Активность амилолитических ферментов по микрофенологическим фазам прорастания семян различных сортов ярового и озимого ячменя
На правах рукописи
ИГНАТЕНКО ИННА СЕРГЕЕВНА АКТИВНОСТЬ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ПО МИКРОФЕНОЛОГИЧЕСКИМ ФАЗАМ ПРОРАСТАНИЯ СЕМЯН РАЗЛИЧНЫХ СОРТОВ ЯРОВОГО И ОЗИМОГО ЯЧМЕНЯ Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук
Краснодар – 2011 2
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Азово-Черноморская государственная агроинженерная академия» в 2008–2011 г.
Научный руководитель – доктор биологических наук, профессор Алия Сабировна Казакова Официальные оппоненты – доктор биологических наук Юрий Петрович Федулов кандидат сельскохозяйственных наук Николай Викторович Серкин Ведущая организация – ФГБОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет»
Защита диссертации состоится 27.12.2011 г. в 9 ч 00 мин на заседании диссертационного совета Д 220.038.04 при ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13, зал заседаний диссертационного совета.
Телефон (факс) (8-861) 221-57-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», с авторефератом на сайтах http://www.vak.ed.gov.ru и http://www.kubsau.ru/ Автореферат разослан «_»_2011 г.
Учный секретарь диссертационного совета, профессор, д.с.-х.н. Слюсарев В.Н.
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Амилолитические ферменты расщепляют запасной крахмал эндосперма и способствуют прорастанию семени. Изучение амилазной активности проводят, как правило, на определенный день прорастания семян, при этом в одну пробу попадают семена, находящиеся на разных этапах прорастания, либо вовсе невсхожие, что не дает возможности оценить нарастание активности фермента в индивидуальном семени. В АЧГАА разработана усовершенствованная шкала микрофенологических фаз прорастания семян (МФФ ПС) ячменя [Казакова, Козяева, 2009]. На основе четких морфологически отличимых МФФ ПС можно изучать закономерности физиологических и биохимических процессов, последовательно включающихся и протекающих в индивидуальном прорастающем семени. Так, было показано функционирование системы низкомолекулярных антиоксидантов в прорастающем семени ярового и озимого ячменя по МФФ ПС (Ковалева, 2011;
Спичак, 2011);
выявлены механизмы действия предпосевной обработки семян электромагнитным полем и влияния условий недостаточного увлажнения в период прорастания семян (Козяева, 2009). Мы считаем, что использование в исследованиях данного подхода дат возможность зафиксировать изменение активности - и -амилаз по МФФ ПС и трактовать полученные результаты применительно к отдельному семени, что является дальнейшим развитием частной физиологии ячменя.
Цель исследований - изучить активность амилолитических ферментов по микрофенологическим фазам прорастания индивидуального семени ярового и озимого ячменя в условиях оптимального увлажнения.
Задачи исследований:
1. Провести анализ современного состояния проблемы участия амилолитических ферментов в прорастании семени зерновых культур;
2. Определить посевные качества семян сортов ярового и озимого ячменя и мощность проростков при их проращивании в условиях оптимального увлажнения;
3. Определить суммарную активность амилазы и активность - и -амилаз в сухом и прорастающем семени по МФФ ПС ярового и озимого ячменя в условиях оптимального увлажнения;
4. Установить влияние гидротермических условий года репродукции семян на суммарную активность и активность - и -амилаз в сухих и прорастающих семенах по МФФ ПС;
5. Провести корреляционный анализ между стартовой активностью - и амилаз с их активностью по МФФ ПС и посевными качествами семян и параметрами проростков;
6. Выявить влияние пониженной температуры проращивания семян пивоваренного ячменя сорта Зерноградец 770 на суммарную активность амилазы и активность - и -амилаз;
7. Определить зависимость качества солода от степени синхронности прорастания семян ярового ячменя сорта Зерноградец 770;
предложить способ увеличения выхода и повышения качества солода из прорастающих семян ячменя и сокращения при этом сроков солодоращения.
Научная новизна: Впервые по МФФ ПС показана динамика активности амилолитических ферментов в прорастающем семени ярового и озимого ячменя в условиях оптимального увлажнения. Выявлены общие закономерности изменения и сортовая специфика абсолютных значений суммарной активности и активности - и -амилаз по МФФ ПС. Показано влияние генотипа и условий весенне-летнего периода года формирования семян на стартовую активность -амилазы в МФФ ПС «вилка» и стартовую активность -амилазы в сухом семени. Предложен способ увеличения выхода и повышения качества солода из семян пивоваренного ячменя.
Положения, выносимые на защиту: закономерность изменения активности амилолитических ферментов по микрофенологическим фазам прорастания индивидуального семени ярового и озимого ячменя;
влияние генотипа и условий года репродукции семян на активность амилолитических ферментов по МФФ ПС;
влияние пониженной температуры проращивания семян на активность амилолитических ферментов по МФФ ПС;
повышение качества солода и сокращение сроков солодоращения возможно за счет синхронизации прорастания семян ячменя.
Практическая значимость. Значение для фундаментальной и частной физиологии и биохимии растений заключается в том, что на основании предложенного подхода можно характеризовать активность амилолитических ферментов по фазам прорастания индивидуального семени.
Значение для селекции и семеноводства ярового и озимого ячменя заключается в том, что можно проводить корректную оценку сортов и партий семян по активности амилолитических ферментов на определенных фазах прорастания семени. Для пивоварения предложен простой эффективный способ получения более качественного солода и сокращения сроков солодоращения за счет синхронизации прорастания семян. В курсе лекций по дисциплине «Физиология и биохимия растений» для студентов агрономического профиля и по дисциплине «Технология пивоварения» для студентов-технологов можно использовать выявленные закономерности развития активности амилолитических ферментов в индивидуальном семени Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научно практических конференциях АЧГАА (г. Зерноград) в 2009, 2010 и 2011гг.;
на Международной молодежной научно-практической конференции «Научно практические исследования и проблемы современной молодежи» (Казань) в 2010г.;
на Межрегиональном Пагуошском симпозиуме «Наука и высшая школа Чеченской республики: перспективы развития межрегионального и международного научного технического сотрудничества» (г. Грозный) в 2010г.;
на V Общероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы современной науки и образования» (г. Красноярск) в 2010г.;
на IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (г. Ростов на-Дону,) 2011г. Участие в конкурсе «Лучший инновационный проект в сфере АПК», (г. Ростов-на-Дону 2010г.), где был получен грант.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах. Подана заявка на патент «Способ повышения качества солода в пивоварении путем синхронизации прорастания семян ячменя».
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 167 страницах компьютерной версии и состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературных источников из 155 наименований, в том числе 29 – иностранных авторов, и 8 приложений. Диссертация включает 21 таблицу и 38 рисунков.
Декларация личного участия автора. Автор принимала непосредственное личное участие во всех экспериментах и обработке результатов исследования, полученных в ходе выполнения работы.
Литературный обзор.
1.
На основании проведенного анализа данных по изменению активности амилолитических ферментов при прорастании семян ячменя сделан вывод об отсутствии сведений о протекании данных процессов в индивидуальном семени.
2. Методика и условия проведения опытов Экспериментальные исследования выполнены на кафедре физиологии и химии АЧГАА (с 01.09.2011г. – кафедра агробиотехнологии) в 2008-2011гг.
Объектом исследований явились семена трех сортов ярового ячменя:
Зерноградец 770 и Ратник (селекции ВНИИЗК), Мамлюк (селекции КНИИСХ) и трех сортов озимого ячменя Зимур, Романс и Самсон (селекции КНИИСХ). Семена были выращены на полях учебно-опытного фермерского хозяйства АЧГАА в 2007 (семена-07), 2008 (семена-08) и 2009 (семена-09) гг.
Методика исследований. Семена проращивали в растильнях на фильтровальной бумаге, их энергию прорастания и всхожесть определяли согласно ГОСТ 12038-84. Гидротермический коэффициент периода вегетации ярового ячменя рассчитывали по Г.Т.Селяниновой [Гордеев, 2006], на основании чего 2007г. характеризуется – острозасушливый, 2008 – умеренно засушливый, а 2009 – оптимальный. Содержание суммарной активности и активности - и -амилазы определяли в сухой зерновке (СЗ), и семенах, достигших определенной МФФ ПС: «точка, Т» (наклюнувшиеся семена), «вилка» (К1), «короткие корешки» (К2), «длинные корешки» (К3), «росток» (Р) и «проросток» (П). Суммарную активность и активности - и амилазы определяли стандартным методом [Третьяков, 2003]. Активность ферментов выражали в мг гидролизованного крахмала за 1час на 1г абсолютно сухой массы. Качество солода определяли согласно ГОСТ 29294 Предпосевную обработку семян в ЭМП ПЧ проводили на 92.
экспериментальной установке [Таранов, 2002]. Полученные результаты подвергали статистической обработке с помощью ПК.
3. Результаты исследований 3.1 Посевные качества семян, мощность проростков, содержание сухой массы по МФФ ПС изученных сортов ярового и озимого ячменя.
Всхожесть семян изученных сортов ярового и озимого ячменя имеет высокие значения (96-98%). Энергия прорастания семян составляет для семян ярового ячменя 47%, а у озимого несколько выше – 51,6%. Масса семян в среднем по трем сортам у ярового ячменя выше в 1,2 раза, чем у озимого. При проращивании в условиях оптимального увлажнения семена всех сортов на седьмые сутки дают мощные проростки, имеющие 5- корешков. Таким образом, исследования были проведены на качественном экспериментальном материале.
Содержание абсолютно сухой массы прорастающего семени ярового и озимого ячменя по МФФ ПС. Для культуры ячменя в целом характерно наступление каждой последующей МФФ ПС при определенной влажности.
В процессе прорастания семени происходит снижение доли абсолютно сухой массы (АСМ) у ярового ячменя на 53%, а у озимого - на 56%. Максимальное поглощение воды семенем происходит от замачивания семян до наклевывания (фаза «точка»), при этом процент АСМ снижается на 24% у ярового ячменя и на 36% - у озимого. Следовательно, при изучении активности амилолитических ферментов по МФФ ПС ярового и озимого ячменя целесообразно выражать активность ферментов на единицу абсолютно сухой массы. Мы считаем, что в этом случае можно будет получить объективные и сравнимые результаты.
3.2 Изменение активности амилолитических ферментов по микрофенологическим фазам прорастания семени различных сортов ярового и озимого ячменя.
Яровой ячмень. У всех сортов активность амилолитических ферментов (ААФ) возрастает в процессе прорастания семени, причем активность -амилазы возрастает более резко, чем активность -амилазы (рисунок 1).
Установлено наличие сортовых особенностей по проявлению и развитию активности изученных ферментов. Нами впервые показано, что активность -амилазы регистрируется только начиная с МФФ «вилка», в сухих и наклюнувшихся семенах она отсутствует. Самая высокая активность -амилазы отмечена у сорта Зерноградец 770, а -амилазы - у сорта Ратник.
Активность -амилазы Суммарная активность амилазы 1,4 0, Зерноградец Мамлюк 1,2 0, крахмала/1г схого в-ва*час крахмала/1г схого в-ва*час Активность амилазы, мг Рат ник 2007г Активность амилазы, мг 1 0, 0,8 0, 0, 0, 0,4 0, 0, 0, СЗ Т К1 К2 К3 Р П СЗ Т К1 К2 К3 Р П МФФ ПС МФФ ПС Активность -амилазы 0, Рисунок 1 – Активность 0, крахмала/1г схого в-ва*час Активность амилазы, мг 0, амилолитических ферментов в сухом 0, и прорастающем семени ярового 0, 0, ячменя (среднее за три года) СЗ Т К1 К2 К3 Р П МФФ ПС Озимый ячмень. У изученных сортов озимого ячменя выявлена аналогичная закономерность изменения ААФ. (рисунок 2). Активность -амилазы также впервые проявляется в МФФ «вилка», а между сортами имеются количественные отличия. Максимальная активность -амилазы отмечена у сорта Романс, а -амилазы у сорта Зимур.
Активсность -амилазы Суммарная активность амилазы 0, 1, Зимур Романс 0, крахмала/г схого в-ва*час Активность амилазы, мг 1, крахмала/г схого в-ва*час Самс он Активность амилазы, мг 0, 0, 0, 0, 0,6 0, 0, 0, 0, 0, СЗ Т К1 К2 К3 Р П СЗ Т К1 К2 К3 Р П МФФ ПС МФФ ПС Рисунок 2 – Активность Активность -амилазы 0, крахмала/г схого в-ва*час амилолитических ферментов в сухом 0, Активность амилазы, мг 0, и прорастающем семени озимого 0, ячменя (среднее за три года) 0, 0, СЗ Т К1 К2 К3 Р П МФФ ПС Факторный анализ общей дисперсии признака стартовая ААФ в семенах ярового и озимого ячменя. Определяющими в стартовой активности -амилазы в МФФ ПС К1 у ярового ячменя являются взаимодействие факторов А и В (генотип-среда) - 36%, а также условия года репродукции семян - 34% (рисунок 3).
Яровой ячмень Озимый ячмень Взаимодействия Год репродукции Год репродукции (А+В) Генотип фактор В) (фактор В) 56% (фактор А) 34% 8% 8% Генотип Влияние (фактор А) Взаимодействия Сила влияния Влияние случайных Сила влияния 32% (А+В) повторений случайных факторов повторений 0% 36% факторов 22% 0% Генотип (фактор А) 4% Год репродукции (фактор В) Генотип (фактор А) Год репродукции (фактор В) Взаимодействия (А+В) Сила влияния повторений Взаимодействия (А+В) Сила влияния повторений Влияние случайных факторов Влияние случайных факторов Рисунок 3 - Факторная структура общей дисперсии признака «активность -амилазы» в семенах ярового и озимого ячменя в ММФ «вилка» (К1) (среднее по трем сортам ярового и трем сортам озимого ячменя за 2007-2009 гг.) У озимого ячменя взаимодействие факторов А и В (генотип-среда) оказывает более существенное влияние на стартовую активность -амилазы – 56%, затем следует влияние генотипа - 32%.
Влияние генотипа и условий среды на стартовую активность -амилазы в сухом семени ярового ячменя (рисунок 4) отличается от их влияния на стартовую активность -амилазы: существенная роль в активности принадлежит влиянию года репродукции семян (25%) и взаимодействию факторов А и В (генотип-среда) (21%). Меньшее влияние оказывает генотип всего 6%. У озимого ячменя преимущественное влияние на стартовую активность -амилазы в сухом семени имеет генотип - 41%. Влияние взаимодействия факторов А и В (генотип-среда) составляет 22%, а года репродукции - 16%.
Яровой ячмень Озимый ячмень Год репродукции Генотип Генотип (фактора В) Год репродукции (фактора А) (фактора А) 25% (фактора В) 6% 41% 16% Взаимодействия Влияние (А+В) Влияние Сила влияния Взаимодействия случайных 22% случайных повторений (А+В) факторов Сила влияния факторов 1% 21% 33% 20% повторений 15% Генотип (фактора А) Год репродукции (фактора В) Взаимодействия (А+В) Сила влияния повторений Генотип (фактора А) Год репродукции (фактора В) Влияние случайных факторов Взаимодействия (А+В) Сила влияния повторений Влияние случайных факторов Рисунок 4 - Факторная структура общей дисперсии признака «активность -амилазы» в сухом семени ярового и озимого ячменя (среднее по трем сортам ярового и трем сортам озимого ячменя за 2007-2009 гг.) Сравнение традиционного (на сырую массу) и предлагаемого (на абсолютно сухую массу) способов выражения ААФ в процессе прорастания семян ярового ячменя (рисунок 5).
По МФФ ПС По сутками проращивания 0, 1, -амилаза -амилаза 0,6 -амилаза -амилаза Активность амилазы, Активность амилазы, 0, 0, мг/гАСМ*час мг/гАСМ*час 0, 0, 0, 0, 0, 0,2 0, СЗ Т К1 К2 К3 Р П 1 2 3 4 5 6 МФФ ПС Сутки проращив ания Рисунок 5 - Изменение активности амилолитических ферментов по суткам проращивания и МФФ в прорастающих семенах ярового ячменя сорта Зерноградец 770, выраженное на абсолютно сухую массу.
Если судить по кривым активности, выраженной на сырую массу, можно сказать, что активность изучаемых ферментов снижается с 3-5 суток проращивания семян и сделать вывод об инактивации фермента. Однако данные по ААФ, выраженные на АСМ, свидетельствует об обратном.
В результате изучения ААФ ферментов по МФФ ПС нами впервые описаны закономерности изменения их активности в индивидуальном семени, что является дальнейшим развитием частной физиологии ячменя и может найти применение в селекции, семеноводстве, а так же в практике солодоращения в пивоварении. Таким образом, изучение активности амилолитических ферментов целесообразно проводить по предлагаемой нами методике: в анализ отбирать семена, находящиеся на одной МФФ ПС, а результаты выражать на абсолютно сухую массу.
3.3 Влияние гидротермических условий года репродукции семян на ААФ в прорастающем семени ярового и озимого ячменя.
Яровой ячмень. Суммарная активность амилазы и активность - и амилаз возрастают от фазы «сухое зерно» до фазы «проросток» независимо от года репродукции семян, гидротермические условия весенне-летнего периода года репродукции семян оказывают влияние только на количественные характеристики активности изученных ферментов.
Острозасушливые условия в период формирования семян приводят к тому, что нарастание активности изученных ферментов начинает отставать, когда идет интенсивный рост и формирование зародышевых корешков.
Озимый ячмень. У изученных сортов озимого ячменя выявлена аналогичная закономерность. ААФ при прорастании возрастает независимо от года репродукции семян. Активность -амилазы не регистрируется в сухих семенах и в фазе «точка», а с фазы «вилка» активность этого фермента начинает возрастать вплоть до фазы «проросток». Условия года репродукции семян влияют на величину активности амилолитических ферментов.
Значения коэффициентов вариации активности -амилазы по МФФ ПС ярового и озимого ячменя в целом значительно выше значений вариации суммарной активности и активности -амилазы (таблица 1).
Таблица 1 - Значения коэффициентов вариации ААФ в прорастающем семени ярового и озимого ячменя по МФФ ПС в зависимости от года репродукции семян (среднее по трем сортам).
МФФ ПС Культура Год СЗ Т К1 К2 К3 Р П Суммарная активность амилазы 2007 0,6 9,8 8,1 3,9 15,4 22,6 19, Яровой 2008 2,1 12,5 19,4 41,1 34,4 33,7 29, ячмень 2009 1,5 8,1 9,2 14,7 18,3 22,3 17, 2007 3,1 26,4 25,1 35,4 16,5 19,4 20, Озимый 2008 4,2 34,4 26,3 43,3 5,6 1,6 2, ячмень 2009 0,6 26,7 28,5 30,2 28,1 12,0 21, Активность -амилазы 2007 - - 28,8 44,9 15,0 23,9 16, Яровой 2008 - - 44,5 65,7 38,9 41,0 37, ячмень 2009 - - 57,9 25,1 51,6 15,9 15, 2007 - - 51,1 56,4 45,4 38,7 31, Озимый 2008 - - 12,1 38,6 36,8 11,8 1, ячмень 2009 - - 52,1 16,8 39,1 19,6 16, Активность -амилазы 2007 1,0 9,8 3,0 18,4 25,1 24,2 31, Яровой 2008 2,8 12,5 19,5 37,6 27,4 27,4 25, ячмень 2009 1,9 8,1 10,4 15,3 19,3 30,0 24, 2007 3,1 30,1 28,4 38,3 35,2 4,8 15, Озимый 2008 4,2 34,3 27,9 44,2 17,2 11,4 16, ячмень 2009 0,6 26,7 33,5 33,6 28,2 29,9 33, Значения коэффициента вариации суммарной активности и -амилазы имеют минимальные значения в МФФ ПС «сухая зерновка» ярового и озимого ячменя.
Сравнивая реакцию изученных сортов по величинам вариабельности стартовой активности - и -амилаз и их активности по МФФ ПС, можно сделать вывод, что условия года репродукции семян по-разному влияют на формирующееся семя изученных генотипов ярового и озимого ячменя.
Изменение ААФ за межфазные периоды может дать дополнительную информацию для оценки влияния экологических условий (рисунки 6,7).
2007г 2008г 0,3 0, су ммарная актив ность -амилаза Изменение активности, мг изменение активности, мг 0, 0,25 -амилаза крахм/час*г АСМ крахм/час*г АСМ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, СЗ-Т Т-К1 К1-К2 К2-К3 К3-Р Р-П СЗ-Т Т-К1 К1-К2 К2-К3 К3-Р Р-П Межфазные периоды Межфазные периоды.
Рисунок 6 - Изменение активности 2009г 0, 0, амилолитических ферментов за Изменение активности, мг 0, крахм/час*г АСМ межфазные периоды прорастания 0, 0, семени ярового ячменя (среднее по 0, трем сортам) 0, 0, СЗ-Т Т-К1 К1-К2 К2-К3 К3-Р Р-П Межфазные периоды Изменение активности -амилазы в семенах ярового и озимого ячменя резко возрастает за межфазные периоды до МФФ «росток», а затем резко снижается как семенах-07, так и семенах-09. А в семенах-08 прирост активности ферментов в семенах ярового ячменя продолжается до полного прорастания семени, а в семенах озимого – снижается. Изменение активности -амилазы как у ярового, так и у озимого ячменя в целом характеризуется снижением значений, при этом в зависимости от года репродукции семян степень снижения активности фермента и форма кривой несколько меняются: увеличение прироста активности фермента сменяется его снижением. Как и у ярового, так и у озимого ячменя возрастание активности -амилазы сменяется возрастанием активности -амилазы. Прирост суммарной активности амилазы от фазы «сухая зерновка» до фазы «вилка» отражает ход кривой -амилазы, а затем до фазы «проросток» - ход кривой -амилазы.
2007г 2008г.
0, 0, су ммарная актив ность 0,4 -амилаза Изменение активности, мг -амилаза 0, Изменение активности, мг 0, крахм/час*г АСМ крахм/час*г АСМ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,05 0, СЗ-Т Т-К1 К1-К2 К2-К3 К3-Р Р-П СЗ-Т Т-К1 К1-К2 К2-К3 К3-Р Р-П Межфазные периоды Межфазные периоды Рисунок Прирост активности 2009г 0, амилолитических ферментов по 0, Изменение активности, мг 0, МФФ ПС озимого ячменя (среднее крахм/час*г АСМ 0, сорта за 3 года) 0, 0, 0, 0, СЗ-Т Т-К1 К1-К2 К2-К3 К3-Р Р-П Межфазные периоды 3.4 Сравнительная оценка активности амилолитических ферментов в прорастающем семени ярового и озимого ячменя свидетельствует о том, что ход изменения активности ферментов имеет идентичный характер (рисунок 8).
Суммарная активность амилазы Активность -амилазы 0, 1, крахмала/г сухого в-ва*час Яровой ячмень крахмала/г сухого в-ва*час Активность амилазы, мг 0, 1, Активность амилазы, мг Озимый ячмень 1 0, 0,8 0, 0,6 0, 0, 0, 0, 0, Сз Т К1 К2 К3 Р П Сз Т К1 К2 К3 Р П МФФ ПС МФФ ПС Рисунок 8 - Изменение активности Активность -амилазы 0, амилолитических ферментов ярового крахмала/г сухого в-ва*час Активность амилазы, мг 0, 0, и озимого ячменя (среднее 3 сорта за 0, 3 года) 0, 0, Сз Т К1 К2 К3 Р П МФФ ПС Изменение активности ферментов на начальных фазах прорастания (до фаз «короткие» и «длинные корешки») происходит в среднем на 12-22% для -амилазы и на 7-23% для -амилазы. С момента активного роста зародышевых корешков увеличение активности фермента замедляется. При этом активность ферментов выше в семенах озимого ячменя (таблица 2).
Активность -амилазы в сухих семенах выше у ярового ячменя. Стартовая активность -амилазы в прорастающем семени озимого ячменя (фаза «вилка») на 61,7% превышает ее активность в семени ярового ячменя.
Стартовая активность -амилазы в фазе точка на 23,8% превышает ее активность в семени ярового ячменя.
Таблица 2 - Величина превышения активности амилолитических ферментов в прорастающем семени озимого ячменя над их активностью в семени ярового ячменя (в % от активности ферментов в семени ярового ячменя).
Превышение активности по МФФ ПС, % Фермент СЗ Т К1 К2 К3 Р П Суммарная активность -2,0 20,2 6,1 11,8 7,1 15,2 11, -амилаза - - 61,7 26,5 5,7 12,4 10, -амилаза -2,0 23,8 12,0 11,6 19,2 16,0 17, Вариабельность значений активности ферментов в прорастающем семени ярового и озимого ячменя (таблица 3).
Таблица 3 - Значения коэффициентов вариации активности амилолитических ферментов в прорастающем семени ярового и озимого ячменя по МФФ ПС (среднее за три года по трем сортам).
МФФ ПС Культура СЗ Т К1 К2 К3 Р П Суммарная активность амилазы Яровой 2,1 9,1 16,4 22,2 23,6 25,3 23, ячмень Озимый 3,2 31,3 24,4 32,4 20,9 12,5 15, ячмень Активность -амилазы Яровой - - 41,0 41,5 39,1 27,0 28, ячмень Озимый - - 39,7 34,9 53,6 24,9 23, ячмень Активность -амилазы Яровой 2,1 9,1 16,1 23,8 22,0 25,0 25, ячмень Озимый 3,2 31,3 27,1 34,3 17,2 17,9 22, ячмень Значения коэффициента вариации суммарной активности ферментов с фазы «сухая зерновка» до фазы «короткие корешки» Квар озимого ячменя выше, чем у ярового (в 1,5-3,7 раза), а с фазы «длинные корешки» до фазы «проросток» Квар выше у ярового ячменя (в 1,5-2раза). Вариабельность активности -амилазы ярового ячменя в целом значительно выше, чем значения Квар озимого ячменя. Наименьшая вариабельность активности -амилазы у ярового ячменя отмечается в фазе «росток» (Квар=27,0%), а у озимого ячменя - в фазе «проросток» (Квар=23,9%).
Прирост ААФ за межфазные периоды в процессе прорастания семени ярового и озимого ячменя. Изменение активности -амилазы у ярового и озимого ячменя несколько отличаются: у ярового ячменя от фазы «вилка» до фазы «росток» линейно возрастает пророст активности данного фермента в 6,2 раза (рисунок 9).
Яровой ячмень Озимый ячмень 0, 0, су ммарная актив ность Изменение активности, мг 0,3 -амилаза 0, Изменение активности, мг -амилаза крахм/час*г АСМ крахмала/час*г АСМ 0,25 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, СЗ-Т Т-К1 К1-К2 К2-К3 К3-Р Р-П СЗ-Т Т-К1 К1-К2 К2-К3 К3-Р Р-П Межфазные периоды Межфазные периоды Рисунок 9 - Изменение активности амилолитических ферментов за межфазные периода ярового и озимого ячменя (среднее по трем сортам за три года).
У озимого ячменя от фазы «вилка» до фазы «длинные корешки» наблюдается прирост активности в 2,1 раза, а затем до фазы «росток» следует возрастание в 3,4 раза. Далее к фазе «проросток» прирост активности -амилазы снижается как у ярового ячменя (в 1,4 раза),так и у озимого (в 1,9 раза).
Корреляционный анализ был проведен для выявления связи между активностью - и -амилазами в прорастающем семени ярового и озимого ячменя по МФФ ПС. Значения коэффициентов корреляции между стартовой активностью -амилазы и стартовой активностью -амилазы представлены на рисунке 10. Корреляция между стартовой активностью - и -амилаз для озимого ячменя имеют слабую отрицательную, а для ярового ячменя – среднюю отрицательную корреляцию в фазе «сухая зерновка», и среднюю положительную для фазы «точка». Это подтверждает полученные нами ранее результаты о том, что - и -амилазы не имеют одинаковые высокие значения на начальных фазах прорастания семени.
0,5 яровой ячмень 0, озимый ячмень 0, 0, Коэффициент корреляции 0, 0, СЗ Т -0,1 -0, -0,2 -0, -0, -0, -0, Рисунок 10 - Корреляция между стартовой активностью -амилазы в МФФ «вилка» и стратовой активнсотью -амилазы в МФФ «сухая зерновка» и «точка» прорастающего семени ярового и озимого ячменя (среднее по трем сортам ярового и трем сортам озимого ячменя за три года).
Наиболее интересные, на наш взгляд, данные получены по изучению связи стартовой активности -амилазы с ее активностью в последующих фазах прорастания семени (рисунок 11А).
Б А 1,2 0, Яров ой ячмень 0,94 0,85 0, 1 0, 0, 0, Озимый ячмень 0, 0, 0,8 0, 0, Коэффициент кореляции Коэффициент корреляции 0, 0, 0, 0, 0, 0,35 0, 0,4 0, 0, 0, 0, 0, 0, Т К1 К2 К3 Р П -0, -0, 0, -0, 0, -0, -0,6 -0,53 -0,61 -0,63 -0,65 К1 К2 К3 Р П -0,8 -0, Яров ой ячмень Озимый ячмень - Рисунок 11 - Корреляция между стартовой активностью -амилазы в фазе «сухая зерновка» (А) и в фазе «точка» (Б) и ее активностью в последующих фазах прорастания семени (среднее по трем сортам ярового и трем сортам озимого ячменя за три года).
Активность свободной формы -амилазы, которая присутствует в сухом семени, отрицательно коррелирует с ее активностью в фазах «точка», «вилка» и «короткие корешки» в прорастающем семени ярового и озимого ячменя. В семенах озимого ячменя эта отрицательная связь выражена более существенно. Корреляционная зависимость между стартовой активностью -амилазы в фазе «точка» и ее активностью в последующие фазы (рисунок 11Б) имеет сильную положительную корреляцию для ярового и озимого ячменя.
Корреляция между стартовой активностью -амилазы и массой семян, энергией прорастания и всхожестью.
Активность -амилазы в сухом семени имеет среднюю положительную связь с энергией прорастания и очень низкую положительную со всхожестью (рисунок 12).
-амилаза в МФФ "точка" -амилаза в сухом семени 0, 0, 0,28 0, 0, 0, Коэффициент корреляции, % 0, Коэффициент корреляции, % 0, 0,4 0, 0,2 0,08 0,05 Масса 1000 Энергия Всхожесть, % семян, г прорастания, % 0 -0, Масса 1000 Энергия Всхожесть, % -0,2 семян, г прорастания, % -0, -0, -0, -0, -0, -0, Яровой ячмень -0,61 -0, -0, -0, -0,8 Озимый ячмень Рисунок 12 - Значения коэффициента корреляции между стартовой активностью -амилазы (в сухом семени и МФФ ПС «вилка») и массой семян, энергией прорастания и всхожестью Ее корреляция с массой 1000 семян, наоборот, имеет средние отрицательные значения. Следовательно, наличие в сухом семени активной формы -амилазы обеспечивает субстратом ткани зародыша и способствует быстрому прорастанию (энергия прорастания повышается). А вот увеличение массы семени в ходе налива еще на материнском растении не приводит к увеличению фонда свободной формы -амилазы.
Связь активности -амилазы в фазе «точка» с массой 1000 семян имеет средние положительные значения, а с энергией прорастания – средние и сильные отрицательные значения. Следовательно, чем больше масса семени, тем больше гранулы крахмала в эндосперме связывают молекул фермента, так как известно, что -амилаза иммобилизуется на крахмальных зернах.
Естественно, чем больше -амилазы находится в связанной форме, тем ниже энергия прорастания.
3.5 Влияние пониженных температур на изменение активности амилолитических ферментов в прорастающем семени ярового ячменя сорта Зерноградец 770.
При низкой температуре активность амилолитических ферментов выше, чем при оптимальной (рисунок 15).
Суммарная активность аимлазы Активность -амилазы 1, 20С 0, 1,6 14С Активность амилазы, мг/г 0, 1, Активность амилазы, 0, 1, АСМ*час мг/гАСМ*час 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, Сз Т К1 К2 К3 Р П МФФ ПС Сз Т К1 К2 К3 Р П МФФ ПС Рисунок 15 - Влияние оптимальной и Активность -амилазы 0, пониженной температур на 0, Активность амилазы, 0, активность амилолитических мг/гАСМ*час 0, 0, ферментов в прорастающем семени 0, 0, ярового ячменя сорта 0, 0, Зерноградец Сз Т К1 К2 К3 Р П МФФ ПС Особенно это характерно для -амилазы. Наибольшие отличия активности обоих ферментов отмечены в фазах росток и проросток. Пониженная температура не приводит к существенному изменению формы кривых активности амилолитических ферментов по МФФ ПС но меняет абсолютные значения их активности.
Прирост активности изученных ферментов при проращивании семян в условиях пониженной и оптимальной температур. Максимальный прирост суммарной активности и активности -амилазы наблюдается за межфазный период «длинные корешки - росток», максимальный прирост -амилазы – за межфазный период «короткие - длинные корешки».
3.6 Зависимость качества солода от степени синхронности прорастания семян ярового ячменя сорта Зерноградец 770.
Повышение синхронности прорастания семян при температуре солодоращения (+140С) было достигнуто за счет их обработки электромагнитным полем промышленной частоты (ЭМП ПЧ). Уже через сутки проращивания количество наклюнувшихся семян возросло в 2,4 раза по сравнению с необработанными семенами, и это преимущество сохранялось до окончания солодоращения. А также увеличилась на 18% всхожесть семян, что повышает выход солода.
Активность амилолитических ферментов в солоде, который мы получали на 7-10 сутки солодоращения, существенно превосходит активность ферментов в контрольном варианте (рисунок 16).
Активность -амилазы в солоде Суммарная активность амилазы в солоде 1,4 0, Контроль Активность амилазы, мг крахмала/1г ЭМП ПЧ 1,2 0, Активность амилазы, мг крахмала/г сухого в-ва*час 1 0, сухого в-ва*час 0,8 0, 0,6 0, 0,4 0, 0,2 0, 0 7 8 9 Сутки 7 8 9 Сутки Рисунок 16 - Активность Активность -амилазы в солоде 0, амилолитических ферментов в солоде Активность амилазы, мг крахмала/г 0, 0, при проращивании семян ярового сухого в-ва*час 0, ячменя сорта Зерноградец 0, 0, 0, 0, 7 8 9 Сутки Активность -амилазы на 9 сутки солодоращения превышает активность ферментов контрольного варианта в 8,4 раза, активность -амилазы на сутки – в 1,7 раза, а суммарная активность амилолитических ферментов на сутки – в 2,2 раза. По всем параметрам солод из обработанных семян соответствует ГОСТу. А вот по продолжительности осахаривания сырья он превосходит контрольный вариант в 1,6…3,3 раза. Таким образом, изучение активности амилолитических ферментов по фазам прорастания семени ячменя выявило «узкое место» в солодоращении и предложить дешевый и эффективный способ увеличения выхода и повышения качества солода.
Выводы 1. Впервые показано изменение активности амилолитических ферментов (суммарная активность, - и -амилазы) по микрофенологическим фазам прорастания индивидуального семени ярового и озимого ячменя.
Установлено, что активность изученных ферментов разнится в разные фазы прорастания семени. Активность амилолитических ферментов возрастает до появления проростка по ГОСТу.
Впервые установлено, что стартовая активность -амилазы в 2.
прорастающем семени ярового и озимого ячменя независимо от года репродукции семян регистрируется только в МФФ «вилка».
3. Для культуры ячменя в целом характерен прирост активности -амилазы до фазы «росток» и снижение прироста к фазе «проросток». Прирост активности -амилазы имеет максимальные значения в МФФ «точка», а затем он постепенно снижается.
4. На стартовую активность -амилазы в МФФ «вилка» у ярового ячменя оказывают влияние взаимодействие факторов генотип-среда (36%) и условия года репродукции семян (34%), а у озимого ячменя - взаимодействие факторов генотип-среда (56%) и генотип (23%). На стартовую активность -амилазы в сухом семени ярового ячменя оказывают влияние год репродукции (25%) и взаимодействие факторов генотип-среда (22%), а у озимого - генотип (41%) и взаимодействие факторов генотип-среда (22%).
5. Гидротермические условия весенне-летнего периода года репродукции семян не влияют на характер изменения активности амилолитических ферментов, но оказывают влияние на количественные характеристики активности данных ферментов. Острозасушливые условия в период формирования семян приводят к тому, что нарастание активности изученных ферментов начинает отставать в момент интенсивного роста и формирования зародышевых корешков.
6. Максимальное варьирование активности -амилазы у ярового ячменя достигается в фазе «короткие корешки» (41,5%), а у озимого - в фазе «вилка» (39,7%). В целом значения коэффициентов вариации активности -амилазы по МФФ ПС значительно выше, чем значения коэффициентов вариации суммарной активности и активности -амилазы.
Стартовая активность - и -амилаз не имеют существенной 7.
корреляционной связи как между собой, так и с активностью данных ферментов в последующих фазах. Активность -амилазы в МФФ «точка», когда активирована уже и связанная форма фермента, имеет существенную положительную связь с его активностью в последующих фазах прорастания.
8. Проращивание семян ярового ячменя при пониженной температуре приводит к повышению активности - и -амилаз. Наибольший прирост активности -амилазы достигается по сравнению с оптимальной температурой проращивания в МФФ «длинные корешки» (60%), а активности -амилазы – в МФФ «росток» (более 76%).
9. Синхронизация прорастания семян ярового ячменя, которая достигается путем предпосевной обработки семян переменным электромагнитным полем промышленной частоты, позволяет при пониженной температуре в ходе солодоращения сократить продолжительность солодоращения на 1 день и получить более качественный солод.
10. Подана заявка на патент «Способ повышения качества солода в пивоварении путем синхронизации прорастания семян ячменя».
Предложения производству. Для пивоварения предложен простой эффективный способ получения более качественного солода и сокращения сроков солодоращения за счет синхронизации прорастания семян.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, определнных ВАК 1. Игнатенко, И.С. Способ увеличения выхода солода в пивоварении путем синхронизации прорастания семян ярового ячменя / И.С. Игнатенко, С.Ю. Козяева, А.С. Казакова // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета, г. Мичуринск. 2011. № 1 (ч.1) – С. 113-117.
2. Игнатенко, И.С. Влияние экологических условий года репродукции семян на развитие амилолитической активности в прорастающих семенах ярового ячменя // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. Режим доступа:
http://ej.kubagro.ru/2011/06/pdf/13.pdf №70 (06) – 2011.
Публикации в других изданиях 3. Игнатенко, И.С. Изменение активности амилолитических ферментов в семенах ярового и озимого ячменя на начальных этапах прорастания / И.С.
Игнатенко, С.Ю. Козяева, А.С. Казакова // Актуальные вопросы современной науки и образования. Выпуск 2- Красноярск. 2010. – С. 223-225.
4. Игнатенко, И.С. Применение экологически безопасного фактора синхронизации прорастания семян ярового ячменя в условиях пониженной температуры / И.С. Игнатенко, С.Ю. Козяева, А.С. Казакова // Труды ІІ Международной молодежной научно-практической конференции. Том 1.
Казань. 2010. – С. 221-226.
5. Игнатенко, И.С. Влияние гидротермического режима весенне летнего периода вегетации растений озимого ячменя на устойчивость семян к почвенной осенней засухе / Е.А. Спичак, И.С. Игнатенко, А.С. Казакова // Межрегиональный Пагуошский симпозиум.- Грозный, 2010. – С. 441-443.
6. Игнатенко, И.С. Предпосевная обработка семян ярового ячменя повышает всхожесть и синхронизирует прорастание в условиях пониженной температуры / И.С. Игнатенко, С.Ю. Козяева, А.С. Казакова // В мире научных открытий.- г. Красноярск. 2010. – С. 297-299.
7. Игнатенко, И.С. Влияние генотипа и факторов среды в период формирования семян на стартовую амилолитическую активность прорастающего семени ярового и озимого ячменя / И.С. Игнатенко, А.С.
Казакова // Вестник аграрной науки Дона №2(14).–Зерноград, 2011.– С.94-98.
8. Игнатенко, И.С. Прирост активности амилазы по микрофенологическим фазам прорастания семени ярового и озимого ячменя / И.С. Игнатенко, А.С. Казакова // IV Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины. – г. Ростов-на-Дону. 2011. – С.193-194.
Издается в авторской редакции ЛР 65-13 от 15.02.99. Подписано в печать 23.11.2011.
Формат 60х84/16. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 405.
© РИО ФГБОУ ВПО АЧГАА 347740, Зерноград, Ростовской области, ул. Советская, 15.