Анализ генов 12srrna, trnaser(ucn), myo7a и ush2a у пациентов с наследственными формами нарушения зрения и слуха
На правах рукописи
ТАЗЕТДИНОВ АНДРЕЙ МАУЛЕТЗЯНОВИЧ АНАЛИЗ ГЕНОВ 12SrRNA, tRNASer(UCN), MYO7A И USH2A У ПАЦИЕНТОВ С НАСЛЕДСТВЕННЫМИ ФОРМАМИ НАРУШЕНИЯ ЗРЕНИЯ И СЛУХА 03.00.15 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа – 2008 2
Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук доктор биологических наук, профессор
Научный консультант:
Хуснутдинова Эльза Камилевна доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Чемерис Алексей Викторович Институт биохимии и генетики УНЦ РАН доктор биологических наук, Голденкова-Павлова Ирина Васильевна Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Медико-генетический научный центр,
Ведущая организация:
РАМН, г. Москва
Защита состоится «_» декабря 2008 г. в часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г.
Уфа, пр. Октября, д.71.
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН и на сайте Института биохимии и генетики: http:www.anrb.ru/molgen/dissov.html
Автореферат разослан «_» ноября 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Бикбулатова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Нарушения зрения и слуха относятся к частым заболеваниям органов чувств, нередко приводящих к инвалидизации, и осложняющих адаптацию человека в обществе. Данные о распространенности врожденных форм нарушения зрения и слуха, а также их сочетанных форм, в различных странах неоднозначны и сильно варьируют. Общепринято, что распространенность наследственных нарушений слуха составляет - 100: населения, зрения- 20-28:105, а сочетанных дефектов зрения и слуха- 6: [www.genetests.org]. По данным ВОЗ, около 13-20 млн. людей в России имеют различные формы тугоухости и глухоты [Гинтер с соавт., 2002;
Зинченко, 2007].
Считается, что 50-60% всех случаев врожденной глухоты имеет наследственную этиологию. Около 75% всех случаев наследственной несиндромальной глухоты приходится на аутосомно-рецессивные формы, 10-15%- на аутосомно доминантные, и несколько процентов - на сцепленную с Х-хромосомой и митохондриальную формы потери слуха [Morton et al., 2006]. Однако, в последнее время, предполагается, что вклад мутаций генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК, ассоциированных, как с врожденной, так и с острой нейросенсорной тугоухостью/глухотой (ОНТ), инициированной приемом аминогликозидов, возможно, более высокий, чем оценивалось ранее [Jacobs et al., 2005]. Исследования последних лет показали, что митохондриальные мутации составляют, по крайней мере, 1% случаев доречевой потери слуха и 5% случаев послеречевой несиндромальной глухоты во многих популяциях Европы и Азии, занимая второе место после гена GJB2 [Jacobs et al., 2005].
В связи с особой актуальностью и значимостью проблемы ОНТ, отсутствия ее ранней диагностики, системы профилактических мероприятий на фоне частой аминогликозидной терапии, и отсутствия точных данных о распространенности различных митохондриальных дефектов у больных с потерей слуха из различных этнических групп России, актуальным является изучение частот и спектра мутаций генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК для оценки риска возникновения нейросенсорной глухоты в семьях с отягощенным наследственным анамнезом, а также разработки схемы дородовой ДНК диагностики у плода.
Среди 400 известных синдромов, сочетающихся с патологией слуха, одной из наиболее распространенных является синдром Ушера (СУ). СУ- это аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся клинической и генетической гетерогенностью, при различных формах которого наблюдаются сочетания нарушения слуха и зрения, встречается у 3-10% больных с врожденной глухотой и у 50% детей со слепоглухотой [Ahmed et al., 2003;
www.genetests.org]. К настоящему времени известно, что для каждой популяции характерны свои спектр и частота мутаций, и что повреждение 8 разных генов могут быть причиной развития 3 типов СУ.
Наиболее частой причиной развития синдрома являются мутации в генах неконвенционального миозина VIIA (MYO7A) и ушерина (USH2A), обуславливающих, 75% случаев USH1B и 70-80%- USH2A, соответственно, белковые продукты которых играют чрезвычайно важную роль в функционировании сетчатки и внутреннего уха. Известно, что различные мутации в гене MYO7A также могут вызывать аутосомно-доминантную (DFNA11) и аутосомно-рецессивную глухоту (DFNB2) [www.genetests.org].
Целью исследования явилось изучение структурных особенностей генов 12SrRNA, tRNASer(UCN) мтДНК, MYO7A и USH2A у пациентов с наследственными формами нарушения зрения и слуха.
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи:
1. провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в генах 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК у больных с врожденной и острой нейросенсорной несиндромальной тугоухостью/глухотой из Республик Башкортостан, Саха (Якутия), Алтай и г. Санкт-Петербурга;
2. провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене MYO7A у больных с несиндромальной глухотой и синдромом Ушера;
3. разработать мультиплексные системы для детекции изменений нуклеотидной последовательности в гене MYO7A;
4. провести скрининг мутации p.Cys759Phe гена ушерина (USH2A) у больных с синдромом Ушера;
5. оптимизировать алгоритм молекулярно-генетической диагностики наследственной несиндромальной глухоты в исследованных регионах.
Проведен молекулярно-генетический анализ Научная новизна.
несиндромальной (врожденной и острой) и синдромальной нейросенсорной тугоухости у пациентов из разных регионов. Впервые получены данные о спектре и частоте патогенных и полиморфных вариантов нуклеотидной последовательности в генах 12SrRNA, tRNASer(UCN) мтДНК, MYO7A у больных с наследственными формами нарушения зрения и слуха из разных регионов РФ.
Проведенный анализ генов 12SrRNA и MYO7A выявил ряд изменений нуклеотидной последовательности, обнаруженных впервые - m.930GC, m.961TA, m.1027AG в гене 12SrRNA, и с.4074CT (p.Ser1358Ser) в гене MYO7A.
Практическая значимость. Оптимизирован алгоритм для выявления мутаций в генах GJB2, GJB6, 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК и проведения ДНК диагностики наследственной несиндромальной глухоты в семьях высокого риска в исследованных регионах РФ. Полученные данные о частоте и спектре мутаций в генах 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК представляют практический интерес для понимания молекулярно-генетических основ функционирования процесса звуковосприятия, и являются необходимым условием для повышения эффективности работы медико-генетического консультирования и профилактики наследственной патологии в исследованных регионах.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: «VII Balkan Meeting of Human Genetics» (Skopje, 2006), «ESHG» (France, 2007), «Newborn Hearing Screening» (Cernobbio, 2008), школе- семинаре «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007), XI ой школе-конференции «БИОЛОГИЯ- НАУКА XXI ВЕКА» (Пущино, 2007), и VI-ой всероссийской ежегодной конференции «Наука и практика в оториноларингологии» (Москва, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе статьи в журналах из перечня рекомендованных ВАК, 2 патента (№2317547 от 20.02.2008, МПК GO1№33/48- Решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2007115659/13(017017)).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материала, методов, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и рисунков. Список литературы включает 256 источников.
Материалы и методы исследования. В качестве материала была использованы образцы ДНК пациентов, а также членов их семей, с диагнозом врожденная и острая нейросенсорная тугоухость/глухота, СУ, и индивидов с нормальным слухом из различных регионов РФ (табл. 1).
Табл. Численность групп больных и здоровых индивидов из разных регионов Кол-во Кол-во Кол-во больных с Кол-во индивидов с Регион больных с больных с нормальным слухом НСТ ОНТ CУ Башкортостан1 279 0 18 С.Петербург2 51 71 22 Якутия3 83 0 0 Алтай4 58 0 0 Степень потери слуха была установлена на основе данных тональной пороговой аудиометрии (по критериям Российской классификации тугоухости), акустической импедансометрии и регистрации отоакустической эмиссии, а диагноз СУ - на основании аудиологических, офтальмологических данных, а также анализа вестибулярной функции (электронистагмографии).
Наследственный характер глухоты в семьях устанавливали на основании генеалогических данных и ретроспективного анализа анамнеза больных, с целью исключения возможного влияния факторов внешней среды (инфекции, травмы слухового аппарата) во время пренатального и постнатального развития.
При изучении анамнеза пациентов особое внимание обращалось на факт Сурдологический центр РДКБ, Перинатальный центр МЗ РБ (г. Уфа);
Кафедра оториноларингологии Военно-медицинской академии имени С.М.
Кирова, лаборатория слуха и речи НИЦ Государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (г. Санкт-Петербург);
Якутский научный центр Сибирского отделения РАМН, Медико-генетическая консультация РБ№1-НЦМ, Сурдологопедический центр РБ№1-НЦМ (г. Якутск);
Республиканский сурдологопедический кабинет, Республиканское общество глухих, специализированная школа для глухих детей (г. Горно-Алтайск).
применения ототоксичных антибиотиков и/или перенесенным в детстве заболеваниям, предполагающим возможную аминогликозидную терапию. В качестве контроля использованы ДНК здоровых индивидов, сопоставимых по полу, возрасту и этнической принадлежности с исследуемой группой.
Молекулярно-генетические методы исследования. Геномная ДНК была выделена методом последовательной фенольно-хлоформной экстракции [Mathew et al., 1984]. На основе первичной последовательности генов 12SrRNA, MYO7A, полученной из баз GenBank® и Genatlas, с помощью пакета биологических программ были подобраны 3 пары обычных и 6 мультиплексных (триплексных) систем синтетических олигонуклеотидов. Предложенные программой праймеры были оценены на степень гомологии с ДНК Homo sapiens посредством сравнения последовательностей праймеров и баз биологических данных [www.genebee.msu.su/blast_new/blast.html].
Для детекции известных мутаций в образцах ДНК пациентов и контрольных выборок, с использованием эндонуклеаз HaeIII, XbaI, MboII, HinfI, CviRI нами был проведен рестрикционный анализ генов 12SrRNA, tRNASer(UCN), USH2A.
Результаты ПДРФ-анализа оценивались проведением вертикального электрофореза в 7% ПААГ при напряжении 300V в 1xTBE буфере с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией при ультрафиолетовом облучении. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага pUC19/MspI. Для выявления изменений нуклеотидной последовательности в гене 12SrRNA был проведен SSCP-анализ трех амплифицированных фрагментов, фланкирующих позиции- 616-938, 894- 1140 и 1247- 1585, соответственно. Для идентификации известных и неизвестных изменений нуклеотидной последовательности в гене MYO7A был использован SSCP-анализ ПЦР продуктов, синтезированных с использованием мультиплексных систем. Определение последовательности нуклеотидов в образцах ДНК с конформационными полиморфизмами проводили с помощью автоматического секвенатора ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Результаты секвенирования оценивали в программе BioEdit v.5.0.9 (1997-2001), MegAlign из пакета программ DNAStar Inc. (1993-2002). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ “STATISTICA 5.0” (StatSoft), MS Excel 2003 (Microsoft). При попарном сравнении частот аллелей в популяционной выборке использовался двусторонний критерий Фишера Р (F2), а также 2(Р) с поправкой Йетса на непрерывность. Статистически значимыми считали различия частот аллелей при значении Р0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК у больных с врожденной и острой несиндромальной нейросенсорной тугоухостью/глухотой из различных регионов РФ. У пациента с нейросенсорной тугоухостью (НСТ) из Республики Башкортостан русской этнической принадлежности в гене 12SrRNA наряду с мутацией m.827AG, обнаружен полиморфизм m.750AG, согласно литературным данным, идентифицированный в популяциях Африки, Сев.
Америки и Европы [Kivisild et al., 2006]. Дальнейшие исследования позволили выявить данный полиморфизм среди пациентов c нарушениями слуха из Туниса и Китая [Li et al., 2005;
Mkaouar-Rebai et al., 2006]. Изменение нуклеотидной последовательности в 827 положении гена 12SrRNA было впервые обнаружено Li et al. в 2005 году при исследовании пациентов из Китая, потерявших слух после аминогликозидной терапии. Вариант m.827AG считается патогенетически значимым на основании его отсутствия в группе контроля и локализации в A сайте 12 S субъединицы рРНК, высоко консервативной области мтДНК, ответственной за инициацию трансляции [Li et al., 2005]. Мутация m.827AG была выявлена у индивида, имеющего диагноз «наследственная несиндромальная тугоухость IV степени».
У 8 пациентов с тугоухостью/глухотой и 3 индивидов с нормальным слухом разной этнической принадлежности в гене 12SrRNA мтДНК обнаружен полиморфизм m.930GA, широко распространенный в популяциях Сев.
Америки, Европы и Азии [www.mitomap.org].
У 1 индивида из группы контроля, якута по этнической принадлежности, выявлено сочетание полиморфных вариантов m.930GC и m.951GA в гене 12SrRNA (рис. 1) [www.mitomap.org].
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что полиморфизм m.930GC ранее не описан, а- m.951GA является достаточно редким (менее 0,01%), и выявляется у нормально слышащих индивидов из Японии, Финляндии, Сев. Америки [Moilanen et al., 2003;
Tanaka et al., 2004].
Рис. 1. А. SSCP-анализ участка гена 12SrRNA: 2- образец с измененной электрофоретической подвижностью;
Б) фрагмент сиквенса образца с полиморфизмом m.930GC.
Инсерция цитозинов и делеция тимина в 961 положении в гене 12SrRNA (m.961_962delTinsC(n)), ассоциированных с потерей слуха - идентифицированы у трех неродственных русских пациентов из г. Санкт-Петербурга (у двух из них, имеющих m.961_962insC в состоянии гетероплазмии, ОНТ IV степени возникла в раннем детстве после пневмонии на фоне антибиотикотерапии) и у пациентов с диагнозом НСТ III-IV степени из Республики Башкортостан (3-х русских, 2-х татар, 1-го эстонца). К сожалению, детальную информацию по анамнезу пациентов получить не удалось.
У трех русских индивидов, одного с нормальным слухом, у двух других из Республики Алтай с НСТ неясной этиологии, возникшей в раннем возрасте, была выявлена мутация- m.961TG, впервые обнаруженная у пациентов с НСТ европейского происхождения [Li et al., 2004]. У одного пациента русской этнической принадлежности с врожденной НСТ идентифицировано новое изменение нуклеотидной последовательности - m.961TA [http://www.mitomap.org/cgi-bin/tbl15gen.pl#20060913001].
Поскольку изменения нуклеотидной последовательности вблизи позиции гена 12SrRNA (m.962_963insC, m.961_962insC(n), m.961_962delTinsC(n) и m.961TG), локализованы в неконсервативной области между петлями 21 и С кластера 12SrRNA и, в основном, обнаруживаются у пациентов, потерявших слух после аминогликозидной терапии, многие исследователи предполагают, что они косвенно влияют на сайты взаимодействия с 12SrRNA аминогликозидами, посредством изменения пространственной структуры 12 S субъединицы рРНК, тем самым, усиливая ототоксический эффект данных препаратов, приводя к дефектам трансляции в митохондриях [Kokotas et al., 2007;
Xing et al., 2007]. Исследования, проведенные в 2002 году у глухих пациентов из Техаса, свидетельствуют о том, что частота мутаций m.961_962delTinsC(n) в гене 12SrRNA равна 1 % [Pandya et al., 2004], однако, по данным других авторов, она составляет от 10 до 50% у больных с ОНТ, возникающей на фоне аминогликозидной терапии [www.genetests.org].
Ввиду обнаружения данных изменений нуклеотидной последовательности у пациентов с нарушениями слуха из разных этнических групп- Италии и Китая, с учетом высокой частоты вариаций в 961 положении гена 12SrRNA в группе пациентов (ОНТ- 4,22% и НСТ- 3,17%) и их отсутствия в группе контроля, можно предположить, что вышеперечисленные изменения нуклеотидной последовательности являются мутациями [www.mitomap.org]. Исследование анамнеза у некоторых пациентов свидетельствует о ряде перенесенных заболеваний в детстве, что предполагает возможную аминогликозидную терапию. Также, вполне возможно, что для фенотипического проявления мутации m.961TG требуется наличие модифицирующих факторов. Недавние работы, показавшие, что некоторые вариации в позиции 961 мтДНК являются характеристическими для ряда митохондриальных гаплогрупп [Yao, 2006], подчеркивают необходимость проведения дальнейших исследований, направленных на выяснение роли этих изменений в возникновении нарушений слуха посредством оценки их вклада в дефекты системы окислительного фосфорилирования и нарушения трансляции [Li et al., 2005].
Полиморфизм m.980TC в гене идентифицированный в 12SrRNA, популяциях армян, финнов, испанцев, индийцев, пакистанцев [Palanichamy et al., 2004;
Achilli et al., 2005], обнаружен у 1-го индивида алтайской этнической принадлежности в выборке пациентов. На основании полученных результатов можно предположить, что выявленная низкая частота полиморфизма m.980TC скорее всего, свидетельствует о необходимости проведения дальнейших молекулярно-генетических исследований для оценки его распространенности в различных популяциях и у больных.
Полиморфный вариант m.988GA гена обнаруженный в 12SrRNA, популяциях американцев и индийцев [www.mitomap.org], был выявлен у 12-ти индивидов различной этнической принадлежности: у 10-ти человек из группы пациентов, и у 2-х - из контрольной выборки. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными, свидетельствующими о его достаточно широкой распространенности в разных популяциях мира [www.mitomap.org].
Мутация m.1005TС, обнаруженная нами у одного индивида из Республики Алтай, ранее была выявлена семье из Китая с потерей слуха, обусловленной применением аминогликозидов [Guan et al, 2004]. Полученные данные ставят под сомнение патогенность мутации, ввиду ее обнаружения у индивида с нормальным слухом.
У 1-го индивида алтайской этнической принадлежности из контрольной выборки обнаружен полиморфный вариант m.1027AG, ранее не описанный в литературе [www.mitomap.org/cgi-bin/tbl15gen.pl#20070709001] (рис. 2).
Рис. 2. А) SSCP-анализ участка гена 12SrRNA: 2- образец с аномальной подвижностью;
Б) фрагмент сиквенса образца с неописанным ранее полиморфизмом- m.1027AG.
У двух индивидов алтайской этнической принадлежности (пациента и индивида с нормальным слухом) обнаружен полиморфизм m.1041AG, с высокой частотой встречающийся в популяциях японцев, китайцев, реже, американцев [Ingman et al., 2000;
Tanaka et al., 2004]. Поскольку m.1041AG выявляется наиболее часто у индивидов из азиатских популяций, можно сделать предположение об его расовой и/или этнической специфичности.
Изменение нуклеотидной последовательности в 1095 положении гена 12SrRNA- m.1095TC, впервые обнаруженное в нескольких неродственных семьях с потерей слуха [Tessa et al., 2001;
Kokotas et al., 2007], было выявлено у двух индивидов, алтайцев: у пациента с НСТ IV степени и у здорового индивида из Республики Алтай. Ввиду изменения им пространственной локализации консервативного участка 12S рРНК, играющего важную роль в инициации белкового синтеза [Thyagarajan et al., 2000], в базе данных MITOMAP m.1095TC рассматривается как мутация, ассоциированная с потерей слуха.
С другой стороны, уточнение филогении мтДНК на основе постоянно расширяющихся данных о полностью секвенированных геномах мтДНК из разных этнических групп позволило выяснить, что транзиция m.1095TC, наряду с некоторыми другими вариациями последовательности мтДНК, является базовым полиморфным вариантом для гаплогруппы М11, характеризующей одну из восточно-азиатских ветвей филогенетического древа мтДНК [Yao et al., 2006].
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о неоднозначности оценки патогенности мутации m.1095TC. Возможно, ее патогенный эффект проявляется под действием каких- либо модифицирующих факторов [www.mitomap.org].
Полиморфизм m.1415GA, описанный в популяции Сев. Америки [Mishmar et al., 2003], обнаружен у здорового индивида татарской этнической принадлежности. Анализ литературных данных свидетельствует о редкой встречаемости данного полиморфизма (менее 0,01%) в различных популяциях мира.
SSCP-анализ участка гена 12SrRNA выявил транзицию- m.1438AG в образцах ДНК индивидов из выборки пациентов и контрольной группы. Данное изменение нуклеотидной последовательности, идентифицированное во многих африканских, европейских (финских, итальянских), азиатских (японских, китайских) популяциях [Olivieri et al., 2006;
www.mitomap.org], считается полиморфным вариантом, не вовлеченным в патогенез глухоты.
Другой полиморфизм в гене 12SrRNA- m.1442GA, описанный в популяциях Африки, Сев. Америки и Азии [www.mitomap.org], обнаружен у двух индивидов алтайской этнической принадлежности.
Полиморфизм в 1462 положении гена - m.1462GA, 12SrRNA идентифицирован в популяциях США, а также у пациентов из Канады с сахарным диабетом и нарушением слуха [www.mitomap.org]. Данный полиморфный вариант был обнаружен у одного индивида алтайской этнической принадлежности и у четырех индивидов с нормальным слухом якутов по этнической принадлежности.
Для детекции известных мутаций- m.1555AG, m.7510TC, m.7511TC, m.7445AG, m.7445AC, m.7444GA, ассоциированных с потерей слуха, мы провели ПДРФ-анализ гена tRNASer(UCN) и участка гена 12SrRNA (1247-1585 п.н.) в образцах ДНК пациентов и контрольных выборок.
Рис. 3. ПДРФ-анализ генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК. Скрининг мутаций:
А) m.1555AG (12SrRNA): 1- мутация m.1555AG в состоянии гетероплазмии (216, 93), 2- норма (216 и 123 п.н.);
3- не обработанный HaeIII образец (339 п.н.);
Б) m.7510TC: 5- отсутствие мутации m.7510TC (148 и 67 п.н.), 6- не обработанный HinfI образец (215 п.н.);
В) m.7511TC: 8- отсутствие мутации m.7511TC (175 п.н.), 9- не обработанный MboII образец (215 п.н.);
Г) m.7445AG, m.7445AC, m.7444GA: 11, 12- отсутствие сайта рестрикции XbaI (мутации m.7445AC и m.7444GA, соответственно) (215 п.н.), 13- норма (166 и 49 п.н.);
14- не обработанный XbaI образец (215 п.н.);
4, 7, 10- маркер молекулярного веса pUC19/MspI.
Из литературы известно, что транзиция m.1555AG была идентифицирована во многих регионах мира, что свидетельствует о широкой распространенности нейросенсорной глухоты и тугоухости, вызванной данной мутацией в различных этнических группах [Prezant et al., 1993;
Pandya et al., 1997;
Tekin et al., 2003]. Анализ многочисленных литературных данных показал, что ее распространенность составляет 0,5-2,4% у пациентов с тугоухостью и глухотой из европейских стран, за исключением необычно высокой частоты, достигающей 27%, выявленной в группе пациентов с НСТ из Испании [Estivill et al., 1998]. В азиатских странах частота m.1555AG, несколько выше: в Китае 2,9% [Li et al., 2005], в Японии- 3%, среди пациентов с НСТ [Usami et al., 2000], в Индонезии- 5,3% [Malik et al., 2003]. Обычно мутация m.1555AG выявляется в состоянии гомоплазмии, более редко с разной степенью гетероплазмии [Kokotas et al., 2007]. Хотя мутация m.1555AG в гене 12SrRNA увеличивает чувствительность организма к антибиотикам из группы аминогликозидов, многочисленные исследования по распространенности нейросенсорной глухоты и тугоухости в различных этнических группах показали, что в некоторых случаях различные формы потери слуха возникают у людей- носителей мутации m.1555AG, но не подвергавшихся воздействию аминогликозидов [Kokotas et al., 2007;
Xing et al., 2007]. В связи с тем, что патогенный эффект изменений нуклеотидной последовательности, вызывающих конформационные нарушения 12SrRNA, часто проявляется после применения аминогликозидов, а начало и течение заболевания варьирует - от врожденной потери слуха до возникновения нарушений слуха в зрелом возрасте, многими исследователями были предложены различные гипотезы для объяснения данного феномена. В настоящее время принято считать, что экспрессию патологического фенотипа (потерю слуха), вероятно, могут модулировать как экзогенные, так и генетические факторы [Xing et al., 2007;
Посух c соавт., 2008]. Интенсивные исследования по поиску ядерных генов, модулирующих фенотипическое проявление мутаций в гене 12SrRNA, выявили несколько потенциальных генов кандидатов [Byhovskaya et al., 2004]. Сравнительно недавно, при изучении индивидов различного этнического происхождения с нейросенсорной глухотой и мутациями m.1555AG и m.1494CT в ядерном гене TRMU, кодирующем митохондриальный белок-модификатор некоторых митохондриальных тРНК, была найдена точковая мутация p.Glu28Thr [Guan et al., 2006]. Дальнейшие исследования показали, что данный дефект тРНК, возникающий у гомозигот по этой мутации и усиленный действием мутаций мтДНК, существенно снижает эффективность трансляции [Guan et al., 2006].
Ввиду высокого гетерозиготного носительства мутаций в гене GJB (особенно, с.35_36delG) во многих популяциях мира некоторыми исследователями были изучены гены коннексинов, как потенциальных модификаторов фенотипической экспрессии мутаций в гене 12SrRNA. В своих исследованиях они исходили из двухлокусной модели, предполагающей взаимодействие ядерного и митохондриального геномов в развитии глухоты, впервые предложенной Bu X. [Bu et al., 1993]. Исследование большой семьи, у одного члена которой была обнаружена с.35_36delG в гене GJB2 в гомозиготном состоянии, показало, что данная делеция, наряду с другими мутациями в генах коннексинов, не является фенотипическим модификатором обнаруженной митохондриальной мутации m.1555AG [Mkaouar-Rebai et al., 2006]. Полученные Mkaouar-Rebai E. выводы согласуются с результатами, полученными ранее Lopez-Bigas et al. в 2000 году [Lopez-Bigas et al., 2000].
Обнаруженное нами сочетание мутаций m.827AG и с.35_36delG, наряду с полиморфизмом в 750 положении мтДНК, оставляет открытым вопрос о возможной модулирующей роли коннексиновых дефектов в фенотипической экспрессии некоторых митохондриальных мутаций.
Ввиду низкой частоты мутации m.1555AG в общей выборке обследованных пациентов из г. Санкт-Петербурга, составившей 2%, и ее отсутствия в выборке пациентов из республик Башкортостан и Алтай, можно предположить, что глухота у данных пациентов, скорее всего, обусловлена наличием еще не идентифицированных мутаций в других генах.
tRNASer(UCN) ПДРФ-анализ гена (7392-7606 п.н.) с использованием эндонуклеаз XbaI, MboII и HinfI для детекции известных мутаций мтДНК, ассоциированных с несиндромальной потерей слуха, выявил отсутствие сайта рестрикции XbaI у пациентов из трех неродственных семей, в то время как изменений сайтов рестрикции для MboII и HinfI обнаружено не было (рис. 3).
Последующее секвенирование образцов ДНК двух неродственных русских пациентов (с ОНТ и НСТ III-IV степени) и трех сибсов из одной казахской семьи (с прогрессирующей НСТ II-III степени), позволило идентифицировать две мутации: m.7444GA и m.7445AC (ген tRNASer(UCN)) (риc. 3).
Впервые нуклеотидные замены m.7444GA, в сочетании с мутацией m.1555AG (ген 12SrRNA) а также m.7443AG (0.33%) и m.7445AC (0.33%) с частотой 1.33% были обнаружены при исследовании глухих пациентов из Монголии [Pandya et al., 1999].
Авторы предположили, что пациенты с обеими мутациями могут иметь более выраженное нарушение процесса звуковосприятия, вследствие эпистатического взаимодействия генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) [Pandya et al., 1999]. Было сделано предположение о том, что механизм их патогенного влияния может быть схож с последствиями известной мутации m.7445AG, нарушающей нормальный процессинг предшественника tRNASer(UCN) и мРНК гена ND6, совместно транскрибируемой с легкой цепи, и приводят к изменениям белковой последовательности цитохром-оксидазы I [Pandya et al., 1999].
Позднее, m.7444GA (изолированно или в сочетании с m.1555AG) была выявлена у некоторых пациентов разного этнического происхождения с потерей слуха [Jin et al., 2007].
Вскоре выяснилось, что мутация m.7444GA является одним из полиморфных вариантов, характеризующих ряд митохондриальных гаплогрупп, в том числе и широко распространенную западно-евразийскую V, что требует уточнения ее роли в молекулярном патогенезе слуховой дисфункции [Yao et al., 2006]. Редкость обнаружения замены m.7445AC не позволяет в настоящий момент подтвердить или опровергнуть ее патогенную роль в развитии нарушений слуха. Следует отметить, что у индивидов с мутациями в гене tRNASer(UCN) изменений в гене 12SrRNA обнаружено не было.
Полученные нами данные согласуются с литературными, свидетельствующими о достаточно низкой частоте данных изменений нуклеотидной последовательности митохондриального генома в общем спектре мутаций среди больных с врожденной глухотой [Kokotas et al., 2007;
Xing et al., 2007], за исключением некоторых популяций, например, испанской, в которой обнаружены митохондриальные мутации с очень высокой частотой (27%) [Estivill et al., 1998;
Torroni et al., 1999].
При ПДРФ-анализе гена tRNASer(UCN) нами идентифицирован полиморфный вариант- m.7569AG гена tRNAAsp. Литературные данные свидетельствуют об отсутствии ассоциации между мутациями в данном гене и глухотой, как синдромальной, так и несиндромальной [www.mitomap.org].
В табл. 2 приведен спектр и частота идентифицированных изменений нуклеотидной последовательности в генах 12SrRNA, tRNASer(UCN), tRNAAsp мтДНК у индивидов с несиндромальной тугоухостью/глухотой и с нормальным слухом из Республик Башкортостан, Алтай, Саха (Якутия) и г. Санкт- Петербурга.
Табл. Изменения нуклеотидной последовательности в генах 12SrRNA, tRNASer(UCN), tRNAAsp мтДНК у индивидов с несиндромальной тугоухостью/глухотой и с нормальным слухом из Республик Башкортостан, Алтай, Саха (Якутия) и г. Санкт- Петербурга Частота в Частота в группе группе Ген Полиморфизм пациентов (%) контроля (%) m.750AG 0,53 12SrRNA m.930GA 2,12 0 0, m.930GC+m.951GA 0,53 m.961TA m.980TC 2,08 m.988GA 1,41 1, m.1005TC 0 0, 0 0, m.1027AG m.1041AG 2,08 0, m.1415GA 0 0, m.1438AG 3,7 3, m.1442GA 2,08 0, m.1462GA 0 3, 2 m.1555AG tRNASer(UCN) 2,1 (НСТ), 1,4 (ОНТ) m.7444GA 2,1 m.7445AC tRNAAsp m.7569AG 0 0, Анализ гена MYO7A. Для анализа гена MYO7A мы применили следующую стратегию: исследовались участки гена, где по литературным данным было выявлено наибольшее количество мутаций, ассоциированных с наследственными формами нарушения свето- и звуковосприятия.
После составления карты распределения мутаций, нами был произведен подбор праймеров для избирательной амплификации 19 экзонных последовательностей данного гена.
В качестве основного метода поиска мутаций был использован метод SSCP, основным преимуществом которого является его простота и достаточно высокая чувствительность [Orita et al., 1989] (рис. 4).
Рис. 4. Пример SSCP-анализа мультиплексной (триплексной) системы из трех экзонов гена MYO7A.
SSCP-анализ 5, 9, 13, 17, 18, 22, 36 экзонов гена MYO7A не выявил изменений электрофоретической подвижности в образцах ДНК больных. В экзоне 7 наблюдалось изменение конформационной подвижности ДНК у одного пациента с нарушением слуха. Однако последующий секвенционный анализ не выявил каких-либо изменений в нуклеотидной последовательности ни в самом экзоне, ни в прилегающих к нему интронных областях.
В экзоне 3 нами было зафиксировано одинаковое изменение подвижности у 110 неродственных больных. Секвенционный анализ 3 экзона позволил обнаружить известный полиморфный вариант p.Leu16Ser. Статистический анализ распределения частот аллелей полиморфных вариантов в контрольных выборках и группах пациентов с нарушениями зрения и слуха не выявил достоверных различий (2= 0,113270955;
p0,05).
Полученные нами данные согласуются с литературными и подтверждают предположение об отсутствии функциональной роли найденной нуклеотидной замены в патогенезе нарушений слуха и зрения. Идентифицированные нами частоты аллелей T* и C* (0,7 и 0,3) совпадают с данными, полученными при исследовании CEPH коллекции, где частым аллелем является T.
Данное соотношение частот аллелей, возможно, объясняется этническим своеобразием индивидов, составивших исследуемые выборки пациентов и группу контроля.
SSCP-анализ ПЦР продуктов, синтезированных с использованием триплекса на 13, 17, 31 экзоны гена MYO7A, выявил изменение электрофоретической подвижности в 31 экзоне, последующее секвенирование которого выявило изменение нуклеотидной последовательности в 4074 положении- с.4074CT, ранее не описанное в литературе.
Данный полиморфный вариант был обнаружен у двух пациентов русской этнической принадлежности из РБ с диагнозом врожденной нейросенсорной тугоухости IV степени. В группе контроля с.4074CT (p.Ser1358Ser) обнаружен не был. Данная нуклеотидная замена является синонимичной, на основании чего ее можно считать полиморфизмом.
Анализ гена USH2A. Проведенный скрининг мутации p.Cys759Phe в гене USH2A не выявил данного изменения нуклеотидной последовательности в выборке пациентов с синдромом Ушера.
На основании данных исследования полиморфных гаплотипов и мутаций в гене GJB2 был оптимизирован предложенный ранее алгоритм молекулярной диагностики наследственной глухоты в семьях высокого риска в Республике Башкортостан [Dzhemileva et al., 2003;
Хуснутдинова c соавт., 2005] и Республике Саха (Якутия) [Барашков, 2007].
Согласно этому алгоритму, обследование следует начинать с прямой диагностики на наличие частых для популяций Республик Башкортостан и Республики Саха (Якутия) мутаций с.35_36delG, c.235_236delC, c.312_326del14, c.299_300delAT, p.Glu47X, p.Val37Ile гена GJB2.
В случае полной информативности семьи ДНК-диагностика ограничивается прямым методом. В случае частичной информативности или абсолютной неинформативности, проводится анализ генов 12SrRNА и tRNASer(UCN) мтДНК для выявления следующих мутаций: m.1555AG, m.1095TС, m.1005TC, m.961_962insC, m.961_962insC(n), m.961_962delTinsC(n), m.7445AC, m.7444GA.
Если эти мутации не выявляются, или же обнаруживается какой-либо новый конформационный полиморфизм ДНК, то проводится секвенирование образца по модифицированному методу Сенгера.
При неинформативности исследования проводится поиск мутаций в генах GJB3, GJB6, MYO7A (рис. 4).
Рис. 4. Алгоритм ДНК- диагностики наследственной несиндромальной глухоты ВЫВОДЫ:
1. Обнаружена мутация m.961_962delTinsC(n) (4,22%) в гене 12SrRNA мтДНК у 3-х больных русской этнической принадлежности с острой нейросенсорной тугоухостью.
2. Выявлены мутации m.827AG (0,53%), m.961TG (4,17%), m.961_962delTinsC(n) (3,17%), m.1095TC (2,1%), m.1555AG (2%) в гене мтДНК у больных с врожденной нейросенсорной 12SrRNA тугоухостью/глухотой.
3. Обнаружена транзиция- m.7444GA в гене tRNASer(UCN) мтДНК у пациентов русской этнической принадлежности с острой нейросенсорной тугоухостью (1,4%) и с врожденной несиндромальной нейросенсорной тугоухостью (2,1%), и трансверсия- m.7445AC- в казахской семье из Республики Алтай (2,1%).
4. Идентифицировано 9 полиморфных вариантов (m.930GA, m.951GA, m.980TC, m.988GA, m.1041AG, m.1415GA, m.1438AG, m.1442GA, m.1462GA) в гене 12SrRNA мтДНК в исследованных группах больных и контроля. Три полиморфных варианта (m.930GC, m.961TA, m.1027AG) обнаружены впервые.
5. Разработаны 6 мультиплексных систем для детекции изменений нуклеотидной последовательности в гене MYO7A.
6. Выявлено 2 полиморфных варианта в гене MYO7A- с.47TC (p.Leu16Ser) в 3 экзоне и с.4074CT (p.Ser1358Ser) в 31 экзоне, у больных с несиндромальной нейросенсорной тугоухостью и синдромом Ушера.
7. Оптимизирован алгоритм ДНК-диагностики наследственной несиндромальной глухоты для исследованных регионов РФ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Джемилева Л.У., Гринберг Э.Р., Тазетдинов А.М., Зайдуллин И.С., Бикбов М.М., Мусина В.В., Хуснутдинова Э.К. «Молекулярные основы дегенеративных процессов в сетчатке при тапеторетинальной абиотрофии» // Молекулярная биология. 2007.- Том 41.- № 6.- С.1-9.
2. Тазетдинов А.М., Джемилева Л.У., Хуснутдинова Э.К. Молекулярная генетика синдрома Ушера // Генетика.- 2008.- T.44. - № 6.- C. 725- 733.
3. Tazetdinov A.M., Dzehemileva L.U., Khusnutdinova E.K. Molecular Genetics of Usher Syndrome // Russian Journal of Genetics, 2008, Vol. 44, № 6. - P. 627– 634.
4. Способ выявления мутаций в гене GJB2, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты Патент №2317547 от 20.02. 5. Способ определения мутаций гена MTRNR1 при острой нейросенсорной тугоухости, вызванной применением антибиотиков из группы аминогликозидов МПК GO1№33/48 Решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2007115659/13(017017).
6. Dzhemileva L.U., Tazetdinov A.M., Baimiev A.H., Khabibulin R.M., Khusnutdinova E.K. Molecular screening of deafness in populations and patients with nonsyndromic congenital deafness in Volga- Ural region // 7th Balkan Meeting of Human Genetics, Skopje 29 September - 2 August, 2006. P. 41.
7. Tazetdinov A.M., Dzhemileva L.U., Ponidelko S.N., Khusnutdinova E.K.
Molecular analysis of MTRNR1 and MTTS1 genes in patients with suddenly deafness from Russia// 7th Balkan Meeting of Human Genetics, Skopje September - 2 August, 2006. P. 96.
8. Dzhemileva L.U., Posukh O.L., Barashkov N.A., Tazetdinov A.M. Mutational analysis of the mitochondrial 12SrRNA and tRNASer(UCN) genes in patients with aminoglycoside-induced and nonsyndromic hearing loss from Volga-Ural region and Siberia (Russia). // European Human Genetics Conference 2007. June 16- 19. Nice, France. P.253.
9. Dzhemileva L.U., Posukh O.L., Barashkov N.A., Tazetdinov A.M., Khusnutdinova E.K. Molecular analysis of the 12SrRNA and tRNASer(UCN) genes (mtDNA) in patients with nonsyndromic hearing loss from different Russia regions. // ESF Research Conference on Rare Diseases: 2008. 8-12 March. Sant Feliu de Guixols, Spain. P. 114.
10. Tazetdinov A.M., Dzhemileva L.U., Ponidelko S.N., Khusnutdinova E.K.
Mutational analysis of the 12SrRNA and tRNASer(UCN) genes in patients with nonsyndromic hearing loss from Volga-Ural region (Russia). // Newborn Hearing Screening 2008.-June 19-21, 2008 – Cernobbio (Italy). P. 59.
11. Тазетдинов А.М. «Анализ спектра и частот мутаций в генах 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК у больных с острой нейросенсорной тугоухостью» // Материалы докладов конференции Вестник оториноларингологии.
Приложение. № 5.- 2007, с. 324-327.
Джемилева Л.У., Посух О.Л., Барашков Н.А., 12. Тазетдинов А.М., Хуснутдинова Э.К. Анализ генов MTRNR1 (12SrRNA) и MTTS (tRNASer(UCN)) у больных с острой нейросенсорной тугоухостью // Материалы докладов 11-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых (2007) «БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА».
13. Джемилева Л.У., Посух О.Л., Барашков Н.А., Тазетдинов А.М., Хуснутдинова Э.К. «Спектр мутаций в 12SrRNA и tRNASer(UCN) генах мтДНК у больных наследственными формами несиндромальной потери слуха, проживающих в различных регионах России» // Материалы школы семинара по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века», стр.39-40 (2007) 14. Тазетдинов А.М., Джемилева Л.У., Пониделко С.Н., Хуснутдинова Э.К Анализ генов 12SrRNA и tRNASer(UCN) мтДНК у больных с острой нейросенсорной тугоухостью // Материалы школы семинара по физико химической биологии и биотехнологии Биомика - наука XXI века», стр.122 123 (2007) СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ:
OНT- острая нейросенсорная тугоухость ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов гены коннексинов 26, GJB2, GJB6 tRNASer(UCN)- ген тРНК серина ген 12 S субъединицы рРНК 12SrRNA