Оценка толерантности организма к тромбину по коагулоактивности тромбоцитов и уровню маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания крови
На правах рукописи
ГАЛУШКО МАКСИМ ГЕННАДЬЕВИЧ ОЦЕНКА ТОЛЕРАНТНОСТИ ОРГАНИЗМА К ТРОМБИНУ ПО КОАГУЛОАКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ И УРОВНЮ МАРКЕРОВ НЕПРЕРЫВНОГО ВНУТРИСОСУДИСТОГО СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ 03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Тюмень – 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Галян Сергей Леонидович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ доктор медицинских наук Шевлюкова Татьяна Петровна ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Челябинская государственная меди цинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Защита состоится «….» …………. 2012 г в …. часов на заседании диссер тационного совета Д 208.101.02 при ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального разви тия Российской Федерации по адресу: 625023, г. Тюмень, ул. Одесская,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Автореферат разослан «…..»…………… 2012 года
Ученый секретарь С.А. Орлов диссертационного совета
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы определяется рядом фактов, которые позволяют сфор мулировать некоторые положения: 1. Ведущая причина смертности в мире, в том числе и в России – заболевания сердечно-сосудистой системы [Е.И.Чазов, 2008;
G.Y.Lip, C.Weber, 2011], при которых непосредственной причиной смерти нередко являются тромбозы, обусловленные атеросклеротическими изменениями сосуди стой стенки, при этом активируются тромбоциты, запуская каскад биохимических реакций, ведущих к образованию тромбоцитарной пробки и к формированию фибриновой сети [Д.М.Зубаиров, 2000;
И.Н.Бокарев, 2008;
Б.И.Кузник, 2010;
K.Tanaka e.a., 2008]. Столь же опасны и кровотечения, которые сопровождают не только травмы и хирургические вмешательства, но нередко и роды [А.Д.Макацария и др., 2011]. При этом часто (70-80%) кровоточивость обусловли вается недостаточностью тромбоцитарного звена системы гемостаза [А.С.Шити кова, 2008]. 2. Не всегда оценку гемокоагуляции сопровождает адекватный кон троль тромбоцитарного звена [И.Е.Попова, 1999;
W.J.Chen, S.L.Yeh;
2003], хотя через тромбоциты в значительной мере реализуется влияние ЛПО на гемостаз [А.Ш.Бышевский и др., 1994, 2006;
2009, 2010, 2011;
В.В.Юдин, 2002;
С.Л.Галян и др., 2003, 2010;
Р.Г.Алборов, 2006]. 3. Наклонность к гипер- или к гипокоагуляции во многом определяется изменением интенсивности взаимодействия тромбин фибриноген (ВТФ) [З.С.Баркаган, 1998;
И.Н.Бокарев, 2002;
M.Levi, 2004;
H.M.Spronk, 2003], так как его скорость, а, следовательно, и скорость непрерыв ного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК) может рассматриваться как мера напряжения в системе гемостаза [А.П.Момот, 1990;
З.С.Баркаган, 1998;
Д.М.Зубаиров, 2000;
В.Ф.Киричук и др., 2002;
H.M.Spronk, 2003]. 4. Интерес к оценке НВСК, протекающего в условиях физиологической нормы с малой интен сивностью [Д.М.Зубаиров, 2000;
А.Ш.Бышевский и др., 2003, 2006], тем и обу словлен, что при экстремальных воздействиях сдвиги уровня маркеров НВСК от ражают наклонность к гипер- или гипокоагуляции [И.Н.Бокарев, 2002;
М.К.Умут баева, 2005;
А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян и др., 2008;
O.Segers e.a., 2010]. 5. Еди ничными работами показано, что сдвиги НВСК, обусловливаемые экзогенной ги пертромбинемией, сопряжены с толерантностью к тромбину (ТкТР) [И.Н.Бокарев, 2002;
В.П.Балуда, 1995;
Р.Г.Алборов, 2006;
А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян и др., 2008;
А.Ш.Бышевский, И.А.Карпова и др., 2011], однако неизвестно, как соотно сятся уровень маркеров ВТФ и ТкТР с коагуляционной активностью тромбоцитов.
Кроме того, важно установить, является ли связь гипертромбинемии с ТкТР зако номерной, независящей от причины, вызывающей рост уровня тромбина в крово токе. 6. Определение уровня маркеров НВСК в плазме и коагулоактивности тром боцитов у больного вполне доступно, тогда как определение ТкТР возможно лишь в экспериментах на животных, которые основаны на оценке частоты выживания после внутривенного введения тромбина или на оценке степени сдвигов активно сти прокоагулянтов или уровня фибриногена. Разумеется, эти способы неприем лемы для клиники, так как введение даже следовых количеств тромбина в крово ток недопустимо в связи с его способностью аутокаталитически ускорять тромби нообразование [Д.М.Зубаиров, 1978, 2000;
А.Ш.Бышевский и др. 1986, 1993;
А.С.Шитикова, 2000;
Л.П.Папаян, 2003]. Вместе с тем, ТкТР – один из важнейших интегральных показателей, характеризующих систему гемостаза.
Всё это и определило необходимость установить возможность оценки ТкТР не инвазивным, косвенным и доступным использованию в клинике приемом.
Цель исследования. Охарактеризовать при разнообразных воздействиях, изме няющих тромбинообразование, зависимость между коагулоактивностью тромбо цитов, плазменным уровнем маркеров непрерывного внутрисосудистого сверты вания крови и способностью организма противостоять гипертромбинемии с тем, чтобы оценить возможность контроля в клинике толерантности к тромбину по уровню в плазме крови продуктов взаимодействия тромбин-фибриноген, т.е. мар керов НВСК.
Задачи исследования. 1. Изучить сдвиги коагулоактивности тромбоцитов и плазменного уровня маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания кро ви при воздействиях, уменьшающих эти величины. 2. Изучить те же сдвиги при воздействиях, повышающих коагулоактивность тромбоцитов и уровень маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания крови. 3. Использовать при выпол нении задач, сформулированных в пп. 1 и 2, воздействия, отличающиеся по меха низму, длительности и интенсивности, следовательно, и по характеру влияния на организм (в частности, на гемостаз) – это позволит выявить, насколько закономер ны соотношения между коагулоактивностью тромбоцитов, плазменным уровнем маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и сдвигами толе рантности к тромбину. 4. Подвергнуть анализу взаимосвязи всех полученных пе ременных, оценить ранговую корреляцию их сочетаний по два, определяя величи ны, характеризующие наличие и тесноту ассоциативных связей (rs), оценить связи переменных, устанавливая корректность усреднения по величине коэффициентов аппроксимации. 5. Повторить эксперимент по изучению гемокоагуляции в усло виях гипер- и гипокоагулемии с тем, чтобы сопоставить сдвиги толерантности к тромбину, оцениваемой использованным нами методом, и методом, основанным на определении частоты выживания животных после внутривенного введения тромбина в DL50%.
Научная новизна.
Впервые выявлено существование тесной положительной и близкой к линейной ассоциативной связи между показателями НВСК и показателями коагулоактивно сти тромбоцитов.
Впервые экспериментально выявлено наличие отрицательной ассоциации между коагулоактивностью тромбоцитов и интенсивностью НВСК с одной стороны, и толерантностью к тромбину - с другой.
Экспериментально показано, что результаты определения ТкТР инвазивным мето дом (по частоте выживания или гибели животных после внутривенного введения DL50% тромбина) близки к данным, полученным при оценке ТкТР неинвазивным ме тодом (по степени сдвигов коагулоактивности тромбоцитов или маркеров НВСК).
Впервые выдвинуто экспериментально обоснованное предположение, согласно которому судить о толерантности пациента к тромбину можно по уровню в крово токе продуктов ВТФ (т.е. маркеров НВСК), или по активности тромбоцитов.
Теоретическая и практическая значимость Опытным путем показано, что оценивать толерантность организма к тромбину можно по уровню маркеров НВСК или по коагулоактивности тромбоцитов, что позволяет судить о ТкТР неинвазивным приемом. Ранее с этой целью определяли частоту выживания животных после введения токсической дозы тромбина или оценивали у них степень сдвигов активности некоторых прокоагулянтов. Такие приемы не могут использоваться в клинической практике, т.к. введение даже сле довых количеств тромбина в кровоток исключается, в связи с его способностью аутокаталитически ускорять тромбинообразование [А.Ш.Бышевский, 1984, А.Ш.Бышевский и др. 1986;
А.Ш.Бышевский, Д.М.Зубаиров и др., 1993;
Д.М.Зубаиров, 1989, 2000;
А.С.Шитикова, 2000;
Л.П.Папаян, 2003].
Апробация и публикация. Основные положения диссертации доложены на 42 й Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2008);
на III научной международной конференции «Современные проблемы науки и образо вания» (Москва, 2008);
на Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009);
на 43-й Всероссийской научной конференции «Ак туальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2009);
на III Международной научно-практической конфе ренции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным фак торам среды» (Челябинск, 2010);
на конгрессе «Человек и лекарство. Урал–2010» (Тюмень, 2010);
на 44-й Всероссийской научной конференции «Актуальные про блемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2010) на 5-й Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиоло гия и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, НЦССХ им.
А.Н.Бакулева, Научное общество «Клиническая гемостазиология», 2011);
на 45-й Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической, экс периментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2011);
заседании Тюменского регионального отделения РАЕ (2010, 2011), на совместном заседании кафедр биохимии, физиологии и общей гигиены с курсом экологии ТюмГМА (2011).
По материалам диссертации имеется 18 публикаций: 4 из них – в журналах, ре комендованных ВАК для публикаций диссертационных материалов, 3 – в мате риалах Российских конференций с международным участием и 2 главы в моно графии.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 167 страницах машино писного текста, включает «Введение», «Обзор литературы», разделы «Материалы и методы исследований», «Обсуждение полученных данных», «Выводы», «Прак тические рекомендации» и «Литература» (436 источников, из них 206 зарубеж ных).
Положения, выносимые на защиту 1. Разнообразные по природе и механизму воздействия (введение 2-кратного избытка витаминов А, Е, В5 и В12, введение тироксина, мерказолила, адрена лина, тромбопластина, гепарина, смена сезонов) сопровождаются изменением интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания крови.
2. Сдвигам интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания кро ви, вызываемым этими воздействиями, неизменно сопутствуют сдвиги пока зателей коагулоактивности тромбоцитов, характеризующие их способность к реакции высвобождения, к спонтанной и АДФ-индуцируемой агрегации и общую коагулоактивность.
3. Воздействие факторов, приводящих к ускорению внутрисосудистого сверты вания крови, сопровождается увеличением коагулоактивности тромбоцитов, а воздействие факторов, замедляющих внутрисосудистое свертывание крови, протекает со снижением коагулоактивности тромбоцитов.
4. Независимо от вида воздействия (из числа перечисленных в п. 1), его интен сивности и продолжительности постоянно выявляется тесная положительная линейная ассоциация между показателями интенсивности непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и показателями коагулоактивности тромбоцитов.
5. Независимо от вида воздействия, его интенсивности и продолжительности связь между показателями коагулоактивности тромбоцитов, а также уровнем маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантно стью к тромбину оказывается тесной отрицательной.
6. Результаты определения у животных толерантности к тромбину инвазивным методом (по частоте выживания животных после внутривенного введения тромбина в DL50%) близки к данным, полученным при оценке толерантности к тромбину методом, основанным на оценке степени сдвигов коагулоактивно сти тромбоцитов или маркеров непрерывного внутрисосудистого свертыва ния крови.
7. Судить о толерантности к тромбину можно по уровню в кровотоке продук тов взаимодействия тромбин-фибриноген, т.е. маркеров непрерывного внут рисосудистого свертывания крови, или по коагулоактивности тромбоцитов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Опыты проводили на нелинейных белых крысах. Животных содержали до включения в опыт на обычном смешанном рационе вивариума (злаки, овощи), а за неделю до начала эксперимента переводили на рацион вязкой консистенции (смесь ячменной и овсяной круп с добавлением растительного масла). Для обеспечения полного потребления добавок их вносили в 1/2 суточной порции рациона в ранние утренние часы. После потребления этой части рациона (примерно через 1 ч) в клетку вносили его остаток (всего – 100 г/кг массы тела).
Чтобы не допустить погрешностей, связанных с сезоном и метеоусловиями, кон трольную группу включали в каждую серию экспериментов, исключая опыты, ин тервал между которыми не превышал 1-2 недель (в этих случаях использовали общий контроль для двух-трёх серий экспериментов).
Пробы крови брали в шприц из v. jugularis, обнажаемой овальным разрезом у фиксированных крыс (наркоз - диэтиловый эфир). Стабилизатор - 3,8% раствор цитрата натрия. Соблюдались правила, предусмотренные для гемостазиологиче ских исследований [В.П.Балуда и др., 1980;
З.С.Баркаган, 1998].
Для оценки состояния гемостаза определяли: 1. Активированное время ре кальцификации (АВР) [Г.Н.Детинкина и др. 1984];
2. Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) [Г.Н.Детинкина и др. 1984];
3. Содержание продуктов деградации фибрина (ПДФ) определяли в модификации А.Ш.Бышев ского и др. [1991];
4. Содержание РКМФ определяли количественным вариантом фенантролинового теста [А.П.Момот и др., 1999];
5. Содержание D-димеров опре деляли методом, основанным на латексной агглютинации с моноклональными ан тителами к D-димерам. Результат выражали в мкг/мл эквивалентов фибриногена;
6. Концентрацию в плазме осаждаемого тромбином фибриногена определяли спектрофотометрически [А.Ш.Бышевский, В.Мохнатов, 1969];
7. Количество тромбоцитов определяли в периферической крови [З.С.Баркаган, А.П.Момот, 1998];
8. Агрегацию тромбоцитов определяли с помощью агрегометра “BIOLA”, индуктор агрегации - АДФ в конечной концентрации 0,01 мг/мл [З.А.Габбасов и др., 1989];
9. Спонтанную агрегацию определяли по Н.И.Тарасовой [В.П.Балуда и др., 1980]. Концентрацию тромбоцитов в плазме приводили к 250 - 500 тыс. клеток в мкл (диапазон, корректный для работы на агрегометре), разбавляя плазму гомо логичной обедненной тромбоцитами;
10. Содержание ф. Р3 в плазме рассчитыва ли по разнице показателей АВР плазмы до, и после освобождения её от тромбоци тов - Rabiner & Groder в описании [В.П.Балуда и др. 1980];
11. Содержание ф. Р4 в плазме определяли по действию прогретой и обедненной тромбоцитами плазмы (источник термостабильного ф. Р4) на тромбин-гепариновое время свертывания плазмы (источник фибриногена и антитромбина III). Степень укорочения времени свертывания - мера активности ф. Р4 [В.П.Балуда и др., 1980];
12. Общую коагули рующую активность тромбоцитов (ОКАТ) определяли по их способности изме нять время свертывания при добавлении в плазму, используемую для теста АВР [А.Ш.Бышевский и др., 1996].
Для оценки липидпероксидации (ЛПО) и антиоксидантного потенциала (АОП) определяли: 1) содержание первичных и вторичных липидпероксидов (ДК и ТБК-продуктов соответственно), 2) период индукции, 3) скорость окисления.
Липиды экстрагировали 100-кратным избытком смеси равных объемов гептана и изопропилового спирта. Содержание сопряженных диеновых соединений (диено вых конъюгат - ДК) устанавливали по оптической плотности ( = 232 нм) гепта новой фазы. Содержание продуктов ЛПО, реагирующих с тиобарбитуровой кисло той (ТБК) - вторичных липидпероксидов, - определяли в том же экстракте флуоро метрически [В.Н.Ушкалова и др., 1987, 1997]. Интенсивность флуоресценции воз буждения устанавливали с помощью флуориметра «Биан 130».
В экстрактах определяли также кинетические величины прямого иницииро ванного окисления липидов молекулярным кислородом в присутствии инициатора свободнорадикального окисления (азобисизобутиронитрил). Период индукции (ПИ) выражали по времени поглощения исследуемой пробой 25 мм3 О2, а скорость окисления (СО) выражали углом наклона линейного участка кинетической кривой [С.Н.Ельдецова, 1990].
Выделяли и отмывали тромбоциты для опытов in vitro и для оценки ЛПО со гласно описанию [А.Б.Самаль и др., 1990].
Толерантность к тромбину устанавливали с помощью запатентованного [А.Ш.Бышевский и соавт., 2003] и апробированного [М.К.Умутбаева, 2005;
Р.Г.Алборов, 2006;
Н.Н.Зороастрова, 2006;
С.В.Миневцев, 2006;
С.В.Шидин, 2007;
Е.С.Забара, 2009;
Е.М.Шаповалова, 2010;
О.К.Щепетева, 2011] способа.
Для расчета использовали предложенную авторами формулу:
D = {1- [(Ск – Со) : Ск]} х 100, где D – остаточная концентрация фибриногена, %;
Ск – концентрация ФГ у крыс, которым тромбин не вводили и каким-либо воздействиям не подвергали (исходный уровень, %);
Со – концентрация ФГ, % у крыс, которым ввели тромбин на фоне изучающегося воздействия.
Остаточную концентрацию у крыс, которым тромбин ввели без предваритель ных воздействий, принимали за 100-процентную толерантность к тромбину, и ус танавливали её (в %) при изучавшемся воздействии по формуле:
Х% = (Do : Dк)х100, где X – ТкТР (%), Do – остаточная концентрация фибриногена (%) у крыс, под вергавшихся воздействию, Dк - остаточная концентрация фибриногена (%) у крыс, не подвергавшихся изучаемому воздействию (контрольная группа).
Анализ результатов проводили с помощью медико-биологической программы Biostat 4.03 [С.А.Гланц, 1998], используя вариационную статистику для малых ря дов наблюдений: вычисляли среднюю арифметическую (М), среднюю ошибку средней арифметической (m) и среднеквадратическое отклонение (). Для оценки достоверности отличий вычисляли доверительный коэффициент Стъюдента (t) и степень вероятности (р). Сопоставляя интенсивные показатели, использовали аль тернативное варьирование, рассчитывая те же показатели. Связи переменных ана лизировали методом ранговой корреляции Спирмена. Различия рассматривали как достоверные при значениях степени вероятности 0.05.
Графический анализ проводили в системе Microsoft Graf (приложение MS Word 2003), корректность аппроксимационных графиков, оценивали по величине коэф фициентов аппроксимации (R2).
В работе использовали: тромбин и фибриноген бычьей крови («Технология стандарт»), тромбопластин (кадаверный лиофильно высушенный, «Технология стандарт»), каолин (легкая фракция фирмы «Технология-стандарт»), набор «D dimer test» («Roche»), изопропанол ч. (дополнительная очистка простой перегон кой), хлорбензол ч. (дополнительная очистка простой перегонкой);
бутанол х. ч., хлорид кальция х.ч., буфер Михаэлиса («Технология-стандарт»), цианокобаламин в ампулах по 1 мл – 200 мкг/мл (ЗАО «Уфавит»), ретинола ацетат в ампулах (Sigma), токоферола ацетат в капсулах (Slovakofarma J.S.C.), никотиновая кислота (ЗАО «Уфавит»);
тетрайодтиронин (L-тироксин-Na, «Berlin-Chemi»).
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Планируя эксперименты, мы сопоставляли уровни маркеров НВСК, коагулоак тивность тромбоцитов и ТкТР при разнообразных по природе, силе и длительно сти воздействиях, объединенных лишь тем, что они приводят к развитию гипо или гиперкоагулемии.
В первую очередь как воздействие, модифицирующее гемостаз [А.И.Бродер, 2002;
П.Я.Шаповалов и др., 2002;
И.А.Аптекарь, 2003;
А.Ш.Бышевский и др., 2003;
С.Л.Галян и др., 2003;
Е.М.Шаповалова, 2010;
О.К.Щепетева, 2011], мы ис пользовали витамины-антиоксиданты и синтетический антиоксидант димефосфон.
Оказалось, что все четыре витамина изменяют коагулоактивность тромбоцитов и плазменный уровень маркеров НВСК в разной мере, но в одном направлении – снижают все без исключения определявшиеся величины. ТкТР, напротив, во всех наблюдениях повышается (рис. 1).
ф.Р-3 ф.-Р-4 ОКАТ СА АДФ-АГ ПДФ РКМФ D-димеры ТкТР - - - - - Ретинол Токоферол Кобаламин Ниацин Димефосфон Рис. 1. Степень изменения (в % от контроля) коагулоактивности тромбоцитов, уровня маркеров НВСК и ТкТР при введении ретинола, токоферола, кобаламина, ниацина (в дозах, превышающих потребность в 2 раза), или димефосфона Сходные сдвиги вызывает и димефосфон – соединение с антиоксидантной актив ностью. Так было получено первое свидетельство существования отрицательной ас социации между коагулоактивностью тромбоцитов и скоростью НВСК с одной сто роны, и ТкТР - с другой. Димефосфон проявляет аналогичный эффект – признак того, что интенсивность ЛПО – фактор, определяющий состояние гемостаза.
На рис. 2 представлен эффект мерказолила, введение которого ведет к торможе нию ЛПО из-за снижения в крови уровня тиреогормонов. На том же рисунке пред ставлен эффект этинилэстрадиола – фактора, ускоряющего ЛПО [В.А.Полякова и др., 1999;
А.И. Бродер, 2002;
П.Я Шаповалов и др., 2003]. Здесь видно, что введе ние мерказолила, снижающего коагулоактивность тромбоцитов (уменьшены все тесты коагулоактивности), сопровождается замедлением НВСК и значительным ростом ТкТР. Видно также и то, что и этинилэстрадиол вызывает противоположно направленные сдвиги коагулоактивности тромбоцитов, скорости НВСК, и величи ны ТкТР - показатели коагулоактивности тромбоцитов и уровень маркеров НВСК растут, а ТкТР снижается.
ф.Р-3 ф.-Р-4 ОКАТ СА АДФ-АГ ПДФ РКМФ D-димеры ТкТР - - этинилэстрадиол мерказолил Рис. 2. Степень отклонения (на 15-й день, в % от контроля) коагулоактивности тромбоцитов, уровня маркеров НВСК и ТкТР при введении мерказолила (12 мг/кг ежедневно) или этинилэстрадиола (6.0 мкг/кг ежедневно) Следовательно, при введении мерказолила или этинилэстрадиола, как и при введе нии витаминов-антиоксидантов, также выявилась отрицательная ассоциация между НВСК и ТкТР – рост коагулоактивности тромбоцитов и ускорение НВСК сопровож далось снижением ТкТР (этинилэстрадиол), а спад коагулоактивности тромбоцитов и замедление НВСК (мерказолил), напротив, сопровождались повышением ТкТР.
Видимо, отрицательная ассоциация между НВСК и ТкТР сопровождает и гипо-, и гиперкоагулемические сдвиги. Значимо и то, что в этом эксперименте выявлена та же ассоциативная связь при воздействиях регуляторных соединений значительно отли чающихся от витаминов по характеру влияния на метаболические процессы.
В следующих опытах крысам вводили те же витамины в прежних дозах, но в те чение восьми недель (вместо двух), контролируя через 2, 4 и 8 недель активность тромбоцитов, уровень маркеров НВСК и ТкТР. Оценивать ЛПО в этом случае не было необходимости, т.к. известно, что с увеличением длительности введения ан тиоксидантов их влияние на ЛПО и АОП в тромбоцитах усугубляются пропор ционально длительности введения [С.Л.Галян и. др., 2003;
А.Ш.Бышевский и др., 2003, 2009;
Р.Г.Алборов и др., 2005;
П.Я.Шаповалов и др., 2005]. Не было необхо димости и в оценке всей совокупности показателей коагулоактивности тромбоци тов, так как все они изменялись однонаправлено и в примерно равной степени с показателем общей коагулоактивности - ОКАТ.
На рис. 3 (рис. 3А - ретинол, 3Б - токоферол, 3В - кобаламин и 3Г - ниацин) представлена динамика сдвигов ОКАТ, уровня маркеров НВСК и ТкТР в зависи мости от продолжительности введения витаминов. Эффекты витаминов выражены в виде степени отклонения измеряемых переменных в процентах от их контроль ных значений (т.е. в виде интенсивных величин). Рис. 3Г содержит легенду, об щую для рис. 3А, 3Б и 3В. В верхней части рисунков располагаются значения ко эффициентов аппроксимации трендов (R2). Чтобы не усложнять рисунки надпися ми, приводим общую для всех графиков последовательность значений R2 слева направо: ОКАТ, ПДФ, РКМФ, D-димеров и ТкТР.
А ОКАТ ПДФ РКМФ D-д ТкТР Линейный (ОКАТ) Линейный (ПДФ) Линейный (РКМФ) Линейный (D-д) Линейный (ТкТР) R2 = 0, R2 = 0,99;
2 R2= 0, R = 0,91;
R = 1,0;
- - - 2 недели 4 недели 8 недель Б R2=0,99 2 R = 0, R = 0, R = 0,999 R = 0, - - - - 2 недели 4 недели 8 недель В R2 = 0,96 2 R2 = 0,75 R2 = 0, R = 0,97 R = 0, - - - 2 недели 4 недели 8 недель Г 40 2 2 2 R = 0,75 R = 0,84 R = 0,98 R = 0, R = 0, - - 2 недели 4 недели 8 недель Рис. 3. Влияние ретинола (3А), токоферола (3Б), кобаламина (3В) и ниацина (3Г) на ОКАТ, уровень маркеров НВСК (ПДФ, РКМФ, D-димеров) и на ТкТР при дли тельном их введении (доза каждого витамина в 2 раза выше потребности в нём).
Обозначения в легенде рис. 3А относятся также к рис. 3Б, 3В и 3Г.
В первую очередь отметим, что степень снижения показателя общей коагулоак тивности тромбоцитов (ОКАТ) становится более выраженной с увеличением дли тельности введения каждого из витаминов. Эффект нарастает линейно – коэффи циенты аппроксимации (R2) трендов, интерполирующих зависимость эффекта от длительности введения ретинола, токоферола и кобаламина весьма близки к еди нице: 0,91, 0,99, 0,96. Исключение составляет величина R2 для ниацина - она равна 0,75. Это связано с относительно малым и медленнее развивающимся его влияни ем (в сравнении с другими витаминами) на величину ОКАТ.
С увеличением длительности опытов столь же закономерно снижался уровень каждого из оцениваемых маркеров НВСК. Коэффициенты аппроксимации (R2) трендов, характеризующих сдвиги уровня ПДФ также предельно близки к единице (1,0, 0,99, 0,97 и 0,84 для ретинола, токоферола, кобаламина и ниацина соответст венно).
Сходны для всех исследованных нами витаминов и линейные тренды, характери зующие спад уровня РКМФ - величины R2 равны 0,99, 0,75, 0,81 и 0,98 соответствен но для ретинола, токоферола, кобаламина и ниацина. Близки и характеристики трен дов, отражающих динамику снижения плазменного уровня D-димеров, - 0,90, 0,99, 0,75 и 0,75 соответственно для ретинола, токоферола, кобаламина и ниацина.
Это позволяет допустить, что оценивать изменения интенсивности НВСК не обяза тельно путем определения всей совокупности маркеров взаимодействия тромбин фибриноген, т.к. динамика их снижения при длительном воздействии, сопровож дающемся развитием гипокоагулемии, сходна (можно сказать идентична).
ТкТР повышалась линейно с увеличением длительности опытов (для каждого из исследуемых витаминов). Об этом свидетельствует величина коэффициентов R линейных трендов, характеризующих динамику эффектов ретинола, токоферола, кобаламина и ниацина - они равны 0,99, 0,96, 0,96 и 0,98 соответственно.
Для подтверждения наличия корреляции и степени ее выраженности, мы ори ентировались на коэффициенты ранговой корреляции (rs).
При введении ретинола обнаружилась тесная положительная связь между сдви гами ОКАТ и уровнем ПДФ (rs = 0,8), сдвигами ОКАТ и уровнем РКМФ (rs = 0,9), сдвигами ОКАТ и уровня D-димеров (rs = 0,8).
При сопоставление динамики сдвигов, вызываемых ретинолом в парах ПДФ РКМФ, ПДФ-D-димеры и РКМФ-D-димеры также выявлены четкие указания на тесную положительную связь (rs = 0,8, 0,8, 0,9 соответственно).
При анализе динамики сдвигов, вызываемых ретинолом в парах ПДФ-ТкТР, РКМФ-ТкТР и D-димеры-ТкТР выявилась тесная отрицательная связь (rs = -0.9, 0.9 и -0,8 соответственно).
Значения rs, вычисленные при сопоставлении динамики тех же пар показателей в опытах с токоферолом или кобаламином практически не отличались от приве денных выше. Несколько ниже была теснота всех положительных и отрицатель ных ассоциаций при введении ниацина, ниже были и все его другие исследовав шиеся эффекты.
Результаты эксперимента позволяют с бльшей уверенностью утверждать наличие тесной положительной связи между сдвигами общей коагулоактивности тромбоци тов (ОКАТ) и уровнем каждого из определявшихся маркеров НВСК. Несомненно, и существование такой же связи между изменениями уровня отдельных маркеров НВСК (ПДФ, РКМФ и D-димеров), а также тесной отрицательной связи между ди намикой каждого из маркеров НВСК с динамикой толерантности к тромбину.
Таким образом, при введении витаминов-антиоксидантов отрицательная ассо циация между НВСК и ТкТР сохраняется при разной длительности воздействия.
Оказалось также, что сдвиги коагулоактивности, будучи тесно положительно ас социированы со сдвигами уровня маркеров НВСК, отрицательно ассоциируют со сдвигами ТкТР. Таким образом, оценка ОКАТ может служить ещё одним тестом для суждения о состоянии ТкТР, особенно в комбинации с маркерами НВСК.
Далее изучали эффекты тироксина, выбрав такие дозы, которые вызывают мед ленно прогрессирующую гиперкоагулемию. Данные рис. 4 свидетельствует, что ОКАТ растет с увеличением продолжительности введения наименьшей из доз ти роксина. Растет также уровень всех определявшихся маркеров НВСК (ПДФ, РКМФ и D-димеров), а ТкТР при этом снижается.
Динамика всех оцениваемых сдвигов предельно близка к линейной – R2 для всех маркеров близки к единице, что указывает на линейную зависимость эффекта ти роксина от длительности его введения в использованной дозе.
Существенно с позиций цели работы то, что здесь, как и в предыдущих опытах, между ОКАТ и уровнем маркеров НВСК (с одной стороны) и ТкТР (с другой) выяв лена отрицательная ассоциация. Таким образом, и при воздействии, ведущем к ги перкоагулемии (введение тироксина), сохраняется тот же тип зависимости (отрица тельная ассоциация) между динамикой сдвигов ТкТР и динамикой сдвигов уровня маркеров НВСК (при минимальной дозе тироксина), который находили на фоне ги покоагулемии (при введении витаминов-антиоксидантов и димефосфона). При оцен ке ранговой корреляции подтвердилась и высокая теснота связи - rs = -0,9.
Все сказанное относится и к сдвигам, вызванным более высокими дозами тирокси на (1,3, 1,6 и 1,9 мг/кг) - при введении каждой них найден линейный прирост коагу лоактивности тромбоцитов, уровня маркеров НВСК и снижения ТкТР (соответст вующие графики мы не приводим из-за ограниченности листажа в автореферате).
ОКАТ R2 = 0,99;
ПДФ РКМФ R = 1,0;
R = 0,91;
D-д ТкТР Линейный (ОКАТ) Линейный (ПДФ) Линейный (РКМФ) Линейный (D-д) Линейный (ТкТР) 65 2 2 2 R = 0,99 R = 0, R = 0,99 R = 0, R = 0, - - 2 недели 4 недели 8 недель Рис. 4. Отклонения (в % от контроля) уровня маркеров НВСК и ТкТР в зависимо сти от длительности введения тироксина в дозе 1,0 мг/кг.
Следовательно, как при инициации гипокоагулемии, так и при инициации ги перкоагулемии существует тесная отрицательная зависимость между сдвигами ин тенсивности НВСК и ТкТР, которая сохраняется при разной продолжительности наблюдений и при изменении силы воздействия (т.е. изменении дозы). Это ещё одно свидетельство существования отрицательной ассоциации между интенсивно стью НВСК и толерантностью к тромбину.
Приняв во внимание то, что состояние гемостаза в разные времена года не одинаково [Ю.И.Гурфинкель и др., 2005], мы рассмотрели сдвиги изучаемых нами показателей в разные сезоны (весна, лето, осень и зима) (рис.5).
На рис. 5 видно, что ход тренда, характеризующего ТкТР прямо противополо жен по направлению трендам, характеризующим сдвиги уровня маркеров НВСК.
В связи с этим можно настаивать на том, что и в сезонном разрезе выявляется от рицательная связь между НВСК и ТкТР.
Затем мы изучили влияние на коагулоактивность тромбоцитов, НВСК, ТкТР и других воздействий, ускоряющих эндогенный тромбиногенез, используя с этой целью введение тромбопластина в дозе, не вызывающей гибели животных.
ОКАТ ПДФ РКМФ Д-димеры ТкТР Полиномиальный (ОКАТ) Полиномиальный (ПДФ) Полиномиальный (РКМФ) Полиномиальный (Д-димеры) Полиномиальный (ТкТР) ОКАТ R2 = ПДФ R2 = РКМФ R2 = Д-димеры, R2 = ТкТР, R2 = - - - Лето Осень Зима Рис. 5. Отклонения (в %) ОКАТ, уровня ПДФ, РКМФ, D-димеров и ТкТР летом, осенью и зимой от значений, найденных весной и принимаемых за равные 100% Через 0,5 ч после введения взвеси тромбопластина заметно возросли значения всех показателей уровня маркеров НВСК (рис.6). Увеличился и интегральный по казатель коагулоактивности тромбоцитов, в то время как ТкТР снизилась.
ОКАТ ПДФ РКМФ D-димеры ТкТР Линейный (ОКАТ) Линейный (ПДФ) Линейный (РКМФ) Линейный (D-димеры) Линейный (ТкТР) ПДФ РКМФ 75 ОКАТ 55 D-димеры - - ТкТР - через 0.5 ч через 1 ч Рис. 6. Динамика общей коагулоактивности тромбоцитов, уровня маркеров НВСК и ТкТР (отклонения в % от контроля) после введения тромбопластина Таким образом, и при гипокоагулемии потребления, которая была вызвана введе нием тромбопластина, выявлена отрицательная ассоциация между коагулоактивно стью тромбоцитов, уровнем маркеров НВСК с одной стороны и ТкТР - с другой.
Далее мы провоцировали эндогенную гипертромбинемию инъекциями адрена лина - 30 мкг/кг. Эта доза не ускоряет потребление фибриногена, т.е. провоцирует компенсированную гиперкоагулемию, длящуюся более получаса.
Выявилось (рис. 7), что сдвиги ОКАТ, ПДФ, РКМФ и D-димеров противона правлены сдвигам ТкТР - признак отрицательной связи.
ОКАТ ПДФ РКМФ D-димеры ТкТР Линейный (ОКАТ) Линейный (ПДФ) Линейный (РКМФ) Линейный (D-димеры) Линейный (ТкТР) ПДФ ОКАТ РКМФ D-димеры - ТкТР - - через 20 мин через 30 мин Рис. 7. Динамика ОКАТ, уровня маркеров НВСК и ТкТР (отклонения в % от кон троля через 20 и 30 мин после инъекции адреналина) Исследуя изменения всех тех же показателей под влиянием гепарина, предвари тельно мы нашли те его дозы (1, 4 и 8 мг/кг), которые при внутримышечном введе нии вызывают различающуюся по степени гипокоагулемию, и изучили их эффекты.
На рис. 8 видно, что, как и в случае с введением животным соединений, вызы вающих гиперкоагулемию (адреналина, тироксина), здесь наблюдаются линейные сдвиги всех оцениваемых показателей.
ОКАТ ПДФ РКМФ D-димеры ТкТР Линейный (ОКАТ) Линейный (ПДФ) Линейный (РКМФ) Линейный (D-димеры) Линейный (ТкТР) R2 = 0, R2 = 0,80 R2 = 0,83 R2 = 0, R2 = 0, - - - дозы: 1 4 8 мг/кг Рис. 8. Изменения ОКАТ, плазменного уровня маркеров НВСК и ТкТР (откло нения в % от контроля через 1 ч после инъекции разных доз гепарина);
значения R2 расположены в поле диаграммы в последовательности, обозначенной в легенде Обнаруживается и отрицательная ассоциация между сдвигами ОКАТ и сдвигами уровня каждого из маркеров НВСК в отдельности (с одной стороны), и толерант ностью к тромбину – с другой.
Можно констатировать, что в результате введения прямого антикоагулянта, как и в других экспериментальных ситуациях, сопровождающихся гипо- или гипер коагулемией, выявляется отрицательная связь между НВСК и ТкТР.
Это подкрепляет предположение о возможности контролировать ТкТР путем оценки уровня маркеров ВТФ, являющихся одновременно маркерами НВСК.
Таким образом, все рассмотренные выше данные указывают на отрицательную корреляцию между коагулоактивностью тромбоцитов и ТкТР, а также между уровнем маркеров НВСК и ТкТР. В связи с этим возникла необходимость выяс нить, какие из указанных сдвигов – изменение ОКАТ или изменение интенсивно сти НВСК - инициируют сдвиги толерантности к тромбину.
Пытаясь ответить на этот вопрос, мы изучили, отбирая пробы крови с малыми ин тервалами после введения гепарина (через 20, 30, 40, 50 и 60 мин) динамику сдвигов коагулоактивности тромбоцитов и уровня маркеров НВСК, контролируя одновре менно и ТкТР. Все результаты подвергли графическому анализу. На рис. 9 и рис. видно, что чем дольше длится наблюдение, тем заметнее становятся сдвиги всех оце ниваемых показателей, и то, что зависимость степени сдвигов от времени наблюде ний носит линейный характер (величины R2 трендов на обоих рисунках близки к единице). Видна и отрицательная зависимость между каждым из тестов, отражающих ОКАТ или уровень маркеров НВСК и толерантностью к тромбину.
Ф.Р.-3 Ф.Р-4 ОКАТ СА АДФ-АГ ТкТР Линейный (Ф.Р.-3) Линейный (Ф.Р-4) Линейный (ОКАТ) Линейный (СА) Линейный (АДФ-АГ) Линейный (ТкТР) R2 = 0,98 R2 = 0, R2 = 0,97 R2 = 0,99 R2 = 0, R2 = 0, - - - через 20 60 мин 30 40 Рис. 9. Изменения коагулоактивности тромбоцитов и ТкТР (отклонения в % от контроля в разные сроки после инъекции гепарина - 8 мг/кг). Значения R2 располо жены в поле диаграммы в той же последовательности, что и в легенде слева направо.
Итак, (рис. 9), через 20 мин после введения гепарина коагулоактивность тромбоци тов уже снизилась (ниже контроля оказались уровни фф. Р3 и Р4, ОКАТ), как и их способность к агрегации (и спонтанная и АДФ-агрегация, р 0.05). Тогда же (рис.
10) уровень ПДФ и РКМФ был равен контрольному, а уровень D-димеров обнаружи вал лишь слабо выраженную тенденцию к снижению (на 5% при р 0,05).
ПДФ РКМФ D-димеры ТкТР Линейный (ПДФ) Линейный (РКМФ) Линейный (D-димеры) Линейный (ТкТР) R2 = 0,89 R2 = 0, 80 R2 = 0, R = 0, - - - через мин 20 30 40 50 Рис. 10. Сдвиги уровня маркеров НВСК и ТкТР (отклонения в % от контроля в разные сроки после инъекции гепарина – 8 мг/кг);
Значения R2 расположены в поле диаграммы в той же последовательности, что и в легенде слева направо.
Через 30 мин после введения гепарина коагулоактивность тромбоцитов (по всем показателям) уже отличалась не только от контрольных величин, но и от величин, найденных на 20-й минуте. Уровень ПДФ обнаружил к этому моменту лишь тен денцию к снижению, уровень РКМФ не изменился, а уровень D-димеров упал, но в меньшей мере, чем показатели коагулоактивности тромбоцитов. И только через 40 минут после введения гепарина, когда показатели коагулоактивности тромбо цитов были уже заметно ниже, чем на 20-й и 30-й минутах, уровни всех маркеров НВСК снизились достоверно. По всей видимости, вначале на введение антикоагу лянта реагируют тромбоциты, несколько позднее изменяется и степень тромбине мии, от которой и зависит интенсивность НВСК. Как и в других экспериментах, здесь (рис. 9 и 10) видно, что со снижением коагулоактивности тромбоцитов и, со ответственно, снижением уровня маркеров НВСК растет ТкТР. Кроме этого здесь видно, что в отсутствии сдвигов со стороны тромбоцитов и НВСК отсутствуют и изменения ТкТР.
Кроме того, выявлено (соответствующие данные приведены в диссертации), что в ответ на введение соединений, вызывающих гиперкоагулемию (адреналина и ти роксина) в более ранние сроки наблюдается рост коагулоактивности тромбоцитов, позднее - рост уровня маркеров НВСК и лишь затем снижение ТкТР. Следова тельно, схематически последовательность наблюдаемых изменений можно пред ставить следующим образом: введение антикоагулянта или прокоагулянта снижение (соответственно рост) коагулоактивности тромбоцитов за медление (соответственно ускорение) НВСК повышение (соответст венно снижение) толерантности к тромбину.
И это позволило согласиться с предположением об инициирующей роли тромбо цитов в развитии гиперкоагулемии [А.Ш.Бышевский и др., 1998, 2006, 2010, 2011;
С.Л.Галян, 1997, 2003;
Р.Г.Алборов, 2006;
В.Г.Соловьев, 1997;
В.В. Юдин, 2002].
Завершая опыты, мы прибегли к определению ТкТР по частоте выживания жи вотных при внутривенном введении тромбина в DL50%, определяя толерантность одновременно и способом, основанном на определении остаточного количества фибриногена после введения более слабого раствора тромбина: 1 группа – кон трольная (крысы получали полноценный рацион 10 недель), 2 группа – крысы по лучали тироксин (1,3 мг/кг ежедневно) в течение 10 недель с тем же рационом, 3.
крыс содержали на полноценном рационе 10 недель, гепарин ввели внутримы шечно (8 мг/кг) в последний день 10-й недели. У всех крыс определяли в один и тот же день активность тромбоцитов и уровень маркеров НВСК (5 особей) и ТкТР (5 особей), а на 20 особях из каждой группы - частоту выживания (за 24 ч) после внутривенного введения тромбина (1 мл/кг, активность - 21 с). Сдвиги после вве дения тироксина или гепарина совпали с представленными на рисунках, иллюст рирующих эффекты этих соединений (рис. 4 и 8). Частота выживания на фоне ти роксина после введения DL50% тромбина (т.е. ТкТР, определяемая этим приемом) упала против контроля на 36%, при введении нетоксичной дозы тромбина ТкТР упала на 34% (р 0,075). На фоне гепарина разница между результатами, полу ченными первым и вторым приёмом, существенна - в первом случае ТкТР повы шена на 81%, во втором - на 39%. Расхождение объяснить так: первый приём оце нивает толерантность к тромбину через 1 ч после внутривенного введения (по сте пени потребления плазменного фибриногена), второй приём выражает толерант ность к тромбину через процент выживших за 24 ч животных. Здесь на результате сказывается не только способность организма ограничивать взаимодействие меж ду тромбином и фибриногеном (за счет изменения скорости потребления субстра та), но и способностью организма противодействовать негативному эффекту, обу словленному успевающими развиться нарушениями микроциркуляции. Иначе го воря, направленность изменений ТкТР, определяемой обоими способами, оди накова - при повышении уровня маркеров НВСК, толерантность к тромбину сни зилась при её оценке обоими приемами, а при снижении уровня маркеров, толе рантность повысилась также в обоих случаях.
Этим ещё раз подтвердилось наличие отрицательной ассоциации между сдви гами интенсивности НВСК и ТкТР при разных экспериментальных ситуациях.
Заключая обсуждение, выделим наиболее важные моменты.
Разнообразие экспериментальных ситуаций, в которых разнонаправлено изменя ется степень коагулоактивности тромбоцитов и уровень маркеров НВСК свиде тельствует о наличии отрицательной связи между коагулоактивностью тромбоци тов или НВСК с одной стороны и ТкТР – с другой.
Последовательность развития этих изменений во времени укладывается в выше представленную схему, а оценка взаимосвязей между изучавшимися переменны ми, позволяет рассматривать эту отрицательную связь как достаточно тесную.
Итак, существует возможность судить о ТкТР путем оценки коагулоактивности тромбоцитов или уровня маркеров НВСК. При повышении коагулоактивности тромбоцитов или уровня маркеров НВСК при разных воздействиях, толерантность к тромбину снижается, а при снижении коагулоактивности тромбоцитов или уровня маркеров НВСК, толерантность к тромбину растет. Это позволяет наде яться, что способность организма адекватно реагировать на воздействия, повы шающие тромбинемию (следовательно, повышающие коагулоактивность тромбо цитов и ускоряющие НВСК), можно оценивать по уровню коагулоактивности тромбоцитов и (или) по плазменному уровню маркеров взаимодействия тромбин фибриноген.
ВЫВОДЫ 1. Разнообразные по природе воздействия (2-кратный избыток витаминов А, Е, В5 и В12, введение тироксина, мерказолила, адреналина, тромбопластина, ге парина, смена сезонов) на организм экспериментальных животных, содержа щихся на сбалансированном по калорийности, микро- и макронутриентам ра ционе, сопровождаются изменением интенсивности НВСК.
2. Сдвигам интенсивности НВСК, вызываемым этими воздействиями, сопутству ют сдвиги доступных определению в неспециализированной клинической лабо ратории показателей коагулоактивности тромбоцитов (их способность к реак ции высвобождения, к спонтанной и АДФ-индуцируемой агрегации и их общей коагулоактивности).
3. При воздействиях, перечисленных в выводе 1, интенсификация внутрисосу дистого свертывания крови сопровождается увеличением коагулоактивности тромбоцитов, а при воздействиях, замедляющих внутрисосудистое свертыва ние крови, коагулоактивность тромбоцитов снижается.
4. Независимо от вида перечисленных воздействий, их интенсивности и про должительности во всех случаях выявляется тесная положительная линейная ассоциация между показателями интенсивности непрерывного внутрисосуди стого свертывания крови и показателями коагулоактивности тромбоцитов (величины rs колеблются от 0,8 до 1.0, а R2 от 0,99 до 0,82).
5. Независимо от вида, интенсивности и продолжительности воздействия, связь между показателями коагулоактивности тромбоцитов, а также уровнем мар керов непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантностью к тромбину является тесной отрицательной (rs колеблются от 0,7 до 0.9).
6. Результаты определения сдвигов коагулоактивности тромбоцитов и интен сивности непрерывного внутрисосудистого свертывания, а также толерантно сти к тромбину инвазивным методом (по частоте выживания животных после внутривенного введения тромбина) близки у животных к данным, получен ным при оценке толерантности к тромбину неинвазивным методом, т.е. по степени сдвигов коагулоактивности тромбоцитов или маркеров НВСК.
7. Судить о толерантности обследуемого к тромбину можно по уровню в кро вотоке продуктов взаимодействия тромбин-фибриноген, являющихся марке рами непрерывного внутрисосудистого свертывания крови, или по коагулоак тивности тромбоцитов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Целесообразно контролировать толерантность к тромбину, определяя спо собность тромбоцитов к высвобождению (определение уровня в плазме крови факторов Р3 и Р4), спонтанную, АДФ-индуцированную агрегацию, общую ко агулоактивность тромбоцитов и плазменный уровень продуктов коагуляци онного превращения фибриногена (ПДФ, РКМФ, D-димеры).
2. В отсутствие условий для выполнения всех перечисленных выше определе ний, можно ограничиваться оценкой общей коагуляционной активности тромбоцитов - метод, который требует минимум оборудования (лабораторная центрифуга для получения тромбоцитов, термостатированная водяная баня, микропипетка с делениями в 0,1 мл и подсветка). Необходимо также распола гать собственными данными о величине определяющихся показателей у здо ровых доноров. Желательно по этим данным строить калибровочную кривую зависимости показателей от степени разведения плазмы донора - в этом слу чае, принимая среднее значение у здоровых доноров за 100%, можно найден ную у пациента величину выражать в процентах относительно нормы.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ (* - публикации в журналах, рекомендованных ВАК) 1.*Бышевский А.Ш. Маркеры взаимодействия тромбин-фибриноген, коагулоак тивность тромбоцитов, фибринолиз, толерантность к тромбину и состояние ЛПО при содержании крыс на сбалансированном рационе без витамина В5 и с его избытком/ А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, М.Г.Галушко, и др. // Медицинская наука и образова ние Урала. - 2008. – 4. - С.32-35.
2.Бышевский А.Ш. Гемостаз при неразвивающейся беременности, влияние антиок сиданта селмевита/А.Ш.Бышевский, В.А.Полякова, М.Г.Галушко и др.//Успехи со временного естествознания. – 2008. – 5. – С.67.
3.Byshevsky A.Sh. Antioxidant complex selmevit in hemostasis correction at some uter ine surgeries (report III) / A.Sh. Byshevsky, S.L. Galyan, M.G. Galushko e.a. // European journal of natural history. – 2008. -3. - P.10-15.
4.Галушко М.Г. О связи витамина В12 с гипергомоцистеинемией и гемостазом (об зор литературы) // Материалы 42-й Всероссийской научной конференции «Актуаль ные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фарма ции». – Тюмень. – 2008.- С.27.
5.Галушко М.Г. Гемостаз и липопероксидация при гипертиреозе и тиреотоксикозе // Материалы 43-й Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теорети ческой, экспериментальной, клинической медицины и фармации». Тюмень. - 2009. С.27.
6.*Алборов Р.Г. Маркеры непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантность к тромбину при гипертромбинемии / Р.Г.Алборов, Л.А.Васильев, М.Г.Галушко и др.// Медицинская наука и образование Урала. – 2009. – 2. - С. 49-51.
7.*Галушко М.Г. Гемостаз при гипертиреозе и тиреотоксикозе/ М.Г.Галушко, Р.Г.Алборов, Л.А.Васильев и др. // Медицинская наука и образование Урала. – 2009. 2. - С.147-149.
8.Бышевский А.Ш. Непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и липидпе роксидация в тромбоцитах/ А.Ш.Бышевский, Л.А.Васильев, С.Л.Галян, М.Г.Галушко и др. // Материалы всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии». Челябинск - 2009. - С.16-19.
9.Byshevsky A.Sh. Antioxidant complex selmevit in hemostasis correction at some uter ine surgeries/ A.Sh.Byshevsky, S.L.Galyan, M.G.Galushko e.a. // Фундаментальные ис следования. – 2009. – 3. – С.7- 10.Бышевский А.Ш. Связаны ли изменения липидпероксидации в тромбоцитах со скоростью самосборки фибрина/ А.Ш.Бышевский, М.Г.Галушко, А.Ю.Рудзевич и др.
// Тромбоз, гемостаз и реология – 2010. - 1(41). – С. 52-59.
11.Винокурова Е.А. Гемостаз и липидпероксидация при беременности (обзор лите ратуры) / Е.А.Винокурова, М.Г.Галушко// Материалы 44-й Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клиниче ской медицины и фармации». Тюмень. - 2010. - С. 19-20.
12.Галушко М.Г. Влияние эстрогенов и гестагенов на гемостаз в эксперименте / М.Г.Галушко, И.А.Карпова // Материалы 44-й Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации». Тюмень. - 2010. – С. 34-35.
13.Полякова В.А. Изменения системы гемостаза и липидпероксидации при внутри маточном использовании левоноргестрела / В.А.Полякова, А.Ш.Бышевский … М.Г.
Галушко и др. // Материалы Российского национального конгресса «Человек и ле карство. Урал–2010». Тюмень. – 2010 - С. 123-123.
14.Бышевский А.Ш. Гемостаз, перекисное окисление липидов и витамины / А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, М.Г.Галушко и др. // Материалы III Международной научно-практической конференции «Адаптация биологических систем к естествен ным и экстремальным факторам среды» Челябинск. – 2010. С.40-43.
15.Бышевский А.Ш. Толерантность организма к тромбину, коагулоактивность тромбоцитов и уровень маркеров непрерывного внутрисосудистого свертывания кро ви /А.Ш.Бышевский, С.Л.Галян, М.Г.Галушко и др. //Материалы 5-й Всероссийской конф. (с международным участием) «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» М.: Министерство здравоохранения и социального развития РФ. Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева, Науч ное общество «Клиническая гемостазиология». – 2011. С.84- 16.Галушко М.Г. Влияние витаминов-антиоксидантов на непрерывное внутрисосу дистое свертывание крови, коагулоактивность тромбоцитов и толерантность к тром бину / М.Г.Галушко, С.Л.Галян // Там же. – С. 122- 17.Галушко М.Г. Влияние витаминов-антиоксидантов на непрерывное внутрисосу дистое свертывание крови, коагулоактивность тромбоцитов и толерантность к тром бину/М.Г.Галушко// Материалы 45-й Всероссийской научной конференции «Акту альные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фар мации». – Тюмень. - 2011. – С.29.
18.*Полякова В.А. Изменения гемостаза у женщин на фоне гормональной контра цепции в зависимости от состава, пути и длительности введения / В.А.Полякова, А.Ш.Бышевский, … М.Г.Галушко // Медицинская наука и образование Урала. 2011. – 3. - С.18-22.
Главы в монографиях 19. Витамины А, Е, С, В5 и В12, гемостаз и перекисное окисление липидов / Е.М.Шапо валова, Л.А.Васильев, М.Г.Галушко и др. // Глава в монографии «Влияние важнейших витаминов-антиоксидантов на непрерывное внутрисосудистое свертывание и толерант ность к тромбину». Москва: Медицинская книга. – 2009. – 112 с. – С. 14-46.
20. Интегральные показатели состояния гемостаза в зависимости от обеспеченности организма витаминами-антиоксидантами /М.Г.Галушко и др.// Глава в монографии «Влияние важнейших витаминов-антиоксидантов на непрерывное внутрисосудистое свертывание и толерантность к тромбину». Москва: Медицинская книга. – 2009. – с. – С. 46-79.
Используемые сокращения активированное время рекальцификации АВР аденозиндифосфорная кислота (аденозиндифосфат) АДФ антиоксидантный потенциал АОП активированное частичное тромбопластиновое время АЧТВ взаимодействие тромбин-фибриноген ВТФ диеновые конъюгаты ДК липидпероксидация (перекисное окисление липидов) ЛПО непрерывное внутрисосудистое свертывание крови НВСК общая коагулирующая активность тромбоцитов ОКАТ продукты деградации фибрина ПДФ период индукции ПИ растворимые комплексы мономерного фибрина РКМФ скорость индуцированного окисления СО вещества, взаимодействующие с тиобарбитуровой кислотой ТБК толерантность к тромбину ТкТР фактор (факторы) Ф. (фф.) средняя летальная доза вещества, вызывающая гибель половины DL50% особей испытуемой группы животных ГАЛУШКО МАКСИМ ГЕННАДЬЕВИЧ ОЦЕНКА ТОЛЕРАНТНОСТИ ОРГАНИЗМА К ТРОМБИНУ ПО КОАГУЛОАКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ И УРОВНЮ МАРКЕРОВ НЕПРЕРЫВНОГО ВНУТРИСОСУДИСТОГО СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Подписано в печать 23.12.2011 г.
Формат 60х84/16. Печ. л. 1,0. Печать ризограф.
Тираж 100. Зак. № Типография ООО «Печатник», лицензия ПД № 17- Тюмень, ул. Республики, 148 корп. 1/2.
Тел. (3452) 20-51-13, тел./факс (3452) 32-13-