПЦР при анализе чистых культур микроорганизмов. При экстракции ДНК из контами нированных патогенными буркхольдериями проб воды и сока набором «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Москва) чувствительность реакции ампли фикации составила 1 х 103 м.к./мл, а для молока – 1 х 104 м.к./мл.
Для эффективной очистки ДНК патогенных буркхольдерий из проб почвы более предпочтительным оказался метод гуанидин-фенол хлороформной депротеинизации с последующей очисткой нуклеосорбцией на SiO2, который, несмотря на многоэтапность и трудоемкость, обеспечивал получение очищенной ДНК. При его использовании чувствительность реак ции амплификации составила 1 х 104 м.к./мл.
Для селективного концентрирования клеток возбудителей сапа и ме лиоидоза из проб почвы, а также с целью очистки ДНК от примесей веществ, ингибирующих ПЦР, и, следовательно, более эффективной пробоподготовки использовали магноиммуносорбенты (МИС). После взаимодействия МИС с анализируемыми пробами, проводили их отмывку от ингибирующих приме сей и выделение ДНК методом нуклеосорбции, после чего проводили реак цию амплификации с флуоресцентной детекцией. Чувствительность реакции амплификации при этом удалось повысить с 1 х 104 м.к./мл до 1 х 102 м.к./мл.
Для оценки информативности реакции амплификации и эффективности различных способов выделения ДНК патогенных буркхольдерий исследова ли биоптаты печени, легкого, селезенки и кровь больных животных, экспе риментально зараженных B. mallei 10230 и B. pseudomallei 100. ДНК возбу дителей сапа и мелиоиоза выделяли методом нуклеосорбции в присутствии гуанитинтиоцианата с дополнительной отмывкой ацетоном, а также набором «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех»).
В результате исследований показана эффективность использования ме тода нуклеосорбции при выделении ДНК патогенных буркхольдерий из кро ви и биоптатов зараженных животных. Так, возбудители сапа и мелиоидоза обнаруживались в печени и селезенке золотистых хомячков в 100 % случаев при исследовании праймерами b23s7/b23a8 и bfl-1s/bfl-2a с детекцией резуль татов как «по конечной точке», так и в режиме реального времени. Эффек тивность ПЦР с праймерами BTTS-s1/BTTS-as3 оказалась ниже на 20%. В пробах крови ДНК микроорганизмов обнаруживали в 33 % случаев, что, ве роятно, с одной стороны связано с ингибированием ДНК-полимеразы веще ствами, циркулирующими в крови (гемоглобин, иммуноглобулины, гормо ны), а с другой – низким уровнем бактериемии, выходящей за пределы чув ствительности реакции амплификации. Обнаружение патогенных буркхоль дерий в реакции амплификации с флуоресцентной детекцией оказалось бо лее информативным в сравнении с бактериологическим методом (р0,05) (рис. 3).
% 83 72 % % % % bfl-1s/ b23s7/ BTTS-s1/ бактериология bfl-2a b23a8 BTTS-as b23s7/b23a8 BTTS-s1/BTTS-as bfl-1s/bfl-2a бактериология Рисунок 3. Выявление патогенных буркхольдерий в органах и крови экспериментально зараженных животных с использованием бактериологиче ского метода и ПЦР «по конечной точке» (выделение ДНК методом нуклео сорбции).
При сравнении двух методов выделения ДНК из биологического мате риала выявлено, что метод нуклеосорбции оказался более эффективным в сравнении с термокоагуляционным методом (набор «ДНК-экспресс») (уро вень достоверности различий – р0,05).
Таким образом, в процессе данной работы для идентификации пато генных буркхольдерий сконструированы праймеры и флуоресцентные зонды для обнаружения гена 23S рРНК, гена orf13 из кластера генов III типа секре ции (TTS1) и флагеллярного гена B. mallei и B. pseudomallei. Использование разработанных олигонуклеотидных затравок и зондов позволяло выявлять возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрации 1 х 103 м.к./мл при детекции «по конечной точке» и 1 х 102 м.к./мл - в режиме реального времени. Изуче ны различные способы подготовки проб, дана сравнительная оценка их эф фективности при исследовании объектов внешней среды и пищевых продук тов, а также показана возможность использования магноиммуносорбентов с целью концентрирования клеток исследуемых микроорганизмов на этапе подготовки проб почвы и пищевых продуктов. Показана принципиальная возможность обнаружения возбудителей патогенных буркхольдерий в про бах биологического материала с помощью ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов.
На основании представленных данных нами предложен алгоритм ген ной диагностики патогенных буркхольдерий, состоящий из двух этапов, раз деленных на индикацию и идентификацию патогена. Причем на каждом эта пе используется свой набор олигонуклеотидов.
Разработанный алгоритм интерпретации результатов позволяет на пер вом этапе проводить индикацию патогенных буркольдерий в объектах внеш ней среды и биологическом материале с помощью праймеров b23-s7/b23-a8 и олигонуклеотидного зонда Pf-23-1. Второй этап предусматривает идентифи кацию штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза в реакции амплификации с праймерами и зондами для обнаружения фрагментов генов fliC и orf13, а также подтверждение первичного положительного ответа, полученного на первом этапе.
Применение флуоресцентных систем детекции снижает риск контами нации, сокращает продолжительность и трудоемкость проведения исследо ваний, что особенно важно в полевых условиях. По этой причине разрабо танные олигонуклеотидные затравки и зонды могут быть использованы для ускоренной идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза в условиях ав тономной мобильной ПЦР-лаборатории. Программное обеспечение позволя ет быстро оценивать и документировать результаты анализов. Мобильные ПЦР-лаборатории с таким набором диагностических тест-систем могут быть использованы как в составе специализированных противоэпидемических формирований, так и в лабораториях, осуществляющих плановый территори альный эпидемиологический мониторинг.
Выводы На основе анализа геномов патогенных буркхольдерий сконст 1.
руированы олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды, являю щиеся фрагментами гена 23S pPHK, флагеллярного гена fliC и гена orf13 из кластера генов III типа секреции B. mallei и B. pseudomallei и разработаны оптимальные параметры ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов син тезируемых фрагментов ДНК патогенных буркхольдерий.
Для индикации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидо 2.
за разработаны праймеры и флуоресцентные зонды с детекцией результатов ПЦР «по конечной точке» и в режиме реального времени, которые позволяют обнаруживать патогенные буркхольдерии с чувствительностью 1 х 10 3 и 1 х 102 м.к./мл, соответственно.
Проведена апробация и подтверждена диагностическая ценность, 3.
разработанных олигонуклеотидных праймеров и зондов для конструирования амплификационных тест-систем с целью обнаружения B. mallei и B. pseudo mallei в объектах окружающей среды, а также диагностики эксперименталь ного сапа и мелиоидоза.
Установлено, что наиболее эффективным способом очистки и 4.
экстракции ДНК из проб жидких пищевых продуктов, искусственно конта минированных патогенными буркхольдериями, является сорбция ДНК на си ликагеле в присутствии гуанидинтиоцианата, а из проб почвы - метод, осно ванный на гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с по следующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции.
Показана целесообразность применения МИС с целью концен 5.
трирования патогенных буркхольдерий и очистки пробы от примесей, инги бирующих реакцию амплификации. Чувствительность ПЦР при этом соста вила 1 х 103 м.к./мл со всеми испытуемыми парами праймеров и флуорес центными зондами.
Предложен алгоритм двухэтапной генной диагностики сапа и ме 6.
лиоидоза, при котором для индикации возбудителей в нативном материале и для идентификации штаммов B. mallei и B. pseudomallei используются разные ДНК-мишени, что позволяет осуществлять подтверждение первичного поло жительного ответа о наличии в пробе ДНК патогенных буркхольдерий.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Ткаченко Г.А., Антонов В.А. Замараев В.С., Илюхин В.И., Алексеева В.В., Зинченко О.В., Использование метода ПЦР для идентификации возбу дителя мелиоидоза // Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика. Сб. науч. тр. - Астра хань, 2001. - С. 328-330.
2. Tkatchenko G.A., Antonov V.A., Zamaraev V.S., Ilyukhin V.I, Alekseeva V.V., Zinchenko O.V. Detection and identification of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei by PCR // Natural infectious diseases.
Abstract
of scientific conference. 6 December, 2001, Ulaanbaatar, Mongolia, 2001. - P. 68-70.
3. Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Замараев В.С., Илюхин В.И., Алексее ва В.В., Зинченко О.В. Идентификация патогенных буркхольдерий методом ПЦР // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-28 марта 2002, Москва, 2002. - С. 347 348.
4. Зинченко О.В., Алтухова В.В., Замараев В.С., Голосеев Ю.А., Ва сильев В.П., Пивень Н.Н. Обнаружение возбудителя мелиоидоза методом ПЦР с использованием магноиммуносорбентов / Санитарная охрана терри торий государств участников содружества независимых государств: пробле мы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в совре менных условиях // Материалы VI Межгосударственной науч.- практ. конф.
государств-участников СНГ, 13-14 сентября, 2005, Волгоград. - 2005. - С.
239-240.
5. Антонов В.А., Зинченко О.В., Лобанов А.Н., Замараев В.С., Алексеев В.В., Трофимов Д.Ю., Гончарова Е.В., Саматов Г.А. Детекция возбудителей особо опасных инфекций в условиях автономной мобильной ПЦР лаборатории / Генодиагностика инфекционных болезней // Материалы Рос сийской науч.-практ. конф., 25-27 октября, 2005, «Сосновка», Новосибирская обл., - Новосибирск. - 2005. - С. 88-89.
6. Антонов В.А., Зинченко О.В., Ткаченко Г.А., Замараев В.С., Алексе ев В.В., Трофимов Д.Ю., Гончарова Е.В. Гибридизационно-флуоресцентная ПЦР-тест-система для идентификации возбудителей сапа (Burkholderia mallei) и мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) / Генодиагностика инфекци онных болезней // Материалы Российской науч.-практ. конф., 25-27 октября, 2005, «Сосновка», Новосибирская обл., - Новосибирск. - 2005. - С. 90-91.
7. Зинченко О.В., Антонов В.А., Алтухова В.В., Замараев В.С., Трофи мов Д.Ю. Конструирование гибридизационно-флуоресцентной амплифика ционной тест-системы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза / Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины // Сбор ник тезисов к науч-практ. конф. молодых ученых - Санкт-Петербург, 2006. С. 274-275.
8. Савченко С.С., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Зинчен ко О.В., Замараев В.С. Идентификация и генетическое типирование возбуди телей сапа и мелиоидоза с использованием методов секвенирования / Чрез вычайные ситуации международного значения в общественном здравоохра нении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и сани тарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» // Материалы VII Межгосударственной науч.- практ. конф. госу дарств-участников СНГ, 3-5 октября, 2006, Оболенск. - 2006. - С. 122-123.
9. Антонов В.А., Зинченко О.В., Ткаченко Г.А., Замараев В.С., Трофи мов Д.Ю., Абрамов Д.Д. Идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией / Чрезвычай ные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная ох рана территорий государств-участников Содружества Независимых Госу дарств» // Материалы VII Межгосударственной науч.- практ. конф. госу дарств-участников СНГ, 3-5 октября, 2006, Оболенск. - 2006. - С. 176-177.
10. Зинченко О.В., Антонов В.А., Замараев В.С., Голосеев Ю.А., Ва сильев В.П., Ломова Л.В., Пивень Н.Н. Использование магноиммуносорбен тов для обнаружения возбудителя мелиоидоза в пробах почвы и молока ме тодом ПЦР / Чрезвычайные ситуации международного значения в общест венном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Груп пы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содру жества Независимых Государств» // Материалы VII Межгосударственной на уч.- практ. конф. государств-участников СНГ, 3-5 октября, 2006, Оболенск. 2006. - С. 203-204.
11. Алтухова В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Зинченко О.В., Зама раев В.С., Плеханова Н.Г., Илюхин В.И., Трофимов Д.Ю. Использование по лимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиои доза при экспериментальной инфекции // Молекулярная генетика, микробио логия и вирусология. – 2007. - №3. - С. 22 -27.
12. Antonov V.A., Alekseev V.V., Tkachenko G.A., Altukhova V.V., Zama raev V.S., Zinchenko O.V., Viktorov D.V., Ilyukhin V.I., Trofimov D.Yu. Mobile PCR Laboratory for Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei detection // The 5th World melioidosis congress, November 21-23 2007, Khon Kaen, Thail and, 2007. - P. 88.
13. Зинченко О.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Зама раев В.С., Пивень Н.Н., Голосеев Ю.А., Васильев В.П., Ломова Л.В., Алексе ев В.В. Сравнительная оценка способов выделения ДНК для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью ПЦР // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. – 2008. - № 1. – С. 55-60.
14. Антонов В.А., Илюхин В.И., Сенина Т.В., Лобойко А.Д., Ткаченко Г.А., Зинченко О.В., Мазурова И.Ю. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia // Журн. микро биол. эпидемиол. иммунобиол.- 2008. - № 4. - С. 78-82.
15. Antonov V.A., Tkachenko G.A., Altukhova V.V., Savchenko S.S., Zin chenko O.V., Viktorov D.V., Zamaraev V.S., Ilyukhin V.I., Alekseev V.V. Mole cular identification and typing of Burkholderia pseudomallei and Вurkholderia mallei: when is enough enough? // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 2008. № 102/S1. – Р. 563-568.