авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Генетический анализ биохимических особенностей штаммов yersinia pestis основного и неосновных подвидов

На правах рукописи

ОДИНОКОВ Георгий Николаевич Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов 03.02.03 – микробиология 03.02.07 – генетика

Автореферат диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук

Саратов – 2010 2

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучии человека» Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович доктор биологических наук, старший научный сотрудник Ерошенко Галина Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна доктор медицинских наук Микшис Наталья Ивановна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН»

Защита состоится «_»2010 г._часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»».

Автореферат разослан «_»2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Чума – зоонозная природно-очаговая особо опасная карантинная бактериальная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя [Черкасский, 1996]. Чума представляет реальную угрозу для населения из-за существования многочисленных природных очагов чумы, часть из которых расположена в Российской Федерации и ближнем зарубежье [Онищенко с соавт., 2004]. Высока вероятность заноса возбудителя чумы на территорию России из соседних, неблагополучных по этой болезни стран, а также в результате биотеррори стических актов. По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется более 2000 случа ев заболевания чумой, многие из которых заканчиваются летальным исходом. Боль шая вспышка легочной чумы в 2009 г. произошла в Хайнань-Тибетском автономном округе Китая, в которой тоже был зарегистрирован ряд смертельных случаев [WHO / plague sheets, 2009]. Все эти факты настоятельно требуют разработки новых, осно ванных на современных технологиях высокоэффективных методов диагностики воз будителя чумы, средств профилактики и лечения вызываемой им особо опасной бо лезни.

Используемые до настоящего времени классификации Yersinia pestis учитыва ли лишь морфологические, культуральные, биохимические и другие фенотипические признаки [Безсонова, 1928;

Борзенков, 1938;

Туманский, 1957;

Тимофеева, 1968;

Ку тырев, Проценко, 1998;

Devignat, 1951] и были не лишены недостатков, связанных с изменчивостью этих свойств. Однако достигнутые в последнее время успехи в фун даментальной генетике и молекулярной микробиологии позволяют перевести реше ние задач по систематизации возбудителя чумы на качественно новый уровень, осно ванный на использовании его молекулярно-генетических особенностей.

В соответствии с принятой в настоящее время отечественной классификацией штаммы возбудителя чумы делят на основной и 4 неосновных (кавказский, алтай ский, гиссарский и улегейский) подвида [Тимофеева, 1985;

Кутырев, Проценко, 1998]. Согласно распространенной зарубежной классификации штаммы Y. pestis на основании различий по ряду биохимических свойств (способность к ферментации глицерина, редукции нитратов, окислению аммиака) и по историко-географическому принципу [Devignat, 1951] делят на три биовара: antiqua (античный), medievalis (средневековый) и orientalis (восточный). По фенотипическим характеристикам штаммы основного подвида соответствуют трем биоварам (античному, средневеко вому и восточному), принятым в зарубежной классификации. Однако штаммы Y. pes tis, циркулирующие в природных очагах чумы в РФ и ближнем зарубежье, остаются не систематизированными по их принадлежности к определенным биоварам.

По экспрессии дифференциально-значимых биохимических признаков наибо лее активными являются штаммы античного биовара. Они ферментируют глицерин и обладают денитрифицирующей активностью. Штаммы средневекового биовара Y.

pestis не способны редуцировать нитраты, но ферментируют глицерин и арабинозу.

Штаммы восточного биовара не ферментируют глицерин, но активно редуцируют нитраты и утилизируют арабинозу.

Штаммы основного подвида, циркулирующие на территории РФ и ближнего зарубежья, как правило, высоко вирулентны и имеют высокую эпидемическую зна чимость. Они не ферментируют рамнозу и мелибиозу, не чувствительны к пестицину I, имеют высокий уровень продукции изоцитралиазы. Штаммы неосновных подвидов ферментируют рамнозу и мелибиозу, чувствительны к пестицину I, не проявляют изоцитрат-лиазной активности, избирательно вирулентны для лаборторных живот ных, эпидемически малозначимы.

Генетические причины различной экспрессии биохимических признаков, ис пользуемых при делении штаммов Y. pestis на биовары и подвиды, остаются к на стоящему моменту изученными недостаточно. Достоверно установлено лишь то, что причиной отсутствия ферментации глицерина у штаммов восточного биовара являет ся мутация в гене глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (glpD). Показано, что в этом гене у всех штаммов восточного биовара присутствует делеция размером 93 п.н. [Parhill et al., 2001;

Motin et al., 2002]. В литературе имеются лишь единичные работы по опре делению различий в структуре генов Y. pestis основного и неосновных подвидов, ко дирующих редукцию нитратов и ферментацию рамнозы [Куклева с соавт., 2008;

2009;

Anisimov et al., 2004;

Zhou et al., 2004].

Остаются не установленными причины гетерогенности штаммов чумного мик роба по питательным потребностям. Штаммы из различных природных очагов чумы отличаются по питательным потребностям, определяемым нарушениями генов про межуточного метаболизма, что может быть использовано в генетической схеме диф ференциации штаммов Y. pestis из различных природных очагов чумы.

Выявление изменений в структуре генов, лежащих в основе различной экс прессии микробиологических и биохимических признаков, послужит надежной ос новой для создания генетической схемы классификации штаммов возбудителя чумы, а также для определения основных направлений внутривидовой эволюции Y. pestis.

Цель работы. Определение генетических основ различной экспрессии биохи мических признаков, используемых для деления штаммов возбудителя чумы на под виды и биовары.

Задачи исследования:

Охарактеризовать использованные в работе штаммы Y. pestis, выделен 1.

ные в природных очагах чумы в РФ и ближнего зарубежья, по биохимическим свой ствам (редукция нитратов, продукция изоцитрат-лиазы, ферментация арабинозы и мелибиозы), лежащим в основе деления на подвиды и биовары. Установить принад лежность штаммов, циркулирующих на территории России и сопредельных стран, к определенным биоварам.

Изучить структурно-функциональную организацию генов, кодирующих 2.

дифференциальные признаки, используемые при делении на биовары, – редукцию нитратов и ферментацию арабинозы.

Выявить изменения в генах Y. pestis, детерминирующих ферментацию 3.

мелибиозы и продукцию изоцитрат-лиазы, лежащих в основе дифференциации ос новного и неосновных подвидов возбудителя чумы.

Определить питательные потребности штаммов Y. pestis кавказского 4.

подвида и установить генетические основы их ауксотрофности.

Оценить перспективность использования полученных результатов для 5.

создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов Y. pestis и ус тановления основных направлений внутривидовой эволюции этого возбудителя.

Научная новизна работы. На основании данных комплексного микробиоло гического, биохимического и генетического анализа установлено, что штаммы воз будителя чумы, циркулирующие в природных очагах РФ и ближнего зарубежья, от носятся к античному и средневековому биоварам.

Впервые показано, что причиной отсутствия нитратредуцирующей активности у части штаммов основного подвида, циркулирующих на территории РФ и ближнего зарубежья, является наличие замены единичного нуклеотида G T в позиции гена периплазматической нитратредуктазы – napA, что доказывает принадлежность этих штаммов к средневековому биовару. Отсутствие экспрессии этого признака у штаммов алтайского и гиссарского подвидов вызвано вставкой тиминового нуклео тида (+Т) в 302 позиции другого гена – ssuA, которая приводит к сдвигу рамки счи тывания и нарушению структуры кодируемого транспортного белка – SsuA, также участвующего в восстановлении нитратов.

Впервые установлено, что отсутствие ферментации арабинозы у штаммов Y.

pestis алтайского и гиссарского подвидов связано с наличием мутации в регулятор ном гене арабинозного оперона – araС, который содержит инсерцию гуанинового нуклеотида (+G) в позиции 773 от начала гена, приводящую к сдвигу рамки считыва ния и нарушению структуры регуляторного белка AraC, необходимого для инициа ции транскрипции генов арабинозного оперона.

Впервые установлена генетическая основа различной продукции изоцитрат лиазы у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, связанная с наличием вставки двух нуклеотидов (+СС) в регуляторном гене iclR в позиции 269 270, которая приводит к инактивации кодируемого им белка-репрессора ацетатного оперона IclR и является причиной конститутивного синтеза фермента изоцитрат лиазы у штаммов основного подвида. Штаммы неосновных подвидов содержат ин тактный ген iclR и не способны к конститутивному синтезу изоцитрат-лиазы.

Показано, что отсутствие ферментации мелибиозы у штаммов Y. pestis основ ного подвида обусловлено внедрением инсерционной последовательности IS285 в ген melB, кодирующий фермент галактозидпермеазу. У штаммов неосновных подви дов вставка IS285 в гене melB отсутствует.

Впервые выявлены генетические основы ауксотрофности штаммов кавказского подвида, которые связаны с внедрением инсерционных последовательностей IS100 в гены argA и aroF, вставкой 10 п.н. в ген aroG, инсерцией тиминового нуклеотида в ген thiH и делецией 13 п.н. в гене thiG.

Полученная молекулярная характеристика штаммов Y. pestis основного и неос новных подвидов по генам, кодирующим биохимические признаки, лежащие в осно ве деления на подвиды и биовары, создает основу для разработки генетической схе мы внутривидовой классификации возбудителя чумы.

По результатам работы оформлены заявки на изобретение «Способ определе ния подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы методом секвенирова ния» (№2009116913. Приоритет от 14.05.2009. Получено решение о выдаче патента) и «Способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультило кусного сиквенс – типирования (№2009146094. Приоритет от 11.12.2009).

Практическая значимость работы. По результатам работы оформлены и ут верждены методические рекомендации «Определение подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы на основе секвенирования генов rhaS и araC, контроли рующих ферментацию рамнозы и арабинозы» (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Протокол № 6 от 16 июня 2009) и «Определение подвидовой принадлеж ности штаммов Yersinia pestis методом мультилокусмного сиквенс – типирования (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Протокол № 1 от 23 февраля 2010).

В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы три штам ма: Y. pestis КМ 910 алтайского, КМ 596 гиссарского и КМ 1861 улегейского подви дов в качестве референс-штаммов этих подвидов.

Полученные в ходе выполнения исследования данные по генетической органи зации штаммов Y. pestis используются при чтении лекций по предмету «Генетика воз будителя чумы» на курсах специализации и повышения квалификации при РосНИП ЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы возбудителя чумы основного подвида, циркулирующие в природных очагах РФ и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам, о чем свидетельствуют данные комплексного анализа микробиологических, биохими ческих и генетических свойств этих штаммов.

2. В основе разного проявления биохимических признаков, используемых при де лении штаммов Y. pestis на подвиды и биовары, лежат различные типы мутаций в ге нах, кодирующих эти признаки. Отсутствие способности к редукции нитратов у штаммов основного подвида средневекового биовара связано с наличием нонсенс мутации (G T) в гене napA периплазматической нитратредуктазы, а у штаммов ал тайского и гиссарского подвидов – с инсерцией единичного нуклеотида в ген ssuA транспортного периплазматического белка SsuA. Отсутствие ферментации арабинозы у штаммов алтайского и гиссарского подвидов обусловлено вставкой гуанинового нуклеотида в последовательность гена araC.

3. Разная биохимическая активность штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы по ряду дифференциальных признаков вызвана редукцией коди рующих их генов у основного подвида и их интактностью у неосновных подвидов.

Отсутствие ферментации мелибиозы штаммами основного подвида обусловлено вне дрением IS285 в ген melB галактозидпермеазы, а конститутивный синтез изоцитрат лиазы у штаммов этого подвида – вставкой двух нуклеотидов (СС) в последователь ность регуляторного гена iclR. Штаммы неосновных подвидов содержат интактные гены melB и iclR.

4. Причиной множественных питательных потребностей штаммов Y. pestis кавказ ского подвида является инактивация у них ряда генов биосинтеза аминокислот и ви таминов. Зависимость штаммов этого подвида по аргинину вызвана инсерцией IS в ген argA, по фенилаланину – вставкой 10 п.н. в ген aroG, по тирозину – внедрением IS100 в ген aroF, по тиамину (B1) делецией 13 п.н. - в ген thiG и инсерцией единич ного нуклеотида в thiH. На основе всего комплекса выявленных мутаций для штам мов кавказского и других подвидов, а также биоваров возбудителя чумы определены характерные генотипы, которые могут быть использованы при создании генетической схемы внутривидовой классификации Y. pestis.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на IХ Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфек ционными болезнями на территории государств – участников содружества независи мых государств», Волгоград, 2008;

VI Международной конференции «Молекулярная диагностика и биобезопасность», М., 2009;

научно-практической школы конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные техноло гии обеспечения биологической безопасности», 25 – 27 мая 2010 г.;

на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов 2008 - 2010 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 в периодических изданиях из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России…».

Структура и объм диссертации. Диссертация представлена на 157 страни цах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 11 таб лицами и 34 рисунками. Библиографический указатель содержит 203 отечественных и зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы В работе использовано 111 штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, из них штамм возбудителя чумы основного и 50 штаммов неосновных подвидов, выделен ных на территории РФ, ближнего и дальнего зарубежья. Исследовано также 10 штам мов Y. pseudotuberculosis различного происхождения. Изучение культурально морфологических и биохимических свойств штаммов проводили с помощью тради ционно используемых методов [Практическое руководство по лабораторной диагно стики опасных инфекционных болезней, 2009 г.]. Выделение ДНК штаммов Y. pestis осуществляли стандартным методом в соответствии с методикой, приведенной в М.У.

1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I – IV групп патогенности». Анализ полученных в ПЦР продуктов проводили в 0,8 – 2 % агарозном геле в соответствии с руководством Т. Маниатиса с соавт. [1984]. Опреде ление нуклеотидных последовательностей генов осуществляли на генетическом ана лизаторе модели “CEQ 8000” (Beckman Coulter) по методу F. Sanger [1977]. Сравни тельный анализ геномов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis и метаболических путей био синтеза факторов роста проводили с помощью алгоритма BLAST базы данных NCBI GenBank и KEGG Metabolic Pathways. Филогенетический анализ штаммов выполняли на основе программ Mega 4.0, PHYLIP и SplitsTree4 и дистанционно-матричных ме тодов: UPGMA, FITCH, Kitch, Neighbor-Joining, Minimum Evolution.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Анализ микробиологических и биохимических свойств штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов чумы Все использованные в работе штаммы Y. pestis были исследованы по их биохи мической активности: способности к редукции нитратов, ферментации глицерина, арабинозы, мелибиозы, рамнозы, продукции изацитрат-лиазы – признакам, исполь зуемым при делении на подвиды и биовары. Как было установлено, все изученные штаммы основного подвида - Y. pestis ssp. pestis не ферментировали рамнозу и мели биозу, но продуцировали изоцитрат-лиазу. В отличие от них все штаммы Y. pestis не основных подвидов ферментировали рамнозу и мелибиозу, но не продуцировали изо цитрат-лиазу. Полученные сведения коррелировали с литературными данными о био химических особенностях штаммов Y. pestis, используемых для дифференциации ос новного и неосновных подвидов возбудителя чумы.

При изучении биохимических признаков, применяемых при делении штаммов Y. pestis на биовары, - редукции нитратов, ферментации арабинозы и глицерина была установлена гетерогенность по этим свойствам у штаммов основного и неосновных подвидов. Часть штаммов основного подвида, выделенных на территории РФ и ближнего зарубежья, не редуцировала нитраты, что свидетельствовало об их принад лежности к средневековому биовару. Штаммы неосновных подвидов – алтайского, гиссарского и улегейского также не редуцировали нитраты, в то время как кавказские штаммы были положительны по этому признаку.

По второму дифференциальному признаку – ферментации арабинозы, все ис следованные в работе штаммы Y. pestis основного, кавказского и улегейского подви дов были однородными и утилизировали этот моносахарид. Штаммы алтайского и гиссарского подвидов не ферментировали арабинозу, и генетические основы различ ной экспрессии этого признака оставались не известными.

Отсутствие способности ферментировать глицерин (еще один дифференциаль ный биохимический признак) является характерным признаком штаммов биовара orientalis. Однако в РФ и странах ближнего зарубежья не выявлено очагов с постоян ной циркуляцией таких штаммов. В литературе имеются лишь отдельные сообщения о выделении на этих территориях единичных глицериннегативных штаммов Y. pestis [Сагымбек с соавт., 2003;

Онищенко с соавт., 2004].

Характерной генетической меткой штаммов биовара orientalis является делеция размером 93 п.н. в гене glpD – глицерол-3-фосфатдегидрогеназы [Parhill et al., 2001].

Нами установлено, что все штаммы Y. pestis из природных очагов чумы РФ и ближ него зарубежья не содержали в гене glpD характерной для восточного биовара деле ции размером 93 п.н., что подтверждает отсутствие среди них штаммов биовара orien talis (рисунок 1). Такие штаммы выявлялись лишь среди изолятов, полученных в странах дальнего зарубежья.

Рисунок 1. ПЦР анализ штаммов Y. pestis с праймерами на ген glpD : 1 – 16 – штаммы основного подвида из природных очагов чумы РФ и ближнего зарубежья;

17 – 19 – штаммы восточного биовара из дальнего зарубежья;

20 – отрицательный контроль.

Стрелками указаны размеры образуемых амплификатов.

Таким образом, изученные нами штаммы Y. pestis, выделенные на территории РФ и ближнего зарубежья, по комплексу биохимических признаков (ферментация глицерина, редукция нитратов) принадлежат к античному и средневековому биова рам, что коррелирует с общепринятым мнением о приуроченности штаммов этих биоваров к континентальным очагам чумы, а штаммов восточного биовара – к очагам крысиного типа, расположенным вдоль океанических побережий.

Большое внимание в ходе выполнения этой работы было уделено исследова нию штаммов возбудителя чумы кавказского подвида, поскольку, по мнению ряда ис следователей [Бобров, Филиппов, 1997], они являются самыми древними из сохра нившихся штаммов возбудителя чумы и наиболее близки к предшественнику – Y.

pseudotuberculosis. По биохимическим свойствам штаммы этого подвида оказались наиболее активными среди всех подвидов Y. pestis. Они обладали нитратредуцирую щей активностью, ферментировали глицерин, арабинозу, рамнозу, мелибиозу. По скольку в литературе имелись противоречивые данные по питательным потребностям штаммов этого подвида [Мартиневский, 1969;

Апарин, Голубинский, 1989], нами проведены исследования по уточнению питательных потребностей штаммов кавказ ского подвида.

Установлено, что все изученные штаммы кавказского подвида вели себя доста точно единообразно. У них выявлена потребность в аминокислотах – фенилаланине, тирозине, аргинине и витамине B1 (тиамине). У штаммов из Восточно-Кавказского высокогорного очага чумы кроме потребностей в этих факторах роста также обнару жена зависимость по лейцину, в то время как штаммы кавказского подвида из Лени наканского, Присеванского, Зангезуро-Карабахского, Приараксинского природных очагов такой зависимости не имели.

Поскольку причины ауксотрофности штаммов кавказского подвида по амино кислотам и витамину B1 (тиамину) не известны, нами в дальнейшем было проведено исследование генетических основ ауксотрофности штаммов этого подвида.

2. Определение структурно-функциональной организации генов, кодирующих биохимические признаки, используемые для дифференциации биоваров возбу дителя чумы Отсутствие способности редуцировать нитраты является характерным призна ком штаммов Y. pestis средневекового биовара, который отличает их от штаммов ан тичного и восточного биоваров. Штаммы неосновных подвидов чумного микроба, циркулирующие в природных очагах на территории РФ и стран ближнего зарубежья, также различаются по их денитрифицирующей активности. Однако генетические причины различного проявления у них этого признака остаются не установленными.

Нами на основе сравнительного компьютерного анализа геномов штаммов Y.

pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, установ лено, что гены, участвующие в редукции нитратов объединены в nap оперон, который имеет у них идентичную структуру и состоит из шести генов: napA-F и napP (рисунок 2).

Были исследованы и другие гены, также принимающие участие в восстановле нии нитратов, – narP и ssuA, кодирующие соответственно регуляторный белок NarP и транспортный белок SsuA Рисунок 2. Структура nap оперона у штаммов Y. pestis В результате проведенного компьютерного анализа генов nap оперона было выявлено наличие единичных нуклеотидных замен во всех генах этого оперона, но наиболее значимой оказалась замена нуклеотида G Т в позиции 613 от начала гена napA – периплазматической нитратредуктазы, которая была выявлена ранее у Y. pestis KIM и других штаммов биовара medievalis [Deng et al., 2002]. По данным компьютер ного анализа с использованием программы MEGA 4.0 установлено, что эта мутация приводит к смене триплета GAA ТАА, который является стоп-кодоном и служит причиной преждевременной терминации трансляции полипептидной цепи (после 204 го аминокислотного остатка) молекулы этого фермента.

Другая значимая для проявления денитрифицирующей активности мутация вы явлена нами в хромосомном гене ssuA (размер гена – 1123 п.н.), который содержал вставку тиминового нуклеотида в 302 позиции у штамма 91001 биовара microtus (NCBI GenBank). По данным компьютерного анализа с использованием программы Mega 4.0 эта мутация приводит к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры белка SsuA.

На вариабельные участки генов napA и ssuA были сконструированы праймеры, с помощью которых проводили амплификацию фрагментов этих генов в ПЦР и, в дальнейшем, определяли их нуклеотидную последовательность. Для выявления при чин различной денитрифицирующей активности у штаммов Y. pestis нами был изуче но 90 штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов чумы, а также 10 штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения. В результате проведенного анализа установлено, что выделенные в РФ и ближнем зару бежье штаммы основного подвида, неспособные редуцировать нитраты, имели еди ничную нуклеотидную замену G Т в позиции 613, характерную для штаммов био вара medievalis, которая приводит к смене кодона (GAA ТАА) и преждевременной терминации трансляции полипептидной цепи молекулы периплазматической нитрат редуктазы. Наличие характерной нуклеотидной замены в позиции 613, являющейся генетической меткой биовара medievalis, у части изученных штаммов основного под вида, наряду с отсутствием у них денитрифицирующей активности служит основани ем для отнесения их к средневековому биовару.

В тоже время нами не было выявлено наличие этой мутации в гене napA у штаммов алтайского и гиссарского подвидов, также не способных редуцировать нит раты. Было установлено, что причиной отсутствия денитрифицирующей активности у этих штаммов является другая мутация, вызванная вставкой тиминового нуклеотида в 302 позиции гена ssuA транспортного периплазматического белка SsuA. Эта мутация обнаружена не только у штаммов алтайского и гиссарского подвидов, но и у штамма 91001 биовара microtus, который также не способен редуцировать нитраты.

Другим важным биохимическим признаком, используемым для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы, является ферментация арабинозы. Все штаммы основного, кавказского и улегейского подвидов способны утилизировать этот углевод, в то время как штаммы алтайского и гиссарского подвидов, а также биовара microtus не способны его использовать. Однако генетические причины отсут ствия проявления этого признака у штаммов алтайского и гиссарского подвидов воз будителя чумы остаются не установленными.

Нами на основе сравнительного компьютерного анализа геномов Y. pestis и Y.

pseudotuberculosis (NCBI GenBank) установлено, что у всех штаммов чумного и псев дотуберкулезного микробов арабинозный оперон имеет идентичную структуру и со стоит из шести генов. В него входят пять структурных - araA, araB, araH, araF, araG, и один регуляторный ген araC (рисунок 3).

Рисунок 3. Структура арабинозного оперона Y. pestis В результате сравнительного компьютерного анализа генов арабинозного оперона, а также гена araD у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank), было установлено наличие значимой мутации в регуляторном гене araC, который содержал делецию в 112 п.н. (26 - 137) и инсерцию гуанина в позиции 773 у штамма 91001 биовара microtus, как это ранее было установлено D. Zhou et al. [2004].

На вариабельные области гена araC были сконструированы две перекрывающиеся пары праймеров, фланкирующие полную нуклеотидную последовательность этого гена, и в ПЦР получены его амплификаты.

Секвенирование полной последовательности гена araC, проведенное нами у природных штаммов Y. pestis и 10 штаммов Y. pseudotuberculosis, установило, что штаммы только алтайского и гиссарского подвидов имели мутацию в гене araC, ко торая была связана со вставкой гуанинового нуклеотида в 773 позиции, в то время как штаммы других подвидов и штаммы псевдотуберкулезного микроба имели интакт ную структуру этого гена. Наличия делеции размером 112 п.н., характерной для штаммов биовара microtus [Zhou et al., 2002], у изученных штаммов Y. pestis, выде ленных на территории РФ и ближнего зарубежья, выявлено не было.

Таким образом, нами впервые установлено, что отсутствие способности утили зировать арабинозу у штаммов алтайского и гиссарского подвидов связано с инсер цией единичного нуклеотида в гене araC.

3. Выявление изменений в генах, кодирующих дифференциальные признаки, используемые при делении возбудителя чумы на основной и неосновные подви ды Штаммы возбудителя чумы неосновных подвидов, также как и штаммы Y.

pseudotuberculosis обладают ферментативной активностью в отношении дисахарида мелибиозы. Способность утилизировать мелибиозу обнаружена и у штаммов Y. pestis биовара microtus [Zhou et al., 2004]. В отличие от них все высоковирулентные штам мы Y. pestis основного подвида не ферментируют мелибиозу. Генетические причины отсутствия у них этой биохимической активности остаются неизвестными.

На основе сравнительного компьютерного анализа геномов штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, нами установле но, что мелибиозный оперон возбудителей чумы и псевдотуберкулеза имеет идентич ную структуру и представлен тремя генами – melA (YP_1469), melB (YP_1470) и melR (YP_1471) (рисунок 4).

В результате анализа структуры этих генов было установлено, присутствие важной для проявления изучаемого свойства мутации в структурном Рисунок 4. Структура мелибиозного оперона Y. pestis Pestoides F гене melB, кодирующем транспортный белок MelB – галактозидпермеазу. В нуклео тидной последовательности этого гена у штаммов основного подвида – CO92, KIM, Antiqua и Nepal516 (NCBI GenBank), обнаружена вставка инсерционной последова тельности – IS285 после 73 нуклеотида. В отличие от них у штамма Y. pestis Pestoides F (кавказскиий подвид) и у всех штаммов Y. pseudotuberculosis обнаружена интактная структура гена melB.

На вариабельные области гена melB была сконструирована пара праймеров, фланкирующая область внедрения IS285, и в ПЦР проведена амплификация фрагмен та этого гена. У всех использованных в работе штаммов Y. pestis основного подвида (51 штамм) амплификаты, полученные с помощью этой пары праймеров, имели раз мер 1648 п.н., что свидетельствовало о внедрении IS285 (1324 п.н.) в последователь ность гена melB у этих штаммов и коррелировало с отсутствием у них ферментатив ной активности в отношении мелибиозы. В отличие от основного подвида у штаммов неосновных в ПЦР выявляли амплификаты меньшего размера (325 п.н.), что свиде тельствовало об интактной структуре гена melB и соответствовало их способности ферментировать этот дисахарид (рисунок 5).

Таким образом, нами установлено, что причиной отсутствия способности штаммов Y. pestis основного подвида к ферментации мелибиозы является нарушение структуры гена melB, обусловленное вставкой IS285. Штаммы неосновных подвидов содержат интактный ген melB.

Для дифференциации штаммов основного подвида возбудителя чумы от штам мов неосновных подвидов и псевдотуберкулезного микроба используется также спо собность первых к конститутивному синтезу фермента изоцитрат-лиазы.

Рисунок 5. ПЦР-анализ гена melB у штаммов возбудителя: 1 – 3 – кавказский подвид;

4 – 5 гиссарский подвид;

6 – 7 – алтайский подвид;

8 – улегейский подвид;

9 – 17 – основной подвид;

18 – отрицательный контроль. Слева представлены маркеры моле кулярных масс X174/HincII.

Показано, что штаммы Y. pseudotuberculosis и Y. pestis неосновных подвидов, в отличие от штаммов основного подвида, не способны к конститутивному синтезу этого фермента. Однако генетические причины различий в экспрессии этого признака у штаммов основного и неосновных подвидов к настоящему моменту не известны.

По данным проведенного нами анализа геномов возбудителя чумы и псевдоту беркулеза у штаммов, представленных в базе данных NCBI GenBank, установлено, что структура ацетатного оперона у всех штаммов возбудителя чумы идентична и включает три структурных гена – aceA, aceB, aceK, которые находятся под негатив ной регуляцией гена iclR (рисунок 6).

Рисунок 6. Структура ацетатного оперона у штаммов Y. pestis Сравнительный компьютерный анализ генов ацетатного оперона показал нали чие значимой для фенотипического проявления изучаемого свойства мутации в регу ляторном гене iclR (843 п.н.). Установлено, что у штаммов Y. pestis CO92, KIM, Anti qua, Nepal516 (основного подвида) ген iclR инактивирован вставкой двух нуклеоти дов (+СС) в позиции 269-270 от начала гена, и его размер составлял у этих штаммов 845 п.н. Выявленная нами инсерция (+СС) в 269-270 позиции гена iclR приводит к преждевременной терминации трансляции полипептидной цепи белка-репрессора IclR, что влечет за собой конститутивную экспрессию генов ацетатного оперона и, как следствие, высокий уровень синтеза изоцитрат-лиазы.

На вариабельную область гена iclR была сконструирована пара праймеров, с помощью которой была изучена структура этого гена у 95 природных штаммов Y.

pestis основного и неосновных подвидов и у 10 штаммов возбудителя псевдотуберку леза. Было установлено, что нуклеотидные последовательности фрагментов гена iclR у всех штаммов Y. pestis кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов идентичны, составляют 370 п.н. и полностью соответствуют аналогичной последова тельности штаммов псевдотуберкулезного микроба, а также штамма Pestoides F (NCBI GenBank), что свидетельствует об интактности секвенированного участка гена iclR и коррелирует с низкой активностью у них фермента изоцитрат-лиазы. Иная кар тина обнаружена у штаммов основного подвида возбудителя чумы. В гене iclR у них выявлена инсерция – вставка двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269 – 270, которая приводит к сдвигу рамки считывания регуляторного гена iclR и, как следствие, к кон ститутивному синтезу фермента изоцитрат-лиазы у штаммов Y. pestis основного под вида.

4. Установление генетических основ ауксотрофности штаммов Y. pestis кавказ ского подвида Как было показано нами выше, все штаммы кавказского подвида нуждаются для своего роста в аминокислотах: аргинине, тирозине, фенилалание и витамине B1 – тиамине. Однако генетические причины ауксотрофности штаммов Y. pestis ssp.caucasica до сих пор не изучались.

На первом этапе нами был проведен компьютерный анализ пути биосинтеза ар гинина, тирозина, фенилалана и витамина B1 (тиамина) у штаммов Y. pestis и Y. pseu dotuberculosis, представленных в базе данных KEGG Metabolic Pathways, и определе ны ключевые ферменты биосинтеза этих факторов роста и кодирующие их гены. С помощью алгоритма BLAST, проведен сравнительный анализ нуклеотидных последо вательностей генов биосинтеза аргинина, тирозина, фенилалана и витамина B1 (тиа мина) у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank). По результатам компьютерного анализа значимой для проявления зависимости по аргинину оказа лась мутация, обнаруженная нами у штамма Pestoides F в структурном гене N ацетилглутаматсинтазы – argA, которая представляла собой вставку инсерционной последовательности IS100 после 196 нуклеотида от начала гена.

В ПЦР-анализе с использованием пары праймеров, фланкирующих внедрение IS100, было установлено, что размер образуемого фрагмента гена argA у всех исполь зованных в работе штаммов возбудителя чумы основного, алтайского и улегейского подвидов, а также псевдотуберкулеза составлял 215 п.н., что соответствовало интакт ной структуре гена. Фрагменты гена argA у штаммов Y. pestis кавказского подвида имели большую молекулярную массу (2143 п.н.), обусловленную наличием вставки IS100, приводящей к инактивации гена.

Анализ генов, участвующих в биосинтезе ароматических аминокислот, пока зал, что ген aroG (1053 п.н.), кодирующий изофермент ДАГФС-[Phe] (3-дезокси-D арабиногептулозонат-7-фосфат-синтаза), у штамма Pestoides F инактивирован встав кой 10 нуклеотидов (в позиции 820 – 829), приводящей к сдвигу рамки считывания и нарушению синтеза фенилаланина.

При секвенировании фрагмента aroG у 95 природных штаммов основного и не основных подвидов было установлено, что у штаммов чумного микроба основного, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов этот ген имеет интактную структуру и кодирует функционально активный белок ДАГФС-[Phe]. В отличие от них у штам мов кавказского подвида Y. pestis в гене aroG обнаружена инсерция 10 п.н. в позиции 820 – 829, приводящая к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры фермента.

Наличие этой мутации у всех штаммов кавказского подвида коррелировало с отсутст вием у них способности синтезировать фенилаланин.

Другой структурный ген - aroF (1071 п.н.), кодирующий изофермент ДАГФС [Tyr], у штамма Pestoides F инактивирован внедрением инсерционной последователь ности IS100 после 888 нуклеотида от начала гена, что вызывает потерю способности синтезировать тирозин. В ПЦР-анализе у штаммов основного, алтайского, гиссарско го и улегейского подвидов образовывались амплификаты гена aroF размером 563 п.н., что соответсвовало интактной структуре гена. У штаммов кавказского подвида спе цифический амплификат гена aroF в ПЦР не образовывался, что свидетельствовало об утрате его фрагмента после внедрения инсерционной последовательности IS100 и коррелировало с ауксотрофностью по тирозину Структурный анализ генов метаболического пути биосинтеза витамина В (тиамина) показал наличие значимых мутации в генах, кодирующих фермент тиазол синтазу – thiG и thiH, которые инактивированы у штамма Pestoides F делецией 13 п.н.

в позиции 384 – 396 и инсерцией тиминового нуклеотида (+Т) в позиции 552.

Проведенное нами секвенирование фрагментов thiG и thiH у природных штам мов Y. pestis выявило интактную структуру этих генов у штаммов основного, алтай ского, гиссарского и улегейского подвидов, что коррелировало с их способностью синтезировать витамин В1. В отличие от других подвидов у штаммов кавказского подвида обнаружена инсерция тиминового нуклеотида в 552 позиции гена thiH и де леция 13 п.н. в позиции 384 – 396 гена thiG, что совпадало с отсутствием у них спо собности синтезировать тиамин.

Таким образом, нами впервые определены генетические основы ауксотрофно сти штаммов Y. pestis кавказского подвида. Установлено, что ауксотрофность по ар гинину обусловлена внедрением IS100 в ген argA, по фенилаланину – вставкой нуклеотидов в aroG, по тирозину – инсерцией IS100 в aroF, по витамину B1 – деле цией в 13 п.н в thiG и инсерцией тиминового нуклеотида в thiH. Такие мутации не встречаются у штаммов Y. pestis других подвидов (основного, алтайского, гиссарско го и улегейского) и поэтому могут быть использованы как характерные генетические метки кавказских штаммов.

5. Оценка перспективности использования полученных данных для создания ге нетической схемы внутривидовой классификации возбудителя чумы В результате выполненных исследований нами были установлены генетиче ские основы различной экспрессии биохимических признаков, используемых при де лении штаммов Y. pestis на подвиды и биовары. Выявленная в ходе выполнения этой работы вариабельность генов napA, ssuА, araC, melB, iclR, argA, aroH, aroF, thiH и thiG, наряду с ранее установленной вариабельностью гена glpD [Parhill et al., 2001;

Motin et al., 2002], а также вариабельностью регуляторного гена rhaS рамнозного опе рона [Куклева с соавт., 2008] может быть положена в основу генетической схемы классификации штаммов возбудителя чумы на биовары и подвиды. На основе сравни тельного анализа последовательностей этих генов нами определены характерные ге нетические особенности основного (античный, средневековый, восточный биовары) и неосновных подвидов Y. pestis (таблица). Вариабельность нуклеотидных последова тельностей генов, кодирующих дифференциальные биохимические признаки, а также биосинтез различных факторов роста была использована нами для определения эво люционных связей штаммов Y. pestis и построения филогенетических деревьев с по мощью компьютерных программ Mega 4.0, PHYLIP, SplitsТree 4 с помощью дистан ционно-матричных методов: UPGMA, взвешенных средних квадратов Фитча Маргулиса, Kitch, Neighbor-Joining.

Таблица. Генетические особенности штаммов Y. pestis основного и неосновных под видов из природных очагов РФ и ближнего зарубежья.

Ген, melB glpD, iclR, позиция инсерция napA, araC, ssuA, делеция вставка Подвид, IS285 по 613 773 19 - 111 269 - Биовар сле Основной п/в античный б/в G T - + + C средневековый б\в T T - + + C Кавказский п/в G T - - - C Алтайский п/в G G - - - T Гиссарский п/в G G - - - T Улегейский п/в G T - - - C Как следует из рисунка 7, применение выбранных ДНК-мишеней позволяет в полной мере проводить дифференциацию штаммов возбудителей чумы и псевдоту беркулеза, а также внутривидовое деление штаммов Y. pestis не только на биовары и на основной и неосновные подвиды, но и на отдельные подвиды этого возбудителя.

Анализ филогенетических данных подтверждает высказанное ранее предполо жение о том, что наиболее древней ветвью эволюции чумного микроба являются штаммы кавказского подвида, обладающего наибольшим генетическим сходством с предшественником – псевдотуберкулезным микробом (рисунок 8).

Другие неосновные подвиды – алтайский, гиссарский и улегейский филогене тически близки друг другу и составляют еще одну древнюю ветвь эволюции Y. pestis.

Полученные нами данные указывают на то, что штаммы microtus, которые недавно китайские исследователи [Zhou et al., 2004] предложили выделить в отдельный био вар, принадлежат к группе штаммов алтайского и гиссарского подвидов и являются их разновидностью.

После отделения от общего ствола кавказского подвида, а затем группы уле гейско-алтайско-гиссарского подвидов дальнейшая эволюция вида Y. pestis сопрово ждалась накоплением мутаций в генах жизнеобеспечения (связанным с усилением паразитизма, патогенности и вирулентности возбудителя) и привела к формированию трех биоваров основного подвида: античного, средневекового и восточного.

А Б Рисунок 7. Дендрограммы (программа Mega 4,0, методы: A - UPGMA и Б -Neighbor Joining) штаммов Y. pestis основного (античного, средневекового, восточного биова ров) и неосновных (кавказского, алтайского, гиссарского, улегейского) подвидов, а также штаммов Y. pseudotuberculosis.

Рисунок 8. Схема внутривидовой эволюции Y. pestis Проведенные в этой работы исследования составляют основу для разработки молекулярной систематики возбудителя чумы, целью которого является создание полной внутривидовой таксономии Y. pestis на основе вариабельности генов диффе ренциально-значимых микробиологических и биохимических признаков чумного микроба.

ВЫВОДЫ 1. На основании проведенного комплексного анализа биохимических и генетиче ских свойств природных штаммов Y. pestis из различных природных очагов чумы ус тановлено, что штаммы основного подвида, циркулирующие на территории РФ и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам.

2. Причиной отсутствия экспрессии дифференциального биохимического призна ка – редукции нитратов у штаммов Y. pestis основного подвида, выделенных в при родных очагах чумы в России и ближнего зарубежья, является наличие мутации – замены единичного нуклеотида в гене napA периплазматической нитратредуктазы, а у штаммов алтайского и гиссарского подвидов – инсерции единичного нуклеотида в гене ssuА периплазматического транспортного белка.

3. Впервые установлены генетические основы различной экспрессии признаков ферментации мелибиозы и продукции изоцитрат-лиазы у штаммов основного и неос новных подвидов чумного микроба. Показано, что отсутствие способности штаммов основного подвида ферментировать дисахарид мелибиозу обусловлено инсерцией IS285 в последовательность структурного гена melB, кодирующего галактозидпер меазу. Установлено, что конститутивный синтез изоцитрат-лиазы, характерный для основного подвида чумного микроба, обусловлен вставкой двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269 – 270 гена -репрессора iclR.

4. Причиной арабинозонегативности штаммов Y. pestis алтайского и гиссарского подвидов является мутация в регуляторном гене арабинозного оперона – araC, кото рая вызвана вставкой единичного гуанинового нуклеотида в 773 позиции этого гена.

5. Впервые определены генетические основы ауксотрофности штаммов Y. pestis кавказского подвида. Установлено, что ауксотрофность по аргинину обусловлена внедрением IS100 в ген argA, по фенилаланину – вставкой 10 р.н. в aroG, по тирози ну – инсерцией IS100 в aro F, по витамину B1 – делецией 13 п.н в thiG и инсерцией тимина в thiH.

6. Определены характерные генотипы основного (античного, средневекового, восточного биоваров) и неосновных подвидов возбудителя чумы, использование ко торых позволяет проводить внутривидовую дифференциацию Y. pestis. Показана пер спективность использования полученных результатов для создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов Y. pestis.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Куклев В.Е., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Одино ков Г.Н., Кутырев В.В. Сравнение полной нуклеотидной последовательности гена rhaS у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов // Проблемы особо опасных инф. – 2008. – Вып. 3 (97). – С. 38 – 42.

2. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Ку тырев В.В. Структурно-функциональный анализ генов nap оперона у Yersinia pestis разных подвидов // Проблемы особо опасных инф. – 2008. – Вып. 4 (98). – С. 12 – 16.

3. Ерошенко Г.А., Куклева Л.М., Видяева Н.А., Одиноков Г.Н., Шавина Н.Ю., Ку тырев В.В. Генетические особенности неосновных подвидов возбудителя чумы // Со временные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников содружества независимых госу дарств. Материалы IХ Межгосударственной научно-практической конференции го сударств-участников СНГ. – Волгоград, 2008. – С. 71 – 73.

4. Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Краснов Я.М., Гу сева Н.М., Кутырев В.В. Структурно-функциональный анализ гена araC у штаммов Yersinia pestis различного происхождения // Молекул. генетика, микробиол. и виру сол. – 2009. – №3. – С. 36 – 40.

5. Куклева Л.М., Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов на основе вариабельности генов rhaS и araC // Сборник материалов VI Международной конференции «Молеку лярная диагностика и биобезопасность». М., 2009. – С. 124.

6. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Вариабельные локусы генов napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB как эффективные ДНК-мишени для генотипирования штаммов Yersinia pestis // Про блемы особо опасных инф. – 2010. – Вып. 2 (104). – С. 57 – 59.

7. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А. Генетические особенности биохимической дифференциации штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов // Мат.

науч.- практ. шк.- конф. молодых ученых и специалистов Фед. службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», 25 – 27 мая 2010 г., С. 289 – 291.

Подписано к печати 11.10. Формат 60 х 84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 410005, г. Саратов, ул. Университетская,

 




 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.