Молекулярно-генетическая и биохимическая характеристики наследственного гемохроматоза 1 типа у детей
На правах рукописи
АВЕРЬЯНОВА НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННОГО ГЕМОХРОМАТОЗА 1 ТИПА У ДЕТЕЙ 03.02.07 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2010
Работа выполнена на базе лаборатории мембранологии с группой генетических исследований научно-исследовательского института Педиатрии Учреждения Российской академии медицинских наук Научного центра здоровья детей Российской академии медицинских наук Научные руководители:
Асанов Алий Юрьевич доктор медицинских наук, профессор Пинелис Всеволод Григорьевич доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Спицын Виктор Алексеевич Доктор биологических наук, профессор Журков Вячеслав Серафимович Доктор медицинских наук, профессор
Ведущая организация:
Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится «»_2010г. в «_» часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 8.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.
Автореферат разослан "_" _2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент О.Б. Гигани
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Синдром перегрузки железом (СПЖ) в детском возрасте является угрожающим состоянием и приводит к поражению различных органов и систем. Известно, что СПЖ может иметь как первичный, так и вторичный характер. Среди причин первичной перегрузки железом большой удельный вес занимают наследственные нарушения обмена железа - наследственные гемохроматозы. Известно 5 типов наследственных гемохроматозов, обусловленных мутациями в разных генах: HFE, гепсидина (HAMP), гемоювелина (HJV), трансферринового рецептора 2 типа (TfR2), ферропортина (McKusick V.A., OMIM, 2005). Наиболее распространенным является наследственный гемохроматоз 1 типа (НГХ 1 типа), обусловленный мутациями в гене HFE. Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Частота НГХ 1 типа в Европейской популяции составляет от 3 до 8 на 1000 населения, а частота гетерозиготного носительства достигает 10 % (Merryweather-Clarke A.T. et al, 2000). В России частота данного заболевания приближается к европейской (Баев А.А., 2006;
Михайлова С.В. с соавт.;
2006, Литвинова М.М., 2009). Избыточное накопление железа в организме сопровождается развитием цирроза печени, сахарного диабета, кардиомиопатии, нарушением выработки гормонов гипофизом и др. Риск развития гепатоцеллюлярной карциномы в 200 раз выше у больных с НГХ 1 типа, чем в среднем в популяции (Шерлок Ш., 1999). Накопление железа в органах и тканях при НГХ начинается с рождения и идет постепенно. Клиническая манифестация НГХ типа чаще наступает после 40 лет, когда избыток железа достигает критического уровня и патологические изменения в организме приобретают необратимый характер (Краснопольская К.Д., 2005). Несмотря на этот общеизвестный факт, у пациентов детского возраста выявляют изменения биохимических параметров обмена железа, а в ряде случаев и неспецифические клинические симптомы (Полякова С.И. с соавт., 2004). Высказывается предположение, что гетерозиготное носительство мутаций, приводящих к НГХ 1 типа, может способствовать нарушению обмена железа при ряде сопутствующих соматических заболеваний (Баев А. А. 2005, Merryweather-Clarke A.T.
et al, 2003;
Кулагина Е.А., 2006).
В литературе встречаются единичные работы, посвященные диагностике НГХ 1 типа у российских детей (Красильникова М.В., 1999;
Аскерова Т.А., 2001;
Козырева Н.В., 2008). До настоящего времени молекулярно-генетических исследований НГХ типа у российских пациентов детского возраста практически не проводилось.
Характер изменения биохимических показателей обмена железа у детей с мутациями в гене HFE не изучался. Группы риска развития НГХ 1 типа среди российских детей не определены.
Таким образом, актуальным является разработка критериев дифференциальной диагностики первичного и вторичного СПЖ у детей на основе биохимических показателей обмена железа и молекулярно-генетических исследований. Выявление групп риска развития НГХ 1 типа и разработка алгоритма обследования детей с СПЖ позволит проводить раннюю диагностику НГХ 1 типа и профилактику тяжелого течения и неблагоприятного исхода заболевания.
Цель исследования Изучение молекулярно-генетических и биохимических особенностей проявления наследственного гемохроматоза 1 типа у детей с СПЖ.
Задачи исследования Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:
1. Сформировать репрезентативную выборку пациентов с признаками СПЖ для проведения молекулярно-генетического анализа гена HFE.
2. Получить данные о спектре мутаций гена HFE и их частоте, а также проанализировать связь генотипа с биохимическими показателями обмена железа и клиническими особенностями у детей изучаемой выборки.
3. Провести полное секвенирование гена HFE у детей с наиболее выраженными биохимическими и клиническими признаками СПЖ и отсутствием гомозиготного генотипа по частым мутациям гена HFE с целью поиска редких мутаций изучаемого гена, а также полное секвенирование генов HJV и HAMP с целью исключения ювенильного гемохроматоза (типы 2A и 2В) у детей с ярко выраженной клинической картиной и исключенным НГХ 1 типа.
4. У всех детей с биохимической картиной перегрузки железом и в контрольной группе оценить частоту мутации Y250X гена трансферринового рецептора 2 Trf2, вызывающей наследственный гемохроматоз 3 типа.
Разработать практические рекомендации по применению молекулярно 5.
генетических исследований НГХ 1 типа у детей из групп риска и протокол молекулярно-генетического обследования на НГХ.
Научная новизна работы Впервые определены частоты мутаций С282Y, H63D и S65C гена HFE в выборке российских детей с соматическими заболеваниями и биохимическими признаками СПЖ.
Впервые показано, что в группе детей с различными соматическими заболеваниями с поражением печени и ЖКТ), (преимущественно сопровождающимися биохимическими признаками СПЖ, частота мутации H63D достоверно более высокая, чем у детей контрольной группы.
Впервые проведено сопоставление биохимических и некоторых клинических признаков НГХ 1 типа у детей с различными генотипами по мутациям в гене HFE.
Показана прямая зависимость средних значений биохимических показателей обмена железа от числа мутантных аллелей H63D. Доказано, что превышение нормальных значений степени насыщения трансферрина железом (СНТЖ) может служить показанием для направления детей на молекулярно-генетическую диагностику НГХ типа.
Практическая значимость работы Доказана необходимость молекулярно-генетической диагностики НГХ 1 типа у детей с признаками СПЖ и различными соматическими заболеваниями (преимущественно печени и ЖКТ). Это позволит контролировать избыточное накопление железа в организме и своевременно проводить специфическую профилактику осложнений, и тем самым повысить качество жизни пациентов.
Разработан протокол молекулярно-генетического обследования детей с СПЖ, который может использоваться при дифференциальной диагностике, медико генетическом консультировании, в научно-образовательной деятельности.
Основные положения, выносимые на защиту 1. У пациентов детского возраста НГХ 1 типа, обусловленный мутациями в гене HFE, может проявляться изменением биохимических показателей обмена железа, а в ряде случаев поражением печени, эндокринной системы, сердца, что является достаточными критериями для направления детей на молекулярно-генетическое обследование.
2. Гомозиготный генотип по мутации H63D или компаунд-гетерозиготные генотипы H63D/C282Y или H63D/S65C являются наиболее частой причиной НГХ типа у детей исследованной выборки.
3. Значительное превышение доли детей с гетерозиготным генотипом по мутации H63D в выборке детей с БППЖ по сравнению с контрольной группой свидетельствует об этиологической значимости данной мутации в развитии СПЖ у российских детей с соматическими заболеваниями.
4. Статистически достоверных различий в частоте мутантного аллеля С282Y в выборке детей с СПЖ по сравнению с группой детей с нормальными показателями обмена железа и общепопуляционной частотой не обнаружено.
5. Определены частоты гетерозигот по мутации S65C гена HFE в исследуемых выборках.
Внедрение результатов работы в клиническую практику Результаты работы внедрены в клиническую практику отделений НЦЗД РАМН, используются при медико-генетическом консультировании пациентов НЦЗД РАМН и в учебном процессе студентов кафедры медицинской генетики Первого МГМУ им.
И.М. Сеченова.
Апробация и публикации Материалы диссертации представлены на Съезде Генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21-28 июня 2009 г., Москва (стендовый доклад);
на VI Съезде Российского Общества Медицинских генетиков в рамках научной конференции «Молекулярные основы наследственной патологии», 14 – мая 2010 г., Ростов-на-Дону (устный доклад);
на научных конференциях лаборатории мембранологии с группой генетических исследований НЦЗД РАМН. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.
Структура и объём диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 38 таблицами. Библиографический список литературы включает 157 источников, из них 118 зарубежных.
Материал исследования В исследование было включено 133 ребенка, находившихся на стационарном лечении в различных отделениях НЦЗД РАМН в период с 2005 по 2009 год. Из них мальчиков и 53 девочки. Средний возраст детей составил 13,6 ± 3,1 лет (от 3 до лет). Для оценки клинико-биохимических и молекулярно-генетических особенностей проявления наследственного гемохроматоза у российских детей были сформированы три группы пациентов. Группа пациентов с биохимическими признаками перегрузки железом (БППЖ) составила 63 ребенка, у которых концентрация железа в сыворотке была выше 23,6 мкмоль/л (35,9±1,2 мкмоль/л), а значения СНТЖ более 40,0% (51,2±1,9%). Среди детей группы БППЖ были также дети, имеющие кроме биохимических, неспецифические клинические признаки перегрузки железом:
гиперпигментацию, гепатомегалию, признаки патологии печени по данным УЗИ изменения паренхимы, фиброз, цирроз), хронические гепатиты (диффузные различной этиологии, гипербилирубинемию, кардиомиопатию, нарушения ритма сердца, нарушения функции эндокринных желез, утомляемость, головные боли.
В контрольную группу были включены 49 пациентов, у которых концентрация железа в сыворотке не превышала 23,6 мкмоль/л и значения СНТЖ были не более 40%, т. е. не превышали нормальных значений, принятых в лаборатории биохимии НЦЗД РАМН, а также не имеющих патологии печени, сердца и эндокринных желез.
В группу с наследственными заболеваниями протекающими (НЗ), преимущественно с поражением печени, вошел 21 пациент с диагнозами - болезнь Вильсона–Коновалова, гликогеновая болезнь III типа, болезнь Гоше и др.
Биохимические параметры обмена железа у этих детей варьировали от нормальных до превышающих референтные значения.
Дети, в анамнезе которых отмечались гемотрансфузии или систематический прием препаратов железа, не были включены в исследование У всех детей были исследованы основные показатели обмена железа, а также состояние ЖКТ, печени, сердца, щитовидной железы. Все дети были генотипированы по трем частым мутациям в гене HFE (C282Y, H63D и S65C) и по мутации Y250X гена Trf2. У детей с выраженными клиническими признаками НГХ, но не имеющих частых мутаций в гене HFE были исследованы гены HFE, HJV, HAMP методом секвенирования.
Методы исследования Биохимические методы исследования. Концентрация железа в сыворотке крови (Fe сыв) и общая железосвязывающая способность (ОЖСС) определялись с помощью наборов IRON/TIBS BECKMAN (США) и набора калибраторов SYNCHRON Systems IRON/TIBC Calibrator Kit на аппарате SYNCHRON CX-4-Рro System. Уровень ферритина (Фр) в сыворотке крови определяли иммунотурбидиметрическим методом при длине волны 700 нм на аппарате Synchron. Использовали реактивы Randox (Великобритания). Содержание трансферрина (Тф) в сыворотке крови определялось иммунотурбидиметрическим методом на спектрофотометре при длине волны 340 нм, с использованием реактива Sentinel СН, Италия на аппарате Synchron.
Степень насыщения трансферрина железом (СНТЖ) рассчитывали по формуле:
СНТЖ = Fe сыв (мкмоль/л) / ОЖСС (мкмоль/л) *100%.
Все вышеуказанные параметры обмена железа определялись в лаборатории клинической биохимии НЦЗД РАМН. Значения всех параметров обмена железа у пациентов сопоставляли с референтной базой, представленной в таблице 1.
Молекулярно-генетические методы. Для выделения геномной ДНК из лейкоцитов венозной крови использовали набор реактивов «Wizard Genomic DNA фирмы в соответствии с протоколом Purification Kit» «Promega» (США) производителя.
Таблица Референтные диапазоны показателей обмена железа у детей * Показатели Fe сыв. ОЖСС СНТЖ Тф сыв. Фр сыв.
обмена мкмоль/л г/дл. мг/дл мкмоль/л % железа 1-5 лет 10 – Референтные 5 -10лет 10- 9,3 – 23,6 45,0 – 81,0 20,0 – 40,0 200,0 – 360, диапазоны 10 -18 10 - * Приняты в лаборатории клинической биохимии НЦЗД РАМН.
Для определения мутаций C282Y и H63D гена HFE использовали метод аллельспецифичной ПЦР с праймерами, опубликованными ранее (Potekhina Е. S. et all, 2005), и некоторыми модификациями (таб. 2). Для детекции мутации S65C гена HFE были разработаны праймеры и тест-система с использованием метода анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (рестриктаза HinfI («Fermentas»). Генотип по мутации Y250X гена трансферринового рецептора 2 Trf также определяли методом рестрикционного анализа (рестриктаза FspBI («Fermentas»). Последовательности праймеров любезно предоставлены лабораторией молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики человека Уфимского научного центра РАМН, возглавляемой профессором Хуснутдиновой Э.К.
(таб. 2).
Таблица Последовательности праймеров для выявления мутаций в генах HFE и Trf № Мутация Наимено- Сиквенс (5 - 3') Длина № вание продукта пп праймера ( п.н.) Ген HFE 1 F-C282Y TTG AAC CTG GGA AGC GGA AGT 2 Rmut -C282Y CCT GGG TGC TCC ACC TGG T C282Y 3 Fwt -C282Y GGG AAG AGC AGA GAT ATA CGT G 4 R-C282Y GGT GCT CTG AAG ATG TTT GTT GAA 5 F-H63D CCC AGG TTT TCA GGA GGC TTA GGT 6 Rmut -H63D CTC CAC ACG GCG ACT CTC ATC H63D 7 Fwt -H63D AGC TGT TCG TGT TCT ATG ATC 8 R- H63D GGT CCC TAT TTC CAC CAT CC 9 F- S65C GTGCCTCAGAGCAGGACCTTG S65C 10 R- S65C CCCCTCTCCACATACCCTTGC Ген Trf 11 F- Y250X TGC ACT GGG TCG ATG AG Y250X 12 R- Y250X CTC AAG CCC TCC CTC T Дизайн праймеров для амплификации локуса S65C и секвенирования осуществлялся на основании данных GeneBank c использованием программ «Vector NTI Suite 8» и «Oligo 6.31».
Состав реакционной смеси для амплификации фрагментов, содержащих локусы C282Y, H63D и S65C, был стандартным: Taq Буфера х10 (pH 8.6) - 2,5 мкл;
Taq полимеразы 5ед/мкл - 1 мкл;
хлорида магния 25 mМ р-ра - 1,5 мкл;
смеси дНТФ (5mМ) - 0,5 мкл;
геномной ДНК - 100 нг;
деионизированной воды до конечного объема 25 мкл. Для амплификации фрагмента содержащего локус Y250X была использована полимераза Taq HotResqu 5ед/мкл - 1 мкл и буфер С х10 - 2,5 мкл с хлоридом магния, остальные составляющие те же. Для локуса C282Y использовали следующие количества праймеров: F-C282С - 3 pmol;
R- C282Y - 5 pmol;
Rmut-C282Y - 2 pmol;
Fwt C282Y - 7 pmol. Для локуса H63D использовали по 8 pmol каждого праймера (F-H63D, Rmut-H63D, Fwt-H63D, R-H63D). Для локусов S65C и Y250X использовали по 10 pmol каждого праймера.
Разделение и детекцию продуктов амплификации и ферментативного гидролиза проводили с помощью горизонтального электрофореза в 2,0 % и 3,5 % агарозном геле.
Таблица Последовательности праймеров для секвенирования генов HFE, HJV, HAMP Праймер Сиквенс (5 - 3') Длина Температу № фрагментов ра пп отжига, (п.н.) °С 1 446 For GCTACTTTCCCCAATCAACAA HFE Rev AGGTCCTCCAAAGTTAGCAAA For CCTCCTACTACACATGGTTAAG 2 HFE Rev GCAAATTCCTTCCCTCTTCC For GCAGGGAAGAGGGAAGGAAT 3 HFE Rev GCCACTAGAGTATAGGGGCA For ATCCCCTCTCCTCATCCTTC 4 389 HFE Rev TGCCATAATTACCTCCTCAG For GAGGGTGGCAATCAAAGGCT 5 201 HFE Rev CTGGGGCAGAGGTACTAAGA For AGAGAGAAGAGGCAAGATGG 6 532 HFE Rev TCTGGTAAGGTTATGACTAGC For ACCGTCAACTCAGTAGCC 7 328 HJV Rev GAGAGACATCCAAGTAGGTG For GCCACACTTATAGTTTGAGGA 8 390 HJV Rev CCCTACATAGCAGCCTACC For CCCTGATGAGATTTGGAAGAG 9 547 HJV3- Rev TGTGAAAGTGATGGTGGAAGC For CGGACCCTTGTGACTATGAA 10 344 HJV3- Rev GAGAGGTTGAGGAAGAAAAGG For GTAGGGATGAGGTAATACTGGAAC 11 406 HJV4- Rev TGATGGAGAAGGAGAGCTGC For CTATCAATGGAGGTGACCGAC 12 342 HJV4- Rev CATCAAAGACACAGGAATGGAAG For CGGGGAGCTATAACCATTGAT 13 370 HJV4- Rev GCCCTGCTTCCTTTAATGATTC For GCATTCAGTAAGGGGACCATC 14 375 HJV4- Rev GCTTTCAGCTCTTGCCTCTT For CTTCACCAATTTTTCCAGCCTC 15 491 HJV4- Rev CTGATACTTCCGAGCCCTCT For GGCTAGAATCTCAGCTCTGC 16 471 HAMP_pr Rev CACACATCTGTAGTCCCAGC For CATAGCTCACTGCAACCTCA 17 384 HAMP_pr Rev GGAACACTAGATAGCCCTGA For GAACCTATGCACGTGTGGTG 18 469 HAMP_pr Rev TCTGGGACCGAGTGACAGT For TTATCTCTCCCGCCTTTTCG 19 411 HAMP_exon Rev TGCCTGTCCTGGTTCCTGTT For CACTTGGAGAGGAGCAGGTT 20 Rev CAGACACTCGGCAGAGAGAA 397 HAMP_exon2, Амплификацию фрагментов для секвенирования экзонов генов HFE, HJV, HAMP проводили с использованием последовательностей разработанных нами праймеров (таб. 3). Праймеры для секвенирования подбирались таким образом, чтобы амплифицировать как экзоны генов, так и экзон-интронные области, включая промоторы генов и возможные сайты сплайсинга. Непосредственно сиквенсовую реакцию и капиллярный электрофорез проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования ИМБ РАН «ГЕНОМ» (http://www.genome centre.narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ (руководитель д.м.н., профессор Полтараус А.Б.) Статистические методы. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием параметрической и непараметрической статистики.
Расчеты осуществляли с использованием пакета «Statistica 6.0». Анализ качественных признаков проводили с использованием критериев Стьюдента, 2, двустороннего теста Фишера, непараметрического критерия Манн-Уитни. Для поиска зависимостей между учитываемыми параметрами проводился корреляционный анализ с использованием рангового коэффициента корреляции Спирмена. Уровень значимости p 0,05 был принят достаточным для признания различий достоверными.
Результаты и обсуждение собственных исследований 1. Распределение частот генотипов HFE в исследуемых группах.
Распределение частот мутаций гена HFE в Европейских популяциях характеризуется пестротой и выраженной неравномерностью. Известно, что частота мутации C282Y уменьшается с севера на юг и с запада на восток, тогда как частота мутации H63D, более древней по происхождению, напротив, увеличивается в тех же направлениях. Таким образом, отмечается определенная клинальная изменчивость частот, что может свидетельствовать о селективной роли данной генетической системы или о влиянии значительных миграционных потоков, формирующих наблюдаемую картину.
По литературным данным доля гомозигот по мутации H63D в группах пациентов существенно отличается в различных регионах Европы: во Франции от 4, до 8,5 %, в Италии 4,0 – 7,6 % (Merryweather-Clarke A.T. et al, 2000), в центральной Испании - 20,0% (Diego C. и др. 2004). По нашим данным, частота гомозигот H63D/H63D в группе обследованных детей с БППЖ составила 14,3% и была ближе всего к частоте, полученной испанскими исследователями на выборке взрослых пациентов. Частота компаунд-гетерозигот H63D/C282Y и H63D/S65C в группе детей с БППЖ составила 4,8 % и 3,2 % соответственно (рис. 1А). В контрольной группе и группе с НЗ гомозигот по мутации H63D и компаунд-гетерозигот по частым мутациям не выявлено (рис. 1Б и 1В).
Частота гетерозигот H63Н/H63D в группе детей с БППЖ составила 34,9 %, что оказалось более чем в 3 раза выше, чем в контрольной группе и группе детей с НЗ.
Различие в частотах генотипа H63Н/H63D высоко значимы (Р0,05). Эти данные свидетельствуют о накоплении пациентов, гетерозиготных по мутации H63D, в группе детей с БППЖ. Частота аллеля Н63D (0,357) была достоверно выше в группе с БППЖ, чем в контрольной группе (0,061) (2 = 27,45;
df = 1;
P = 0,0001) и группе детей с НЗ (0,048) (2 = 14,98;
df = 1;
P = 0,0001).
Рис. 1. Распределение частот генотипов по мутациям C282Y, H63D и S65C гена HFE в группах БППЖ (А), контрольной (Б) и НЗ (В).
В среднем, более 80% пациентов с НГХ 1 типа в Европе являются гомозиготами по мутации C282Y.: например, 94,6 % в Германии (Nielsen et al, 1998), 67,0 % в Испании (Fabrega et al., 1999), 48,0 % в Словении (Cukjati M. et al, 2007) и 33,0 % - на юге Италии (Piperno et al,1998). Пациенты, гомозиготные по мутации C282Y, в исследуемой выборке не выявлены, что отличает наши данные от результатов других исследований, полученных на выборках взрослых пациентов.
В настоящем исследовании также не обнаружено гомозиготных генотипов по мутации S65C. Частота встречаемости компаунд-гетерозигот H63D/S65C в группе БППЖ составила 3,2%, что сопоставимо с данными других исследователей (Mura C.,1999;
Щербинина С.П. с соавт., 2005;
Михайлова С.В. с соавт., 2006).
При сравнении частот встречаемости гетерозиготных генотипов по мутациям C282Y и S65C (рис.1) в исследуемых группах детей статистически значимых различий не выявлено. В Европе частота гетерозигот C282С/C282Y в среднем достигает 9,2 %, (Merryweather-Clarke A. T., 2000), а частота гетерозигот S65S/S65C – от 1,6 – до 5,5 % (Camaschella C. Et al., 2002).
В ряде исследований было показано, что этиологически значимой в возникновении НГХ 1 типа у российских пациентов является мутация С282Y, которая встречается в гомозиготном состоянии примерно в 5,1 % (Лавров А. В., 2004), 6,0 % (Баев А.А., 2006), 5,9% (Михайловой С.В. с соавт., 2005) случаев. В настоящем исследовании ведущей причиной развития НГХ 1 типа выступает мутация H63D, а именно гомозиготный генотип. Возможно, одной из причин расхождений наших данных с работами указанных исследователей может являться существенная разница в источниках формирования выборок больных с СПЖ. В работах Баева А.А. и Лаврова А.В. наряду с пациентами гастроэнтерологического и гепатологического отделений, в выборки были включены пациенты из отделения гематологии центра диагностики гемохроматозов. К тому же, в отличие от настоящего исследования, в этих работах были обследованы пациенты с развернутой клинической картиной НГХ, тогда как у пациентов ведущим было основное соматическое заболевание, протекающее на фоне СПЖ.
При сопоставлении частот аллелей С282Y, H63D и S65С, полученных в настоящем исследовании (группа детей с БППЖ) и в выборках взрослых пациентов из групп высокого риска развития НГХ 1 типа (исследования Лаврова А.В., 2004, Михайловой С.В. и соавт., 2006 и Баева А.А., 2006) статистически значимых различий в частотах встречаемости исследуемых аллелей не выявлено. Однако выборка детей отличалась по спектру выявленных генотипов HFE (таб.4).
Таблица Частоты генотипов и аллелей по мутациям C282Y, H63D и S65C гена HFE в группах детей и взрослых с высоким риском развития НГХ Частота (для генотипов в %;
для аллелей в долях) Дети с БППЖ Взрослые с Взрослые с Взрослые Генопип/ Мутация предположительн клиническими с ГХ (настоящее аллель (N=50)*** исследование) ым диагнозом признаками * ** НГХ (N=67) НГХ (N=39) (N=63) YY 0,0 6,0 5,1 6, CY 7,9 7,5 2,6 14, Y/D 4,8 3,0 5,1 6, C282Y CC 87,3 83,5 87,2 74, Y 0,063 0,112 0,090 0, C 0,937 0,888 0,910 0, DD 14,3 4,5 2,6 6, HD 34,9 34,3 41,0 40, Y/D+C/D 7,9 3,0 5,1 6, H63D HH 42,9 58,2 51,3 48, D 0,357 0,231 0,256 0, H 0,643 0,769 0,744 0, СС ни ни 0,0 0, ни ни SС 3,2 4, ни ни C/D 3,2 0, S65C ни ни SS 93,6 95, С ни ни 0,032 0, ни ни S 0,968 0, ни – не исследовано * Рассчитано по данным Михайловой С.В. и соавт. (2006), ** Рассчитано по данным А.В.Лаврова (2004), *** Рассчитано по данным А.А.Баева (2006) 2. Биохимические показатели обмена железа в исследуемых группах. При сравнении средних значений показателей обмена железа в группах БППЖ и контрольной получено статистически значимое различие для уровня гемоглобина крови, содержания эритроцитов, концентрации железа в сыворотке, содержания трансферрина в сыворотке, а также для ОЖСС и СНТЖ (р0,05).
При сравнении средних значений концентрации ферритина в сыворотке у детей в группе БППЖ и контрольной группе достоверных различий выявлено не было. В отличие от взрослых пациентов, в детском возрасте накопление железа находится на начальной стадии и уровень ферритина часто не превышает границы референтных значений.
Проведенное сопоставление средних значений биохимических показателей обмена железа у детей с различными генотипами по исследуемым мутациям в группе БППЖ показало, что у детей гомозигот H63D/H63D и компаунд-гетерозигот H63D/C282Y и H63D/C65S средняя концентрация железа в сыворотке (40,1±2,3) достоверно выше, чем у детей без мутаций (32,9±1,2) (t = 2,95;
df = 32;
P = 0,0058).
Такая же закономерность наблюдалась для СНТЖ при значениях 58,6±4,3 и 44,5±2, (t = 2,93;
df = 32;
P = 0,0062) (таб. 5).
У пациентов в группе с БППЖ, гетерозиготных по одной из частых мутаций, отмечались более высокие средние значения содержания железа и ферритина в сыворотке, и более высокий средний уровень СНТЖ по сравнению с пациентами, не имеющими частых мутаций гена HFE. Различие было статистически не значимым, тем не менее, такая тенденция изменений биохимических показателей обмена железа указывает на возможность развития СПЖ у гетерозиготных носителей частых мутаций в гене HFE при наличии ряда провоцирующих факторов: употребление в пищу воды, с повышенным содержанием железа, вирусная нагрузка на печень, передозировка препаратов железа и др. лекарственных препаратов. Эти данные согласуются с данными других исследователей о совместном влиянии гетерозиготного генотипа и других патогенных факторов на показатели обмена железа (Mura C.,1999, Кулагина Е. А., 2006).
Для оценки связи между числом мутантных аллелей и значениями биохимических показателей у детей в группе БППЖ был проведен корреляционный анализ (с применением рангового коэффициента корреляции Спирмена). Нами получена статистически значимая прямая связь числа мутантных аллелей в гене HFE (по любой из частых мутаций) с уровнем содержания железа в сыворотке (R = 0,25;
df = 61;
Р = 0,05) и СНТЖ (R = 0,333;
df = 61;
Р = 0,008). Предполагая, что наличие различных (C282Y, H63D и S65C) мутантных аллелей гена HFE могло по-разному влиять на уровень биохимических показателей обмена железа, была предпринята попытка оценить связь исследуемых показателей обмена железа только с наличием аллеля H63D. При перерасчете выявлена статистически значимая прямая связь числа мутантных аллелей Н63D со средним уровнем содержанием железа в сыворотке и СНТЖ.
Таблица Биохимические показатели у детей в группе БППЖ в зависимости от генотипа Показатель Хср±m/ ОЖСС СНТЖ Тф сыв. Фр сыв.
Fe генотип, (мкмоль/л) (мкмоль/л) (%) (мг/дл) (мг/дл) число детей, N Гомозиготы 63DD и компаунд- 40,1±2,3 67,4±3,6 58,6±4,3 224,1±18,5 104,1±20, гетерозиготы N = Гетерозиготы* 52,2±2, 35,8±2,1 69,5±2,3 216,9±12,4 123,5±23, N = Без частых мутаций 32,9±1,2 77,3±3,7 44,5±2,7 243,8±16,3 67,9±15, N= * гетерозиготы по одной из частых мутаций в гене HFE Предположение о том, что аллель Н63D вносит наиболее существенный вклад в зависимость уровня СНТЖ от числа мутантных аллелей гена HFE у пациентов исследованной выборки получило подтверждение. Данные непротиворечиво свидетельствуют об участии мутации Н63D в гетерозиготном состоянии в формировании СПЖ у обследованных пациентов. Вместе с тем, четких закономерностей связи количества мутантных аллелей гена HFE с концентрацией трансферрина и ферритина в группе больных с БППЖ не было выявлено.
3. Связь основных клинических проявлений СПЖ с генотипом по HFE. В результате оценки характера клинических проявлений НГХ 1 типа у детей с СПЖ было показано, что статистически достоверных различий между группой пациентов носителей одного или двух мутантных аллелей (по любой из исследованных мутаций гена HFE) и группой пациентов без частых мутаций не выявлено (таб. 6). Полученные данные свидетельствуют о том, что у детей выявляются только минимальные клинические проявления СПЖ, без развития классической клинической картины НГХ 1 типа. Эти признаки в сочетании с биохимическими изменениями, характерными для НГХ 1 типа, являются показанием для направления ребенка на молекулярно генетическую диагностику НГХ 1 типа.
Таблица Клинические проявления СПЖ у детей группы БППЖ с разными генотипами Клинический Доля детей с нарушениями, % признак Гомозиготы и Гетерозиготы** Без частых мутаций в компаунд- гене HFE N= гетерозиготы* N= N= Поражение 85, 64,3 93, печени Нарушение 85, 83,4 86, деятельности сердца Нарушение 28, 28,5 20, пигментации кожи Нарушение 20, 21,4 13, толерантности к глюкозе *- гомозиготы H63D/ H63D и компаунд-гетерозиготы H63D/C282Y и H63D/C65S, ** - гетерозиготы по C282Y, H63D и S65C в сумме 4. Поиск редких мутаций в гене HFE и других генах наследственного гемохроматоза. Некоторым пациентам из обследованной выборки диагноз НГХ был поставлен на основе клинических признаков. Однако, частых мутаций в гене HFE у них не было выявлено. Поэтому необходимо было исключить другие генетические причины данного состояния.
Известно, что причина раннего дебюта заболевания может быть связана с одновременным наследованием мутаций гена HFE и мутации Y250X гена Trf2. Для исключения этой причины ранней манифестации НГХ был проведен поиск мутации Y250X в гене Trf2 у детей с БППЖ и в контрольной группе. Мутации Y250X в гене Trf2 у обследованных пациентов не было выявлено.
Чтобы исключить наличие у наших пациентов других, более редких мутаций в гене HFE, а также, учитывая возраст наших пациентов и описанные в литературе случаи одновременного наследования мутаций в гене HFE и генах гемоювелина и гепсидина (HVJ и HAMP ), приводящих к ювенильному гемохроматозу, был проведен поиск мутаций в этих генах методом секвенирования. В подгруппу было включено человек с клиническим диагнозом «наследственный гемохроматоз» и отсутствием гомозиготного генотипа по частым мутациям гена HFE. Мутаций в исследованных генах у этих пациентов обнаружено не было.
На основе полученных данных нами был разработан протокол медико генетического обследования детей с наследственными гемохроматозами (рис. 2).
Первый этап обследования - выявление детей с биохимическими признаками СПЖ и клиническими симптомами гемохроматоза среди пациентов с соматическими заболеваниями. Далее проводится молекулярно-генетическое обследование по трем частым мутациям гена HFE. По результатам генотипирования у детей с гомозиготными и компаунд-гетерозиготными генотипами диагноз НГХ 1 типа считается подтвержденным;
у детей, гетерозиготных по одной из частых мутаций и детей, не имеющие частых мутаций в гене HFE, при наличии клинической картины СПЖ необходимо исключить сначала другие мутации гена HFE, а при их отсутствии, мутации в генах гемоювелина, гепсидина, ферропортина и ТфР2. Такое обследование дает возможность быстро и эффективно выявлять больных с наследственными гемохроматозами на ранней, иногда доклинической стадии развития заболевания, что позволит предотвратить развитие тяжелой клинической картины в старшем возрасте.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Наследственный гемохроматоз типа является одним из немногих наследственных заболеваний обмена веществ, для которых существует эффективная и доступная терапия. Однако данное заболевание, как правило, диагностируется во взрослом возрасте при наличии развернутой клинической картины, которая проявляется в виде тяжелых необратимых поражений ряда органов и тканей (цирроза печени, сахарного диабета, кардимиопатии). Тем не менее, эти явления можно предотвратить в случае ранней диагностики НГХ 1 типа, на доклинической стадии, когда заболевание проявляется в виде биохимических признаков СПЖ. В практике педиатров часто возникает необходимость дифференциальной диагностики СПЖ первичного и вторичного характера. Выше изложенные причины обусловили проведение данного исследования. В настоящем исследовании впервые проведено молекулярно-генетическое обследование детей с соматическими заболеваниями и СПЖ, а также дана биохимическая характеристика различных генотипов по мутациям в гене HFE.
Рис. 2. Протокол молекулярно-генетического обследования детей на наследственные гемохроматозы.
При расчете частот встречаемости генотипов по исследуемым мутациям гена HFE в нашей выборке был выявлен ряд особенностей. Основными вариантами гена HFE, определяющими наследственный гемохроматоз 1 типа в настоящей выборке детей, были гомозиготы H63D/H63D и компаунд-гетерозиготы H63D/C282Y и H63D/S65C. Отбор детей по биохимическим критериям СПЖ на молекулярно генетическую диагностику позволил выявить высокий суммарный процент (22,3 %) детей с подтвержденным диагнозом НГХ 1 типа. Полученные данные с высокой частотой аллеля H63D в группе детей с БППЖ подтверждают вовлеченность этого аллеля в механизм развития СПЖ у обследованных детей.
В ходе работы было показано, что повышение СНТЖ у детей является прямым показанием для проведения молекулярно-генетического обследования на НГХ 1 типа.
Анализ взаимосвязи биохимических показателей с различными генотипами по трем мутациям в гене HFE в группе детей с БППЖ показал, прямую зависимость СНТЖ и концентрации железа в сыворотке от числа мутантных аллелей H63D. Показано, что у детей гетерозигот по мутации H63D присутствуют биохимические признаки СПЖ, которые могли быть спровоцированы сопутствующей патологией.
Сопоставление клинических признаков СПЖ с генотипами по HFE у детей в группе БППЖ показало, что проявления НГХ 1 типа в детском возрасте имеют неспецифический характер.
На основе полученных данных разработаны протокол молекулярно генетического обследования детей на НГХ и практические рекомендации для врачей.
ВЫВОДЫ 1. НГХ 1 типа у детей с соматическими заболеваниями может проявляться изменениями биохимических показателей обмена железа, из которых наиболее информативным и значимым для обоснования необходимости дальнейшего молекулярно-генетического обследования является степень насыщения трансферрина железом.
2. Основной причиной наследственного гемохроматоза 1 типа в исследуемой выборке российских детей является гомозиготный генотип по мутации H63D и компаунд-гетерозиготные генотипы H63D/C282Y и H63D/S65C гена HFE.
3. В выборке детей с биохимическими признаками синдрома перегрузки железом частота гетерозигот H63D достоверно выше по сравнению с контрольной группой, что может рассматриваться как указание на участие данного аллеля в развитии патологии обмена железа у детей с сопутствующими соматическими заболеваниями.
4. Частота гетерозигот С282Y, оцененная на выборке детей с синдромом перегрузки железом, статистически не отличается от частоты, оцененной в группе детей с нормальными показателями обмена железа, а так же от общепопуляционной частоты.
5. В группе детей с БППЖ и контрольной группе частоты гетерозигот по мутации S65C гена HFE составили соответственно 3,2 % и 2,0%. Полученные оценки частот статистически не различались.
6. Разработан и внедрен в практику протокол молекулярно-генетического обследования детей на наследственные гемохроматозы.
Практические рекомендации 1. При выявлении синдрома перегрузки железом у детей с соматической патологией необходимо направлять этих пациентов на молекулярно-генетическое исследование с целью исключения НГХ 1 типа, а так же других типов наследственных гемохроматозов.
2. При диагностике мутантного генотипа по гену HFE у ребенка с соматической патологией внимание врачей должно быть обращено на контроль и коррекцию уровня железа.
3. Разработанный протокол молекулярно-генетического обследования может быть использован в отделениях крупных научно-практических центров и при медико генетическом консультировании семей с гемохроматозом для оценки риска потомства, определения прогноза течения заболевания, скорости прогрессирования и выбора адекватных методов терапии.
.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Полякова С.И., Журкова Н.В., Потапов А.С., Аверьянова Н.С. Гемохроматоз:
состояние проблемы // Справочник педиатра. - 2006. - №12.- С. 18-28.
2. Полякова С.И. Чибисов И.В., Потапов А.С., Сенцова Т.Б., Баканов М.И., Аверьянова Н.С., Журкова Н.В., Пинелис В.Г. Возрастные особенности уровня ферритина – ключ к ранней диагностике гемохроматоза // Материалы VII съезда научного общества гастроэнтерологов России, Москва. - 2007. С.194.
3. Полякова С.И., Аверьянова Н.С., Тихомиров Е.Е., Баканов М.И., Пинелис В.Г., Потапов А.С., Журкова Н.В. Фенотипические и молекулярно генетические корреляции доклинического наследственного гемохроматоза у детей // Материлы XIII Росс. Гастроэнтерологической недели. Росс. Журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007.-Т. 17. - №5. - C.114.
4. Полякова С.И., Журкова Н.В., Аверьянова Н.С., Чибисов И.В., Потапов А.С., Куприянова О.О., Баканов М.И., Пинелис В.Г., Строкова Т.В. Алгоритм ранней диагностики гемохроматоза // Сб. матер. XI Конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», Моcква, 5-8 фев. 2007 г. – М.: Изд.
Группа «ГЭОТАР-Медиа», 2007. - С. 546.
5. Полякова С.И., Строкова Т.В., Баканов М.И., Потапов А.С., Сенякович В.М., Аверьянова Н.С., Журкова Н.В. Обмен железа у детей с холестатическими и метаболическими заболеваниями печени // Росс. Журн гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктол. Прил. № 29. материалы XII Российской конференции «Гепатология сегодня», Москва, 19-21 марта 2007 г. – М.-C.54.
6. Полякова С.И., Потапов А.С., Сурганова А.А., Аверкина Н.В., Цимбалова Е.Г., Аверьянова Н.С., Тихомиров Е.Е., Журкова Н.В. Парадоксы железа у детей с соматической патологией Российский журнал гастроэнтерологии, // гепатологии и колопроктологии. Прил. № 31. Материалы XIII Российской конференции «Гепатология сегодня», Москва, 17-19 марта 2008 г.-М.- Т. XVIII.
- №1 – С.82.
7. Полякова С.И., Аверьянова Н.С., Потапов А.С., Журкова Н.В. Туманова Е.Л., Баканов М.И., Пинелис В.Г. Гемохроматоз у детей и подростков: трудности диагностики на раннем этапе // Росс. Журн. гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктол. Прил. № 34. Материалы XV Российской гастроэнтерологической недели, Москва, 12-14 октября 2009 г.-М.- Т. XIX. - №5.– C.124.
8. Polyakova S., Bezrukavnikova L., Averyanova N., Potapov A., Chetkina T., Senyakovich V., Bakanov M. Hepatic iron content in children with major mutation of hereditary haemochromatosis // 4th Europediatrics, Moscow, 3-6 June, 2009.-M. abstr.448.
9. Аверьянова Н.С., Давыдова О.Н., Журкова Н.В., Полякова С.И., Пинелис В.Г., Асанов А.Ю. Молекулярно-генетические аспекты наследственного гемохроматоза у детей // Материалы Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Ч.Дарвина и V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров Москва, 21 июня-28 июня 2009 г. –М.: –В 2-х частях. Часть I. - С. 379.
10. Асанов А.Ю., Аверьянова Н.С., Журкова Н.В., Полякова С.И., Давыдова О.Н., Диагностика наследственного гемохроматоза 1типа в группе детей с клиническими проявлениями гемосидероза Сб. научных трудов.
// Современные технологии профилактики наследственных болезней и детской инвалидности (к 40-летию медико-генетического центра).- Спб. ГУЗ МГЦ.:
«Феникс», 2009.- С. 111-112.
11. Аверьянова Н.С., Журкова Н.В., Полякова С.И., Асанов А.Ю., Пинелис В.Г.
Наследственный гемохроматоз у детей – необходимость молекулярно генетической диагностики // Медицинская генетика. Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков Ростов-на-Дону, 14-18 мая г.- Ростов-на-Дону.- С. 3.
12. Полякова С.И., Аверьянова Н.С., Баканов М.И., Потапов А.С., Журкова Н.В., Пинелис В.Г. Биохимические критерии перегрузки железом у детей с мутациями в гене HFE // Медицинская генетика. Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г.- Ростов-на-Дону.- С. 144-145.
13. Аверьянова Н.С., Полякова С.И., Журкова Н.В., Кондакова О.Б., Асанов А.Ю. Исследование частых мутаций гена HFE у детей с синдромом перегрузки железом // Педиатрия. Журнал им. Сперанского.- 2010.- т.89.- № 6.- С. 156.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БППЖ – биохимические признаки синдрома перегрузки железом ЖКТ – желудочно-кишечный тракт НГХ – наследственный гемохроматоз НЗ – наследственные заболевания ОЖСС – общая железосвязывающая способность сыворотки ПДРФ – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов СНТЖ – степень насыщения трансферрина железом СПЖ – синдром перегрузки железом Тф сыв. – трансферрин сыворотки Фр сыв. – ферритин сыворотки Fe сыв. – концентрация железа в сыворотке HAMP – ген гепсидина HFE – ген наследственного гемохроматоза 1 типа (от англ. high ferum) HJV – ген гемоювелина TfR2 – ген трансферринового рецептора 2 типа WT – от англ. wild type – «дикий тип» Аверьянова Наталья Сергеевна Молекулярно-генетическая и биохимическая характеристики наследственного гемохроматоза 1 типа у детей Биохимические и молекулярно-генетические особенности наследственного гемохроматоза 1 типа были исследованы у детей с синдромом перегрузки железом.
Основной причиной HГХ 1 типа у детей в исследованной выборке являлись гомозиготный генотип по мутации H63D и компаунд-гетерозиготные генотипы C282Y/H63D и H63D/S65C. Установлено, что биохимические признаки синдрома перегрузки железом могут отмечаться у детей с различными соматическими заболеваниями, что определяет необходимость проведения молекулярно генетического исследования для подтверждения наследственного характера синдрома перегрузки железом у пациентов детского возраста. Разработан и внедрен в практику протокол молекулярно-генетического обследования детей с признаками СПЖ.
Результаты исследования рекомендованы для практического применения в работе врачей-педиатров, генетиков в медико-генетических консультациях и научно образовательной деятельности.
Averyanova Natalya Sergeevna Molecular genetic and biochemical characteristics of hereditary haemochromatosis type 1 in children Biochemical and molecular-genetic features of hereditary haemochromatosis type were studied in children with iron overload. Our patients with hereditary haemochromatosis showed a homozygous genotype for the H63D mutation and compound heterozygous genotype C282Y/H63D and H63D/S65C in HFE gene. Biochemical signs of iron overload syndrome could be observed in children with different somatic diseases therefore molecular-genetic study is necessary to confirm hereditary haemochromatosis in children.
We have developed and introduced a special protocol of molecular-genetic investigation of children with iron overload syndrome. These results can be used by pediatricians, in medico-genetic consultation and in scientific and educational activities.
Подписано в печать 18.11.2010 г.
Печать трафаретная Усл.п.л. – 1, Заказ №_ Тираж: 100 экз.
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 115230, Москва, Варшавское ш., (499) 788-78- www.autoreferat.ru