Структурно-функциональная характеристика поджелудочной железы потомства самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы различного генеза
На правах рукописи
Ильиных Марина Анатольевна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПОТОМСТВА САМОК КРЫС С ХРОНИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ГЕПАТОБИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА 03.00.13 – «Физиология»
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Челябинск - 2007 1
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному разви тию» Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Брюхин Геннадий Васильевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Сашенков Сергей Львович ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» кандидат биологических наук, доцент Мамылина Наталья Владимировна ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет»
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Курганский государственный университет»
Защита диссертации состоится « » октября 2007 года в часов на заседании диссертационного совета Д 212.295.03 при ГОУ ВПО «Челябинский государст венный педагогический университет» по адресу: Россия, 454080, г. Челябинск, пр. им.Ленина, д.69, 116 ауд.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Челябинский го сударственный педагогический университет».
Автореферат разослан « » августа 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Н.В. Ефимова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность настоящего исследования определяется, прежде всего, тем, что сегодня в условиях критического демографического положения, сложивше гося в Российской Федерации, одной из ведущих проблем современного обще ства является воспроизводство здорового поколения (Кулаков В.И., Серов В.Н.
и др., 1998, 2001;
Баранов А.А., 1999;
Филатов Н.Н., 1999 и др.). Наиболее ост рыми проблемами здоровья населения в 2003 году явились низкий уровень ро ждаемости (9,8 на 1000 населения в 2002 году и 10,2 в 2003 году), и более вы сокий уровень смертности (16,3 на 1000 населения в 2002 году и 16,4 в 2003 го ду) (Государственный доклад…, 2005).
Общепризнанно, что здоровье детей тесно связано с состоянием здоровья их родителей и, прежде всего, их матерей, особенно в период вынашивания ре бенка. Как свидетельствуют данные официальной статистики, ухудшение пока зателей воспроизводства населения России происходит на фоне понижения ка чества здоровья беременных женщин (Гимадеев М.М., Бородин Ю.В. и др., 1998;
Государственный доклад…, 2006).
Среди факторов, определяющих беременность высокого риска, выделяют демографические, социально-экономические, материальные, плацентарные, ро довые, неонатальные. При этом одной из причин перинатальной патологии яв ляются экстрагенитальные заболевания женщин, в структуре которых особое место занимают болезни гепатобилиарной системы (Гутман Л.Б., Закревский А.А. и др., 1981;
Шехтман М.М., 1991;
Подымова С.Д.,1998). Среди хрониче ских заболеваний печени наиболее распространенными являются хронические гепатиты различной этиологии (инфекционной, токсической, лекарственной, алкогольной, аутоиммунной, холестатической и др.), циррозы печени, а также заболевания желчных путей - холангиты, дискинезии желчных путей, желчно каменная болезнь, часто обусловливающие развитие хронических поражений печени (Михайленко Е.Т., Закревский А.А. и др., 1990;
Шехтман М.М., 2000).
Многочисленные клинические наблюдения и экспериментальные исследования указывают на задержку структурно-функционального становления систем жиз необеспечения потомства матерей с хронической патологией гепатобилиарной системы.
В связи с выше изложенным, целью настоящего исследования явился анализ особенностей структурно-функционального становления поджелудоч ной железы у потомства самок крыс с экспериментальным хроническим пора жением печени различного генеза.
Для достижения поставленной цели нами были сформулированы сле дующие задачи:
1. Оценить особенности структурно-функционального становления экзок ринного аппарата поджелудочной железы потомства самок крыс с хрони ческим экспериментальным поражением печени различного генеза.
2. Изучить особенности структурно-функционального становления эндок ринного аппарата поджелудочной железы потомства самок крыс с хрони ческим экспериментальным поражением печени различного генеза.
3. Провести сравнительный анализ особенностей структурно функционального становления поджелудочной железы потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени токсическо го и аутоиммунного генеза.
Научная новизна На адекватных экспериментальных моделях, воспроизводящих различные формы поражения печени (аутоиммунную и токсическую) у матери, впервые установлены общие механизмы нарушения структурно-функционального со стояния поджелудочной железы у потомства, обусловленные изменением усло вий внутриутробного развития.
Новыми являются данные по сравнительному анализу особенностей структурно-функционального состояния экзокринной и эндокринной части поджелудочной железы потомства самок крыс с экспериментальным хрониче ским аутоиммунным и токсическим поражением печени. При этом установле но, что более выраженные нарушения структурно-функционального состояния эндокринного (уменьшение относительной объемной плотности эндокринной части, размеров и плотности расположения островков Лангерганса, диаметра эндокриноцитов и снижение содержания органоидов секреции и концентрации инсулина в сыворотке крови) и экзокринного (уменьшение относительной объ емной плотности паренхиматозного компонента, диаметра секреторных отде лов, размеров ациноцитов и их ядер, снижение активности амилазы крови) ап паратов поджелудочной железы выявлены у потомства самок крыс с токсиче ским поражением печени по сравнению с крысятами аутоиммунной группы.
Теоретическое и практическое значение В условиях эксперимента впервые получены новые данные об особенно стях становления стромального и паренхиматозного компонентов поджелудоч ной железы у потомства матерей с хроническим поражением гепатобилиарной системы, которые являются фундаментальными в области физиологии пищева рения. Результаты проведенных исследований позволяют углубить и расширить представление о механизмах, обусловливающих нарушение становления секре торной и инкреторной функций поджелудочной железы у потомства матерей с хронической патологией гепатобилиарной системы различной этиологии.
Экспериментальные данные, выявленные в ходе проведенного исследо вания, научно обосновывают необходимость выделения потомства матерей с хронической патологией гепатобилиарной системы различной этиологии в группу риска, в связи с возможностью развития заболеваний пищеварительной системы и обмена веществ. Полученные результаты могут быть использованы для этиологически и патогенетически обоснованного планирования и ведения беременности с целью получения морфофункционально зрелого и здорового потомства.
Результаты проведенного исследования используются в учебном процес се кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедры акушерства и гине кологии №1 ГОУ ВПО «Челябинской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», а так же кафедры биологии человека и медико-биологической подготовки ГОУ ВПО «Челябинского государственного педагогического университета».
Апробация работы Материалы диссертации рассмотрены и обсуждены на международной научно-практической конференции, посвященной 75-летию УГАВМ (Троицк, 2005);
70-ой юбилейной Республиканской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретиче ской и практической медицины» (Уфа, 2005);
конференции «Естествознание и гуманизм», посвященной 170-летию со дня рождения Г.Н. Потанина (Томск, 2005);
V Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2006);
научно-практической конференции «Современные медицинские технологии в здравоохранении города», посвященной 270-летию г.Челябинска (Челябинск, 2006);
конференции «Актуальные проблемы морфологии», посвя щенной 30-летию НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 2006);
I Международной научно-практической конференции «Адаптация био логических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челя бинск, 2006).
Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 1 публикация в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 165 страницах машинописи и состоит из введе ния, обзора литературы, описания использованных моделей и методов исследо вания, главы с описанием полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка использованной литературы, включающего 266 источников, в том числе 43 работы зарубежных авторов. Диссертационное исследование иллюстрирова но 13 таблицами, 27 рисунками, в том числе 13 микрофотографиями и 9 элек тронными микрофотографиями.
Положения, выносимые на защиту:
1. Фактором риска, оказывающим неблагоприятное влияние на антена тальное и постнатальное структурно-функциональное состояние под желудочной железы потомства, являются хронические поражения пе чени матери.
2. Поражение гепатобилиарной системы различного генеза у матери в условиях эксперимента приводит к стандартным нарушениям струк турно-функционального состояния экзокринного аппарата поджелу дочной железы потомства, о чем свидетельствует изменение весовых характеристик органа, увеличение массы стромы, уменьшение массы паренхимы, изменение диаметра концевых (секреторных) отделов, а также снижение активности амилазы сыворотки крови.
3. В основе формирования дисфункции эндокринного аппарата поджелу дочной железы у 45-ти дневного потомства самок крыс с эксперимен тальным поражением печени различного генеза является изменение количественного соотношения А- и В-эндокриноцитов и снижение концентрации инсулина в сыворотке крови.
4. Схема патогенеза нарушений морфогенеза поджелудочной железы у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением гепатобилиарной системы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные исследования проведены на белых лабораторных крысах (самках) «Вистар» и их потомстве (125 животных из 29 пометов) в раз личные сроки постнатального развития (на 1-ый, 15-ый, 30-ый и 45-ый дни).
Сроки исследования согласуются с общепризнанным подразделением возрас тных периодов данной группы животных (Западнюк И.П. и др., 1983): период новорожденности (1-5 день), подсосный (6-21 день) и период полового созрева ния (22-50 день).
В соответствии с задачами настоящего исследования все животные были разбиты на 3 группы. Первая группа включала потомство, рожденное от здоро вых животных (контрольная группа – «К») (50 животных из 16 пометов). Вто рая группа – потомство животных с хроническим аутоиммунным поражением печени (аутоиммунная группа – «А») (45 крысят из 15 пометов). Третья группа – потомство животных с хроническим токсическим поражением печени (токси ческая группа – «Т») (48 крысят из 14 пометов).
Модель хронического аутоиммунного поражения печени у взрослых са мок крыс создавалась путем длительной сенсибилизации животных гомологич ным антигеном печени, приготовленным по общепринятой методике с адью вантом Фрейнда (Брюхин Г.В., Грачев А.Ю., 1987;
Lohse A., Manns M., 1990).
Модель хронического токсического поражения печени у крыс создавалась путем подкожного введения 0,1 мл 40%-го раствора четыреххлористого угле рода (ССL4) на растительном масле дважды в неделю в течение двух месяцев (Саркисов Д.С., Ремизов П.И., 1960). Поражение гепатобилиарной системы у экспериментальных животных верифицировали с помощью морфологических, биохимических и иммунологических методов.
Исходя из поставленных задач, нами использовались морфологические, морфометрические, иммунохемилюминесцентный, амилокластические, элек тронномикроскопические и статистические методы исследования.
Оценку особенностей структурно-функционального становления экзок ринной и эндокринной функции поджелудочной железы потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени производили с исполь зованием общепринятых критериев (Агеев А.К., 1984;
Комолов И.С., Садовни кова Н.В., 1984;
Бойко Ю.Г., Прокопчик Н.И., 1987;
Зуннунова С.Э., 1987;
Да нилов М.В., 1995;
Соколов В.И., 1995).
Оценка состояния соединительнотканного компонента поджелудоч ной железы. На серийных гистологических срезах поджелудочной железы оп ределяли абсолютную и относительную площадь соединительной ткани, крове носных сосудов, относительную объемную плотность стромы. О степени кро воснабжения железы судили на основании числа кровеносных сосудов в услов ной единице площади (0,1 мм2). С помощью окуляр-микрометра при увеличе нии окуляра 15, объектива 40 определяли диаметр кровеносных сосудов.
Оценка состояния паренхиматозного компонента. Для оценки состоя ния паренхимы поджелудочной железы, окрашенной галлоцианином, гематок силином и эозином, определяли абсолютную и относительную площадь экзок ринной и эндокринной части. Кроме того, производили подсчет числа остров ков Лангерганса в 1,0 мм2 площади среза (показатель плотности расположения островков) (Халилов Ф.Х., Инюшин В.М., 1966;
Шевчук И.А., Ковтуняк Н.А. и др., 1977). Для изучения состояния эндокринной части железы определяли аб солютное и относительное содержание А-клеток и В-клеток в островках, а за тем подсчитывали коэффициент Ричардсона-Янга, отражающий отношение от носительного количества В- и А-клеток (Детюк Е.С., 1979;
Быков А.В., 1981).
Используя окуляр-микрометр при увеличении окуляра 15, объектива 40, производили измерение диаметра концевых секреторных отделов, высоты панкреацитов и диаметра их ядер, диаметра панкреатических островков, клеток островков Лангерганса. Вместе с тем, методом точечного счета (Глаголев А.А., 1941) производили определение относительной объемной плотности тканевых структурных компонентов поджелудочной железы. При этом определяли отно сительную объемную плотность паренхимы органа, а также относительную объемную плотность экзокринной и эндокринной части. Кроме того, вычисля ли коэффициент, отражающий соотношение относительной объемной плотно сти стромы и паренхимы органа.
Оценка экзокринной функции поджелудочной железы. Внешнесекре торную ферментативную активность поджелудочной железы эксперименталь ных животных исследовали йодометрическим способом амилокластического метода Вольгемута (Справочник по детской гастроэнтерологии, 1995;
Соколов В.И., 1998: Надинская М.Ю., 1999). Данный метод основан на том, что альфа амилаза гидролизует крахмал, в результате чего образуются продукты, не даю щие цветной реакции с йодом. По скорости уменьшения концентрации крахма ла судят об активности фермента. Активность фермента оценивали, используя таблицу расчетов активности амилазы по Вольгемуту.
Оценка эндокринной функции поджелудочной железы. О функцио нальной активности поджелудочной железы судили на основании концентра ции иммунореактивного инсулина (ИРИ) в сыворотке крови животных. Анализ проводился на автоматическом иммунохемилюминесцентном анализаторе IM MULITE 2000, который выполняет хемилюминесцентный иммунологический тест. Метод количественного определения ИРИ основан на принципе конку рентного взаимодействия коньюгата антиген-фермент и фиксированных на твердой фазе антител (Иммунологические методы…, 1987).
Электронномикроскопические методы исследования эндокриноци тов. Материал для электронномикроскопического исследования подготавли вался по общепринятой методике (Карупу В.Я., 1984). После декапитации жи вотных поджелудочная железа отпрепарировалась и взвешивалась. Кусочки ор гана помещали на 20-30 минут в глутаровый альдегид (первичная фиксация).
Вторичная фиксация осуществлялась 4%-м раствором OsO4 в течение двух ча сов. Последующая заливка материала осуществлялась в эпоксидную смолу Epon-812. При помощи ультрамикротома УМТП 6 готовились полутонкие сре зы толщиной 0,8-1,0 мкм и окрашивались 0,1%-м раствором метиленового си него. Ультратонкие срезы делались на ультрамикротоме Power Tome X (RMC Products by Boeckeler R) толщиной 70-80 нм и контрастировались уранилацета том свинца и цитратом свинца по Reynolds E. (1963) (Саркисов Д.С., 1996).
Электронные микрофотографии изготавливались при использовании просвечи вающего электронного микроскопа Libra 120 (Carl Zeiss SMT) с SSССД камерой ultrascan 850 (Gattan) при ускоряющем напряжении 80 кВ в диапазонах электронно-оптических увеличений от 2000 до 10000. По электронным микро фотографиям производилась оценка ультраструктуры эндокринной части под желудочной железы экспериментальных животных.
Статистические методы исследования. При обработке полученных ре зультатов использовались методы вариационной статистики. Определялись средняя арифметическая и ее ошибка (М±m) (Венчиков А.И., Венчиков В.А., 1974). При этом во внимание принимали результаты, где уровень значимости (р), обнаруженных различий был меньше 0,05 (95%). Учитывая небольшой ко личественный состав групп экспериментальных животных, для оценки досто верности использовались непараметрические методы анализа (Гланц С., 1998):
порядковые признаки между двумя группами – критерий Манна-Уитни. Все полученные данные обработаны ПЭВМ Pentium III с использованием про граммного пакета Statistica v.6,0.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оценка структурно-функционального становления поджелудочной желе зы потомства самок крыс с хронической патологией печени проводилась нами в различные сроки постнатального онтогенеза комплексно с использованием морфологических, морфометрических, биохимических, ультрамикроскопиче ских и иммунохемилюминесцентного метода анализа.
Характеристика весовых параметров поджелудочной железы Одним из показателей функционального состояния органа, в том числе, поджелудочной железы, являются его весовые характеристики (Гацко Г.Г., Шкуматов Л.М., 1984;
Комолов И.С., Садовникова Н.В., 1984;
Яхонтова О.И., 1992). Нами установлено, что у интактных крысят после рождения отмечается постепенное увеличение абсолютной массы железы, достигающее максималь ной величины на 45-ый день исследования. Аналогичная закономерность выяв лена и у животных аутоиммунной и токсической групп. Обращает на себя вни мание, что у животных аутоиммунной группы на всех сроках постнатального периода абсолютная масса поджелудочной железы превышает таковую в кон троле. У животных токсической группы до периода полового созревания иссле дуемый показатель также превышает абсолютную массу железы в контроле.
Однако на поздних стадиях постнатальной жизни абсолютная масса железы достоверно снижена по сравнению с контролем на 25,46%.
Наиболее чувствительным показателем состояния поджелудочной желе зы является весовой индекс поджелудочной железы, представляющий собой отношение массы органа к массе животного, выраженное в процентах. Из ри сунка 1 следует, что у интактных животных весовой индекс поджелудочной железы после рождения постепенно увеличивается и достигает максимальной величины к периоду полового созревания. У животных аутоиммунной группы отмечается постепенное увеличение исследуемого показателя, достигающего наибольшей величины на 45-ый день наблюдения. Обращает на себя внимание, что весовой индекс поджелудочной железы животных аутоиммунной и токси ческой групп на 1-ые и 15-ые сутки исследования превышает таковой в контро ле (соответственно на 35,29%, 25,00% на 1-ые сутки и 2,72%, 7,48% на 15-ые сутки), в то время как в период полового созревания достоверно снижен по сравнению с контролем (соответственно на 10,03%, 32,79% на 30-ые сутки и 14,29%, 41,10% на 45-ые сутки). При этом наиболее выраженное снижение ве сового индекса поджелудочной железы наблюдается у крысят токсической группы.
0, * * 0, 0, * * 0, * % 0, * 0, * 0, 0, 1 сутки 15 сутки 30 сутки 45 суток возраст Контрольная группа Аутоиммунная группа Токсическая группа Рис. 1. Весовой индекс поджелудочной железы Примечание: *-статистически значимое различие результатов по сравнению с контролем (р0,05);
- статистически значимое различие результатов по срав нению с аутоиммунной группой (р0,05) Характеристика стромы и паренхимы поджелудочной железы Важным показателем, отражающим морфофункциональную зрелость органа, является показатель соотношения компонентов стромы и паренхимы.
Нами установлено, что у животных интактной группы после рождения имеет место постепенное снижение относительной объемной плотности стромы и, на против, увеличение относительной объемной плотности паренхимы. Аналогич ная закономерность выявлена нами и у животных аутоиммунной и токсической групп. При этом обращает на себя внимание, что у подопытных животных ау тоиммунной и токсической групп до периода полового созревания относитель ная объемная плотность стромы достоверно снижена по сравнению с анало гичным показателем в контроле, а объемная плотность паренхимы, напротив, увеличена, что может свидетельствовать о повышенной функциональной ак тивности поджелудочной железы. Однако, в период полового созревания объ емная плотность стромы у подопытных животных, как аутоиммунной, так и токсической групп, несмотря на снижение, достоверно превышает таковой по казатель в контроле (соответственно на 30-ый день 17,48%, 25,21% и на 45-ый день 57,14%, 91,72%). В то же время, объемная плотность паренхимы у 30-ти и 45-ти дневных подопытных животных обеих групп, напротив, снижается до уровня более низкого, чем в контроле. При этом обращает на себя внимание, что у животных токсической группы снижение показателя относительной объ емной плотности паренхимы в период полового созревания носит более выра женный характер по сравнению с контролем, чем у животных аутоиммунной группы.
Важным показателем морфологической зрелости является коэффициент, отражающий отношение массы стромы и паренхимы органа. Из рисунка 2 сле дует, что у интактных животных данный коэффициент после рождения посте пенно снижается и достигает минимальной величины на 45-ый день постна тальной жизни.
20, 18, * * 16, * * 14, * 12, % * 10, 8, * * 6, 4, 2, 1 сутки 15 сутки 30 сутки 45 суток возраст Контрольная группа Аутоиммунная группа Токсическая группа Рис. 2. Коэффициент, отражающий соотношение массы стромы и паренхимы поджелудочной железы (р0,05) Примечание: *-статистически значимое различие результатов по сравнению с контролем (р0,05);
- статистически значимое различие результатов по срав нению с аутоиммунной группой (р0,05) Аналогичная закономерность отмечается у подопытных животных. Обращает на себя внимание, что данный показатель у подопытных животных до периода полового созревания достоверно снижен по сравнению с контролем. В тоже время, у 30-ти и 45-ти дневных животных обеих опытных групп исследуемый показатель превысил (соответственно на 20,09%, 59,71% в аутоиммунной груп пе и на 29,20%, 96,70% в токсической группе) таковой в контроле, что может свидетельствовать о снижении секреторной активности поджелудочной желе зы. При этом у животных токсической группы данный коэффициент в период полового созревания превышает таковой у животных аутоиммунной группы, что свидетельствует о преобладании паренхиматозного компонента в иссле дуемой железе.
Характеристика экзокринной части поджелудочной железы О характере экзокринного аппарата поджелудочной железы у экспери ментальных животных мы судили по величине относительной объемной плот ности. Нами установлено, что в постнатальном периоде исследуемый показа тель у всех экспериментальных животных постепенно увеличивается, достигая максимальной величины к периоду полового созревания (рис. 3). Обращает на себя внимание, что в период новорожденности и подсосный период показатель относительной объемной плотности экзокринного аппарата поджелудочной железы превышает таковой в контроле, соответственно на 2,46 ед., 1,15 ед. у крысят аутоиммунной группы и у крысят токсической группы соответственно на 6,45 ед., 5,39 ед. Как видно из рисунка 3, в период полового созревания, по казатель относительной объемной плотности экзокринной части поджелудоч ной железы у подопытных животных аутоиммунной и токсической групп дос товерно снижен по сравнению с контролем.
* * * * * * * * % 1 15 30 возраст, сутки К А Т Рис.3. Относительная объемная плотность экзокринной части поджелудочной железы Примечание: *-статистически значимое различие результатов по сравнению с контролем (р0,05);
- статистически значимое различие результатов по срав нению с аутоиммунной группой (р0,05) Одним из показателей зрелости секреторного отдела экзокринной железы является величина концевых секреторных отделов (Бойко Ю.Г., Прокопчик Н.И., 1987;
Коротько Г.Ф., 1999). Нами установлено, что у экспериментальных животных интактной группы диаметр концевых секреторных отделов после рождения постепенно увеличивается и достигает максимальных значений к 45 му дню постнатального периода. У экспериментальных животных аутоиммун ной и токсической групп диаметр концевых отделов поджелудочной железы в период постнатального онтогенеза меняется незначительно, что является стати стически значимо по сравнению с группой контроля. Однако обращает на себя внимание, что на ранних стадиях исследования (период новорожденности и подсосный период) диаметр концевых секреторных отделов превышает таковой в контроле, что может свидетельствовать о повышенной функциональной ак тивности. В тоже время в период полового созревания исследуемый показатель оказывается сниженным по сравнению с контролем (в аутоиммунной группе на 30-ые и 45-ые сутки соответственно на 4,53%, 3,78% и в токсической группе соответственно на 14,03%, 7,97%), что может указывать на угнетение секретор ной активности экзокринного аппарата поджелудочной железы.
Секреторная активность поджелудочной железы коррелирует с размера ми ациноцитов и их ядер (Детюк Е.С., 1979). Установлено, что у интактных крысят наибольшая величина данного показателя характерна для периода по лового созревания, что свидетельствует об усилении их секреторной активно сти (рис. 4). У подопытных крысят аутоиммунной и токсической групп в пери од новорожденности и подсосный период отмечается превышение данного по казателя по сравнению с контролем. Однако на 30-ые и 45-ые сутки исследова ния высота ациноцитов снижена по сравнению с контролем.
* * * * * * * мкм 1 15 30 Возраст, сутки К А Т Рис. 4. Высота ациноцитов поджелудочной железы Примечание: *-статистически значимое различие результатов по сравнению с контролем (р0,05);
- статистически значимое различие результатов по срав нению с аутоиммунной группой (р0,05) Аналогичная закономерность выявлена при изучении диаметра ядер аци ноцитов поджелудочной железы. Эти морфологические изменения в период полового созревания могут свидетельствовать об угнетении функциональной активности ациноцитов поджелудочной железы у животных подопытных групп, причем более выраженный характер изменений отмечен у животных токсической группы.
Функционирование любой тканевой структуры, как правило, неразрывно связано с характером кровоснабжения. Установлено, что у подопытных живот ных аутоиммунной и токсической групп на всех сроках исследования показа тель средней площади кровеносных сосудов превышает таковой в контроле (рис. 5). Исключение составили новорожденные крысята токсической группы.
При этом исследуемый показатель новорожденных крысят аутоиммунной группы практически не отличался от контроля, в то время как исследуемый по казатель у однодневных крысят токсической группы был снижен. Аналогичные изменения выявлены и при исследовании диаметра кровеносных сосудов.
У животных аутоиммунной группы на большинстве сроков исследования показатель плотности расположения кровеносных сосудов в единице условной площади превышает таковой в контроле.
* * * 550 * мкм * * * 1 15 30 Возраст, сутки К А Т Рис. 5. Площадь кровеносных сосудов поджелудочной железы Примечание: *-статистически значимое различие результатов по сравнению с контролем (р0,05);
- статистически значимое различие результатов по срав нению с аутоиммунной группой (р0,05) Исключение составили 15-ти дневные крысята, у которых исследуемый показа тель практически не отличался от такового в контроле. У животных токсиче ской группы плотность расположения кровеносных сосудов на 1-ые и 45-ые сутки превышает таковой в контроле (в 2,1 и 2,7 раза соответственно), в то вре мя как на 15-ые и 30-ые сутки наблюдения данный показатель снижен по срав нению с контролем (соответственно в 2,2 и 3,8 раза).
Секреторная активность экзокринной части поджелудочной железы экспериментальных животных О секреторной активности экзокринной части поджелудочной железы в экспериментальных исследованиях и клинических наблюдениях принято, пре жде всего, судить по амилазе в сыворотке крови (Кузин М.И., Данилов М.В. и др., 1985;
Соколов В.И., 1998;
Надинская М.Ю., 1999). Активность амилазы в сыворотке крови экспериментальных животных потомства самок крыс с хрони ческим поражением печени аутоиммунной и токсической этиологии определя лась по методу Вольгемута. Как видно из рисунка 6, у интактных животных по сле рождения до периода полового созревания отмечается постепенное увели чение активности амилазы. На ранних сроках исследования (период новорож денности и подсосный период) активность экзокринной части поджелудочной железы у подопытных животных аутоиммунной и токсической групп превыша ет таковую в контроле. В тоже время в период полового созревания активность железы у подопытных животных, напротив, снижается по сравнению с контро лем в два раза.
* * * * ** ЕД 1 сутки 15 сутки 30 сутки 45 суток возраст Контрольная группа Аутоиммунная группа Токсическая группа Рис. 6. Активность амилазы (ЕД) в сыворотке крови экспериментальных жи вотных Примечание: *-статистически значимое различие результатов по сравнению с контролем (р0,05);
- статистически значимое различие результатов по срав нению с аутоиммунной группой (р0,05) Характеристика эндокринной части поджелудочной железы Оценка эндокринного аппарата поджелудочной железы нами проводи лась комплексно с использованием многочисленных общепринятых критериев, в том числе объемной плотности эндокринного аппарата, числа островков Лан герганса в единице условной площади, площади и диаметра панкреатических островков, количества и диаметра А- и В-клеток, содержания инсулина в сыво ротке крови, а также содержания органоидов синтетического аппарата в цито плазме эндокриноцитов.
Нами установлено, что объемная плотность эндокринной части поджелу дочной железы на большинстве сроков исследования у подопытных животных достоверно превышает таковую в контроле (рис. 7). Исключение составили но ворожденные крысята токсической группы, у которых данный показатель был снижен по сравнению с контролем на 17,18%.
При анализе площади и диаметра островков Лангерганса нам удалось вы явить следующую закономерность. После рождения у экспериментальных жи вотных отмечается постепенное увеличение площади и диаметра островков Лангерганса, достигающее наибольшей величины к периоду полового созрева ния. Динамика изменения площади островков Лангерганса находится в полном соответствии с результатами, полученными при изучении диаметра панкреати ческих островов.
2, 1, * 1, 1, 1, % 1, * * 0, * * 0, 0, * 0, 0, 1 сутки 15 сутки 30 сутки 45 суток возраст Контрольная группа Аутоиммунная группа Токсическая группа Рис. 7. Относительная объемная плотность эндокринной части поджелудочной железы Примечание: *-статистически значимое различие результатов по сравнению с контролем (р0,05);
- статистически значимое различие результатов по срав нению с аутоиммунной группой (р0,05) Другим показателем, отражающим состояние эндокринного аппарата, является плотность расположения панкреатических островков в единице услов ной площади. У экспериментальных животных интактной и подопытных групп после рождения отмечается постепенное снижение числа эндокринных остров ков в единицу условной площади, достигающее наименьшей величины к пе риоду полового созревания. Вместе с тем, обращает на себя внимание, что на всех сроках исследования данный показатель у животных аутоиммунной и ток сической групп превышает таковой в контроле в среднем на 1,94 - 5,61 %.
Наибольший интерес при оценке эндокринного аппарата поджелудочной железы представляют данные, отражающие клеточный состав островков. С по мощью гистохимических методов проводилось определение А- и В-клеток и их размеров. Установлено, что у экспериментальных животных интактной и под опытных групп в период постнатального онтогенеза имеет место изменение численного состава А- и В-клеток панкреатических островков: происходит по степенное уменьшение числа А-клеток и увеличение числа В-клеток. Анало гичная закономерность выявлена и у животных аутоиммунной и токсической групп. Однако у подопытных животных до периода полового созревания на большинстве сроков исследования имеет место снижение количества А-клеток и, напротив, увеличение числа В-клеток. На 45-ые сутки исследования количе ство В-клеток в эндокринных островках поджелудочной железы подопытных животных аутоиммунной и токсической групп снижено (на 8,88 и 10,28% соот ветственно) по сравнению с 45-ти дневными крысятами контрольной группы, а А-клеток – повышено соответственно на 5,56 и 41,21%.
Наибольший интерес представляет коэффициент Ричардсона-Янга, отра жающий отношение количества В-клеток к А-клеткам. Данный показатель сви детельствует о том, что у 45-ти дневных крысят, как аутоиммунной, так и ток сической группы количество А-клеток в эндокринных островках поджелудоч ной железы повышено, а количество В-клеток снижено по сравнению с контро лем (рис. 8).
4, * 3, * * * * * * 2, 1 сутки 15 сутки 30 сутки 45 сутки Возраст К А Т Рис. 8. Коэффициент Ричардсона - Янга Примечание: *-статистически значимое различие результатов по сравнению с контролем (р0,05);
- статистически значимое различие результатов по срав нению с аутоиммунной группой (р0,05) Измерение диаметра эндокринных клеток островков Лангерганса позво лило выявить следующее. У интактных животных после рождения отмечается первоначальное увеличение размеров А- и В-клеток. К 30-м суткам исследова ния диаметр эндокринных клеток уменьшается, а затем к периоду полового со зревания (45-ые сутки) вновь увеличивается. У животных аутоиммунной груп пы после рождения диаметр А-клеток постепенно снижается и достигает мини мальной величины на 30-ый день, после чего исследуемый показатель вновь увеличивается, но не достигает исходного уровня. Размеры В-клеток до перио да полового созревания у данной группы животных не меняются. Однако к пе риоду полового созревания исследуемый показатель заметно увеличивается. У животных токсической группы первоначально отмечается снижение размеров А-клеток. Однако к 45-му дню постнатальной жизни исследуемый показатель увеличивается, но не достигает исходного уровня. Диаметр В-клеток у живот ных токсической группы после рождения постепенно снижается и достигает минимального уровня к периоду полового созревания (45-ые сутки). На боль шинстве сроков исследования диаметр А-эндокриноцитов у подопытных жи вотных меньше по сравнению с контролем. Диаметр В-эндокриноцитов у жи вотных аутоиммунной группы также меньше по сравнению с аналогичным кон тролем. В то же время данный показатель у животных токсической группы до периода полового созревания превысил таковой в контроле. Однако к 45-м сут кам наблюдения диаметр В-клеток у них снижался до уровня более низкого, чем в контроле.
Сравнительный анализ диаметра эндокриноцитов панкреатических ост ровков поджелудочной железы у подопытных животных аутоиммунной и ток сической групп позволяет сделать заключение о том, что наиболее выраженное снижение исследуемого показателя имеет место у крысят токсической группы.
Инкреторная активность поджелудочной железы Оценка содержания инсулина, вырабатываемого В-клетками поджелу дочной железы в сыворотке крови интактных и подопытных животных ауто иммунной и токсической групп, осуществлялась с помощью иммуннохемилю минесцентного метода на 45-ый день постнатальной жизни. Установлено, что у 45-ти дневных крысят аутоиммунной и токсической групп содержание гормона в сыворотке крови достоверно снижено в 3,4 и 6,5 раза по сравнению с контро лем.
Сравнительный анализ содержания инсулина в сыворотке крови под опытных животных аутоиммунной и токсической групп в период полового со зревания позволяет сделать заключение о том, что наиболее выраженное сни жение исследуемого показателя имеет место у крысят с токсическим поражени ем печени (рис. 9).
Ультрамикроскопическая характеристика эндокриноцитов поджелудочной железы Одним из показателей функциональной активности эндокриноцитов пан креатических островков поджелудочной железы является степень развития синтетического аппарата, о чем мы судили на основании электронномикроско пических исследований. Так, у животных аутоиммунной и токсической групп на 45-ые сутки исследования в цитоплазме В-клеток панкреатических остров ков снижено содержание органоидов синтетического аппарата. Кроме того, на ми установлено, что на 45-ый день постнатальной жизни животных аутоим мунной и токсической групп происходит уменьшение содержания секреторных гранул в В-эндокриноцитах поджелудочной железы.
Аутоиммунная группа;
3,805±2,333* Токсическая группа;
Контрольная 2,000±1,572* группа;
12,945±3, Рис. 9. Содержание инсулина (мкЕД/мл) в сыворотке крови потомства экспери ментальных животных на 45-ые сутки исследования Примечание: *-статистически значимое различие результатов по сравнению с контролем (р0,05);
- статистически значимое различие результатов по срав нению с аутоиммунной группой (р0,05) Аналогичная закономерность выявлена и в ультраструктурном строении А клеток эндокринных островков железы опытных групп на 45-ый день наблюде ния. Так, отмечено понижение содержания секреторных гранул, в отличие от такового показателя в контрольной группе животных, что может свидетельст вовать об угнетении активности А-клеток в период полового созревания.
Таким образом, анализ полученных результатов позволяет сделать за ключение, что на ранних сроках исследования (период новорожденности и под сосный период) активность экзокринной части поджелудочной железы у под опытных животных аутоиммунной и токсической групп превышает таковую в контроле. В тоже время в период полового созревания (30-ый и 45-ый день) ак тивность железы у подопытных животных, напротив, снижается по сравнению с контролем, о чем свидетельствует снижение массы органа, уменьшение объ емной плотности паренхимы экзокринной части, за счет увеличения объемной плотности стромы, уменьшение размеров экзокриноцитов и их ядер, а также снижение активности амилазы в сыворотке крови. При этом наиболее выра женные изменения структурно-функционального состояния экзокринного ап парата наблюдается у крысят токсической группы.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что эндокринный аппа рат поджелудочной железы потомства самок крыс с хроническим аутоиммун ным и токсическим поражением печени в ранние сроки постнатального онтоге неза (период новорожденности и подсосный период) характеризуется повы шенной, по сравнению с контролем, активностью. В то же время, в период по лового созревания (30-ый и 45-ый день после рождения) активность островков Лангерганса у подопытных животных снижается до уровня более низкого, чем у крысят интактной группы, что, проявляется изменением соотношения раз личных типов эндокриноцитов в островках Лангерганса, слабой степенью раз вития секреторного органоидного аппарата в них, снижением концентрации инсулина в сыворотке крови. При этом наиболее выраженные изменения на блюдаются у крысят токсической группы.
Исходя из результатов собственного исследования и данных литературы, предполагаемые механизмы, лежащие в основе развития нарушений морфо функционального состояния поджелудочной железы у потомства самок крыс с хроническим поражением печени различной этиологии можно представить сле дующим образом. Развивающийся комплекс структурно-функциональных из менений может возникать в результате массированного проникновения через фето-плацентарный барьер, проницаемость которого возрастает (Савченков Ю.И., Лобынцев К.С., 1980), из материнского организма патологических про дуктов метаболизма, что наиболее характерно для токсической формы патоло гии печени, а также специфических антител, циркулирующих иммунных ком плексов и других гуморальных факторов иммунной системы, сенсибилизиро ванных цитотоксических Т-лимфоцитов (наиболее характерно для аутоиммун ных поражений печени), что приводит к нарушениям гомеостаза плода, вклю чая и иммунный гомеостаз: изменению интенсивности клеточных и гумораль ных иммунных реакций, развитию гиперчувствительности к тканям печени.
Под влиянием патологических продуктов метаболизма (желчные кислоты, би лирубин, продукты перекисного окисления липидов, ацетон, кетоновые тела и др.), органных (печеночных) специфических белков, а также сенсибилизиро ванных иммуннокомпетентных клеток и противопеченочных аутоантител, воз никающих в организме матери при патологии гепатобилиарной системы и проникающих через гематоплацентарный барьер, происходит нарушение реак тивности и резистентности внутриутробно развивающегося плода, морфофунк ционального становления различных жизненно важных систем, в том числе пищеварительной, являющейся чувствительной системой организма, особенно на ранних стадиях эмбрионального развития. Повышенная чувствительность последней объясняется ранними сроками закладки главного ее компонента – поджелудочной железы, а также скорым появлением в ней экзокринной и эн докринной части, являющихся главной мишенью для агрессивных агентов, на фоне незрелого гематоплацентарного барьера. Повреждение ацинарных и эн докринных клеток приводит в дальнейшем к угнетению процессов секретооб разования и инкретообразования в постнатальном периоде и, как следствие, может явиться причиной роста заболеваемости панкреатитом и сахарным диа бетом.
Таким образом, представляется возможным предположить, что у самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы аутоиммунного и токсического генеза рождается потомство с нарушенным «стартом здоровья» со стороны пищеварительной системы, что обусловливает нарушение резистент ности организма. Кроме того, полученные результаты позволяют считать, что стрессовое состояние плодов, возникающее при экспериментальном моделиро вании патологии гепатобилиарной системы у самок крыс, представляет собой центральное звено патогенеза в нарушении структурно-функционального ста новления систем жизнеобеспечения реактивности и резистентности.
ВЫВОДЫ 1. На экспериментальных моделях, воспроизводящих наиболее распростра ненные клинические синдромы (цитолитический, аутоиммунный), свя занные с патологией гепатобилиарной системы матери, установлено на рушение структурно-функционального становления экзокринного и эн докринного аппаратов поджелудочной железы их потомства в постна тальном периоде.
2. Сравнительный анализ особенностей структурно-функционального ста новления поджелудочной железы у подопытных животных свидетельст вует о том, что при токсическом поражении гепатобилиарной системы самок крыс у их потомства имеет место более выраженное повреждение эндокринного и экзокринного аппаратов железы, по сравнению с аутоим мунным поражением.
3. На ранних стадиях (период новорожденности и подсосный период) пост натального онтогенеза у потомства самок крыс с хроническим поражени ем гепатобилиарной системы аутоиммунного и токсического генеза имеет место транзиторное усиление активности экзокринного аппарата подже лудочной железы: достоверное увеличение весового индекса железы, массы паренхиматозного компонента и уменьшение стромального ком понента, увеличение диаметра секреторных отделов, размеров ациноци тов и их ядер, а также повышение активности амилазы крови.
4. Моделирование хронической патологии печени у самок крыс обусловли вает у потомства в период полового созревания дисфункцию экзокринно го аппарата поджелудочной железы, о чем свидетельствует достоверное уменьшение весового индекса железы, относительной объемной плотно сти паренхиматозного компонента, диаметра секреторных отделов, раз меров ациноцитов и их ядер, снижение активности амилазы крови.
5. Хроническое поражение печени аутоиммунного и токсического генеза у самок крыс обусловливает транзиторную активацию эндокринного аппа рата поджелудочной железы потомства в период раннего постнатального онтогенеза (период новорожденности и подсосный период), что проявля ется в увеличении относительной объемной плотности островков Лангер ганса, размеров и плотности их расположения, а также увеличении диа метра эндокриноцитов и накоплении в них органоидов секреции.
6. У потомства самок крыс с хронической патологией печени различного генеза в период полового созревания развивается дисфункция эндокрин ного аппарата поджелудочной железы, что находит свое проявление в уменьшении относительной объемной плотности эндокринной части, размеров и плотности расположения островков Лангерганса, диаметра эндокриноцитов и числа органоидов секреции, а также снижении содер жания инсулина в сыворотке крови.
7. Полученные результаты теоретически обосновывают необходимость вы деления детей, рожденных от матерей с хронической патологией гепато билиарной системы в группы риска, требующих диспансерного наблюде ния у гастроэнтеролога и эндокринолога.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Ильиных, М.А. Эндокринная функция поджелудочной железы самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы / М.А.Ильиных, Г.В.Брюхин // Сборник научных работ «Естествознание и гуманизм». – Томск, 2005. – С. 3.
2. Ильиных, М.А. Внешнесекреторная функция поджелудочной железы по томства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением пе чени различной этиологии / М.А.Ильиных, Г.В.Брюхин // Сборник мате риалов 70-ой юбилейной итоговой Республиканской научной конферен ции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины». – Уфа, 2005. Ч. 1. – С. 11.
3. Ильиных, М.А. Морфофункциональная характеристика поджелудочной железы потомства самок крыс с хроническим поражением гепатобилиар ной системы / М.А.Ильиных, Г.В.Брюхин // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 75-летию УГАВМ «Ак туальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домаш них животных». – Троицк, 2005. – С. 38 - 40.
4. Ильиных, М.А. Морфологическая характеристика поджелудочной железы потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени различной этиологии / М.А.Ильиных // Альманах «Бабухинские чтения»: материалы 5-ой Всеросс. конф. – М.: Ретиноиды, 2006. – Вып.
24. – С. 124 - 126.
5. Ильиных, М.А. Влияние хронического токсического и аутоиммунного поражения печени матери на структуру и функцию островкового аппара та поджелудочной железы ее потомства / М.А. Ильиных // Сборник науч ных трудов «Новые технологии в здравоохранении». – Челябинск, 2006. – С. 257.
6. Ильиных, М.А. Морфофункциональные изменения поджелудочной желе зы потомства животных с хроническим экспериментальным поражением печени различного генеза / М.А.Ильиных // Материалы I Международной научно-практической конференции. – Челябинск: Изд-во Челяб. гос. пед.
ун-та, 2006. – С.361-363.
7. Ильиных, М.А. Влияние аутоиммунного и токсического поражения пече ни матери на структурно-функциональное становление поджелудочной железы ее потомства / М.А.Ильиных, Г.В.Брюхин // Известия Челябин ского научного центра УрО РАН.-Челябинск, 2006.-№ 4 (34).-С.145-148.
8. Ильиных, М.А. Сравнительная характеристика структурной организации эндокринной части поджелудочной железы потомства матерей, подвер женных хроническому поражению печени в условиях эксперимента / М.А.Ильиных // Сборник научных трудов «Актуальные проблемы мор фологии».-Красноярск, 2006.-Вып.5.-С.64-65.
9. Ильиных, М.А. Структурно-функциональное становление поджелудоч ной железы потомства животных с хроническим экспериментальным по ражением гепатобилиарной системы различного генеза / М.А. Ильиных, Г.В. Брюхин // Вестник Челябинского государственного педагогического университета.-Челябинск, 2006.-Ч. 4, № 6.-С. 113-123.
На правах рукописи Ильиных Марина Анатольевна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПОТОМСТВА САМОК КРЫС С ХРОНИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ГЕПАТОБИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА 03.00.13 – «Физиология» Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Челябинск - Отпечатано в издательстве «Челябинская государственная медицинская академия». Лицензия № 01906. Подписано к печати 20.08.07г. Объем 1 п.л. Формат 6484. Гарнитура «Times New Roman cyr». Бумага для офисной техники, г/м2. Тираж 120 экз.