Свободнорадикальные процессы и антиокислительные свойства молока и кисломолочных продуктов
На правах рукописи
Лазарева Оксана Николаевна СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ И АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МОЛОКА И КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ 03.00.04. – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
ОМСК – 2008
Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии продуктов животноводства Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет».
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор В. Е. Высокогорский
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор С. В. Сибиряк доктор биологических наук, профессор В. Э. Цейликман
Ведущая организация: Российский университет дружбы народов, г. Москва
Защита состоится «30» октября 2008 года в 16.00 часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу:
450054, г. Уфа, пр. Октября, Тел/факс (3472) 35-60-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября,
Автореферат разослан « » сентября 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета С. М. Бикбулатова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Многочисленные результаты исследований, полученные в последний период времени, подтверждают, что одной из основных причин патологических процессов в организме, вызывающих преждевременное старение и развитие многих заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых и онкологических, является избыточное накопление в организме свободных радикалов (Меерсон, 1993;
Кольтовер, 1998;
Хавинсон, 2003, Владимиров, 1998;
Скулачев, 2007). Эффективная защита от разрушительного действия свободных радикалов обеспечивается различными антиоксидантами ферментативной и неферментативной природы.
При избытке свободных радикалов и недостатке антиоксидантов в организме их баланс нарушается и происходит свободнорадикальное повреждение нуклеиновых кислот, белков, липидов мембран и других макромолекул клетки. Для профилактики окислительного стресса значительная часть антиоксидантов должна поступать в организм с пищей, богатой антиокислительным комплексом.
Молоко проявляет антиокислительные свойства благодаря содержанию в нем следующих антиоксидантов: ферментных (каталаза, пероксидаза, супероксиддисмутаза и др.) и неферментных (витамины А, Е, С, SH-соединения) (Горбатова, 2004;
Твердохлеб, 2006).
Однако в процессе технологической обработки молока изменяются его физико-химические и биологические свойства. Например, липиды молока и кисломолочных продуктов при технологической обработке и хранении могут подвергаться свободнорадикальному окислению (СРО), что приводит к снижению их качества и биологической ценности (Горбатова, 2004;
Твердохлеб, 2006;
Рогожин, 2006). Так, образующиеся на начальной стадии окисления перекиси и гидроперекиси существенно не влияют на органолептические свойства молочных продуктов, но могут быть токсичны, способствуют разрушению жирорастворимых витаминов и полиненасыщенных жирных кислот. Вторичные продукты окисления (альдегиды и кетоны) придают продуктам соответствующие специфические посторонние привкусы (Нечаев, Траубенберг, Кочеткова;
2003). Кроме того, потребление молочных продуктов с окисленными липидами может вызывать возникновение патологических изменений в организме, поэтому поиск средств защиты молочных продуктов от инициирования в них перекисного окисления важен не только для удлинения сроков хранения, но и для повышения биологической ценности продуктов.
Таким образом, исследование процессов СРО и антиоксидантной активности приобретает в настоящее время приоритетное значение. Однако в литературе практически отсутствуют данные об антиокислительных свойствах молока и кисломолочных продуктов, что определяет актуальность данного исследования.
Цель исследования: изучить процессы свободнорадикального окисления молока и кисломолочных продуктов для обоснования путей повышения их антиокислительных свойств.
Задачи исследования:
1. С помощью хемилюминесцентного анализа исследовать Fe2+ индуцированную интенсивность свободнорадикального окисления и антиоксидантную активность молока и кисломолочных продуктов.
2. Изучить уровень некоторых компонентов неферментативной антиокислительной системы молока и кисломолочных продуктов.
3. Оценить влияние водных экстрактов из растительного сырья на железоиндуцированную хемилюминесценцию молока и кисломолочных продуктов 4. Исследовать антиоксидантную активность молока и кисломолочных продуктов, обогащенных водными экстрактами из растительного сырья in vitro на модельной системе.
Научная новизна исследования. В настоящей работе дана сравнительная характеристика интенсивности свободнорадикального окисления и антиокислительных свойств молока и кисломолочных продуктов. Для этой цели впервые использована железоиндуцированная хемилюминесценция, с помощью которой установлено, что антиоксидантная активность зависит от особенностей технологии изготовления молочной продукции: она значительно снижена в продуктах, подвергнутых высокотемпературной обработке (стерилизованное молоко, ряженка). Для улучшения свойств стерилизованного молока и ряженки нами впервые в качестве добавок использовано натуральное растительное сырье в виде водных экстрактов. Показано, что водные экстракты из растительного сырья способствуют торможению процессов СРО и повышают антиокислительные свойства молочных продуктов.
Практическая значимость работы. Полученные данные могут служить теоретической основой для разработки рекомендаций по повышению антиоксидантной активности молока и кисломолочных продуктов. Выяснение биохимических механизмов, способствующих повышению антиокислительных свойств молочных продуктов, дают возможность определить пути для совершенствования используемых технологий производства и разработки новых видов этой продукции. Экспериментально обоснована возможность применения растительного сырья с целью повышения антиокислительных свойств молочных продуктов. Использование растительных экстрактов в создании новых видов молочных продуктов имеет важное значение для профилактики заболеваний и позволит расширить ассортимент функциональных конкурентоспособных продуктов.
Внедрение результатов исследования в практику. Основные положения работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре биохимии и технологии продуктов животноводства Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет».
Положения, выносимые на защиту:
1. Технологическая обработка молока приводит к активации свободнорадикального окисления в питьевом молоке и кисломолочных продуктах.
2. Антиокислительные свойства молочных продуктов выражены в различной степени в зависимости от особенностей технологического процесса их изготовления.
3. Водные экстракты из растительного сырья приводят к торможению процессов свободнорадикального окисления молочных продуктов, а также повышают их антиоксидантную активность.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на I теоретико методологической конференции аспирантов и соискателей «Методология в науках агропромышленного комплекса» (г. Омск, 2005);
на конференции «Инновационные технологии производства и переработки сельскохозяйственной продукции» (г.
Омск, 2006);
на Международной научно-практической конференции «Интеграция науки и образования – решающий фактор устойчивого развития государства» (Казахстан, г. Семипалатинск, 2006);
на V специализированном конгрессе «Молочная промышленность Сибири» (г. Барнаул, 2006);
на межвузовской научно практической конференции «Роль свободнорадикальных процессов в физиологии и патологии» (г. Омск, 2007);
на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (г. Киров, 2007);
на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 2008);
на Международной научно-практической конференции «Современные технологии производства продуктов питания: состояние, проблемы и перспективы развития» (г. Омск, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе две в журналах, рекомендованных ВАК;
два свидетельства на интеллектуальный продукт: «Метод повышения антиоксидантной активности молочных продуктов» зарегистрирован ФГУП «ВНТИЦ» 27 апреля 2007 г. № 73200700038 и «Методика регистрации железоиндуцированой хемилюминесценции кисломолочных продуктов» зарегистрирован ФГУП «ВНТИЦ» 11 сентября 2008 г. № 73200800086.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц, 22 рисунка. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение»;
«Обзор литературы»;
«Материалы и методы исследования»;
«Результаты исследований и их обсуждение»;
«Заключение»;
«Выводы»;
«Библиографический список», который содержит 196 источников литературы, в том числе 151 отечественных и 45 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В данной работе исследовали интенсивность процессов СРО и состояние неферментативной антиокислительной системы следующих маложирных (с массовой долей жира 2,5%) молочных продуктов: пастеризованное и стерилизованное молоко, кефир, варенец, простокваша «Мечниковская», ацидофилин, кефирный напиток «Бифидок», напиток ацидофильный сладкий фруктовый, кефирный напиток сладкий фруктовый и ряженка;
производитель ООО «Манрос - М», г. Омск. В качестве контроля использовали сырое нормализованное молоко с массовой долей жира 2,5%.
С целью выяснения возможности активизации процессов СРО молока и кисломолочных продуктов, нами проведен хемилюминесцентный анализ, заключающийся в регистрации сверхслабого свечения, сопровождающего окислительную реакцию. Свечение индуцировали добавлением 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа. Анализировали следующие параметры кривой хемилюминесценции (ХЛ): амплитуду быстрой вспышки, латентный период времени от момента введения Fe2+ до начала развития медленной вспышки, амплитуду медленной вспышки (максимальную светимость), светосумму.
Регистрацию свечения проводили на приборе «Хемилюминомер – ХЛ 003» (Владимиров, 1999;
Фархутдинов с соавт., 2005).
Антиокислительные свойства (АОС) молока и кисломолочных продуктов оценивали in vitro на модельной системе, в которой инициировали реакции СРО – перекисное окисление липидов (ПОЛ). В качестве модельной системы использовали липиды, полученные из куриного желтка, содержащего липопротеиновые комплексы. Интегративным параметром ХЛ является светосумма свечения, по изменению которой судили о про- или антиокислительных свойствах молочных продуктов in vitro при их добавлении в модельную систему.
Сравнительную характеристику антиокислительной активности водных экстрактов из мелиссы лекарственной, плодов шиповника, зеленого чая «Принцесса Ява», листьев брусники, цветков липы, листьев стевии проводили in vitro на модельной системе ПОЛ. Для оценки влияния растительных экстрактов на интенсивность СРО молочных продуктов и их АОС, вносили их в молочные продукты в объеме 10% (норма, рекомендованная Европейским научным сообществом по фитотерапии).
Содержание аскорбиновой кислоты в молоке и кисломолочных продуктах определяли по методу Девятнина и Дорошенко с использованием 2,6 дихлорфенолиндофенола (1971). Количество доступных сульфгидрильных групп (SH-групп) в молочных продуктах оценивали спектрофотометрически с помощью ДТНБК (5,5 - дитиобис-2-нитробензойной кислоты) (Черданцев с соавт., 2002).
Содержание малонового диальдегида определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (2-ТБК) (Стальная, Гаришвили, 1977).
Статистическая обработка экспериментальных данных выполнена с использованием пакета программ «Biostat» и «Microsoft Office Excel».
Экспериментальные данные статистически обработаны с помощью параметрического t-критерия Стьюдента и корреляционного анализа (Петри, Сэбин, 2003;
Сергиенко, Бондарева, 2001). Нулевая гипотеза отвергалась при уровне значимости, соответствующей p 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Хемилюминесцентный анализ молока и кисломолочных продуктов При изучении Fe2+-индуцированной ХЛ выяснили, что технологическая обработка молока изменяет параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции (табл. 1).
Даже кратковременная пастеризация молока несколько активизирует свободнорадикальные процессы. Так, параметры хемилюминесценции пастеризованного молока изменяются в сравнении с сырым нормализованным молоком: амплитуда быстрой вспышки выше на 15,23%;
а латентный период на 10,51% меньше, чем у сырого нормализованного молока;
амплитуда медленной вспышки (максимальная светимость) (р = 0,334) и светосумма (р = 0,402) хемилюминесценции пастеризованного молока не изменены (табл. 1).
Таблица 2+ Параметры Fe -индуцированной хемилюминесценции кисломолочных продуктов ( X ) ±m Показатели хемилюминесценции Быстрая Максимальная Латентный Светосумма, Вид продукта вспышка, светимость, период, сек у.е·мин усл.ед. усл.ед.
Молоко 1,51 ± 0,03 63,96 ± 1,62 1,24 ± 0,05 7,58 ± 0, нормализованное (n=10) Молоко 1,74 ± 0,06 57,24 ± 1,63 1,43 ± 0,18 8,09 ± 0, пастеризованное Р1 = 0,005 Р1 = 0,009 Р1 = 0,334 Р1 = 0, (n=10) 3,69 ± 0,09 24,66 ± 1,24 3,75 ± 0,11 23,48 ± 0, Молоко стерилизованное Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0, (n=10) Р2 0,001 Р2 0,001 Р2 0,001 Р2 0, 3,25 ± 0,28 58,35 ± 2,92 3,46 ± 0,16 20,21 ± 0, Кефир (n=10) Р1 0,001 Р1 = 0,110 Р1 0,001 Р1 0, Р2 0,001 Р2 = 0,744 Р2 0,001 Р2 0, 2,69 ± 0,16 49,56 ± 1,61 3,40 ± 0,13 20,70 ± 0, Варенец (n=10) Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0, Р2 0,001 Р2 = 0,004 Р2 0,001 Р2 0, 2,65 ± 0,10 53,91 ± 1,15 3,31 ± 0,10 21,55 ± 0, Простокваша «Мечниковская» Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0, (n=10) Р2 0,001 Р2 = 0,112 Р2 0,001 Р2 0, 2,77 ± 0,29 55,47 ± 1,56 3,73 ± 0,17 22,61 ± 0, Ацидофилин (n=10) Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0, Р2 = 0,003 Р2 = 0,442 Р2 0,001 Р2 0, 3,04 ± 0,28 62,91 ± 2,24 3,14 ± 0,12 19,08 ± 0, Кефирный напиток Р1 0,001 Р1 = 0,709 Р1 0,001 Р1 0, «Бифидок» (n=10) Р2 0,001 Р2 = 0,056 Р2 0,001 Р2 0, Напиток 3,15 ± 0,13 52,26 ± 1,80 4,66 ± 0,16 27,58 ± 0, ацидофильный Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0, сладкий, Р2 0,001 Р2 = 0,055 Р2 0,001 Р2 0, фруктовый (n=10) 3,31 ± 0,26 58,17 ± 3,95 3,23 ± 0,19 20,90 ± 1, Кефирный напиток сладкий, Р1 0,001 Р1 = 0,191 Р1 0,001 Р1 0, фруктовый (n=10) Р2 0,001 Р2 = 0,830 Р2 0,001 Р2 0, 28,12 ± 1,43 16,89 ± 1,33 36,08 ± 1,51 250,30 ± 4, Ряженка (n=10) Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0,001 Р1 0, Р2 0,001 Р2 0,001 Р2 0,001 Р2 0, Примечание: значения Р1 в сравнении с сырым нормализованным молоком, Р2 – в сравнении с пастеризованным молоком.
Стерилизация молока уже значительно активизирует процессы СРО. В стерилизованном молоке все показатели СРО достоверно изменены по сравнению с сырым молоком: амплитуда быстрой вспышки, характеризующая содержание гидроперекисей в пробе, увеличена в 2,44 раза;
латентный период времени, характеризующий окисление липидов в зависимости от содержания антиоксидантов уменьшен на 61,44%;
увеличены амплитуда медленной вспышки, отражающая максимально возможную интенсивность СРО – в 3,10 раза и величина светосуммы, характеризующая способность субстратов к развитию цепных процессов окисления – в 3,10 раза. В стерилизованном молоке, по сравнению с сырым, повышено содержание гидроперекисей, понижена антиокислительная активность и, как следствие, увеличена интенсивность ХЛ под действием Fe2+.
При исследовании ХЛ (табл. 1) таких кисломолочных продуктов, как варенец, простокваша «Мечниковская» и ацидофилин наблюдается достоверное увеличение амплитуды быстрой вспышки по сравнению с сырым молоком на 75-;
83%;
и более чем в 2 раза у таких продуктов как кефир, «Бифидок» и сладких кисломолочных продуктов. Латентный периода ХЛ варенца уменьшается на 22,51%;
простокваши «Мечниковской» - на 15,71%;
ацидофилина – на 13,27%;
напитка ацидофильного сладкого – на 18,29%. Латентный период свечения кефира (р = 0,110), кефирного напитка «Бифидок» (р = 0,709) и кефирного напитка сладкого (р = 0,191) достоверно не изменен по сравнению с латентным периодом ХЛ нормализованного молока.
Достоверно увеличены амплитуда медленной вспышки (максимальная светимость) ХЛ кисломолочных продуктов, за исключением ряженки, в 2,7-3, раза, а светосумма в 2,7-3,6 раза в сравнении с показателями сырого нормализованного молока.
Таким образом, в исследуемых кисломолочных продуктах процессы СРО под действием Fe2+ протекают более интенсивно по сравнению с сырым молоком.
Для уточнения влияния температурного фактора на интенсивность СРО в следующей серии мы сравнили показатели ХЛ кисломолочных продуктов и пастеризованного молока.
Выяснили, что амплитуда быстрой вспышки, максимальная светимость и светосумма хемилюминесценции кисломолочных продуктов достоверно увеличены и по сравнению с пастеризованным молоком (табл. 1). Поэтому можно сказать, что в данных кисломолочных продуктах наблюдается более высокая активность свободнорадикальных процессов в сравнении с пастеризованным молоком. Этот факт можно объяснить в определенной степени тепловой обработкой, так как при производстве этих кисломолочных продуктов молоко пастеризуют дольше, и температура пастеризации несколько выше, чем при производстве пастеризованного молока. Однако, латентный период при изучении хемилюминесценции кефира (р = 0,744), простокваши «Мечниковской» (р = 0,112), ацидофилина (р = 0,442), кефирного напитка «Бифидок» (р = 0,056), напитка ацидофильного сладкого фруктового (р = 0,055) и кефирного напитка сладкого фруктового (р = 0,830) достоверно не изменен по сравнению с пастеризованным молоком. Таким образом, в результате деятельности молочнокислых бактерий, могут синтезироваться вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, и при увеличении интенсивности СРО кисломолочных продуктов соотношение про и антиоксидантов в них сохраняется. Однако, более длительная пастеризация при производстве варенца приводит к уменьшению латентного периода его ХЛ на 13,42% (р = 0,004) в сравнении с пастеризованным молоком.
Наиболее интенсивно СРО, индуцированное ионами Fe2+, протекает в ряженке, где наблюдаются особенно значительные изменения показателей хемилюминеценции. Так, в сравнении с сырым молоком, амплитуда быстрой вспышки увеличена в 18,62 раза, латентный период меньше на 73,59%, максимальная светимость увеличена в 29,10;
а светосумма – в 33,02 раза (табл. 1).
Таким образом, ряженка имеет более высокие прооксидантные и низкие антиоксидантные свойства. Вероятно, это происходит вследствие более жесткой тепловой обработки.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что способность к активации СРО молока и кисломолочных продуктов под действием Fe2+ повышается после определенной технологической обработки, прежде всего, за счет усиления термического воздействия, что проявляется изменением показателей хемилюминесценции.
Fe2+-индуцированной Данные ХЛ подтверждаются результатами определения ТБК-активных продуктов перекисного окисления липидов. Выявлено их повышение в кисломолочных продуктах, особенно в ряженке, по сравнению с сырым нормализованным молоком. Содержание малонового диальдегида в кефире, варенце, ацидофилине на 27,50% (р 0,001, р = 0,007, р = 0,006), в простокваше «Мечниковской» – на 22,50% (р = 0,013), в ряженке в 2,65 раза (р 0,001) выше, чем в сыром молоке. Увеличение содержания малонового диальдегида в кисломолочных продуктах связано, вероятно, с активизацией процессов перекисного окисления липидов в этих продуктах, что отражается в повышении светосуммы свечения (табл. 1). Между светосуммой ХЛ молочных продуктов и содержанием в них ТБК-активных субстанций наблюдается высокая степень корреляции, которая представлена на рисунке 1.
Светосумма ХЛ, усл. ед*мин y = 495,12x - 362,8x + 78, R = 0, 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1, Содержание ТБК-активных субстанций в молочных продуктах, ммоль/л Рис. 1. Связь между содержанием ТБК-активных субстанций и светосуммой ХЛ молочных продуктов С увеличением содержания ТБК-активных субстанций светосумма свечения молочных продуктов увеличивается.
Для уточнения результатов по антиокислительной активности, полученной путем определения латентного периода ХЛ нами исследованы антиокислительные свойства молока и кисломолочных продуктов in vitro на модельной системе (табл.
2). Установлено, что наибольшей способностью угнетать СРО модельной системы, а значит большей антиокислительной активностью обладает нормализованное молоко, при добавлении которого, светосумма ХЛ модельной системы снижается почти до 67%, наименьшей – стерилизованное. Кисломолочные продукты, за исключением ряженки, в сравнении с сырым нормализованным молоком в равной степени угнетают свечение модельной системы, то есть проявляют одинаковую антиоксидантную активность. Светосумма ХЛ модельной системы при добавлении кефира, варенеца, простокваши «Мечниковской», кефирного напитка «Бифидок», напитка ацидофильного сладкого фруктового достоверно не отличается в сравнении с интенсивностью свечения тест-системы с пастеризованным молоком.
Антиткислительная активность ацидофилина и кефирного напитка сладкого выше пастеризованного молока. Эти данные еще раз подтверждают сохранение антиокислительных свойств кисломолочных продуктов в результате деятельности молочнокислых бактерий. Ряженка не угнетает светосумму хемилюминесценции модельной системы (светосумма ХЛ модельной системы с добавлением ряженки составила 103,90%).
Таблица Антиокислительные свойства молока (%% от данных модельной системы) Изменение светосуммы ХЛ в модельной системе ПОЛ Вид продукта р* р# n s X ±m Молоко 10 66,61 ± 1,84 5,83 0, нормализованное Молоко 10 74,52 ± 1,82 5,74 0,007 пастеризованное Молоко 10 84,58 ± 1,34 4,22 0,001 0, стерилизованное Кефир 10 70,07 ± 1,70 5,38 0,184 0, Варенец 10 71,18 ± 2,44 7,73 0,153 0, Простокваша 10 69,67 ± 1,68 5,31 0,236 0, «Мечниковская» Ацидофилин 10 68,37 ± 1,71 5,41 0,492 0, Кефирный напиток 10 69,33 ± 2,50 7,90 0,392 0, «Бифидок» Напиток ацидофильный 10 68,56 ± 2,46 7,79 0,533 0, сладкий фруктовый Кефирный напиток 10 67,90 ± 1,09 3,46 0,554 0, сладкий фруктовый Ряженка 10 103,90 ± 2,22 7,02 0,001 0, Примечание: * значения p в сравнении с сырым нормализованным молоком, # значения p в сравнении с пастеризованным молоком, s – стандартное отклонение средней величины Антиокислительная активность пастеризованного, стерилизованного молока и ряженки снижена за счет уменьшения антиоксидантов, прежде всего, антиокислительных ферментов и витаминов, в результате тепловой обработки.
Исследование некоторых компонентов неферментативной антиоксидантной системы Для более детального исследования антиокислительных свойств молочных продуктов, нами определено содержание некоторых неферментативных компонентов антиоксидантной системы.
Как видно из результатов, приведенных в таблице 3, при тепловой обработке и сквашивании снижается содержание аскорбиновой кислоты в молоке и кисломолочных продуктах, что подтверждает литературные данные (Твердохлеб, 2006).
Таблица Содержание в молочных продуктах некоторых неферментативных компонентов антиокислительной защиты ( X ) ±m Содержание Вид продукта n витамина С, доступных SH-групп, ммоль/л мг/100 г Молоко 2,24 ± 0,03 0,16 ± 0, нормализованное 1,41 ± 0,03 0,62 ± 0, Молоко пастеризованное Р1 0,001 Р1 0, 1,33 ± 0,02 0,47 ± 0, Молоко стерилизованное Р1 0,001;
Р2 = 0,069 Р1 0,001;
Р2 0, 1,03 ± 0,03 0,91 ± 0, Кефир Р1 0,001;
Р2 0,001 Р1 0,001;
Р2 0, 0,88 ± 0,04 0,54 ± 0, Варенец Р1 0,001;
Р2 0,001 Р1 0,001;
Р2 = 0, 0,90 ± 0,04 0,56 ± 0, Простокваша «Мечниковская» Р1 0,001;
Р2 0,001 Р1 0,001;
Р2 = 0, 0,97 ± 0,04 0,61 ± 0, Ацидофилин Р1 0,001;
Р2 0,001 Р1 0,001;
Р2 = 0, 0,77 ± 0,04 0,30 ± 0, Ряженка Р1 0,001;
Р2 0,001 Р1 0,001;
Р2 0, Примечание: значения Р1 в сравнении с сырым нормализованным молоком, Р2 – в сравнении с пастеризованным молоком.
Установлено, что в пастеризованном молоке аскорбиновой кислоты содержится на 37,05%, а в стерилизованном – на 40,63% меньше, чем в сыром нормализованном молоке. В кисломолочных продуктах количество витамина С еще больше снижено по сравнению с сырым молоком. Так, содержание аскорбиновой кислоты в кефире на 54,02%;
варенце – на 60,71%;
простокваше «Мечниковской» - на 59,82%;
ацидофилине – на 56,70%;
а в ряженке – на 65,63% ниже, чем в сыром молоке. На снижение витамина С в кисломолочных продуктах, наряду с температурным фактором, оказывают влияние молочнокислые бактерии, которые в процессе своей жизнедеятельности потребляют аскорбиновую кислоту.
Витамин С может обусловливать АОА сырого молока, в то время как, на формирование антиокислительных свойств пастеризованного, стерилизованного молока и кисломолочных продуктов аскорбиновая кислота влияет в меньшей степени.
Определение доступных сульфгидрильных групп выявило (табл. 3), что наибольшее их количество находится в кефире маложирном, наименьшее – в сыром нормализованном молоке. Содержание доступных сульфгидрильных групп в пастеризованном молоке увеличено в 3,88 раза, стерилизованном молоке – в 2, раза, кисломолочных продуктах – в 3,5-3,8 раза, а ряженке – на 87,50% по сравнению с сырым нормализованным молоком. При нагревании освобождаются ранее «скрытые» сульфгидрильные группы, которые в сыром молоке находились внутри глобулы. С увеличением температурного воздействия количество доступных сульфгидрильных групп снижается, так как повышается степень агрегации белковых молекул за счет взаимодействия SH-групп с образованием дисульфидных связей (SS) (Горбатова, 2004). Так, количество доступных сульфгидрильных групп в стерилизованном молоке снижено на 24,19%, варенце – на 12,90%, а в ряженке – на 51,61% по сравнению с пастеризованным молоком.
Содержание тиольных групп в простокваше «Мечниковской» и ацидофилине достоверно не изменено по сравнению с пастеризованным молоком. В кефире доступных сульфгидрильных групп на 46,77% больше, чем в пастеризованном молоке. Данный факт, возможно, объясняется тем, что микрофлора молочнокислых заквасок обладает протеолитической активностью.
Кефир, по сравнению с другими кисломолочными напитками характеризуется большой степенью протеолиза, так как наряду со стрептококковыми формами в нем развиваются молочнокислые палочки и дрожжи, обладающие наиболее сильно выраженной протеолитической активностью (Горбатова, 2004;
Степаненко, 1999). В процессе созревания кефира происходит активный распад белков до пептидов и свободных аминокислот, и поэтому количество доступных сульфгидрильных групп в кефире значительно увеличивается, и, возможно, поэтому его антиокислительные свойства достаточно высоки и не отличаются от сырого нормализованного молока, о чем свидетельствует латентный период ХЛ (табл. 1) и светосумма модельной системы при добавлении кефира (табл. 2).
Проводя сравнение между полученными данными длительности латентного периода ХЛ молочных продуктов и содержанием в них доступных сульфгидрильных групп, можно заметить, что с повышением концентрации SH групп в молочных продуктах увеличивается длительность латентного периода ХЛ, а, значит, увеличивается их антиокислительная активность (рис. 2).
Латентный период ХЛ, сек 40 y = -180,32x + 295,21x - 59, R = 0, 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Содержание доступных SH-групп в молочных продуктах, ммоль/л Рис. 2. Связь между содержанием доступных сульфгидрильных групп и латентным периодом ХЛ молочных продуктов.
Таким образом, возможно, на формирование антиокислительных свойств питьевого молока и кисломолочных продуктов в большей степени оказывает влияние наличие доступных сульфгидгильных групп. Более выраженные антиоксидантные свойства сырого молока (табл. 1, 2) в сравнении с другими молочными продуктами, возможно, объясняются содержанием в нем других антиокислительных компонентов, прежде всего ферментов и витаминов.
Влияние водных экстрактов из растительного сырья на процессы свободнорадикального окисления и антиоксидантную активность молока и кисломолочных продуктов Значительное повышение интенсивности процессов СРО и снижение антиокислительных свойств стерилизованного молока и ряженки в результате тепловой обработки молока побудило нас к поиску средств, восстанавливающих эти полезные качества молочных продуктов.
С целью проверки изменения антиокислительных свойств стерилизованного молока и ряженки, нами использованы водные экстракты из растительного сырья.
Вначале была определена антиокислительная активность различных растительных экстрактов in vitro в %% изменения светосуммы ХЛ модельной системы, в которой инициировали реакции СРО. Исследовали антиокислительную способность водных экстрактов цветков липы, листьев стевии, мелиссы лекарственной, плодов шиповника, зеленого чая и листьев брусники.
Добавление в модельную систему экстрактов растительного сырья вызывало угнетение хемилюминесценции (рис. 3).
Рис. 3. Определение антиокислительной активности экстрактов растительного сырья в модельной системе: 1 – хемилюминесценция модельной системы (ХЛ МС);
2 – ХЛ МС + экстракт цветков липы;
3 – ХЛ МС + экстракт листьев стевии;
4 – ХЛ МС + экстракт мелиссы лекарственной;
5 – ХЛ МС + экстракт плодов шиповника;
6 – ХЛ МС + экстракт зеленого чая;
7 – ХЛ МС + экстракт листьев брусники.
Установлено, что наибольшей антиоксидантной активностью обладают листья брусники, зеленый чай, мелисса лекарственная и плоды шиповника, так как данные экстракты наиболее сильно угнетают свечение модельной системы.
Водный экстракт из листьев брусники снижает светосумму модельной системы на 92,29%;
зеленого чая - на 90,90%;
плодов шиповника – на 57,81%;
мелиссы лекарственной – на 57,14% ( во всех случаях р 0,001). Экстракты, полученные из данного растительного сырья, были выбраны для внесения в стерилизованное молоко и ряженку с целью повышения их антиокислительных свойств.
Как показало хемилюминесцентное исследование, добавление водных экстрактов из растительного сырья ведет к снижению интенсивности процессов СРО, повышению антиокислительной активности стерилизованного молока и ряженки, что подтверждается изменением показателей свечения (табл. 4).
Таблица 2+ Параметры Fe -индуцированной хемилюминесценции стерилизованного молока с водными экстрактами из растительного сырья ( X ) ±m Латентный период, Вид продукта Светосумма, у.е·мин сек Молоко стерилизованное + дистиллированная вода 26,14 ± 1,66 24,11 ± 0, (n=10) Молоко стерилизованное + 46,02 ± 1,02 6,36 ± 0, экстракт мелиссы Р 0,001 Р 0, лекарственной (n=10) Молоко стерилизованное + 31,02 ± 1,08 13,92 ± 0, экстракт плодов шиповника Р = 0,021 Р 0, (n=10) Молоко стерилизованное + 57,51 ± 1,61 6,92 ± 0, экстракт зеленого чая Р 0,001 Р 0, «Принцесса Ява» (n=10) Молоко стерилизованное + 59,58 ± 1,45 7,31 ± 0, экстракт листьев брусники Р 0,001 Р 0, (n=10) Примечание: значения Р в сравнении с показателями стерилизованного молока с дистиллированной водой Так, светосумма ХЛ стерилизованного молока с экстрактами из мелиссы лекарственной;
зеленого чая и листьев брусники на 70-74% ниже, в сравнении с данными, полученными при изучении стерилизованного молока с дистиллированной водой. Минимальное уменьшение светосуммы (на 42,26%) наблюдается при добавлении в стерилизованное молоко экстракта из плодов шиповника. Латентный период ХЛ стерилизованного молока при добавлении экстракта листьев брусники и зеленого чая увеличивается в 2,2 раза;
мелиссы лекарственной – на 76,05%;
плодов шиповника – на 18,67%.
Добавление растительных экстрактов к ряженке ведет к снижению интенсивности ее ХЛ (рис. 4). Наибольший антиокислительный эффект достигается при добавлении к ряженке экстрактов из листьев брусники и зеленого чая, наименьший – при добавлении экстракта шиповника.
Рис. 4. Показатели хемилюминесценции ряженки с добавками: 1 – с дистиллированной водой;
2 – с экстрактом плодов шиповника;
3 – с экстрактом мелиссы лекарственной;
4 – с экстрактом зеленого чая;
5 – с экстрактом листьев брусники.
Антиокислительные свойства стерилизованного молока и ряженки с добавлением водных экстрактов из выбранного растительного сырья также исследовали на модельной системе желточных липопротеинов.
Экспериментальные данные показали, что при добавлении растительных экстрактов, антиоксидантная активность стерилизованного молока значительно повышается. Снижение светосуммы ХЛ модельной системы при добавлении стерилизованного молока с листьями брусники составляет 52,24% (р 0,001);
зеленого чая – 50,85% (р 0,001);
мелиссы лекарственной – 31,12% (р 0,001);
плодов шиповника – 22,81% (р 0,001).
При добавлении к ряженке экстрактов зеленого чая и листьев брусники проявляется антиокислительная активность, так как светосумма ХЛ модельной системы снижается на 43-47%, чего не наблюдается в смеси ряженки с экстрактами из мелиссы лекарственной (p = 0,263) и плодов шиповника (p = 0,133).
Различное влияние растительных экстрактов на антиокислительную активность стерилизованного молока и ряженки возможно объясняется более высокой интенсивностью перекисного окисления липидов ряженки. Как показало исследование Fe2+-индуцированной хемилюминесценции данных молочных продуктов, параметры свечения ряженки значительно выше стерилизованного молока (рис. 5).
Рис. 5. Хемилюминограммы: 1 – стерилизованного молока;
2 – ряженки.
Так, амплитуда быстрой вспышки ХЛ ряженки в 7,62 раза (p 0,001) выше, латентный период времени меньше на 31,51% (p 0,001), максимальная светимость в 9,62 раза выше (p 0,001), а светосумма увеличена в 10,66 раза (p 0,001).
Таким образом, добавление растительных экстрактов в стерилизованное молоко и ряженку повышает антиокислительные свойства данных молочных продуктов в модельной системе, особенно в присутствии экстрактов зеленого чая и листьев брусники.
Обобщая вышеизложенное, можно сказать, что в результате тепловой обработки теряются антиоксидантные свойства молочных продуктов, прежде всего за счет снижения активности антиокислительных ферментов, содержания витаминов и увеличения продуктов перекисного окисления липидов. Тепловая обработка также влияет на активность тиол-зависимых компонентов антиоксидантной защиты. Первоначально температурная обработка ведет к увеличению содержания доступных сульфгидрильных групп за счет денатурации, а с повышением термического воздействия их количество снижается, так как повышается степень агрегации белковых молекул за счет взаимодействия тиольных групп с образованием дисульфидных связей.
Добавление экстрактов из растений в молочные продукты способствует торможению свободнорадикальных процессов в них, повышению их антиокислительных свойств, и, как следствие, увеличению их биологической ценности.
Результаты исследований расширяют представления о состоянии процессов СРО и антиокислительной системе различных молочных продуктов и обосновывают возможность повышения их антиокислительных свойств.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что интенсивность свободнорадикальных процессов по данным железоиндуцированной хемилюминесценции повышается в стерилизованном молоке и кисломолочных продуктах, особенно в ряженке.
2. Показано, что максимальной антиоксидантной активностью на модели липопротеинов куриного желтка обладает сырое нормализованное молоко, минимальной – стерилизованное молоко. Кисломолочные продукты, за исключением ряженки, оказывают такое же антиоксидантное действие в модельной системе, как и сырое молоко. Ряженка не угнетает светосумму ХЛ модельной системы.
3. Сырое молоко характеризуется большим содержанием аскорбиновой кислоты в сравнении с другими исследованными молочными продуктами.
Наибольшее количество сульфгидрильных групп находится в кефире, наименьшее – в сыром нормализованном молоке. На формирование антиокислительных свойств кисломолочных продуктов в большей степени оказывает влияние наличие большого количества доступных SH-групп.
4. Выявлено, что среди изученных водных растительных экстрактов наиболее высокую антиокислительную активность в модельной системе проявляют зеленый чай, листья брусники, мелисса лекарственная и плоды шиповника.
5. Водные экстракты из растительного сырья существенно снижают интенсивность процессов СРО стерилизованного молока и ряженки под действием ионов Fe2+ и повышают антиокислительные свойства данных молочных продуктов в модельной системе. Максимальный антиокислительный эффект достигается при добавлении к стерилизованному молоку и ряженке водных экстрактов из листьев брусники и зеленого чая, минимальный – при добавлении экстракта шиповника.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Лазарева О. Н. Антиокислительные свойства молочных продуктов // Инновационные технологии производства и переработки сельскохозяйственной продукции : к 85 – летию образования Института заочного обучения и повышения квалификации ОмГАУ : Материалы научно-практической конференции. – Омск :
издательство ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2006. – С. 226 – 229.
2. Лазарева О. Н. Хемилюминесцентный анализ кисломолочных продуктов / О. Н. Лазарева, В. Е. Высокогорский, Т. Д. Воронова // Сборник материалов Международной научно-практической конференции «Интеграция науки и образования – решающий фактор устойчивого развития государства». – республика Казахстан, г. Семипалатинск, 2006. – С. 386 – 390.
3. Лазарева О. Н. Сравнительная характеристика антиоксидантной активности некоторых кисломолочных продуктов / О. Н. Лазарева, В. Е.
Высокогорский // Сборник материалов V специализированного конгресса «Молочная промышленность Сибири». – Барнаул, 2006. – С. 83 – 85.
4. Лазарева О. Н. Кисломолочные продукты с повышенными антиоксидантными свойствами / О. Н. Лазарева, Т. Д. Воронова, В. Е.
Высокогорский, Г. П. Ковтуновская // Молочная отрасль Сибири : Международный сборник материалов научных чтений, посвященных 90-летию со дня рождения профессора Николая Семеновича Панасенкова и 90-летию ОмГАУ. – Омск : ООО ИПЦ «Сфера», 2007. – С. 79 – 81.
5. Лазарева О. Н. Пути повышения антиокислительных свойств стерилизованного молока / О. Н. Лазарева, В. Е. Высокогорский // Вятский медицинский вестник : Специальный выпуск : Материалы Всероссийской научно практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии», посвященной 20-летию Кировской государственной медицинской академии. – Киров, 2007. – С. 192 – 193.
6. Высокогорский В. Е. Экстракты растительного сырья, снижающие окисление молочных продуктов / В. Е. Высокогорский, О. Н. Лазарева // Молочная промышленность. – 2007. - № 10. – С. 83 – 84.
7. Лазарева О. Н. Роль сульфгидрильных групп в формировании антиокислительных свойств молока и кисломолочных продуктов / О. Н. Лазарева, В. Е. Высокогорский // Биотехнологические системы как один из инструментов реализации «Государственной программы развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2008-2012 годы» : материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 5-летию со дня основания факультета биотехнологии, товароведения и экспертизы товаров. – Пос. Персиановский, ДонГАУ, 2008. – С. – 100.
8. Лазарева О. Н. Влияние водных экстрактов из растительного сырья на окислительные свойства молочных продуктов / О. Н. Лазарева, В. Е.
Высокогорский, Т. Д. Воронова // Труды Кубанского государственного аграрного университета. – 2008. - № 2(11). – С. 182 – 186.
9. Лазарева О. Н. Характеристика антиокислительных свойств различных видов молока и кисломолочных продуктов / О. Н. Лазарева, В. Е. Высокогорский // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов : Сборник трудов. – Новосибирск : издательство «Арта», 2008. – С. 378.
10. Метод повышения антиоксидантной активности молочных продуктов :
информ. листок № 55-018-08 / ОмЦНТИ ;
сост. : О. Н. Лазарева, В. Е.
Высокогорский, Т. Д. Воронова. – Омск : [б. и.], 2008. – 2 с.
11. Лазарева О. Н., Высокогорский В. Е., Воронова Т. Д. Свидетельство на интеллектуальный продукт «Метод повышения антиоксидантной активности молочных продуктов», № 73200700038 зарегистрирован ФГУП «ВНТИЦ» апреля 2007 г.
12. Лазарева О. Н., Высокогорский В. Е., Воронова Т. Д. Свидетельство на интеллектуальный продукт «Методика регистрации железоиндуцированной хемилюминесценции кисломолочных продуктов», № 73200800086 зарегистрирован ФГУП «ВНТИЦ» 11 сентября 2008 г.