Лев николаевич моделирование организации активных рибосомных генов в геноме человека и фенотипических проявлений их копийности
На правах рукописи
УДК 575.17:575.224:51-76 Пороховник Лев Николаевич МОДЕЛИРОВАНИЕ ОРГАНИЗАЦИИ АКТИВНЫХ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА И ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ ИХ КОПИЙНОСТИ 03.02.07 – Генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013 2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Медико генетический научный центр” Российской академии медицинских наук
Научный консультант:
Ляпунова Наталия Алексеевна доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Балановский Олег Павлович, доктор биологических наук Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт общей ге нетики им. Н.И. Вавилова» Российской академии наук, руководитель группы ге номной географии Носиков Валерий Вячеславович, доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохими ческой физики им. Н.М.Эмануэля» Российской академии наук, заведующий лабо раторией постгеномных молекулярно-биологических исследований
Ведущая организация:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет им.
А.И.Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра ме дицинской генетики
Защита состоится «07» октября 2013 г. в _ часов на заседании Диссертационно го ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учрежде нии «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д.1)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственно го бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской акаде мии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.
Автореферат разослан «06» сентября 2013 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016. по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.
Рибосомы – цитоплазматические органеллы, осуществляющие синтез белков на матричных РНК. Их основным компонентом служат рибосомные РНК (рРНК), кодируе мые рибосомными генами (РГ). РГ представлены в геноме человека множественными копиями. За один митотический цикл эукариотическая клетка продуцирует около миллионов рибосом, а на рРНК приходится до 80% общего количества РНК в клетке.
Последние три десятилетия интенсивно изучаются молекулярные механизмы ре гуляции транскрипции РГ (Jacob S.T., 1995;
Xie W. et al., 2012). При этом неоправданно мало внимания уделяется биологической роли количества копий (копийности) РГ в ге номе. Это в значительной мере объясняется техническими трудностями определения числа копий умеренно повторяющихся последовательностей. Кроме того, изучение ко пийности РГ затруднено наличием разных эпигенетических состояний активности этих генов (Santoro R., 2011;
Ляпунова Н.А., Вейко Н.Н., 2010).
Вместе с тем, в ФГБУ «МГНЦ» РАМН разработаны методы определения общего количества рибосомных повторов в индивидуальных геномах человека, и на больших выборках показано, что у разных индивидов этот признак варьирует в пределах от 250 до 670 копий на диплоидный геном (Вейко Н.Н., 2001;
Вейко Н.Н. и др., 2003). Однако ак тивна в отношении транскрипции и, следовательно, обеспечивает необходимое клетке количество рибосом только часть (около 30%) копий РГ (Вейко Н.Н., 2001;
Ляпунова Н.А., Вейко Н.Н., 2010).
У человека кластеры тандемных повторов РГ разного размера формируют ядрыш кообразующие районы (ЯОР) в коротких плечах пяти пар акроцентрических хромосом (13, 14, 15, 21 и 22). Уникальным свойством РГ является сохранение в метафазных хро мосомах белков транскрипционного комплекса (UBF и РНК-полимераза I), обладающих селективной аргентофильностью (Roussel P. et al., 1996;
Roussel P., Hernandez-Verdun D., 1994, Sirri V. et al., 2000). До настоящего времени единственным методом оценки общего количества активных копий РГ (АкРГ) в отдельных ЯОР и в индивидуальных геномах остается цитогенетический метод полуколичественной (ранговой) визуальной оценки в условных единицах размеров преципитатов серебра на 10 ЯОР метафазных хромосом (AgЯОР) после селективной окраски кластеров АкРГ нитратом серебра (Howell W.M., Black D.A, 1980). Сумма оценок 10 размеров AgЯОР служит мерой общего количества АкРГ в диплоидном геноме индивида (Ляпунова Н.А. и др., 1988, 2001). В специальном исследовании показано, что одной условной единице размера AgЯОР соответствуют 8± копия рибосомного повтора (Вейко Н.Н., 2001).
С помощью этого метода в Лаборатории цитогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН на коплен большой массив данных о количестве АкРГ в геномах индивидов разного пола и возраста, как практически здоровых, так и страдающих разными формами наследствен ных и ненаследственных патологий. На основании наблюдаемых пределов варьирования признака высказано предположение о существовании стабилизирующего отбора на пре натальной стадии. Выявлен внутрипопуляционный полиморфизм размеров AgЯОР, од нако механизмы формирования и поддержания подобного полиморфизма неясны. Уста новлено, что размер AgЯОР, отражающий количество транскрипционно активных копий РГ в кластере, является стабильной и наследуемой характеристикой соответствующей хромосомы. Однако известно, что в кластерах тандемных повторов повышена вероят ность неравного кроссинговера в профазе мейоза, приводящих к изменению числа по второв в кластере. Вопросы существования и частоты спонтанных «мутационных» изме нений размеров кластеров АкРГ остаются неизученными.
Ранее в ряде работ продемонстрированы фенотипические проявления количества активных копий РГ человека в норме и патологии (Ляпунова Н.А. и др., 2000), в том числе в раннем развитии (Воронина В.Н., 2001), при атопическом дерматите (Неудахин Е.В. и др., 2008), ревматоидном артрите (Шубаева Н.О., 2004;
Вейко Н.Н. и др., 2005), в ходе старения (Малиновская Е.В. и др., 2008) и др.
Одним из основополагающих факторов, определяющих способность клетки эф фективно отвечать на стресс и выживать, является возможность быстрой активации бел ковых синтезов, что в свою очередь зависит от скорости синтеза рибосом de novo. По скольку стадией, лимитирующей скорость биогенеза рибосом, является транскрипция генов рРНК (Larson D.E. et al., 1991;
Sirri V. Et al., 2008), естественно ожидать, что коли чество активных копий РГ в геноме влияет как на стрессоустойчивость здорового инди вида, так и на развитие заболеваний. Это предположение подтверждено в экспериментах по изучению преодоления окислительного стресса клетками в зависимости от количест ва АкРГ в их геномах (Вейко Н.Н. и др., 2005).
Патогенез мультифакториальных заболеваний (МФЗ) определяется аддитивным взаимодействием генетических и средовых факторов. Увеличение генетического груза и антропогенные изменения окружающей среды, многократно усилившие стрессорные сре довые воздействия, приводят к наблюдаемому в последние десятилетия росту частоты МФЗ, в частности, аутоиммунных и нейродегенеративных. Так, частота раннего детского аутизма в США возросла десятикратно за два десятилетия (1988-2008 гг.), достигнув уровня одного случая на 150 детей. Выработка персональной стратегии обследования, вакцинации, лечения пациента из группы риска по ряду МФЗ будет малоэффективна без учета количества активных копий РГ в геноме пациента. В целом, персонифицированный подход к диагностике и лечению требует полной генетической характеристики индивида, обязательной частью которой должно стать определение количества АкРГ в геноме.
В этой связи понятна практическая значимость метода цитогенетического анализа копийности АкРГ в индивидуальных геномах, в силу чего возникает необходимость в ве рификации его надежности и в определении связей между копийностью АкРГ и предрас положенностью к тому или иному МФЗ и прогнозом протекания заболевания. Все выше сказанное позволяет сформулировать цель и задачи диссертационного исследования.
Цель и задачи исследования.
Цель настоящей работы заключалась в оценке надежности цитогенетического по луколичественного метода определения копийности активных рибосомных генов, в изу чении стабильности и изменчивости количества рибосомных генов человека на уровне ЯОР, индивида и популяции, а также в анализе фенотипических проявлений копийности активных рибосомных генов в норме и патологии.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:
1) Создание компьютерной базы данных «Копийность активных рибосомных ге нов в индивидуальных геномах человека» на основе экспериментальных материалов, по лученных в Лаборатории цитогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН за 1988-2013 гг.;
2) Анализ надежности (точности и воспроизводимости) метода визуальной полу количественной оценки размеров кластеров АкРГ на материале компьютерной Базы данных;
3) Исследование условий стабильности популяционного полиморфизма размеров кластеров АкРГ в ряду поколений;
4) Оценка среднепопуляционной величины стабилизирующего зиготического (эм брионального) отбора, направленного на поддержание копийности АкРГ в интервале, обеспечивающем жизнеспособность клетки и организма человека;
5) Определение величины зиготических потерь по признаку копийности АкРГ в выборках здоровых и страдающих репродуктивными нарушениями супружеских пар и оценка возможного вклада этих потерь в нарушения репродуктивной функции;
6) Изучение копийности активных рибосомных генов у детей с ранним детским аутизмом и анализ влияния данного признака на развитие окислительного стресса как фактора патогенеза детского аутизма.
Научная новизна.
Впервые на обширном материале проведена верификация надежности цитогене тического метода оценки числа копий активных рибосомных генов в кластере на основа нии ранговой оценки размера AgЯОР и показана удовлетворительная точность и воспро изводимость метода.
На большой выборке уточнены пределы признака копийности активных рибосом ных генов, обеспечивающие жизнеспособность клетки и организма, и определена средне популяционная доля зигот (около 9-10%), подлежащих элиминации по данному признаку.
Впервые показано, что для поддержания стабильного полиморфизма частот разме ров AgЯОР, наблюдаемого в реальной панмиктической популяции большого размера, не обходимо и достаточно двух факторов: гибель зигот, количество активных копий РГ в ге номе которых выходит за пределы, обеспечивающие жизнеспособность клетки (15 или 24 усл.ед.), и «мутирование» размеров кластеров АкРГ с определенной частотой (около 3,510-2 на кластер на поколение). Частота «мутирования» размеров кластеров АкРГ впер вые определена экспериментально на выборке семей (родители и ребенок).
Впервые получены экспериментальные подтверждения того, что высокая вероят ность появления зигот с недостаточным или избыточным количеством активных копий РГ может проявляться в снижении плодовитости супружеской пары.
Общее количество активных копий РГ впервые определено в геномах детей с ранним детским аутизмом и расстройствами аутистического спектра. Обнаружена достоверно более низкая копийность АкРГ по сравнению с контрольной выборкой здоровых индивидов.
На основе биоматематической модели Вольтерра «хищник-жертва» создана ори гинальная математическая модель, впервые увязывающая окислительный стресс у паци ентов, страдающих нейродегенеративными заболеваниями, со скоростью ответного син теза антиоксидантных ферментов, зависящего от уровня синтеза рибосом, а следова тельно, и от копийности АкРГ.
Научно-практическая значимость.
Создана компьютерная база данных «Копийность активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека», объединившая и систематизировавшая эксперимен тальный материал, полученный в Лаборатории цитогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН за 1988-2013 годы. База данных позволяет формировать выровненные по полу, возрасту и размеру контрольные выборки;
анализировать и сравнивать количество АкРГ в выборках индивидов разных возрастных групп и с различными патологиями;
формировать случай ные выборки разного размера из протоколов с идентифицированными хромосомами для проведения имитационных скрещиваний.
Обоснована целесообразность нового критерия для обследования супружеских пар с нарушением репродуктивной функции: определение количества активных генов рРНК в каждом из 10 ЯОР обоих супругов с последующим расчетом ожидаемых потерь зигот по причине наследования ими избыточного или недостаточного для нормальной жизнедеятельности количества АкРГ.
Создана прогностическая таблица «Ожидаемая задержка наступления планируе мой беременности в зависимости от зиготических потерь по количеству активных рибо сомных генов» для возможного использования в медико-генетическом консультирова нии. Определена верхняя граница величины зиготических потерь для репродуктивно здоровых супружеских пар (15%).
Предложен новый критерий дифференциальной диагностики раннего детского ау тизма и ранней шизофрении: низкая копийность АкРГ свидетельствует скорее о наличии раннего детского аутизма, а высокая копийность – о наличии шизофрении. Результаты диссертационной работы позволяют обосновать эффективность антиоксидантной тера пии только у детей с низкой копийностью АкРГ.
В целом научно-практическая значимость работы заключается в обосновании но вого критерия для индивидуального подхода к диагностике, профилактике и лечению широкого круга заболеваний как наследственной, так и ненаследственной природы, учи тывающего количество активных копий РГ в геномной ДНК пациента.
Основные положения, выдвигаемые на защиту:
1. Воспроизводимость измерений размеров как отдельных AgЯОР, так и общего размера 10 AgЯОР на метафазных хромосомах дает основания использовать цитогенети ческий метод ранговой оценки размеров AgЯОР для сравнения индивидов и групп инди видов по признаку копийности АкРГ в их геномах.
2. Достаточным условием стационарности частот размеров AgЯОР в панмиктиче ской популяции человека является сочетание стабилизирующего отбора, поддерживаю щего копийность активных РГ в пределах от 120 до 190 копий, и определенного уровня спонтанного «мутирования» ЯОР. При этом предсказанная в модельном эксперименте частота «мутирования» размеров кластеров АкРГ в результате неравного кроссинговера находится в доверительном интервале эмпирической частоты «мутирования», а распре деление зигот по числу возникших мутаций соответствует теоретически ожидаемому биномиальному закону.
3. В результате стабилизирующего отбора по количеству активных РГ элиминации подлежат 9-10% всех зигот (эмбрионов) в популяции, причем доля элиминируемых зигот является специфической характеристикой каждой супружеской пары и может варьиро вать в пределах от 0 до 45%. Одним из условий репродуктивного здоровья пары является небольшая (15%) величина зиготических потерь по данному признаку.
4. Динамика окислительного стресса в клетках носит колебательный характер с наличием единственной точки устойчивого равновесия, причем равновесный уровень окислительного стресса обратно пропорционален копийности АкРГ в геноме клетки. По скольку в геномах детей с ранним детским аутизмом количество транскрипционно ак тивных копий генов рРНК достоверно ниже среднего значения как в контрольной вы борке, так и в выборке больных шизофренией, можно предполагать более важную роль окислительного стресса в патогенезе детского аутизма, чем шизофрении, и обосновать эффективность антиоксидантной терапии в лечении детского аутизма, но не шизофре нии.
Апробация работы.
Материалы исследования докладывались на V Съезде Российского общества ме дицинских генетиков (Уфа, 2005), II Съезде Общества клеточной биологии (С. Петербург, 2007), IV Съезде медицинских генетиков Украины (Львов, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), VI Съезде Россий ского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), V Конгрессе Всемирной Ассоциации Репродуктивной Медицины (Москва, 2010) и на II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины. Возможное и реальное» (С.-Петербург, 2012). 10 июня 2013 года состоялась апробация диссертаци онного исследования на семинаре в ФГБУ «МГНЦ» РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в т. ч. три ста тьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ, и глава в зарубежной монографии.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, трех основных глав: «Обзор литературы», «Ма териалы и методы», «Результаты и обсуждение», списка использованной литературы и трех приложений. Список литературы содержит 227 источников, из них 55 отечествен ных и 172 зарубежных авторов. Работа изложена на 141 странице. Текст содержит 22 ри сунка и 12 таблиц.
Личный вклад соискателя.
Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Большая часть исследований, включая формирование базы данных, плани рование исследований и статистическая обработка результатов, написание компьютерных программ и проведение вычислительных экспериментов, создание математических моде лей и их анализ, выполнена автором лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и написание рукописи выполнены автором самостоятельно.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для создания компьютерной базы данных «Копийность активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека» (далее – «База данных») использованы ре зультаты исследований размеров AgЯОР на метафазных хромосомах, проведенных в Ла боратории общей цитогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН в 1988-2013 гг. Результаты иссле дований оформлены в виде таблиц из 10 (или 11 – для синдрома Дауна) колонок по числу ЯОР и 20 строк по числу проанализированных метафазных пластинок. В ячейки таблиц внесены визуальные целочисленные оценки размеров AgЯОР в условных единицах.
В зависимости от того, была ли проведена идентификация хромосом, колонки с размерами AgЯОР в протоколах без идентификации хромосом подразделяются на груп пы D (колонки 1-6) и G (колонки 7-10), а в протоколах с идентификацией хромосом – на пары хромосом 13, 14, 15, 21 и 22, по две колонки, соответствующие двум гомологам, в каждой паре.
Система управления базой данных (СУБД) создана в программной среде Borland Delphi 7 на языке программирования Object Pascal. База данных реализована средствами СУБД Microsoft Access 2003 при содействии Р.В.Вейко.
Выборка анонимных больных ранним детским аутизмом (n=51) сформирована из пациентов Федерального государственного бюджетного учреждения (ФГБУ) «Мос ковский НИИ психиатрии» Минздрава Российской Федерации и ФГБУ «Научный центр психического здоровья» РАМН. В указанных учреждениях имеются информированные согласия законных представителей пациентов на использование биоматериала в научных целях. Для анализа нам предоставлялись шифрованные образцы (1-2 мл) венозной крови.
В исследование включены дети с расстройствами аутистического спектра, соответ ствующие критериям диагностики раннего детского аутизма Международной классифика ции болезней (МКБ-10) и Американского общества психиатров (DSM-IV-TR).
Отбор больных проводился врачами детских психиатрических отделений с ис пользованием клинико-психопатологического метода, включавшего наблюдение за ре бенком в различных ситуациях с психопатологической оценкой поведения, эмоциональ ных и когнитивных проявлений, особенностей социального функционирования, допол ненных материалами медицинской документации (карты амбулаторных исследований).
Проводили изучение семейных наследственных факторов, раннего анамнеза пациентов, учитывали особенности течения беременности и родов у матери, сведения о перенесен ных ею заболеваниях. Первичную оценку состояния ребенка проводили с помощью шкалы рейтинга детского аутизма (Childhood Autism Raiting Scale – CARS).
Возраст пациентов на момент исследования колебался от 2 лет 8 месяцев до 13 лет при соотношении мальчиков и девочек 3,5:1. В исследование не включали детей, у кото рых аутистические проявления обусловлены другими заболеваниями, такими как орга нические поражения центральной нервной системы, эпилепсии, врожденные дефекты обмена веществ. Для исключения такого рода заболеваний также использовали метод сравнительного электроэнцефалографического картирования.
Культивирование ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови больных детским аутизмом, фиксация клеток, приготовление и окраска препаратов мета фазных хромосом и оценка размеров AgЯОР проводились сотрудниками Лаборатории ци тогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН (Н.А. Еголина, Н.В. Косякова). Культивирование и фиксацию клеток, приготовление препаратов метафазных хромосом осуществляли стан дартными методами. Селективную окраску препаратов нитратом серебра проводили по методу W.M.Howell и D.A.Black (1980) в модификации Н.А. Еголиной (Ляпунова Н.А. и др., 1998, 2001). Количество активных копий РГ в индивидуальном геноме определяли пу тем суммирования усредненных по 20 метафазным пластинкам ранговых оценок размера преципитата металлического серебра над каждым из десяти ЯОР в условных единицах от до 3. При необходимости хромосомы идентифицировали с помощью стандартной G окраски.
Статистические параметры выборок определяли при помощи пакета программ “AtteStat” (http://attestatsoft.narod.ru/download.htm) или стандартных встроенных функцией Microsoft Excel 2007. Решение о наличии или отсутствии мутационного изменения размера (числа копий) кластера АкРГ при сравнении протоколов цитогенетических визуальных ранговых оценок размеров AgЯОР принимали с помощью вычисления критерия хи-квадрат. Сравнение групп проводили с применением методов непараметрической статистики для несвязанных выборок (Холлендер М., Вульф Д., 1983) или с помощью критерия Стьюдента (для нормально распределенных величин) при помощи пакета программ “AtteStat” или путем расчетов по введенным вручную формулам в Microsoft Excel 2007. Вычисление точной вероятности по Фишеру проводили с помощью веб-приложения http://www.langsrud.com/fisher.htm.
Моделирование и вычисления вероятностей проводили на основе закона геометрического распределения (Гмурман В.Е., 2005;
Холлендер М., Вульф Д., 1983).
Программы имитационных скрещиваний и моделирования динамики популяционных частот размеров AgЯОР в ряду поколений написаны автором на языке программирования SmallBasic версии 0.9.5.2. Уровень значимости для отклонения нулевой гипотезы выбирали как p0,01 или p0,05 в зависимости от рода решаемой задачи.
Для математического моделирования внутриклеточной динамики активных форм кислорода и антиоксидантных ферментов применяли аппарат обыкновенных диф ференциальных уравнений. Использованные математические средства приведены в «Справочнике по математике» И.Н. Бронштейна и К.А. Семендяева (1981). Численное изучение модели проводили при помощи некоммерческого пакета программ “ODE” (Московский энергетический институт).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Содержание и функции базы данных «Количество активных рибосомных генов в индивидуальных геномах человека» В базу данных «Количество активных рибосомных генов в индивидуальных гено мах человека» (далее – «База данных») внесены все протоколы исследований, проведен ных в Лаборатории цитогенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН в 1988-2013 гг.
Для каждого внесенного в Базу данных индивида, как правило, вносили следую щие данные: шифр донора, содержащий сведения о принадлежности к той или иной те матической выборке;
пол;
возраст (абсолютный в годах или условный в градациях от 0 – пренатальный период до 5 – старческий возраст);
диагноз;
дата исследования;
сотрудник, проводивший исследование;
статус в семье (входит ли данный индивид в семью и в ка честве кого, родителя или ребенка);
статус идентификации хромосом.
Постоянно пополняемая База данных содержит сведения о количестве активных ге нов рРНК в геномах 1191 индивида, часть из которых обследована повторно несколько раз (от двух до восьми). Сведения об индивидах, вошедших в Базу данных, приведены в табл. 1.
Таблица 1. Выборки индивидов, вошедшие в Базу данных «Количество активных рибо сомных генов в индивидуальных геномах человека» Без идентификации хромосом С идентификацией хромосом Выборка n Выборка n Новорожденные 159 Здоровые индивиды среднего возраста Дети 3-9 лет 44 Семьи с ребенком (кордоцентез) Здоровые индивиды среднего возраста 189 Семьи со здоровым ребенком Старческий возраст (80-100 лет) 90 Семьи с ребенком с синдр. Дауна Фибробласты кожи здоровых индивидов Супружеские пары с нормальной пло 45 среднего возраста довитостью Ревматоидный артрит Супружеские пары из отделения ЭКО Шизофрения (взрослые) Синдром Дауна 90 Пары с репродуктивными нарушения 17 ми Системная красная волчанка Ранние детский аутизм и шизофрения* Атопический дерматит ИТОГО 854 ВСЕГО Примечание: * отмечены данные, полученные после 2007 года.
Функции системы управления базой данных (СУБД) позволяют: вводить и выво дить различные данные и результаты исследований для каждого донора;
производить вы борку данных индивидов по интересующим исследователя параметрам в любой комбина ции введенных в параметров;
выводить результаты выборки в файл Microsoft Excel для последующего определения всех заданных пользователем статистических показателей.
Созданная СУБД дает возможность решать следующие задачи: для различных изучаемых групп пациентов формировать выровненные по полу, возрасту и размеру кон трольные выборки;
анализировать и сравнивать количество АкРГ в выборках индивидов разных возрастных групп и с различными патологиями;
формировать случайные выбор ки разного размера из протоколов с идентифицированными хромосомами для проведе ния имитационных скрещиваний, и т.п.
Надежность метода определения числа активных копий генов рРНК в отдельных ЯОР и в геноме индивида Для определения степени доверия к полученным в эксперименте результатам не обходимо оценить такие критерии надежности метода как точность и воспроизводи мость. Под точностью подразумевается мера, обратная случайной ошибке измерения в заведомо стандартных условиях (разброс оценок размеров всех AgЯОР в разных мета фазных пластинках в пределах одного препарата, обусловленный субъективной погреш ностью визуальной ранговой оценки размера AgЯОР и/или случайными флуктуациями Ag-окраски). Воспроизводимость показывает разброс результатов в условиях, не яв ляющихся гарантированно стандартными. Мерой разброса служат дисперсия или стан дартное отклонение.
Для анализа точности метода сначала измеряли дисперсию повторных оценок AgЯОР, произведенных в одно и то же время одним исследователем на одном и том же препарате (строка 1 в табл. 2).
Таблица 2. Определение надежности метода оценки копийности АкРГ в отдельном ЯОР и в геноме индивида (полуколичественный метод визуальной оценки размера AgЯОР в условных единицах).
Исследуемая случайная № п/п Объекты сравнения N SD CV, % D величина Сравнение двух независимых сред Размер AgЯОР, усред 1 них оценок каждой из 10 хромосом 60 0,081 4,3% D1=0, ненный по 20 измере у трех индивидов ниям (отражает число копий АкРГ в отдель- Сравнение одной и той же хромо 2 212 0,110 5,8% D2=0, ном ЯОР) сомы в семьях у ребенка и родителя Сумма размеров Протоколы повторно обследован 10 AgЯОР (отражает 3 52 0,67 3,5% D3=0, ных индивидов общую копийность АкРГ индивида) У трех индивидов оценивали 10 AgЯОР (то есть, всего 30 ЯОР) в серии по 40 оце нок на каждый ЯОР. Стандартным числом определений метода является 20 оценок, кото рые усредняются. Следовательно, серию из 40 оценок можно рассматривать как две серии по 20 оценок, после чего в каждой из двух серий вычисляли усредненное значение и полу чали в результате для каждого из 30 исследуемых ЯОР две оценки в рамках одного препа рата, то есть, 30 пар измерений. Таким образом, размер выборки составил 60 усредненных значений размера AgЯОР. Вычисленный по этим данным коэффициент вариации CV, по казывающий относительную ошибку метода, составил всего 4,3%. Точность измерения считается приемлемой для медико-биологических исследований, если у результатов изме рений CV не превышает 10% (Лакин Г.Ф., 1980). Несколько большее значение оказалось у дисперсии (характеризующей воспроизводимость метода) в другой выборке 212 повтор ных измерений размеров AgЯОР одной и той же хромосомы в семьях (два родителя и ре бенок), в которых в качестве пары повторных измерений брали родительскую хромосому и соответствующую ей хромосому ребенка (строка 2 в табл. 2). В данной выборке по срав нению с предыдущей добавился еще один потенциальный фактор изменчивости: прохож дение хромосомы с ЯОР через мейоз, в ходе которого размер кластера АкРГ может изме ниться («мутировать») в результате неравного кроссинговера. Анализ проведен на выбор ке 11 семей, в которых можно проследить происхождение 110 ЯОР у детей от того или иного родителя. Однако четыре хромосомы детей оказались «мутировавшими» по размеру кластера АкРГ, что сделало невозможным определение их происхождения от того или иного родителя. Остальные 106 хромосом, не маркированные как мутантные, сопоставили с родительскими, каждая с соответствующей хромосомой соответствующего родителя.
Сравнение дисперсий этой выборки и предыдущей выборки (строка 1 в табл. 2) по Фише ру-Снедекору показывает незначимость отличий на 1%-ном уровне значимости (F=1,71;
р0,01), однако отличия значимы на 5%-ном уровне.
Для определения воспроизводимости измерения числа активных копий генов рРНК как суммарного размера всех десяти отдельных AgЯОР использовали выборку многократно исследованных в разные годы индивидов. Число повторных исследований одного индивида варьировало от двух до восьми. Суммарное число протоколов по всем повторам всех индивидов равнялось 52 (строка 3 в табл. 2). Эта выборка также проде монстрировала низкие дисперсию и коэффициент вариации.
Принципиально важными выводами, которые можно сделать на основании приве денных в таблице данных, являются: (1) воспроизводимость измерений размеров как отдельных AgЯОР, так и суммы размеров 10 AgЯОР на хромосомах данного индивида (даже если анализы проведены в разные годы и/или разными исследователями), что, в свою очередь, свидетельствует о постоянстве количества копий АкРГ в каждом из ЯОР и в геноме данного индивида в целом, и (2) постоянство копийности АкРГ в данном ЯОР на протяжении онтогенеза и в ряду поколений (сравнение размеровAgЯОР у ребенка и родителей). Всё это дает основания использовать данный метод для сравнения разных индивидов и разных групп индивидов по признаку копийности АкРГ в их геномах.
Эмпирические популяционные частоты размеров AgЯОР В выборке 475 индивидов из Базы данных, для каждого из которых размеры AgЯОР проанализированы в 20 метафазах (всего 95000 отдельных оценок размеров AgЯОР) определены популяционные частоты вариантов размера AgЯОР в усл.ед. от 0 до 3 (табл. 3).
Таблица 3. Частоты целочисленных оценок размеров AgЯОР (усл.ед. 0-3) в выборке n = 95 000 оценок размеров отдельных AgЯОР, полученных от 475 индивидов Оценка размера Число оценок в ис- Частота в иссле- Теоретическая частота при рав AgЯОР, усл. ед. следованной выборке дованной выборке ной вероятности каждой оценки “0” 0,094 0, “1” 0,205 0, “2” 0,394 0, “3” 0,307 0, Всего 1,000 1, Полученные частоты заметно отличаются от теоретических частот, которые имели бы место при допущении равновероятности каждого варианта (1/4 = 0,25 для каждого из че тырех вариантов), отклонения высокозначимы (p0,00001).
Пределы варьирования копийности АкРГ в индивидуальных геномах В выборке размером n=1191 индивидов минимальное и максимальное значение копийности АкРГ оказались: хmin=14,9 и хmax=23,7 усл. ед. при среднем значении усл.ед. и стандартном отклонении 1,54. Критерии согласия хи-квадрат (2=19=20,4;
p=0,51) и Колмогорова-Смирнова (D=0,06;
p=0,73) не дают оснований отвергнуть нуле вую гипотезу о соответствии изученной выборки нормальному закону распределения с параметрами µ=18,9 и =1,54.
На основании эмпирических данных принято, что копийность АкРГ ниже 14,9 или выше 23,7 усл.ед. является летальной. Поскольку в специальных исследованиях показа но, что одной усл.ед. размера AgЯОР соответствует 8±1 активная копия рДНК (Вейко, 2001), в реальных популяциях признак варьирует в пределах от 120 до 190 копий. Ес ли копийность АкРГ в геноме зиготы выходит за указанные пределы, происходит пренатальная гибель зиготы (эмбриона, плода), что собирательно именуется далее зи готическим отбором.
Компьютерное моделирование условий стабильности полиморфизма размеров кла стеров АкРГ у человека в ряду поколений Проведен ряд вычислительных экспериментов, моделирующих естественные про цессы, протекающие в популяциях, с целью выяснения условий поддержания стабильно сти популяционных частот отдельных вариантов AgЯОР (табл. 3).
В основу алгоритма программы заложены следующие условия:
1. Большой и стабильный размер популяции N (предварительные эксперименты пока зали, что N=10000 является достаточным размером для реализации модели).
2. Полная панмиксия, т.е. случайное и равновероятное формирование пар скрещивания.
3. Равновероятное попадание каждого гомолога в гамету и случайное формирование зиготы.
4. Гибель (элиминация) зигот, суммарный размер 10 AgЯОР в которых оказывается меньше 14,9 или больше 23,7 условных единиц.
5. Стартовые частоты четырех вариантов размеров AgЯОР (0, 1, 2, 3) задаются экспе риментатором.
6. Возможность спонтанного «мутирования» (изменения числа копий АкРГ в кластере) с заданной частотой pм на один ЯОР на поколение.
Программа оперирует матрицей из N строк по 10 числовых переменных, что явля ется моделью популяции из N индивидов, причем N задается экспериментатором. Пер воначально значения переменных в строках задаются случайными числами от 0 до 3, ко торые генерируются с равной вероятностью. Таким образом, в нулевом поколении час тоты всех вариантов размеров AgЯОР одинаковы и равны 0,25.
Далее в ходе программного цикла смены поколений выполняются следующие действия. Программой случайно выбираются две разные строки в качестве “родитель ских индивидов”. Каждый индивид генерирует случайную “гамету”, в которую случай ным образом попадает какой-то один гомолог из каждой из пяти пар родительских ЯОР несущих хромосом. Затем две такие “гаметы” от выбранных “родителей” объединяются в новую строку, образуя “зиготу”.
По количеству копий АкРГ в зиготах программа определяет число жизнеспособ ных и нежизнеспособных зигот, генерированных в текущем поколении, и вычисляет ко эффициент зиготических потерь E как:
D E = 100%, D+V где D – число нежизнеспособных зигот, подвергнутых элиминации, V – число жизнеспо собных зигот, из которых формируется следующее поколение.
По завершении заданного числа циклов (как правило, 200) смены поколений вы водится график динамики частот вариантов AgЯОР (от 0 до 3) во всех поколениях и производится проверка по критерию хи-квадрат на соответствие частот вариантов в по следнем поколении частотам, которые наблюдались в реальной выборке из нашей Базы данных (см. табл. 3).
В первой серии экспериментов (рис. 1а) отбор по дозе АкРГ достаточно быстро приводил к потере всех вариантов, кроме одного. Быстрее всех элиминирует вариант “0”.
Растет частота лишь варианта “2”, и можно прогнозировать, что рано или поздно вся по пуляция будет состоять только из этих вариантов и сумма размеров 10 AgЯОР у всех ин дивидов будет равна 20. Но этого не происходит в реальной популяции. Влиянием гене тического дрейфа в популяциях столь большого размера и при относительно высоких зи готических потерях можно пренебречь.
а б в г Рисунок 1. Динамика частот размеров кластеров АкРГ баллов “0”, “1”, “2”, “3” на протяжении 200 поколений, в популяции размером 10000 индивидов, в зависимости от частоты «мутаций» (спонтанное изменение размера кластера АкРГ), заложенной в модельный эксперимент: а - 0%;
б - 1%;
в - 5%;
г - 3,4%.
Примечание: По оси абсцисс – порядковый номер поколения (от 0 до 200);
по оси ординат – частоты вариантов AgЯОР: “0” (сплошная тонкая линия), “1” (пунктирная линия), “2” (сплош ная жирная линия) и ”3”(точечная линия). Горизонтальными линиями показаны эмпирические частоты соответствующих вариантов размера AgЯОР (см. табл. 3). Исходная частота всех вари антов AgЯОР одинакова и равна 0,25.
Далее в модель вводили спонтанное «мутирование» с заданной ненулевой вероят ностью pм на один ЯОР, имитирующее случайные изменения размеров кластеров АкРГ в индивидуальных ЯОР в результате неравного кроссинговера в профазе мейоза. При за данной частоте «мутирования» pм= 0,01 (рис. 1б) картина становится иной. Примерно к 150-160 поколению частоты всех вариантов размеров AgЯОР почти стабилизируются на определенных уровнях, приближающихся к эмпирическим, но ещё далеких от них.
На следующем шаге пятикратно увеличили частоту «мутаций» до уровня pм= 0, (рис. 1в). В этих условиях равновесная частота варианта “2” стала ниже эмпирической, частоты вариантов “0” и “3” – выше эмпирических, а модельная частота варианта “1” стабилизировалась на уровне, близком к эмпирическому. Естественно ожидать, что час тота «мутаций», при которой равновесные частоты всех вариантов совпадут с эмпириче скими, должна лежать в интервале между pм= 0,01 и pм= 0,05. Путем перебора частот «мутирования» с шагом 0,01 искомые значения частоты «мутаций» найдены в интервале (3,4-3,5)10-2 на отдельный ЯОР на поколение (рис. 1г, табл. 4).
Модельные эксперименты показали, что сочетание стабилизирующего отбора по количеству копий АкРГ и частоты спонтанного изменения размера кластера в данном ЯОР в результате неравного кроссинговера(«мутирования») в пределах 3-4% на ЯОР на поколение является достаточным условием для поддержания равновес ных частот вариантов размеров AgЯОР в панмиктической популяции человека.
В отдельной серии экспериментов случайно задавали разные исходные частоты для вариантов размеров AgЯОР. Это не повлияло на конечный результат эксперимента, что дополнительно свидетельствует о стабильности стационарного состояния частот по лиморфных вариантов размеров AgЯОР в определенном диапазоне вероятности их «му тирования» и определенного давления стабилизирующего отбора.
Таблица 4. Оценка методом хи-квадрат сходства модельных равновесных частот вари антов AgЯОР в 200-ом поколении (строки 1-8) с эмпирическими (строка 9) Частоты вариантов Средний суммар- Доля зигот Согласие с Частота № AgЯОР, % ный размер 10 E, %, подлежащих гипотезой о мутаций, п/п AgЯОР, M±sd, отсеву в 200-м по- сходстве pм 0 1 2 3 усл.ед. (p0,01) колении 1 0,010 5,1 16,8 60,2 17,9 18945 19,1±1,96 3,7 нет 2 0,032 9,7 22,0 38,6 29,7 16,1 18,8±2,13 9,7 нет 3 0,033 9,9 21,7 38,3 30,1 11,3 18,9±2,16 9,2 нет 0,034 10,3 20,9 38,5 30,3 10,4 18,9±2,15 9,9 есть 0,035 10,0 21,2 38,9 29,9 8,6 18,9±2,16 9,4 есть 6 0,036 10,0 21,7 38,0 30,3 15,8 18,9±2,16 10,3 нет 7 0,037 10,2 21,8 37,6 30,4 38,5 18,8±2,16 10,4 нет 8 0,050 11,4 22,1 34,6 31,9 1192 18,7±2,20 11,6 нет Эмпири 9 ческие 9,4 20,5 39,4 30,7 - 19,0±1,54 9, данные Сравнение модельных и эмпирических данных о частотах «мутирования» размеров AgЯОР и о распределении зигот (индивидов) по числу «мутаций» Эмпирическая частота «мутирования» кластеров АкРГ изучена на основе анализа наследования вариантов AgЯОР в 57 реальных семьях (отец, мать, ребенок) с оценками 10 AgЯОР на идентифицированных хромосомах. Среди 57 семей в 39 семьях дети были здоровые, а в 18 семьях – дети с синдромом Дауна (для них хромосому 21 из анализа ис ключали). Таким образом, всего изучено наследование 534 ЯОР. Отсутствие наследова ния родительских вариантов выявлено в 19 из 534 ЯОР. Это позволило сделать вывод:
эмпирическая частота «мутирования» 19/534 = 3,5610-2 при 95%-ной надежности - находится в доверительном интервале (1,99-5,13)10. При этом предсказанная в мо дельном эксперименте частота спонтанных «мутаций» размера кластера АкРГ на ЯОР также лежит в указанном доверительном интервале. Это позволяет заклю чить, что предложенная модель адекватно предсказывает реальную частоту «му таций» вариантов размеров AgЯОР.
Из 57 детей в изученных семьях у 40 мутации не выявлены, у 15 обнаружено по одной мутации и у двух выявлено по две мутации. Индивидов с тремя и более мутация ми не обнаружено (табл. 5).
Таблица 5. Сравнение ожидаемых и наблюдаемых абсолютных частот носителей разно го количества мутантных ЯОР в F1.
Число мутаций у Эмпирические Теоретически ожидаемые на основе би Хи-квадрат ребенка данные номиального распределения 0 40 39,68 0, 1 15 14,64 0, 2 2 2,43 0, 3 и более 0 0,26 0, ВСЕГО: 57 57 0, Распределение зигот по числу возникших мутаций (0, 1, 2, 3 и более) соответ ствует теоретически ожидаемому биномиальному закону (2=3=0,34;
p=0,88), что свидетельствует о независимости возникновения мутаций в разных хромосомах Таким образом, модель поддержания полиморфизма размеров кластеров АкРГ пу тем баланса между «мутационным» процессом и отбором по суммарной копийности АкРГ продемонстрировала предсказательную силу в отношении частоты «мутацион ных» событий. Тем самым верифицированы все допущения, методы и данные, лежащие в основе модели. В частности, получила подтверждение возможность использования ме тодики оценки размеров кластеров АкРГ в условных единицах как объективной и вос производимой величины.
Стабилизирующий отбор и величина зиготических потерь по признаку копийности АкРГ С помощью специально написанной автором компьютерной программы на выборке 240 индивидов, для которых варианты AgЯОР определены на идентифицированных парах акроцентрических хромосом, проведены имитационные «скрещивания» по принципу «ка ждого с каждым» с учетом идентичности реципрокных «скрещиваний». Определяли пока затель копийности АкРГ в условных единицах для всех 25=32 типов гамет каждого из «ро дителей» и суммарную копийность АкРГ для всех 3232=1024 равновероятных типов зи гот данной пары. Всего проведено 2,8104 «скрещиваний» и получено 2,9107 «зигот» («потомков»), у которых копийность АкРГ варьировала от xmin=5,8 до xmax=29,8 усл.ед.
Графики распределений суммарных размеров 10 AgЯОР в выборке «родителей» и «потомков» всех имитационных скрещиваний приведены на рис. 2. Обе нормально рас пределенные выборки имеют одинаковое среднее m=19. Однако стандартное отклонение распределения «потомков» (штрих-пунктирная линия, sd=2,46) существенно выше, чем в «родительской» выборке (сплошная линия, sd=1,54).
Рисунок 2. Идеализированные распределения копийности активных рибосомных генов (сум марный размер 10 AgЯОР, усл.ед., абсцисса) в выборке условных “родителей”, использованных в имитационных скрещиваниях (n = 240, сплошная линия), и у “потомков” этих скрещиваний (n = 2,9 107), проведенных без учета «мутаций» (штрих-пунктирная линия) и при случайном ге нерировании «мутационных изменений» размеров кластеров АкРГ с вероятностью 3,4 10– (точечная линия).
Примечание: По оси ординат – частота. Отсекаемые вертикальными линиями “хвосты” показы вают доли элиминируемых зигот Зная пределы действия отбора (пределы жизнеспособности клетки) по признаку копийности АкРГ в условных единицах и параметры распределения «потомков» тоталь ных имитационных скрещиваний, которое можно считать модельным отражением всех потенциально возможных в реальной популяции вариантов формирующихся зигот (по томков), можно оценить среднепопуляционную величину зиготических потерь в рамках рассматриваемой модели. Доля подлежащих элиминации низкокопийных зигот состави ла: px14,9 = 0,048 (4,8%), и доля высококопийных зигот: px23,7 = 0,028 (2,8%) всех зигот.
Общая величина зиготических потерь (доля элиминируемых зигот):
E=0,048+0,028=7,610-2 (7,6%). Однако эта величина отбора заметно меньше, чем вели чины, полученные в модели с учетом мутаций (табл. 4, строки 4 и 5).
После этого имитационные скрещивания тех же 240 реальных индивидов из Базы данных повторно проводили по тому же алгоритму, но со случайным генерированием «мутаций» с частотой 3,410-2.В результате пределы копийности АкРГ расширились (xmin=4,6, xmax=29,9 усл.ед.), а величина зиготических потерь возросла до 9,1% (рис. 2, точечная линия), при этом доля низкокопийных летальных зигот составила 6,8%, а доля высококопийных 2,3%. Это значение хорошо согласуется с величинами 9,4-9,9%, полу ченными в имитационных скрещиваниях с учетом «мутаций» (табл. 4, строки 4 и 5). Та ким образом, это еще одна величина, предсказанная в модельном эксперименте.
Полученная величина зиготических потерь является среднепопуляционной оцен кой давления отбора на общий пул всех возможных зигот данной популяции (напомним, что зиготическими потерями мы называем любую пренатальную гибель организма). При этом, однако, каждая супружеская пара характеризуется своим распределением зи гот и своим значением зиготического отбора, который варьирует в широких преде лах у разных пар. На основании этого выдвинуто предположение, что у некоторых пар значения зиготических потерь по признаку копийности АкРГ зигот настолько велики, что могут служить причиной репродуктивных проблем.
Сравнение зиготических (эмбриональных) потерь у супружеских пар с нормальной плодовитостью и пар с репродуктивными нарушениями неясной этиологии Для определения величины зиготических потерь для заданной пары индивидов спе циально написана программа, которая путем перебора генерирует все возможные вариан ты гамет заданной пары, определяет копийность АкРГ каждого из1024 потенциально возможных вариантов зигот и проверяет, попадает ли копийность АкРГ в интервал жиз неспособности зигот. В результате рассчитывается доля нежизнеспособных зигот, то есть, коэффициент элиминации зигот E.
Из созданной Базы данных извлекли информацию о размерах преципитата серебра (AgЯОР) на пяти парах метафазных хромосом, идентифицированных с помощью G окраски, у 114 индивидов 57-ми супружеских пар, а также у 233 здоровых индивидов, не входящих в супружеские пары. Исследованные реальные пары разбиты на три группы:
нормальные с точки зрения плодовитости, имеющие не менее двух (до пяти) здоровых детей (группа I, n=18 пар), и две группы с нарушением репродуктивной функции неясно го генеза, обратившиеся в медико-генетическую консультацию с диагнозом либо «невы нашивание» – как правило, имеющие в анамнезе не менее двух случаев замершей бере менности или спонтанного аборта в первом триместре беременности (группа II, n=21 па ра), либо «бесплодие», как первичное, так и вторичное (группа III, n=18 пар). Кроме того, сгенерирована отдельная группа имитационных пар, в которую вошли все возможные парные сочетания, полученные из 233 здоровых индивидов.
Для каждой группы определили коэффициент зиготических потерь и вычислили средние и медианные значения зиготических потерь для каждой группы.
Полученные результаты показали, что коэффициенты элиминации Е у разных пар варьируют в широких пределах: от 0 до 45 процентов. При этом величина коэффи циента определяется не суммарной копийностью АкРГ, а по-хромосомным распре делением размеров AgЯОР у каждого супруга. Три примера показаны на рис. 3.
Рисунок 3. Примеры реальных семейных пар с разными значениями зиготических потерь Примечание: По оси абсцисс – количество активных рибосомных генов (АкРГ), усл.ед., по оси ор динат – частоты вариантов зигот. Черным цветом выделены элиминируемые варианты (копийность АкРГ 15 усл.ед. или 24 усл.ед.). Сумма частот элиминируемых вариантов соответствует коэф фициенту E.
а) пара в браке 14 лет, многодетная (5 детей), репродуктивные проблемы отсутствуют. Копийность АкРГ супругов: 20,05 и 17,90 усл.ед., Е=0%;
б) пара в браке 9 лет, идиопатическое первичное бес плодие. Копийность АкРГ супругов: 19,55 и 17,05 усл.ед., Е=13%;
в) идиопатическое бесплодие.
Копийность АкРГ супругов: 17,05 и 15,50 усл.ед., Е=31%.
В результате имитационных скрещиваний 233 здоровых индивидов получено псевдо-пар. Распределение коэффициента Е в имитационных скрещиваниях можно считать модельным отражением его распределения в популяции (рис. 4 и табл. 6).
В реальных парах групповые среднее, медиана и дисперсия коэффициента Е, его макси мальное значение и размах (разность между максимальным и минимальным значением) воз растают с повышением степени репродуктивных проблем в ряду изученных групп IIIIII.
Рисунок 4. Распределение коэффициента зиготических потерь Е в 27028 модельных парах, полученных в имитационных скрещиваниях 233 здоровых индивидов.
Примечание: По оси абсцисс - коэффициент Е (%), по оси ординат - частота Группа I наиболее однородна по коэффициенту E, значения которого в данной группе не превышают 15% (см. табл. 6). При этом в группах II и III значительная часть пар имеет коэффициент Е в тех же пределах. Очевидно, у этих пар следует искать другие причины нарушений репродуктивной функции, не связанные с зиготическими потерями по копийно сти АкРГ. Вместе с тем, в группах II и III присутствует примерно 20% пар с высокими зна чениями зиготических потерь, которые отсутствуют в группе I (см. табл. 6).
Таблица 6. Распределение коэффициента зиготических потерь Е в модельных парах, полученных в имитационных скрещиваниях n=233 фенотипически нормальных индивидов, и в трех исследованных группах реальных супружеских пар (I-III).
Группы Имитационные I II III Параметры пары 0-5 0,67 (12) 0,43 (9) 0,39 (7) 0, 5-10 0,22 (4) 0,33 (7) 0,22 (4) 0, 10-15 0,11 (2) 0,05 (1) 0,17 (3) 0, 15-20 - 0,14 (3) 0,11 (2) 0, 20-25 - 0,05 (1) 0,05 (1) 0, Е, % 25-30 - - - 0, 30-35 - - 0,05 (1) 0, 35-40 - - - 0, 40-45 - - - 0, 45-50 - - - 0, Размер выборки, n 18 21 18 * Медиана 2,54 6,45 7,28 6, * Среднее 3,93 7,25 8,84 7, Стандартное отклонение 4,26 6,50 8,65 6, Минимум 0,00 0,39 0,00 0, Максимум 13,77 23,05 30,96 47, Размах 13,77 22,66 30,96 47, * Примечание: Указаны относительные и абсолютные (в скобках) частоты. - статистически досто верное отличие от всех остальных групп (p0,05) При попарном сравнении медиан и средних трех групп по Уилкоксону-Манну-Уитни достоверно различались данные параметры групп I и II (p0,05) и групп I и III (p0,05), то гда как отличия между группами II и III незначимы (p0,10). Это позволило нам объеди нить группы II и III и рассматривать их как единую выборку из одной генеральной сово купности. После этого каждую пару мы могли характеризовать дихотомическим (альтерна тивным) признаком “здоровая” или “имеющая репродуктивные отклонения”, связь которо го с величиной Е данной пары можно оценить с помощью бисериального коэффициента корреляции (Лакин Г.Ф., 1980).
Бисериальный коэффициент корреляции r=0,28 оказалась небольшим, но достоверно отличным от нуля (p=0,04), что показывает значимую, хотя и слабую зависимость. Факт слабой корреляции может быть объяснен тем, что существует много причин идиопатического бесплодия, и зиготические потери по количеству АкРГ – это только одна из них, которая имеет место лишь у некоторых пар с нарушениями репродуктивной функции.
Далее провели сравнение группы I с объединенной группой II+III при помощи медианного теста. Медианное значение (5,18) общей выборки (N=57) превышается в 5 из 18, или в 28% здоровых пар, и в 23 из 39, или в 59% пар с репродуктивными нарушениями.
Согласно одностороннему точному критерию Фишера по этому тесту выборки достоверно различаются на 5%-ном уровне (p=0,03).
Таким образом, полученные результаты говорят о том, что одним из условий репродуктивного здоровья пары является небольшая (15%) величина зиготических потерь по признаку копийности АкРГ у возможных потомков.
Математическое моделирование и оценка влияния зиготических потерь по признаку числа копий АкРГ на плодовитость супружеских пар Для оценки связи вероятного срока наступления беременности с долей элиминируемых зигот у супружеских пар предложена простая математическая модель на основе формулы геометрического распределения вероятностей наступления события A при k-том испытании, если вероятность его наступления в каждом испытании равна p:
Pk=qk-1p, где q=1–p, здесь и далее обозначает вероятность ненаступления (отсутствия) события.
Соответственно, вероятность ненаступления события в серии из k испытаний:
Qk = qk (1) Известно, что без применения противозачаточных средств планируемая беременность наступает в течение 12 месяцев примерно у 75% супружеских пар. По усредненным данным разных авторов, полученным на случайных выборках необследованных индивидов, у 25% супружеских пар беременность наступила в течение одного месяца, у 63% в течение 6 месяцев, у 80% в течение 1 года и у 90% в течение 18 месяцев (сб.
“Бесплодный брак” под ред. Пепперелл Р.Дж. и др., 1986). Эти значения хорошо ложатся на кривую геометрического распределения. Методом наименьших квадратов получаем наиболее удовлетворяющее эмпирическим данным уравнение регрессии:
Qk = 0,78k где Qk – вероятность ненаступления беременности у среднепопуляционной супружеской пары через k акушерских месяцев (28-дневных менструальных циклов). Рассчитанные по этому уравнению значения хорошо согласуются с эмпирическими.
Рассмотрим роль зиготических потерь. Для нормальной беременности необходимо совпадение двух независимых событий: зачатие и жизнеспособность зиготы по количеству активных РГ. Вероятность этой комбинации событий равна произведению вероятностей каждого из них:
p1 = p2 p откуда :
q1 = 1p1 = 1(p2 p3) (2) где p1 – вероятность наступления беременности, q1 – вероятность не наступления беременности, p2 – вероятность зачатия и p3 – вероятность того, что зигота окажется жизнеспособной по числу копий активных генов рРНК. Эмпирическое значение q1 может быть рассчитано по формуле (1): q1=Q1=0,78 и тогда p1=1–0,78=0,22. Зная полученную выше эмпирическую среднепопуляционную величину зиготических потерь (9,5% =0,095), получим: q3=0,095, и p3=1–0,095=0,905. Тогда из формулы (2) выводим:
p2=p1/p3=0,22/0,905=0,243 (3) Соответственно, при отсутствии зиготического отбора вероятность ненаступления беременности в каждом цикле снизилась бы до величины q2=1–0,243=0,757 и для интервала в k циклов рассчитывалась бы по формуле: Qk = 0,757k.
Далее с помощью модели можно оценить, насколько может возрасти длительность ожидания наступления беременности в парах, у которых давление зиготического отбора превышает среднепопуляционный уровень, и у какой доли пар действительно можно ожидать длительного (в течение нескольких лет) не наступления беременности из-за постоянной гибели зигот.
Пусть x – количество условных 28-дневных менструальных циклов, в течение которых “обязательно” (с вероятностью 0,99) наступит беременность. Тогда qх= 1 – 0,99 = 0,01 и х = logq(0,01) = ln(0,01)/ln(q1) = –4,605/ln(q1). Учитывая, что по формулам (2) и (3):
q1 = 1 – p2p3 = 1–0,243p3 (4) получаем формулу расчета числа акушерских месяцев, в течение которых с вероятностью 99% наступит успешная беременность:
х = –4,605/ ln(1–0,243 p3) (5) Вычислив количество акушерских месяцев x при различных значениях p3, получаем таблицу, отражающую зависимость длительности прогнозируемого периода ожидания беременности от величины давления зиготического отбора по признаку количества АкРГ в геномах зигот (табл. 7). Учитывая, что астрономический год примерно равен акушерским (28-дневным) месяцам, из таблицы можно видеть, что при интенсивности зиготического отбора 15% может произойти задержка наступления беременности до полутора лет, что уже дает основания для диагноза “бесплодие”. Этот факт дает основание провести условную границу между парами без риска и с риском попасть в категорию репродуктивных нарушений на уровне 15% зиготических потерь. Зиготические потери в выборке здоровых пар не превышают 15%.
Таблица 7. Расчетная длительность периода “гарантированного” (с вероятностью 99%) наступления беременности в зависимости от давления зиготического отбора по признаку количества АкРГв геноме зиготы Интенсивность Вероятность образования жизне- Число акушерских месяцев зиготического способной зиготы по признаку ко- для гарантированного зачатия отбора, S пийности АкРГ, p3= 1-E (с вероятностью 99%) 16, 0% 1, 17, 5% 0, 18, 10% 0, 19, 15% 0, 21, 20% 0, 22, 25% 0, 24, 30% 0, 26, 35% 0, 29, 40% 0, 32, 45% 0, На основании вышеизложенных данных можно сформулировать предложение о включении в цитогенетическое обследование супружеских пар с нарушением репродуктивной функции неясной этиологии нового критерия: определение количества активных генов рРНК в 10 ЯОР обоих супругов с последующим проведением имитационного скрещивания для определения ожидаемых потерь зигот по причине наследования зиготами избыточного или недостаточного для нормальной жизнедеятельности количества активных рибосомных генов.
Сравнение числа копий АкРГ в контрольной выборке, при шизофрении и при ран нем детском аутизме (РДА) В геномах детей с РДА и расстройствами аутистического спектра (n=51) количество транскрипционно активных копий генов рРНК варьировало от 15,5 до 20,1 усл.ед. при среднем 17,8±0,25 (SE), что достоверно отличается от среднего значения как в контроль ной выборке (p0,01), так и в выборке больных шизофренией (p0,001) (рис. 5).
Рисунок 5. Нормированные распределения количества копий активных генов рРНК в выборках здоровых доноров (А) и пациентов с шизофренией (Б) и аутизмом (В).
Примечание: Ось абсцисс: количество копий активных рибосомных генов (условные единицы);
ось ординат: относительная частота (%). Черным цветом показаны значения ниже среднего в кон троле, серым цветом – значения выше среднего в контроле.
n – размер выборки, M – среднее арифметическое, SE – стандартная ошибка Математическое моделирование динамики окислительного стресса в зависимости от количества копий активных генов рРНК За интенсивность окислительного стресса (ОС) в модели принята безразмерная при веденная общая концентрация активных форм кислорода (АФК) независимо от их приро ды. Для математического моделирования динамики АФК и ферментов антиоксидантной защиты использовались обыкновенные дифференциальные уравнения и подход, аналогич ный тому, который В.Вольтерра (Volterra V., 1931) применил в своей модели «хищ никжертва». В предлагаемой модели АФК рассматриваются в качестве аналога «жертв», тогда как ферменты-катализаторы реакций нейтрализации АФК выступают в качестве «хищников». Модель задается скоростями изменения АФК и ферментов антиоксидантной защиты (ФАЗ), катализирующих реакции нейтрализацию АФК в клетке.
При отсутствии ФАЗ (количественно ФАЗ описываем переменной y) рост АФК (пе ременная x) происходит в простейшем случае со скоростью, пропорциональной текущему наличию АФК x. Таким образом, первый компонент скорости роста АФК можно записать в виде k1x, где k1 некоторый положительный коэффициент (константа). Этот компонент со ответствует экспоненциальному росту жертв, при отсутствии хищников в экологической модели Вольтерра.
Второй компонент скорости АФК соответствует взаимодействиям АФК и ФАЗ и описывает убыль АФК, пропорциональную текущим значениям x и y и записывается как – k2xy, где k2 положительная константа. Данный компонент является аналогом убывания жертв из-за их уничтожения хищником.
Что касается скорости изменения ФАЗ в клетке, то вне зависимости от присутствия или отсутствия АФК молекулы ФАЗ деградируют с постоянной скоростью, так что их убыль пропорциональна текущему наличию ФАЗ в клетке, т. е. соответствующий компо нент скорости записываем как –K2y, K2 0. Другой компонент скорости изменения ФАЗ отражает реакцию клетки на рост АФК, которая заключается в усилении выработки ФАЗ в ответ на окислительный стресс. Этот компонент пропорционален текущему присутствию АФК и не зависит от наличия ФАЗ в клетке. Поэтому запишем его как K1x, K1 0. Коэффи циент (K1) скорости синтеза ФАЗ зависит от копийности активных рибосомных генов, по скольку число копий рибосомного повтора определяет концентрацию рибосом в клетке и, как неоднократно показано, тем самым модулирует общую скорость трансляции.
В итоге получаем следующую модель динамики АФК и ФАЗ в клетке (штрих озна чает производную по времени):
x’ = k1x – k2xy, y’ = K1x –K2y. (1) Поскольку для АФК и ФАЗ компоненты скоростей численно не известны, мы ограни чимся изучением качественных свойств модели: будем исследовать вопросы существования равновесий и их устойчивости, наличия колебаний и их характера при единственном допу щении – положительных и постоянных коэффициентах k1, k2, K1, K2. Заметим, что k2 и K варьируют у разных индивидов в зависимости от аллельных форм генов, кодирующих ФАЗ.
Анализ модели (1) состоит из трех этапов: поиск точек равновесия, исследование ло кального поведения системы вблизи точек равновесия (устойчивость равновесий) и анализ глобального поведения системы. Если равновесие неустойчиво (при малых отклонениях происходит их рост), то не следует ожидать реализации такого равновесия ввиду случайных возмущений, обычных для живой природы. Иными словами, система уходит от точки неус тойчивого равновесия и стремится к устойчивому. При любых значениях коэффициентов в модели имеются два положения равновесия. Первое – это нулевое равновесие с отсутствием как свободных радикалов, так и ФАЗ: x = 0, y = 0. Анализ этого равновесия показал его не устойчивость. Следовательно, в живой клетке такое состояние не может быть реализовано из-за того, что при дыхании неизбежно генерируются свободные радикалы (малые отклоне ния от нуля в терминах модели) и система удаляется от точки неустойчивого равновесия.
Кроме нулевого, всегда существует равновесие с положительными значениями пе ременных (x, y) вида:
k 1 K2 k (x*, y*) =, (2) k 2 K1 k Из (2) видно, что чем больше скорость K1 синтеза ферментов антиоксидантной за k 1 K щиты на рибосомах, тем ниже равновесный уровень для АФК.
k 2 K При любых значениях коэффициентов модели данное равновесие устойчиво, т.е.
любые малые отклонения от равновесия со временем затухают. Интересно, что когда K 4k1, затухание отклонений происходит колебательным образом, т.е. с переменой знака. С учетом того, что антиоксидантные ферменты («хищники») представляют собой крупные белковые молекулы, период полувыведения которых из клетки велик, а свободные радика лы («жертвы») – это очень короткоживущие и реакционно способные частицы, становится очевидно, что скорость цепного прироста свободных радикалов выше скорости выведения из клетки или распада белковых ферментов, то есть, k1K2, и тем более K2 4k1. Поэтому имеет место колебательный характер приближения к равновесию.
k 1 K Глобальный анализ показал единственность устойчивого равновесия x =. Важ k 2 K но, что в знаменателе формулы стоит коэффициент K1, показывающий скорость генерации клеткой ферментов антиоксидантной защиты в условиях стресса и отражающий, как ска зано выше, количество транскрипционно активных копий РГ индивида. Следовательно, чем больше копий активных рибосомных генов в геноме индивида, тем ниже у данного индивида равновесная концентрация АФК, а следовательно, уровень окислительного стресса (рис. 6) при прочих равных условиях.
На основании результатов моделирования и данных о разных средних количествах активных генов рРНК у пациентов с аутизмом и шизофренией можно высказать предпо ложение, что в патогенезе раннего детского аутизма вклад ОС более выражен, чем в пато генезе шизофрении (по крайней мере, в большинстве случаев). Можно поэтому предполо жить, что лечебный эффект антиоксидантной терапии должен быть выражен только у де тей с низкой копийностью активных рибосомных генов (17 усл.ед.), в клетках которых интенсивность ОС максимальна.
Рисунок 6. Фазовые траектории для двух индивидов с разным количеством копий активных рибо сомных генов К2 (пунктирная линия – К21, сплошная линия – К22, причем К21К22).
Примечание: Все остальные параметры модели у обоих индивидов одинаковы. Координаты фокуса спирали соответствуют формуле (2). Точка старта обозначена стрелкой. Ось абсцисс: концентрация активных форм кислорода (АФК), x;
ось ординат: концентрация ферментов антиоксидантной защи ты клетки, y. В точке А окислительный стресс слабее (уровень АФК ниже), но при этом уровень ан тиоксидантных ферментов выше, чем в точке В. Поскольку нельзя предугадать, в какой точке будет находиться система при взятии проб, однократный замер концентрации антиоксидантных фермен тов не дает истинного представления о равновесной величине окислительного стресса у того или иного индивида.
Как показало математическое моделирование, динамика ОС носит колебательный ха рактер. Эти колебания в идеальной модели являются затухающими. Однако в реальности клетка постоянно подвергается стрессорным воздействиям, выводящим ее из точки равнове сия, в которое система затем возвращается по колебательной траектории. Предсказать зара нее, в какой фазе цикла (восходящей или нисходящей) окажется индивид на момент измере ний, невозможно. Выявленная в ходе анализа модели циклическая динамика процесса может объяснить противоречивость данных литературы о наличии ОС при шизофрении и РДА. Как правило, в опубликованных работах ОС исследовали однократно в малой выборке пациен тов, очевидно, находящихся на разных стадиях циклических колебаний – как на пике стрес са, так и на спаде. Мы полагаем, что наблюдавшееся в ряде экспериментов повышенное со держание антиоксидантных ферментов на фоне отсутствия маркеров перекисного окисления липидов характерно для нисходящей фазы цикла борьбы клетки с ОС (в модели y отстает от x, см. рис. 6, точки А и В). Следовательно, для адекватной оценки уровня ОС необходимые многократные измерения в разное время с последующим усреднением.
ВЫВОДЫ 1. Цитогенетический метод ранговой оценки размеров AgЯОР обеспечивает достаточ ную воспроизводимость результатов (с коэффициентом вариации CV6%) и поэтому мо жет использоваться для сравнения индивидов и групп индивидов по признаку копийности активных рибосомных генов (АкРГ) в их геномах.
2. Достаточным условием стабильности популяционного полиморфизма размеров кластеров АкРГ в вычислительном эксперименте оказалось сочетание стабилизирующего отбора по общей копийности АкРГ индивида, отсеивающего зиготы, несущие менее или более 190 копий, и вероятности спонтанного «мутирования» (изменение размера кла стера АкРГ) на уровне 3-4% на ЯОР на поколение.
3. Предсказанная в вычислительном эксперименте частота «мутирования» размеров кластеров активных рибосомных генов в результате неравного кроссинговера соответству ет эмпирической частоте «мутирования», которая лежит в доверительном интервале Д.И.95%=(3,56±1,57)10- 4. Величина стабилизирующего отбора по количеству копий АкРГ, предсказанная в модельном эксперименте и подтвержденная на эмпирическом материале, составляет в среднем по популяции около 9-10% зигот. При этом величина зиготических потерь являет ся специфической характеристикой каждой супружеской пары, которая у разных пар нахо дится в интервале от 0 до 45%. У репродуктивно нормальных пар зиготические потери по данному признаку не превышают 15%, более высокие потери могут повлечь задержку пла нируемой беременности на полтора года и более.
5. У детей с ранним детским аутизмом (РДА) количество АкРГ (17,8±0,25 условных единиц) достоверно ниже среднего значения как в контрольной выборке (19,0±0,23 усл.ед., p0,01), так и в выборке больных шизофренией (21,1±0,22 усл.ед., p0,001).
6. Динамика окислительного стресса (ОС) в клетках носит колебательный характер с наличием единственной точки устойчивого равновесия, причем равновесный уровень ОС обратно пропорционален копийности АкРГ в геноме клетки. Это позволяет объяснить про тиворечивость опубликованных данных о показателях ОС и антиоксидантого статуса клет ки, а также об эффективности антиоксидантой терапии у пациентов с РДА и шизофренией.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:
Пороховник Л.Н., Викторов В.В., Еголина Н.А., Цветкова Т.Г., Ляпунова Н.А.
1.
Полиморфизм размеров кластеров активных рибосомных генов у человека и моделирование условий его стабильности в ряду поколений // Генетика. 2011. Т. 47. №12.
С. 1666-1675.
Пороховник Л.Н., Еголина Н.А., Косякова Н.В., Цветкова Т.Г, Ляпунова Н.А.
2.
Зиготический и эмбриональный отбор по геномной дозе активных рибосомных генов как один из возможных факторов сниженной плодовитости супружеских пар // Медицинская генетика. 2012. Т. 11. №6. С. 31-34.
Пороховник Л.Н., Пасеков В.П., Еголина Н.А., Цветкова Т.Г., Косякова Н.В., 3.
Горбачевская Н.Л., Сухотина Н.К., Козловская Г.В., Сорокин А.Б., Коровина Н.Ю., Ляпунова Н.А. Окислительный стресс, гены рРНК и антиоксидантные ферменты в патогенезе шизофрении и аутизма: моделирование и клинические рекомендации // Журнал общей биологии. 2013. Т. 74. №5. С. 362-375.
Публикации в других изданиях:
Воронина В.Н., Пороховник Л.Н., Иванов В.П., Ляпунова Н.А. Демонстрация 4.
фенотипического проявления геномной дозы рибосомных генов в физическом развитии детей в первый год жизни: формирования зубного аппарата и гармоничность развития // Матерiали III З’iзда медичних генетикiв Украiни. Львiв, 2002. C. 37.
Еголина Н.А., Мхитарова Е.В., Мхитаров В.А., Пороховник Л.Н., Местергази Г.М., 5.
Ляпунова Н.А. Изменяется ли геномная доза рибосомных генов у человека при старении?
// «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (3-й съезд ВОГиС), т. 2, Москва, 2004. С. 87.
Агапова Р.К., Пороховник Л.Н., Дубынин П.Т., Ляпунова Н.А. Компьютерная база 6.
данных «Количество активных рибосомных генов (АкРГ) в индивидуальных геномах человека». (Материалы V съезда РОМГ, часть I. Уфа, май 2005) // Медицинская генетика.
2005. №4. С. 145- 7. Ляпунова Н.А., Еголина Н.А., Мхитарова Е.В., Мхитаров В.А., Косякова Н.В., Малиновская Е.М., Агапова Р.К., Пороховник Л.Н., Местергази Г.М., Вейко Н.Н.
Количественные характеристистики комплекса рибосомных генов у индивидов старческого возраста. (Материалы V съезда РОМГ, часть 2. Уфа, май 2005) // Медицинская генетика. 2005. №5. С. Ляпунова Н.А., Вейко Н.Н., Костюк С.В., Калашникова Е.А., Пороховник Л.Н., 8.
Агапова Р.К. Накопление в составе внеклеточной ДНК фрагментов транскрибируемой области рибосомного гена может провоцировать аутоиммунные реакции и быть причиной гибели зародыша в раннем эмбриогенезе (Тезисы докладов 2-го Съезда Общества клеточной биологии, С-Петербург, октябрь 2007) // Цитология. 2007. Т.49. № 9. С. 772.
Пороховник Л.Н., Еголина Н.А., Цветкова Т.Г., Агапова Р.К., Ляпунова Н.А.
9.
Геномная доза рибосомных генов как одна из возможных причин «необъяснимого» (идиопатического) бесплодия супружеских пар // Матерiали IV З’iзда медичних генетикiв Украiни. Львiв, 2008. C. 31.
10. Пороховник Л.Н., Ляпунова Н.А. Моделированиеусловий стабильности полиморфизма по признаку геномной дозы активных рибосомных генов у человека // V съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров. Москва, июнь 2009. Изд-во РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева. Москва. 2009. Часть 1. С. 481.
11. Пороховник Л.Н., Викторов В.В., Ляпунова Н.А. Экспериментальное подтверждение частоты мутаций кластеров рибосомных генов, предсказанной в модельных опытах // Медицинская генетика, 2010. Материалы VI Съезда РОМГ, Ростов на-Дону, май 2010. С. 145-146.
12. Пороховник Л.Н., Еголина Н.А., Цветкова Т.Г., Косякова Н.В., Ляпунова Н.А..
Зиготический отбор по геномной дозе активных рибосомных генов как возможный фактор пониженной плодовитости супружеских пар // Материалы II Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины. Возможное и реальное».С-Петербург, 18-20 июня 2012 г. С. 220- 13. Nataliya A. Lyapunova, Nataliya N. Veiko, Lev N. Porokhovnik. Human rRNA Genes:
Identification of Four Fractions, Their Functions and Nucleolar Location // «Proteins of the Nucleolus Regulation, Translocation and Biomedical Functions», Edited by D.H. O’Day and A.Catalano. Chapter 5. Springer, UK. 2012. P. 95- СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ AgЯOP – ядрышкообразующие районы хромосом, окрашенные азотнокислым серебром SE – стандартная ошибка UBF – фактор транскрипции, связывающийся с рибосомной ДНК перед промотором АкРГ – активные рибосомные гены АФК – активные формы кислорода МФЗ – мультифакториальные заболевания ОС – окислительный стресс РГ – рибосомные гены РДА – ранний детский аутизм рДНК – рибосомная ДНК рРНК – рибосомная РНК СУБД – система управления базой данных ФАЗ – ферменты антиоксидантной защиты ФГА – фитогемагглютинин ФГБУ «МГНЦ» – Федеральное государственное бюджетное учреждение “Медико РАМН генетический научный центр” Российской академии медицинских наук ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение ЯОР – ядрышкообразующие районы хромосом _ Подписано в печать 05.09.2013 г.
Печать трафаретная Усл.п.л. – 1, Заказ № Тираж: 100 экз.
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 115230, Москва, Варшавское ш., (499) 788-78- www.autoreferat.ru _