Регуляция метаболизма метионина в печени

На правах рукописи

КОРЕНДЯСЕВА Татьяна Константиновна Регуляция метаболизма метионина в печени 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

Атауллаханов доктор биологических наук, профессор Фазоил Иноятович

Официальные оппоненты:

Болдырев доктор биологических наук, профессор Александр Александрович Егорова доктор медицинских наук Марина Олеговна Bедущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита диссертации состоится « 24 » марта 2011 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.001.042.02.

при ФГБУ «Гематологический Научный Центр» Минздравсоцразвития России по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Гематологический Научный Центр» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « » 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Метионин – незаменимая аминокислота, которая играет исключительно важную роль во внутриклеточном метаболизме. Метионин необходим для инициации трансляции и синтеза белковых молекул, а также является единственным субстратом для синтеза S-аденозилметионина (AdoMet), универсального донора метильных групп и предшественника в синтезе полиаминов (Рис. 1). AdoMet зависимое метилирование лежит в основе регуляции важнейших внутриклеточных процессов, включая регуляцию экспрессии генов, регуляцию активности ферментов и т.п. Воспроизводство метионина из гомоцистеина в метионинсинтазной реакции сопряжено с превращением 5-метилтетрагидрофолата (циркулирующей формы фолиевой кислоты) в тетрагидрофолат, необходимый для синтеза ДНК (Рис. 1). В ряде клеток и тканей (в том числе в печени) метионин может использоваться для синтеза цистеина, который, в свою очередь, является субстратом для синтеза основного внутриклеточного антиоксиданта – глютатиона. Таким образом, метаболизм метионина тесно связан с окислительно-восстановительным метаболизмом. Независимое функционирование метаболических систем, связанных с метаболизмом метионина, требует эффективной и жесткой регуляции. Неудивительно, что нарушения в метаболизме метионина связаны с целым рядом серьезных патологий, таких как дефекты развития нервной трубки [Beaudin and Stover 2009], онкологические заболевания [Lu and Mato 2008], сердечно-сосудистые заболевания [Yamada et al. 2008] и нейродегенеративные заболевания [Zoccolella et al. 2010]. Многие нарушения в метаболизме метионина приводят к росту концентрации гомоцистеина (промежуточного продукта метаболизма метионина) в плазме крови. Показано, что повышение концентрации гомоцистеина в плазме крови является независимым и достоверным фактором риска возникновения осложнений беременности [Vollset et al.

2000], патологий развития плода, в частности, синдрома Дауна [James et al. 1999] и дефектов развития нервной трубки [Beaudin and Stover 2009], смертности от сердечно сосудистых заболеваний [Vollset et al. 2001], развития нейродегенеративных заболеваний, в первую очередь болезни Альцгеймера и Паркинсона [Mattson and Shea 2003]. Однако механизмы, обеспечивающие связь высокого уровня гомоцистеина с патологиями, остаются невыясненными.

Важным источником информации для анализа патологий, связанных с нарушениями в метаболизме метионина, являются дефициты ферментов метаболизма метионина у человека. Правильная интерпретация последствий дефицита ферментов метаболизма метионина также требует понимания нормальной регуляции этого метаболизма.

Большинство раковых клеток демонстрирует метиониновую зависимость – Рис. 1. Схема метаболизма метионина в печени. Широкими стрелками показаны реакции ферментов, формирующих уникальный ферментный профиль метаболизма метионина в печени. Широкими черными стрелками показаны реакции ключевых ферментов, функционирующих в режиме необратимого разрушения метионина, более светлыми стрелками – реакции ферментов, функционирующих в режиме сохранения метионина в клетке. Обозначения метаболитов: AdoMet – S-аденозилметионин, MGA – акцептор метильных групп, Gly – глицин, AdoHcy – S-аденозилгомоцистеин, Hcy – гомоцистеин, MTHF – 5-метилтетрагидрофолат, DMG – диметилглицин, Cys – цистеин, GSH – глютатион. Обозначения ферментов: MAT – метионин аденозилтрансфераза, GNMT – глицин N-метилтрансфераза, Methylases – внутриклеточные метилазы, AHC – аденозилгомоцистеиназа, BHMT – бетаин гомоцистеин S-метилтрансфераза, MS – метионин синтаза, MTHFR – метилентетрагидрофолат редуктаза, CBS – цистатионин -синтаза, CSE – цистатионаза. Пунктирными стрелками показано аллостерическое регуляторное влияние метаболитов на скорость работы соответствующих ферментов.

Открытыми пунктирными стрелками показана активация, закрытыми – ингибирование.

Реметилированием называется совокупность реакций, обеспечивающих превращение гомоцистеина в метионин, транссульфурированием – гомоцистеина в цистеин.

гибель или снижение скорости деления при замене метионина его непосредственным предшественником, гомоцистеином (рис. 1) [Hoffman 1982]. Причина такой ауксотрофии не вполне ясна. Разработано несколько терапевтических стратегий, использующих явление метиониновой зависимости для избирательного подавления роста опухолевых клеток [Stankova et al. 2008]. Исследование регуляции метаболизма метионина в нативных и раковых клетках может привести к повышению эффективности существующих методик, а также к разработке новых стратегий в противоопухолевой терапии, использующих различия в метаболизме метионина между нормальными и опухолевыми клетками.

Актуальность исследования регуляции метаболизма метионина также связана с результатами программы обязательного обогащения (фортификации) продуктов питания фолиевой кислотой, запущенной в 1998 году в США [U.S. Food and Drug Administration, 1996]. По данным рандомизированных исследований, проведенных в начале 90-х годов прошлого века в Европе [Czeizel and Dudas 1992], увеличение потребления фолиевой кислоты женщинами в период зачатия значительно снижает вероятность дефекта нервной трубки у ребенка. Драматическое снижение частоты рождения детей с дефектами нервной трубки, зарегистрированное после начала действия программы фортификации в США [Honein et al. 2001;

Ray et al. 2002], является первым примером эффективной профилактики врожденного заболевания.

Однако, все большее количество исследований показывает, что повышение потребления фолиевой кислоты могло спровоцировать рост абсолютного числа случаев рака толстой кишки, совпавший с началом действия программы [Cole et al. 2007;

Mason et al. 2007]. Несмотря на многочисленные исследования, последствия фортификации и целесообразность обязательного обогащения продуктов питания всего населения фолиевой кислотой до сих пор остаются предметом дискуссии [Lucock and Yates 2009].

Таким образом, изучение метаболизма метионина имеет большое значение для понимания нормальной регуляции внутриклеточного метаболизма, для понимания молекулярных механизмов развития многих патологий, а также для решения целого ряда медицинских проблем.

Ключевая роль в регуляции уровня метионина в крови принадлежит печени [Shinohara et al. 2006;

Wilson et al. 2009]. Метаболизм метионина в печени характеризуется уникальным тканеспецифическим ферментным профилем (рис. 1). В клетках печени одновременно экспрессируются две изоформы метионин аденозилтрансферазы (МАТ), МАТ1 и МАТ3, в то время как в других органах и тканях экспрессируется МАТ2. Зависимость скорости реакции МАТ3 от концентрации продукта (AdoMet) противоположна той, которую демонстрируют МАТ1 и МАТ2, AdoMet ингибирует МАТ1, МАТ2 и активирует МАТ3 (рис. 1). Для печени также характерно исключительно высокое содержание глицин N-метилтрансферазы (фермента, который катализирует бесполезную, на первый взгляд, реакцию), бетаин гомоцистеин S-метилтрансферазы и цистатионин -синтазы. Таким образом, интересной особенностью метаболизма метионина в печени является существование параллельных путей превращения метаболитов на нескольких участках метаболического пути (рис. 1). Физиологическая роль такого дублирования до сих пор оставалась неясной.

В нашей лаборатории была предложена гипотеза, объясняющая все описанные выше особенности метаболизма метионина в печени в рамках довольно простых представлений о регуляции этой системы. Согласно этим представлениям метаболизм метионина в клетках печени функционирует в двух режимах. При низких концентрациях метионина работают, в основном, ферменты, изображенные на рис оттенком черного. Эти ферменты обеспечивают воспроизводство и сохранение метионина в клетке. При концентрациях метионина выше физиологической концентрации метаболитов и скорости метаболических процессов резко меняются, и клетка переключается на превращение избытка метионина в цистеин и глютатион.

Было предположено, что такая регуляция обеспечивает гомеостаз метионина – поддержание его концентрации в крови на примерно постоянном уровне. Одной из целей данной работы являлась экспериментальная проверка этой гипотезы.

Цель работы: Экспериментальное исследование зависимости метаболизма метионина в свежевыделенных гепатоцитах мыши и крысы от концентрации метионина в диапазоне наблюдаемых in vivo изменений концентрации метионина в крови.

Задачи исследования:

1. Исследовать распределение метионина между клетками и средой в суспензии свежевыделенных крысиных гепатоцитов в диапазоне наблюдаемых in vivo изменений концентрации метионина в крови.

2. Исследовать зависимость стационарных концентраций S аденозилметионина, S-аденозилгомоцистеина и скорости потребления метионина от концентрации метионина в суспензии свежевыделенных гепатоцитов мышей и крыс в физиологическом диапазоне концентраций метионина 40-400 мкМ.

3. Сопоставить экспериментальные зависимости стационарной концентрации S-аденозилметионина и скорости потребления метионина от концентрации метионина с результатами анализа математических моделей метаболизма метионина.

Научная новизна. Подтверждено прямыми измерениями концентрации метионина в клетках и инкубационной среде, что транспорт метионина через мембрану свежевыделенных крысиных гепатоцитов является быстрым, пассивным и обратимым.

Показано, что транспорт метионина в гепатоцитах крысы обеспечивает практически равномерное стационарное распределение метионина между клетками и средой в диапазоне концентраций 60-1500 мкМ.

Впервые исследованы экспериментально зависимости стационарных концентраций AdoMet, AdoHcy и скорости потребления метионина от концентрации метионина в свежевыделенных мышиных и крысиных гепатоцитах в физиологическом диапазоне концентраций метионина 40-400 мкМ. Обнаружено, что повышение концентрации метионина в узком диапазоне концентраций 50-100 мкМ приводит к резкому 5-10-кратному росту стационарных концентраций AdoMet, AdoHcy и скорости потребления метионина, что соответствует предсказаниям простой математической модели метаболизма метионина в печени [Martinov et al. 2000]. Вне зоны резкой зависимости метаболизма метионина от концентрации метионина стационарные концентрации метаболитов и скорость потребления метионина относительно слабо зависят от его концентрации. Резкий рост скорости потребления метионина в узком диапазоне концентраций (50-100 мкМ) предполагает переключение метаболизма с режима сохранения (рециркуляции) метионина в клетке, на режим необратимого разрушения метионина, т.е. с реметилирования на транссульфурирование (рис. 1).

Таким образом, впервые экспериментально показана возможность регуляции метаболической системы за счет триггерного переключения метаболического потока между параллельными метаболическими путями, обусловленного аллостерическими взаимодействиями в системе.

Научно-практическое значение. В настоящей работе экспериментально показана возможность существования двух режимов метаболизма метионина в печени, переключение между которыми регулируется концентрацией метионина. Этот результат подтверждает новые представления о механизмах регуляции метаболизма метионина, которые могут лечь в основу понимания механизмов нарушений, возникающих при дефицитах ферментов метаболизма метионина у человека.

Скачкообразная регуляция метаболизма метионина в нормальных гепатоцитах, обнаруженная в нашей работе и отсутствие такой регуляции в клетках гепатомы (показанное в работе [Prudova et al. 2005]) может послужить основой для разработки новых методов избирательного уничтожения клеток опухолей печени.

Положения, выносимые на защиту:

1. Путем прямого измерения концентрации метионина в клетках и среде показано, что транспорт метионина через мембрану свежевыделенных крысиных гепатоцитов является быстрым, пассивным и обратимым.

2. Транспорт метионина в гепатоцитах крысы обеспечивает практически равномерное стационарное распределение метионина между клетками и средой в диапазоне концентраций 60-1500 мкМ.

3. В диапазоне физиологических концентраций метионина 40-400 мкМ обнаружена узкая зона (50-100 мкМ) резкой зависимости метаболизма метионина в гепатоцитах от его концентрации. Повышение концентрации метионина внутри этой зоны приводит к резкому росту стационарной концентрации S-аденозилметионина, S-аденозилгомоцистеина и скорости потребления метионина в гепатоцитах приблизительно в 10 раз. До и после зоны резкой зависимости метаболизма метионина от его концентрации стационарные концентрации метаболитов и скорость потребления метионина относительно слабо зависят от концентрации метионина.

4. Экспериментально подтверждена гипотеза о существовании двух устойчивых режимов метаболизма метионина в печени, переключение между которыми регулируется концентрацией метионина.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на 31st FEBS Congress: Molecules in Health & Disease (Istanbul, Turkey, June 24-29, 2006), на VIой Ежегодной Международной Молодежной Конференции ИБХФ РАН – ВУЗЫ "Биохимическая физика" (Москва, 24-27 ноября 2006 г.), на Международной Конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино МО, 5-7 июня 2007 г.), на конференции Life Sciences 2007 (Glasgow, UK, July 8-12, 2007).

Публикации. По материалы диссертационной работы опубликовано 6 научных работ. Статей в международных рецензируемых журналах – 2;

публикаций в трудах конференций и съездов – 4.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 – обзора литературы, главы 2 – описания материалов и методов исследования, главы 3 – описания экспериментальных результатов, главы 4 – обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 227 источников. Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией д.б.н., проф. Атауллаханов Ф.И.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность исследования регуляции метаболизма метионина в печени, обозначены основные проблемы в данной области, сформулированы цели и задачи, дана общая характеристика работы.

Глава 1 содержит обзор литературы. В обзоре литературы приведены сведения о метаболизме метионина в клетках млекопитающих, кинетических свойствах ферментов метаболизма метионина, описаны особенности ферментного профиля метаболизма метионина в клетках печени и опухолевых клетках. Обзор литературы содержит данные о дефицитах ферментов метаболизма метионина у человека и генетических моделях этих дефицитов. В главе приводятся данные о регуляции метаболизма метионина, изложены современные представления о механизмах регуляции метаболизма метионина в печени, включая краткий обзор математических моделей. В обзоре также описаны некоторые методические проблемы, связанные с исследованием регуляции метаболизма метионина в свежевыделенных гепатоцитах.

В главе 2 описываются материалы и методы исследования. В главе описаны методики выделения гепатоцитов из печени мышей и крыс, включая подробные схемы установок для перфузии печени и анатомические рисунки, позволяющие воспроизвести хирургическую часть процедуры выделения гепатоцитов. Глава также включает описание экспериментальных исследований, процедур отбора и фиксации проб и методик измерения концентраций метаболитов.

Выделение гепатоцитов из печени мышей и крыс. Использованные в настоящей работе протоколы выделения гепатоцитов из печени мышей и крыс основаны на методике перфузии печени раствором коллагеназы [Berry and Friend 1969]. Мышиные гепатоциты выделяли из печени самок мышей CBF1 массой 20-22 г. Перфузию печени выполняли при постоянной скорости подачи растворов. В экспериментах использовали суспензии, не менее 85% клеток в которых не прокрашивалось 0.4% трипановым синим. Выход жизнеспособных гепатоцитов из печени одной мыши в наших условиях составлял (51±16)·106.

Крысиные гепатоциты выделяли из печени самок крыс линии Вистар массой 250± г. Перфузию выполняли через воротную вену под давлением 120 мм водного столба. В экспериментах использовали суспензии, не менее 92% клеток в которых не прокрашивалось 0.4% трипановым синим. Выход жизнеспособных гепатоцитов из печени одной крысы в наших условиях составлял (294±86)·106.

Исследование распределения метионина между клетками и средой в суспензии гепатоцитов. Распределение метионина между клетками и инкубационной средой исследовали в суспензии свежевыделенных гепатоцитов крысы с концентрацией клеток ~107 мл-1. Аликвоту суспензии объемом 5 мл помещали в 50 мл стеклянную колбу Эрленмейера, добавляли концентрированный раствор метионина до заданной конечной концентрации и инкубировали при 37°C и орбитальном перемешивании с частотой об/мин на воздухе. Образцы суспензии объемом 1.2 мл отбирали через заданные промежутки времени после добавления метионина. Быстрое разделение клеток и среды и фиксация клеточных образцов достигалось центрифугированием суспензии через дибутилфталат, нанесенный поверх раствора перхлорной кислоты [Fariss et al. 1985].

Перхлорные экстракты клеток и среды хранили при -20°С.

Исследование обратимости транспорта метионина в гепатоцитах. Для исследования обратимости транспорта метионина в гепатоцитах суспензию клеток с концентрацией ~107 мл-1 "нагружали" метионином в течение 15 мин инкубации при начальной концентрации метионина 1500 мкМ. Затем суспензию центрифугировали при 250g в течение 30 сек при комнатной температуре. Надосадок полностью удаляли с помощью пипетки и фильтровальной бумаги. Клеточную массу ресуспендировали в среде, не содержащей метионина, до конечной концентрации клеток ~107 мл-1.

Полученную суспензию инкубировали при 37°C и орбитальном перемешивании с частотой 100 об/мин на воздухе. Образцы суспензии для измерения концентрации метионина в клетках и среде отбирали через заданные промежутки времени после ресуспендирования клеточной массы в среде без метионина. После отбора последней пробы в суспензии определяли концентрацию клеток и гепатокрит.

Исследование кинетики изменения концентрации AdoMet, AdoHcy и метионина при заданных начальных концентрациях метионина. Аликвоты суспензии объемом 5 мл с концентрацией клеток 106 мл-1 помещали в 50 мл стеклянные колбы Эрленмейера и инкубировали при 37°C и орбитальном перемешивании с частотой 100 об/мин в атмосфере увлажненного карбогена (смесь 95% O2 и 5% CO2). В начале эксперимента в каждую колбу добавляли концентрированный раствор метионина до заданной конечной концентрации. Образцы суспензии отбирали через заданные промежутки времени после добавления метионина и смешивали с 0.2 объема 30% трихлоруксусной кислоты. Денатурировавшие белки осаждали центрифугированием при 6500g в течение 8 мин при комнатной температуре. Надосадок отбирали и замораживали. До анализа образцы хранили при -78°C.

Измерение концентрации метаболитов. Концентрацию метаболитов в полученных образцах определяли методом ВЭЖХ [Aw et al. 1986;

Prudova et al. 2005]. Разделение AdoMet и AdoHcy проводили на колонке Кромасил-100 C18, 8 мкм, 2504.6 мм, фирмы Элсико (Москва, Россия). Измеренные значения концентраций AdoMet и AdoHcy нормировали на объемную долю клеток в суспензии, считая, что объем гепатоцита составляет 10-11 л. Значение было посчитано исходя из предположения, что гепатоцит представляет собой шар диаметром 26 мкм [Katayama et al. 2001]. Расчетное значение объема гепатоцитов хорошо согласуется со значением, измеренным нами с помощью следующей процедуры. Образец густой суспензии гепатоцитов крысы помещали в гематокритный капилляр и центрифугировали при 170g в течение 30с. При нормировке на концентрацию клеток в суспензии среднее значение объема гепатоцита, полученное в этих условиях, составляет (10±2)*10-12 л (n=10). Данные [Martin et al. 2002] показывают, что объем мышиных гепатоцитов практически не отличается от объема гепатоцитов крысы. Для измерения концентрации метионина проводили дериватизацию проб 2,4-динитрофторбензолом [Aw et al. 1986]. Полученные образцы анализировали на колонке Диасфер–110 С-18, 5 мкм, 250x4 мм, фирмы БиоХимМак (Москва, Россия).

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка и аппроксимация экспериментальных данных проводилась в программе Microcal Origin 6.0 (Microcal Software, Inc., MA, USA). Для всех экспериментальных данных приведены среднее значение и стандартное отклонение.

Глава 3 содержит результаты работы.

Распределение метионина между клетками и средой в суспензии гепатоцитов крысы. При добавлении в суспензию свежевыделенных гепатоцитов крысы метионин быстро проникает в клетки. В течение 1 мин после добавления метионина в 10% [Мет], мкмоль/л кл или среды Рис. 2. Кинетика изменения концентрации метионина в среде (открытые кружки) и 1000 гепатоцитах (сплошные кружки) после добавления метионина в среду до конечной концентрации 1500 мкМ.

0 10 20 30 40 Время, мин суспензию гепатоцитов внутриклеточная концентрация метионина достигает 50-100% значения концентрации метионина в среде (рис. 2). В течение последующих нескольких минут возможно дальнейшее незначительное увеличение концентрации А Рис. 3. Зависимость стационарного распределения 1. 1. метионина между гепатоцитами и 1. 0.8 инкубационной средой от концентрации 0.6 метионина в среде. Символами обозначены 0. 0. 0.2 экспериментальные данные. Сплошными 0. [Мет]кл/[Мет]среда линиями показаны теоретические кривые (см.

Б 1. 1.2 Главу 4 – обсуждение результатов), полученные 1. при следующих значениях параметров: А 0. 0.6 Kc=150 мкмоль/мин·л клеток, Km=100 мкМ, при 0. разных значениях Kt;

Б - Kt=1/мин·л клеток, 0. Km=100 мкМ, при разных значениях Kc;

В 0. В 1.4 Kt=1/мин·л клеток, Kc=150 мкмоль/мин·л клеток, 1. при разных значениях Km. Значения 1. 0.8 варьируемых параметров указаны под 0.6 соответствующими кривыми. Пунктирной 0.4 0.2 линией показана теоретическая кривая, 0. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 обеспечивающая наилучшую аппроксимацию экспериментальных данных.

[Мет], мМ среда метионина в гепатоцитах, после чего уровень метионина в клетках и среде начинает падать за счет метаболического потребления метионина в клетках. Уменьшение концентрации метионина не вызывает значительного изменения отношения концентраций метионина в клетках и среде. Значения коэффициента распределения метионина были измерены в четырех интервалах концентраций метионина: 30-80 мкМ, 100-200 мкМ, 300-400 мкМ и 1000-1300 мкМ. Полученные данные показывают, что в диапазоне концентраций 40-1300 мкМ отношение концентраций метионина в клетках и среде близко к единице (рис. 3). В то же время, наблюдается слабая зависимость распределения метионина между гепатоцитами и средой от концентрации метионина со статистически достоверным минимумом при концентрациях метионина в диапазоне 300-400 мкМ.

Обратимость транспорта метионина в гепатоциты крысы. Транспорт метионина в гепатоциты крысы обратим. При ресуспендировании нагруженных метионином гепатоцитов в десятикратном объеме среды без метионина концентрация метионина в клетках падает на 60-80% в течение первой минуты (рис. 4). Быстрое снижение концентрации метионина в клетках сопровождается накоплением эквивалентного количества метионина в среде. В последующие минуты концентрация метионина в среде продолжает увеличиваться, а внутриклеточная концентрация метионина снижается и приближается к значению концентрации метионина в среде.

Прямые измерения концентрации метионина в клетках и среде, выполненные в настоящей работе, показывают, что в диапазоне концентраций метионина 60-1500 мкМ квазистационарное распределение метионина между клетками и средой достигается в течение 1 мин после добавления метионина в суспензию гепатоцитов, значение Рис. 4. Кинетика изменения концентрации метионина в среде (открытые кружки) и [Мет], мкмоль/л среды или клеток гепатоцитах (сплошные кружки) при ресуспендировании нагруженных метионином гепатоцитов в среде без 900 метионина. Клетки были нагружены метионином до конечной концентрации 250 1098 мкмоль/л кл в течение 15 мин 200 инкубации в среде с начальной 150 концентрацией метионина 1500 мкМ.

100 Затем суспензию центрифугировали, 50 полностью убирали надосадок и ресуспендировали клетки в 10 объемах среды без метионина.

0 2 4 6 8 Время, мин коэффициента распределения метионина между клетками и средой близко к единице (то есть метионин распределяется равномерно между клетками и средой), транспорт метионина в гепатоциты обратим.

Влияние метионина на концентрацию AdoMet, AdoHcy и скорость потребления метионина в гепатоцитах мыши. При инкубации свежевыделенных мышиных гепатоцитов в среде, содержащей 40 мкМ метионина, что соответствует нормальной физиологической концентрации метионина в крови, концентрация AdoMet в клетках практически не меняется на протяжении ~3 ч (рис. 5А). По данным 24 независимых экспериментов при начальной концентрации метионина 40 мкМ среднее значение концентрации AdoMet в мышиных гепатоцитах на протяжении всего периода инкубации составляет 79±37 мкмоль/л·клеток, что также соответствует нормальному уровню AdoMet в печени. При более высоких начальных концентрациях метионина внутриклеточная концентрация AdoMet увеличивается в течение 20-30 мин и в пределах ~1 ч выходит на плато, достигая нового стационарного уровня (рис. 5А).

Установившийся (стационарный) уровень внутриклеточной концентрации AdoMet сохраняется в течение ~2 ч, после чего концентрация AdoMet начинает снижаться. При увеличении начальной концентрации метионина стационарный уровень внутриклеточной концентрации AdoMet монотонно растет. Однако при начальных концентрациях метионина выше 200 мкМ наблюдается драматический рост стационарной концентрации AdoMet. При начальных концентрациях метионина 200 A В µмоль/л клеток µмоль/л клеток 1000 1000 [АдоМет], [АдоМет], 500 500 0 400 Г Б [Мет], µM [Мет], µM 200 200 0 0 30 60 90 120 150 0 30 60 90 120 Время, мин Время, мин Рис. 5. Кинетика изменения концентрации AdoMet и метионина в суспензии мышиных гепатоцитов при разных начальных концентрациях метионина. На панели А-Б представлены данные репрезентативного эксперимента, полученные при начальных концентрациях метионина 40 мкМ (), 120 мкМ (), 240 мкМ () и 400 мкМ (). На панели В-Г кинетика изменения концентрации AdoMet и метионина, рассчитанная с помощью количественной математической модели метаболизма метионина (см. Главу 4 – обсуждение результатов). Начальные концентрации метионина указаны над соответствующими кривыми.

240 мкМ и 400 мкМ стационарное значение внутриклеточной концентрации AdoMet достигает 590±180 (n=9) и 930±350 мкмоль/л клеток (n=12) соответственно, превышая значения, полученные при концентрации метионина 40 мкМ, в среднем, в 11 и 15 раз.

По данным 7 независимых экспериментов при начальной концентрации метионина мкМ концентрация AdoHcy в гепатоцитах мыши поддерживается на уровне 7.1±7. мкмоль/л клеток (n=7). При более высоких начальных концентрациях метионина внутриклеточная концентрация AdoHcy также растет и в течение ~ 80 мин достигает нового уровня, на котором сохраняется до конца эксперимента (не показано). При начальной концентрации метионина 400 мкМ уровень AdoHcy в гепатоцитах увеличивается до 76±21 мкмоль/л клеток, превышая значения, полученные при 40 мкМ метионина, в среднем, в 10 раз. Концентрация метионина в суспензии гепатоцитов со временем уменьшается за счет метаболического потребления метионина клетками (рис.

5Б). Кинетику изменения концентрации метионина в суспензии гепатоцитов аппроксимировали прямой линией. Скоростью потребления метионина клетками считали тангенс угла наклона аппроксимационной прямой, отнормированный на объемную концентрацию клеток в суспензии. Увеличение начальной концентрации метионина в суспензии мышиных гепатоцитов сопровождается ростом скорости потребления метионина клетками. По данным 15 независимых экспериментов при начальной концентрации метионина 40 мкМ скорость потребления метионина мышиными гепатоцитами составляет 0.86±0.40 ммоль/ч·л клеток. При увеличении начальной концентрации метионина до 400 мкМ скорость потребления метионина гепатоцитами возрастает до 6.0±2.4 ммоль/ч·л клеток (n=12), превосходя значение, полученное при 40 мкМ метионина в 8.1±3.6 раз.

Зависимость стационарной концентрации AdoMet, AdoHcy и скорости потребления метионина от концентрации метионина в гепатоцитах мыши. Для оценки характера экспериментальной зависимости стационарной концентрации AdoMet от концентрации метионина средние значения концентрации AdoMet, измеренной в интервале с 60 до 160 мин инкубации при заданной начальной концентрации метионина, были отложены против средних значений концентрации метионина в суспензии, измеренной за тот же период времени. Стационарные значения концентрации AdoMet, соответствующие определенной начальной концентрации метионина, в каждом эксперименте были отнормированы на максимум – стационарное значение концентрации AdoMet, полученное при начальной концентрации метионина 400 мкМ в том же эксперименте.

На рис. 6А представлена зависимость стационарной концентрации AdoMet от концентрации метионина в мышиных гепатоцитах, построенная по данным независимых экспериментов. Видно, что характерной особенностью зависимости стационарной концентрации AdoMet от концентрации метионина в гепатоцитах мыши является резкий рост концентрации AdoMet в диапазоне концентраций метионина 50 100 мкМ. Угол наклона к оси Ox участков кривой, лежащих в области более низких (рис. 6А, вставка) и более высоких значений концентрации метионина, значительно ниже, чем в диапазоне концентраций 50-100 мкМ, что говорит о более слабой зависимости стационарной концентрации AdoMet от концентрации метионина. Таким образом, в мышиных гепатоцитах зависимость стационарной концентрации AdoMet от концентрации метионина имеет сигмоидный характер. Зависимость стационарной концентрации AdoHcy от концентрации метионина в гепатоцитах мыши, построенная аналогичным образом, показывает, что при увеличении концентрации метионина концентрация AdoHcy повторяет поведение стационарной концентрации AdoMet (не показано). Скорости потребления метионина, полученные при разных начальных концентрациях метионина, были отложены против средних значений концентрации метионина, измеренной в интервале с 60 до 160 мин инкубации при данной начальной концентрации метионина. Таким образом, значения стационарной концентрации AdoMet и скорости потребления метионина, полученные в одном эксперименте при одной и той же начальной концентрации метионина, на рис. 6 соответствуют одному интервалу концентраций метионина. Значения скорости потребления метионина в каждом эксперименте были отнормированы на значение, полученное при начальной концентрации метионина 400 мкМ в том же эксперименте. При сопоставлении графиков для стационарной концентрации AdoMet и скорости потребления метионина видно, что скачок концентрации AdoMet в диапазоне концентраций метионина 50- мкМ сопровождается резким ростом скорости потребления метионина (рис. 6).

1. А 1. [АдоМет], отн. ед.

Рис. 6. Зависимость стационарной 0. концентрации AdoMet и скорости 0.6 потребления метионина от концентрации метионина в гепатоцитах 0.4 0. мыши. Показаны данные 0. 0.0 независимых экспериментов. Данные Скорость потребления Мет, отн. ед.

0 25 50 0.0 одного эксперимента обозначены 1. Б одинаковыми символами. На вставках 1.0 начальные участки кривых растянуты 0.8 вдоль оси Ox. Планки ошибок на вставках убраны.

0. 0. 0. 0. 0.2 0. 0 25 50 0. 0 100 200 300 [Мет], мкМ Подобно стационарной концентрации AdoMet и AdoHcy, выше и ниже зоны скачка скорость потребления метионина относительно слабо зависит от концентрации метионина (рис. 6Б, вставка).

Влияние метионина на концентрацию AdoMet и скорость потребления метионина в гепатоцитах крысы. При начальной концентрации метионина 40 мкМ концентрация AdoMet в крысиных гепатоцитах в аналогичных экспериментальных условиях также практически не меняется в течение ~3 ч инкубации (рис. 7А). По данным независимых экспериментов среднее значение концентрации AdoMet в крысиных гепатоцитах на протяжении 160 мин инкубации составляет 32±7 мкмоль/л·клеток. При более высоких начальных концентрациях метионина внутриклеточная концентрация AdoMet увеличивается и в течение ~1 ч достигает нового стационарного уровня (рис.

7А). Установившийся уровень концентрации AdoMet сохраняется на протяжении ~1 ч, после чего концентрация AdoMet начинает снижаться. Как и в мышиных гепатоцитах, увеличение начальной концентрации метионина в суспензии крысиных гепатоцитов приводит к монотонному росту стационарной концентрации AdoMet в клетках с наиболее существенным увеличением уровня AdoMet при начальных концентрациях метионина выше 200 мкМ. При начальных концентрациях метионина 200-240 и мкМ стационарный уровень концентрации AdoMet в крысиных гепатоцитах составляет 165±19 (n=7) и 214±44 мкмоль/л клеток (n=7) соответственно, превосходя значения, полученные при 40 мкМ метионина, в 5.1±0.9 и 6.7±1.5 раз. Концентрация метионина в суспензии гепатоцитов крысы со временем также уменьшается за счет метаболического потребления метионина клетками (рис. 7Б). Процедура расчета скорости потребления метионина клетками для крысиных и мышиных гепатоцитов была одинаковой. По данным 8 независимых экспериментов при начальной концентрации метионина 40 мкМ [АдоМет], мкмоль/л клеток А Рис. 7. Кинетика изменения концентрации AdoMet и метионина в суспензии гепатоцитов крысы при начальных концентрациях метионина 40 мкМ (), 120 мкМ (), 240 мкМ () и 400 мкМ ().Показаны данные репрезентативного Б эксперимента.

[Мет], мкМ 0 40 80 120 Время, мин скорость потребления метионина гепатоцитами крысы составляет 0.63±0.25 ммоль/ч·л клеток. Повышение начальной концентрации метионина в суспензии гепатоцитов приводит к росту скорости потребления метионина клетками. При начальной концентрации метионина 400 мкМ скорость потребления метионина гепатоцитами крысы составляет 5±1 ммоль/ч·л клеток (n=8), что выше значения, полученного при мкМ метионина, в 8.9±2.8 раз.

Зависимость стационарной концентрации AdoMet и скорости потребления метионина от концентрации метионина в гепатоцитах крысы. Рассмотренные особенности зависимости стационарной концентрации AdoMet от концентрации метионина в мышиных гепатоцитах характерны также для гепатоцитов крысы (рис.

8А). Несмотря на то, что максимальная амплитуда увеличения абсолютного значения стационарной концентрации AdoMet в крысиных гепатоцитах более чем в два раза ниже, чем в гепатоцитах мыши, зависимость стационарной концентрации AdoMet от концентрации метионина в крысиных гепатоцитах также имеет сигмоидный характер.

В диапазоне концентраций метионина 25-75 мкМ угол наклона экспериментальной кривой значительно ниже, чем в диапазоне концентраций 75-100 мкМ (рис. 8А, вставка). В области высоких концентраций метионина (100-400 мкМ) для стационарной концентрации AdoMet в гепатоцитах крысы также характерна слабая зависимость от концентрации метионина, при начальных концентрациях метионина 200-240 мкМ и мкМ стационарная концентрация AdoMet увеличивается в 5.1±0.9 и 6.7±1.5 раз относительно значения, полученного при 40 мкМ метионина. Резкий рост стационарной концентрации AdoMet в гепатоцитах крысы также сопровождается А 1. [АдоМет], отн. ед.

1.0 Рис. 8. Зависимость стационарной 0.8 концентрации AdoMet и скорости потребления метионина от концентрации 0. метионина в гепатоцитах крысы.

0.4 0. Показаны данные 7 независимых 0. 0.2 0. экспериментов. Данные одного опыта Скорость потребления Мет, отн. ед.

0 25 50 0. обозначены одинаковыми символами.

1. Б Процедура расчета стационарного 1. значения концентрации AdoMet и 0. скорости потребления метионина не 0. отличалась от описанной для 0.4 0. гепатоцитов мыши. На вставках 0. 0.2 начальные участки кривых растянуты 0. вдоль оси Ox.

0 25 50 0. 0 100 200 300 [Мет], мкМ ростом скорости потребления метионина (рис. 8Б).

Глава 4 посвящена обсуждению результатов работы.

Полученные нами данные показывают, что в диапазоне концентраций метионина 60 1500 мкМ квазистационарное распределение метионина между клетками и средой достигается в течение 1 мин после добавления метионина в суспензию гепатоцитов (рис. 2). Поскольку стационарное отношение концентраций метионина в клетках и среде в диапазоне концентраций 60-1500 мкМ близко к единице (рис. 3, символы), можно утверждать, что зависимость метаболизма метионина от концентрации метионина в суспензии гепатоцитов, исследованная в нашей работе, фактически соответствует зависимости метаболизма метионина от внутриклеточной концентрации метионина.

В настоящей работе впервые исследованы экспериментально зависимости стационарной концентрации AdoMet, AdoHcy и скорости потребления метионина от концентрации метионина в свежевыделенных гепатоцитах мышей и крыс. Полученные данные показывают наличие резкого роста (скачка) на этих зависимостях при небольшом возрастании концентрации метионина выше физиологически нормальных значений (рис. 6, 8, 9). Этот скачок, предсказанный ранее качественной математической моделью метаболизма метионина в печени [Martinov et al. 2000], подтверждает правильность наших представлений о регуляции этого метаболизма. В соответствии с предсказаниями качественной модели при концентрациях метионина ниже его физиологической нормы в крови (~50 мкМ) метаболизм функционирует в "низком" режиме, который характеризуется низкими концентрациями метаболитов и низкой скоростью потребления метионина (рис. 6, 8, 9, вставки). При повышении концентрации метионина в узком диапазоне концентраций 50-100 мкМ стационарная концентрация AdoMet и скорость потребления метионина не увеличиваются постепенно с ростом концентрации метионина, а резко вырастают ~ в 10 раз (рис. 6, 8, 9), достигая значений, которые соответствуют "высокому" режиму работы метаболизма метионина. Такое поведение метаболизма метионина основано на аллостерической регуляции его ферментов. Анализ математических моделей показывает, что небольшое увеличение концентрации метионина относительно физиологической нормы приводит к умеренному повышению концентрации AdoMet. При этом, благодаря противоположному влиянию AdoMet на скорость МАТ1 и МАТ3 (рис. 1), скорость МАТ1 уменьшается, в то время как скорость МАТ3 увеличивается. В результате суммарная скорость образования AdoMet немного увеличивается. При некотором пороговом значении концентрации метионина скорость МАТ3 превышает скорость МАТ1, и скорость производства AdoMet становится больше суммарной активности внутриклеточных метилаз. Результатом этого является стремительное и самоускоряющееся накопление AdoMet и дальнейшее увеличение скорости МАТ3 под влиянием положительной обратной связи (рис. 1). В то же время, рост концентрации AdoMet приводит к ингибированию метилентетрагидрофолат редуктазы (рис. 1), следствием которого является снижение уровня 5-метилтетрагидрофолата. Ослабление ингибирования глицин N-метилтрансферазы 5-метилтетрагидрофолатом (рис. 1) и активация AdoMet приводят к резкому увеличению скорости работы этого фермента. В результате скорость разрушения AdoMet увеличивается и в клетках устанавливается новое устойчивое стационарное состояние с высокой концентрацией AdoMet и высокой скоростью потребления метионина. Существование метаболического скачка подтверждают формальные оценки характера экспериментальных зависимостей стационарной концентрации AdoMet и скорости потребления метионина от его концентрации. Эти оценки показывают, что полученные экспериментальные зависимости не могут быть описаны линейной или гиперболической функциями.

диапазоне концентраций метионина 0-100 мкМ простой степенной функцией = + Формальная аппроксимация начальных участков экспериментальных кривых в показывает, что наилучшая аппроксимация во всех случаях достигается при значениях n, значительно превышающих единицу. Среднее значение n для нормированной зависимости стационарной концентрации AdoMet от концентрации метионина и нормированной зависимости скорости потребления метионина от его концентрации в гепатоцитах мыши составляет 2.2 и 1.4 соответственно, а в гепатоцитах крысы 2.25 и 2.5 соответственно. Для гиперболической зависимости, заданной 1. А 1.0 Рис. 9. Сравнение качества аппроксимации [АдоМет], отн. ед.

экспериментальной зависимости 0. метаболизма метионина в гепатоцитах 0.6 мыши от его концентрации кривыми, полученными в результате анализа 0.4 0. количественной модели (показаны 0. сплошными черными линиями), и 0. Скорость потребления Мет, отн. ед.

0 25 50 0.0 гиперболами, рассчитанными по 1. Б уравнению Михаэлиса-Ментен.

1.0 Наилучшая аппроксимация гиперболой 0.8 получена при Km=163 мкМ (А) и Km= мкМ (Б) (красные кривые). Остальные 0. гиперболы посчитаны при значениях Km 0. 0. 400 мкМ (синие), 50 мкМ (зеленые), 0. 0.2 мкМ (оранжевые). Для всех кривых 0. 0 25 50 75 значение, полученное при концентрации 0. 0 100 200 300 400 метионина 400 мкМ, принято за 1.0.

[Мет], мкМ уравнением Михаэлиса-Ментен = (100+), значение n оказывается равным 0.64.

Визуальная оценка качества аппроксимации экспериментальных данных гиперболами, посчитанными при разных значениях Km, подтверждает результаты формальной аппроксимации (рис. 9). Пологие начальные участки экспериментальных кривых для стационарной концентрации AdoMet и скорости потребления метионина несовместимы с резкой зависимостью, характерной для гиперболы (рис. 9, вставки), а также исключают возможность аппроксимации экспериментальных данных прямой линией.

На основании данных, полученных в настоящей работе, была построена количественная модель метаболизма метионина в гепатоцитах, которая позволяет хорошо описать экспериментальные результаты, полученные при разных начальных концентрациях метионина [Korendyaseva et al. 2008]. Кинетика изменения концентрации AdoMet и скорость потребления метионина гепатоцитами при разных начальных концентрациях метионина количественно соответствуют расчетным значениям (рис. 5). Согласно модели, снижение концентрации AdoMet, наблюдаемое в конце экспериментов, объясняется снижением концентрации метионина в процессе инкубации. Модель также хорошо описывает стационарные зависимости концентрации AdoMet и скорости потребления метионина от концентрации метионина (рис. 9).

Как качественная, так и количественная модели предсказывают существование, при определенных значениях параметров, триггерного поведения (бистабильности) в метаболизме метионина. При таком поведении метаболизм может стационарно функционировать только в "низком" или "высоком" режиме. Переключение между режимами происходит при некоторой пороговой концентрации метионина, а промежуточные стационарные состояния являются неустойчивыми, то есть фактически отсутствуют. В наших экспериментах условия не являлись строго стационарными, поскольку концентрация метионина в суспензии уменьшалась в ходе инкубации клеток. В связи с этим, наши экспериментальные данные не позволяют ответить на вопрос, переходит ли метаболизм метионина из "низкого" состояния в "высокое" в результате скачка (бистабильности в системе) при отсутствии промежуточных стационарных состояний, или этот резкий переход обусловлен резкой, но непрерывной зависимостью стационарного состояния метаболизма от концентрации метионина.

Надо отметить, однако, что разница между этими вариантами не играет принципиальной роли для регуляции метаболизма метионина в печени [Korendyaseva et al. 2008].

Полученные данные о регуляции метаболизма метионина позволяют хорошо описать зависимость распределения метионина между гепатоцитами и средой от его концентрации, обнаруженную в нашей работе (рис. 3). Для исследования возможного влияния метаболизма метионина на распределение метионина между клетками и средой была построена простая, качественная математическая модель.

Внутриклеточная концентрация метионина в модели определяется разностью скоростей кл транспорта метионина через клеточную мембрану и потребления метионина в клетке:

= где Mкл – концентрация метионина в клетке, Vt – суммарная скорость транспорта метионина через клеточную мембрану, Vc – суммарная скорость метаболического потребления метионина в клетке. Скорость транспорта метионина через клеточную мембрану задана как линейная функция разности внешней и внутриклеточной = среда кл концентраций метионина:

где Kt – константа, соответствующая коэффициенту диффузии метионина через клеточную мембрану, Mсреда – концентрация метионина в среде. В соответствии с нашими собственными данными (рис. 6, 8, 9) скорость потребления метионина в = гепатоцитах описывается сигмоидной зависимостью от концентрации метионина:

1+ кл где Kc соответствует максимальной скорости потребления метионина в гепатоцитах, Km – константа, соответствующая концентрации метионина, скорость потребления метионина при которой равна половине максимальной. Таким образом, стационарное отношение концентраций метионина в клетках и среде может быть получено из среда кл = следующего уравнения:

1 + кл Расчеты, выполненные с помощью модели, показывают, что обнаруженная в экспериментах зависимость распределения метионина от его концентрации может быть объяснена взаимодействием мембранного транспорта и метаболизма метионина в клетках. При значениях параметров, близких к физиологически нормальным, модель хорошо описывает экспериментальные данные (рис. 3). Кривая, обеспечивающая наилучшую аппроксимацию экспериментальных данных, была получена при следующих значениях параметров: Kt=0.8/мин·л клеток, Kc=150 мкмоль/мин·л клеток, Km=220 мкМ (рис. 3, пунктирные линии). Хорошее совпадение экспериментальных данных с расчетной кривой подтверждает, в частности, что предположение о линейной зависимости скорости транспорта метионина через мембрану гепатоцитов от разности между внешней и внутриклеточной концентрациями метионина является вполне корректным. Таким образом, распределение метионина в суспензии свежевыделенных гепатоцитов крысы зависит от скорости метаболического потребления метионина в клетках и фактически является стационарным, а не равновесным.

Согласно количественной математической модели, резкий рост скорости потребления метионина в узком диапазоне концентраций (50-100 мкМ) связан с переключением метаболизма с режима сохранения (рециркуляции) метионина в клетке при низких концентрациях метионина, на режим необратимого разрушения метионина по пути транссульфурирования при его избытке. Сопоставление наших экспериментальных данных с математическими моделями подтверждает наличие скачкообразной регуляции метаболизма метионина в печени, возникающее в результате аллостерически регулируемого переключения между двумя группами ферментов, формирующих параллельные метаболические потоки. В режиме, обеспечивающем сохранение метионина в клетке, метаболический поток определяется набором ферментов, включающим МАТ1, функциональные метилазы и метионин синтазу, тогда как в режиме сброса метионина метаболический поток определяется набором ферментов, включающим МАТ3, глицин N-метилтрансферазу и цистатионин -синтазу (рис. 10) Насколько нам известно, подобный механизм регуляции, связанный с переключением метаболического потока между параллельными реакциями не был показан в других метаболических системах.

Рис. 10. Схема, иллюстрирующая распределение метаболического потока в гепатоцитах при низкой (А) и высокой (Б) концентрации метионина. Толщина сплошных стрелок качественно пропорциональна потоку через соответствующую реакцию. Пунктиром показаны субстратные и аллостерические регуляторные связи, определяющие распределение метаболического потока в "низком" и "высоком" режимах метаболизма метионина. Открытыми и закрытыми пунктирными стрелками обозначены активация и ингибирование соответственно. МТ - функциональные метилазы (метилтрансферазы).

ВЫВОДЫ 1. Показано, что транспорт метионина в гепатоцитах крысы обеспечивает практически равномерное стационарное распределение метионина между клетками и средой в диапазоне концентраций 60-1500 мкМ.

2. Показано, что с увеличением концентрации метионина стационарные концентрации S-аденозилметионина, S-аденозилгомоцистеина и скорость потребления метионина в гепатоцитах мыши скачком вырастают приблизительно в десять раз в узком диапазоне концентраций метионина 50 100 мкМ.

3. В метаболизме метионина в гепатоцитах крыс наблюдается аналогичный резкий скачок стационарных концентраций S-аденозилметионина, S аденозилгомоцистеина и скорости потребления метионина в диапазоне концентраций 75-100 мкМ.

4. Полученные экспериментальные данные хорошо подтверждают гипотезу о существовании двух устойчивых режимов метаболизма метионина в печени (режимы сохранения и разрушения метионина), переключение между которыми регулируется концентрацией метионина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Korendyaseva T.K., Kuvatov D.N., Volkov V.A., Martinov M.V., Vitvitsky V.M., Banerjee R., Ataullakhanov F.I. An allosteric mechanism for switching between parallel tracks in mammalian sulfur metabolism. PLoS Comput Biol. 2008 May 2;

4(5):e1000076.

2. Korendyaseva T.K., Martinov M.V., Dudchenko A.M., Vitvitsky V.M. Distribution of methionine between cells and incubation medium in suspension of rat hepatocytes.

Amino Acids 2010 Nov;

39 (5):1281-9.

3. Korendyaseva T.K., Volkov V.A., Kuvatov D.N., Martinov M.V., Vitvitsky V.M., Ataullakhanov F.I. The metabolic switch in liver methionine metabolism. FEBS J.

2006 June;

273 (s1): 77.

4. Куватов Д.Н., Корендясева Т.К., Волков В.А., Мартынов М.В., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И. Математическое моделирование метаболизма метионина в клетках печени мыши и экспериментальная проверка предсказаний модели. VI Ежегодная Международная Молодежная Конференция ИБХФ РАН – ВУЗЫ “Биохимическая физика” (Москва, 24-27 ноября 2006 г.), стр. 115-119.

5. Корендясева Т.К., Волков В.А., Куватов Д.Н., Мартынов М.В., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И. Аллостерический механизм переключения между параллельными потоками метаболизма метионина в печени. Международная Конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино МО, 5- июня 2007 г.), стр. 28-31.

6. T. Korendyaseva, V. Volkov, D. Kuvatov, M. Martinov, V. Vitvitsky, R. Banerjee, F.

Ataullakhanov. Methionine concentration triggers switching between parallel tracks in liver sulfur metabolism. Life Sciences 2007 (Glasgow, UK, July 8–12, 2007), p. 115.

Список сокращений:

ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография ИБХФ РАН, Институт биохимической физики РАН ФГБУ, Федеральное государственное бюджетное учреждение FEBS, Федерация европейских биохимических обществ