Физиологическая роль немышечных миозинов в подвижности клеток
На правах рукописи
Ненашева Татьяна Анатольевна Физиологическая роль немышечных миозинов в подвижности клеток 03.00.13 - физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Екатеринбург – 2008 2
Работа выполнена на кафедре физиологии человека Уральского государственного университета им. А.М. Горького и в Национальном Институте Медицинских Исследований, Лондон, Великобритания.
Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук, профессор, Юшков Борис Германович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Бершицкий Сергей Юрьевич доктор медицинских наук, профессор Сторожок Сергей Анатольевич
Ведущая организация: ИТЭБ РАН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики», г. Пущино
Защита состоится «_» 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 004.027.01 при Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу: 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, д.106.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН по адресу: 620041 г. Екатеринбург, ГСП-593, ул. Софьи Ковалевской /Академическая, 22/20, с авторефератом - на официальном сайте Института иммунологии и физиологии УрО РАН - http: // www. iip. uran. ru.
Автореферат разослан «» 2008 года.
Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., проф. И.А. Тузанкина Введение Актуальность проблемы. Клеточная подвижность является фундаментальным биологическим процессом, который необходим для миграции клеток при эмбриональном развитии, формирования иммунного ответа, заживления ран и многих других жизненно важных физиологических функций многоклеточных и одноклеточных организмов.
Подвижность клеток зависит от их способности активно перестраивать свой актиновый филаментарный цитоскелет. Важнейшую роль в этом процессе выполняют актинсвязывающие моторные белки – миозины. Вместе с тем роль миозинов в обеспечении физиологических функций и сегодня остается одной из актуальных и вместе с тем наименее исследованных проблем современной физиологии. Во многом это связано с гетерогенностью данного класса белков, очень низким содержанием их в клетках, и тем, что многие из них открыты лишь в последние годы.
Благодаря огромному количеству работ посвященных мышечному сокращению [Бэгшоу С., 1985, Леднев В. В., 1983, Подлубная З. А., 1978, Поглазов Б. Ф., 1982] миозин, выделенный из скелетных мышц (или миозин-2), является одним из самых хорошо изученных белков. Однако, в конце восьмидесятых годов стали появляться сообщения о том, что мышечный миозин является лишь одним из классов семейства миозинов [Mooseker M.S., 1995]. В настоящее время уже известно 19 классов немышечных миозинов и их число продолжает пополняться. Миозины обнаружены в клетках самых разнообразных тканей животных и растений, а их функции так же разнообразны [Mooseker M.S., 1995, Oliver T.N., 1999, Sellers J.R., 2000]. Они играют важную роль в поддержании формы клеток и клеточной подвижности (миозины 1e, 2a, 2b, 10), внутриклеточном транспорте (миозины 5, 6, 11), слухового восприятия (миозины 1с, 7а) [Mooseker M.S., 1995] и других процессах. Мутации генов, кодирующие специфические миозины приводят к глухоте, слепоте, онкологическим и другим заболеваниям [Montel C., 1988, Mooseker M.S., 1995, Frank 2004, Self T., Sobe T., 1999, Titus M., 2000].
Главной чертой, объединяющей миозины, является наличие «головного» домена, который может циклически связываться с актиновыми филаментами, и превращать химическую энергию гидролиза АТФ в механическую работу. В то же время «хвостовые» домены немышечных миозинов обладают значительным разнообразием, что позволяет им связываться с разнообразными белками и специализированными фосфолипидами. Наличие специализированных хвостовых доменов, а также вариации в скорости гидролиза АТФ и присоединения/отсоединения от актина определяют специфические клеточные функции немышечных миозинов.
Особый интерес представляют немышечные миозины, присоединяющиеся к клеточной мембране, подвижность которых существенно влияет на физиологическое состояние последней.
Одной из главных трудностей изучения немышечных миозинов является их исключительно низкая концентрация в клетках. Так, например, в отличие от хорошо изученного мышечного миозина-2 (40% от всех белков в скелетных мышцах), концентрация миозина-10 составляет всего несколько сотен молекул на клетку [Berg J.S., 2000, 2002]. Поэтому визуализация миозинов представляется важной задачей.
Для исследования функций немышечных миозинов “in vivo” используют иммуно окраску фиксированных клеток или трансфецируют клетки ДНК исследуемого миозина, соединенного с ДНК флуоресцентного белка для последующей визуализации миозинов в живых клетках. Однако, для обнаружения флуоресцентного сигнала методами эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии необходимо поддерживать исключительно высокий уровень трансфекции, во много раз превышающий физиологический.
Очевидно, что для исследования функций миозинов необходимо изучить подвижность и распределение одиночных молекул немышечных миозинов при физиологических концентрациях в живых клетках. Одним из методов, подходящих для визуализации отдельных молекул немышечных миозинов, помеченных флуоресцентным белком GFP и сравнения подвижности немышечных миозинов на поверхности мембраны эукариотических клеток с разным уровнем подвижности, является использование флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (ФМПВО) [Mashanov G.I., 2004].
Цель исследования: Цель данной работы - изучить динамику перемещения одиночных молекул немышечных миозинов на поверхности клеточной мембраны, влияние их подвижности на клеточные функции, связанные с перестроением цитоскелета и установить взаимосвязь между подвижностью индивидуальных молекул немышечных миозинов и подвижностью клеток.
Задачи исследования:
1. Изучить различия в подвижности фибробластов и эндотелиальных клеток с использованием темнопольной микроскопии низкого увеличения и замедленной видеосъемки, комбинированной с автоматической трассировкой отдельных клеток.
2. Используя два типа клеток, фибробласты мыши и эндотелиальные клетки, исследовать влияние температуры на свойства клеточной мембраны и на динамику подвижности немышечных миозинов.
3. Исследовать присоединение одиночных молекул миозинов 1е, 2b, 6, 7а и 10 к базальной мембране клеток с различной подвижностью и изучить их специфическое распределение в зависимости от класса миозина.
4. Исследовать латеральную подвижность молекул с использованием методов автоматической детекции и определения пространственных координат одиночных молекул немышечных миозинов 1е, 2b, 6, 7а и 10 на последовательностях изображений базальной мембраны живых клеток.
5. Изучить отдельные функциональные домены миозина-10 (плекстрин гомологичные домены - ПГ12, ПГ123 и MyTH4-FERM-домен) для исследования деталей связывания миозина-10 с клеточной мембраной и его последующего перераспределения в филоподии.
Научная новизна. Разработан новый метод автоматической трассировки отдельных клеток, перемещающихся по поверхности субстрата, используя темнопольную микроскопию с замедленной съемкой, для изучения подвижности клеток.
Впервые в мировой практике исследованы одиночные молекулы нескольких классов немышечных миозинов, которые могут прикрепляться к мембране живых клеток. Получена детальная информация о пространственно-временной динамике мембаносвязывающихся миозинов 1е, 6, 7а и 10, а также миозина-2b, который связывается не с плазматической мембраной, а со стрессовыми актиновыми волокнами.
Доказано, что подвижность миозинов зависит от класса миозина, от типа клеток, и в некоторых случаях, от температуры. Обнаружено, что в эндотелиальных клетках существует две популяции молекул миозина-1е и ПГ12, ПГ123 доменов миозина-10, а именно - подвижная и неподвижная фракции. Впервые показано, что молекулы миозина-6 могут связываться с плазматической мембраной, а не только с мембраной везикул в цитоплазме клетки. Доказано, что абсолютное большинство молекул миозина-7а практически неподвижны на мембране, поскольку прикрепляются к трансмембранным белкам, прочно связанным с внеклеточным субстратом, однако, небольшая часть молекул может «плавать» на поверхности мембраны, следуя законам неограниченной диффузии в двухмерном пространстве.
Показано, что перераспределение молекул на плазматической мембране может быть достигнуто как за счет перемещения молекул, прикрепленных к мембране, так и за счет динамического связывания молекул с клеточной мембраной, когда распределение молекул обусловлено их отсоединением и прикреплением на новом участке мембраны, а не только, и часто не столько, латеральной подвижностью.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Получены новые сведения о роли немышечных миозинов в изменении цитоскелета клетки, раскрывающие ранее не исследованные механизмы клеточной подвижности.
Установлено, что температура оказывает существенное влияние на зависимую от немышечных миозинов перестройку цитоскелета.
Теоретически обоснована методология исследования отдельных молекул на клеточной мембране (визуализация + автоматическая детекция), что позволяет изучать многочисленные физиологические и патологические процессы, развивающиеся в непосредственной близости от мембраны или в самой мембране.
Разработан новый метод исследования подвижности клеток, который может быть применен для широкого круга физиологических исследований разных клеток, позволяющий изучать характер движения индивидуальных клеток.
Положения, выносимые на защиту.
1. Клеточная подвижность зависит от скорости перестроения цитоскелета у разных типов клеток, подвижность фибробластов при 37°С в 5 раз ниже подвижности эндотелиальных клеток.
2. Метод Флуоресцентной Микроскопии Полного внутреннего отражения (ФМПВО) позволяет визуализовать одиночные молекулы миозинов-1е, 6, 7а, присоединяющиеся к базальной мембране живой клетки.
3. Латеральная подвижность немышечных миозинов, прикрепляющихся к плазматической мембране, зависит не только от класса миозина, но и от свойств плазматической мембраны (типа клеток) а также, в некоторых случаях, от температуры.
4. Каждый из миозинов (1е, 6, 7а, 10) имеет свое специфическое место локализации и функционирования в клетке.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были апробированы на конференции «European Muscle Congress» (о. Эльба, Италия) 12-15 сентября 2004 г.;
на конференции «Biological motility: Basic research and practice» (г. Пущино) 11- мая 2006 г;
на ежегодной конференции биофизического общества в Балтиморе (США) (51 Biophysical Society Annual Meeting, Baltimore) 6-10 марта 2007 г. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК -1 печатная работа.
Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы могут быть использованы для исследования различных процессов в иммунологии и патологической физиологии. В настоящее время результаты диссертации используются в отделе физической биохимии национального института медицинских исследований (Лондон, Великобритания) для анализа подвижности изолированных клеток, мигрирующих на поверхности субстрата, и для оценки подвижности одиночных флуоресцирующих молекул, присоединенных к базальной мембране исследуемых клеток.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической и двух экспериментальных глав, обсуждения результатов, заключения и списка литературы из 161 наименования. Диссертация изложена на 155 страницах, включая 45 рисунков.
Методы исследования Исследования проведены с использованием культуры клеток мышиных фибробластов 3Т3 и эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). Для изучения подвижности клеток использовано по 3000 клеток каждого вида при 23?С и 37?С. Для изучения каждого класса миозина и субфрагментов миозина- использовано по 10 трансфецированных фибробластов и эндотелиальных клеток, на мембране которых находилось от 1000 до 5000 флуоресцентных молекул миозинов.
Исследуемые клетки помещали в стандартную проточную камеру, которая заполнялась раствором солей Ханкса (рН 7.4), смешанным с сывороткой плодов телят (Sigma-Aldrich, Великобритания) и устанавливали на столик микроскопа в инкубаторе. Измерения подвижности клеток проводили при 23С и 37С. Для автоматической трассировки миграции клеток по поверхности субстрата использовалась темнопольная микроскопия низкого увеличения с замедленной видеосъемкой в течение 36 часов. Последовательности изображений записаны с использованием аналоговой видеокамеры WAT902H и обработаны с использованием алгоритма автоматической трассировки отдельных частиц (ASPT) [Mashanov G.I., 2007] в программном пакете GMimPro. Полученные траектории движения клеток объединялись для получения усредненных значений среднеквадратичного перемещения (СКП) при данном временном интервале между измерениями. Также измерялась средняя скорость движения клеток при заданном временном интервале между измерениями.
Для визуализации одиночных молекул немышечных миозинов фибробласты (3Т3) и эндотелиальные клетки (HUVEC) трансфецировали ДНК миозинов 1е, 2b, 6, 7а и 10, а также субфрагментами миозина 10 (безголовым миозином-10, плекстрин гомологичными доменами и MyTH4-FERM доменами хвоста миозина-10), соединенными с ДНК одной молекулы GFP. ДНК химер полноразмерного миозина 10, субфрагментов миозина-10, миозинов 1е, 2b, 6 и 7, были приготовлены в лаборатории университета Лидса и в лаборатории физической биохимии Национального Института Медицинских Исследований методом полимеразо цепной реакции. Для экспериментов использовали раствор ДНК с концентрацией 1 мг/мл.
Трансфекции фибробластов проводили реагентом GeneJjuice (Novagen, Великобритания) с культурой, выращенной в течение 24-72 часов, с оптимальной плотностью 50-80% соприкосновения клеток. Перед процедурой трансфекции клетки снимали с поверхности и доводили их концентрацию до 1х105 клеток на миллилитр среды. Трансфекция HUVEC проводилось методом электропорации. Для трансфекций клеток при воздействии электрического тока использовался нуклеофекторный буферный раствор фирмы Amaxa (http://www.amaxa.com).
Для прижизненного изучения миозинов на базальной мембране клеток использовалась установка флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (ФМПВО), в которой использовался голубой лазер Proterra (488 нм, мВ). Луч лазера был увеличен в диаметре с помощью 16-кратного телескопа и сфокусирован в обратной фокальной плоскости объектива (Zeiss, alfa-plan, 100, NA1.45) у края последней линзы для создания эффекта полного внутреннего отражения. Этот же объектив использовался для сбора флуоресцентного сигнала от молекул, расположенных в фокальной плоскости объектива. Для записи последовательности изображений использовалась цифровая видеокамера с электронным усилением сигнала iXon897BV (Andor, Ирландия).
Метод ФМПВО позволяет возбуждать свечение флуоресцентных молекул только в тонком слое на границе раздела двух сред с разным коэффициентом преломления света стекло-вода). Флуоресцентные молекулы, (например, прикрепленные к базальной мембране клетки на границе раздела сред, находятся в слое интенсивного освещения ( 100 нм), а остальные части клетки - в темноте, что позволяет улучшить соотношение сигнал/шум для процесса детекции одиночных флуоресцентных молекул.
Для идентификации одиночных молекул на мембране клетки использовались два алгоритма - один для детекции неподвижных молекул, другой для идентификации и трассировки подвижных молекул. Автоматическая детекция неподвижных флуоресцентных молекул проводилась с использованием модуля в компьютерной программе SFDA GMimPro [Mashanov G.I., 2007] (www.nimr.mrc.ac.uk/GMimPro). Для автоматической детекции и последующего вычисления координат флуоресцентных молекул, перемещающихся (плавающих) по поверхности мембраны, использовался модуль ASPT, также реализованный в вышеупомянутой программе GMimPro (Рисунок 1). Следует отметить, что идентификация движущихся молекул сложнее, чем детекция неподвижных молекул, поскольку мгновенное прекращение флуоресценции не может быть использовано как критерий для положительной идентификации отдельных движущихся молекул.
Подвижность молекул, хаотично движущихся в 2-х мерном пространстве, описывается коэффициентом латеральной диффузии (Dlat), который полностью аналогичен коэффициенту диффузии (D) и вычисляется по формуле:
Dlat = CKП / (4t), где t – интервал между измерениями, а СКП - среднее квадратичное перемещение, вычисляемое по сумме квадратов перемещений объекта за интервал 1 i N между измерениями:
{( xi xi1 )2 ( yi yi 1 ) 2} CKП N 1 i А Б Рисунок 1 - Результат работы метода ASPT.
Примечание: А – Изображение эндотелиальной клетки, трансфецированной ПГ123 GFP. Видны одиночные молекулы, координаты которых могут быть определены с точностью до 1/10 размера пикселя. Б – результат трассировки траекторий одиночных флуоресцирующих молекул методом ASPT. Использование автоматической трассировки позволяет одновременно отслеживать сотни молекул, чьи траектории перекрываются в пространстве.
Результаты и обсуждение результатов Подвижность фибробластов и эндотелиальных клеток.
Различия в подвижности клеток связывают со многими факторами, в большой степени скорость миграции клеток зависит от перестроения актинового цитоскелета клетки, важнейшее влияние на цитоскелет оказывает наличие или отсутствие А Б Рисунок 2 - Траектории движения клеток по поверхности субстрата.
Примечание: Замедленная съемка в темнопольной микроскопии низкого разрешения. Время съемки 15 часов, интервал между кадрами 5 минут, температура 37°С. А – фибробласты 3Т3. Б – эндотелиальные клетки (HUVEC).
определенных классов миозинов. Строение и состав фосфолипидов и белков, встроенных в клеточную мембрану также могут влиять на миграцию клеток и строение актинового цитоскелета.
Полученные данные свидетельствуют, что фибробласты и эндотелиальные клетки, сохраняя свою форму, продолжают мигрировать по поверхности субстрата в течение нескольких суток после помещения в камеры для видеосъемки. При этом скорость движения возрастает в течение 10-12 часов после прикрепления клеток к покровному стеклу.
Показано, что подвижность эндотелиальных клеток (Dmob) при 37С в пять раз превышает подвижность фибробластов (3.35 м2 мин-1 и 0.62 м2 мин-1) (Рисунок 2).
При снижении температуры до 23С подвижность эндотелиальных клеток уменьшается до 0.7 м2 мин-1 (Рисунок 3), а фибробласты прекращают мигрировать по поверхности субстрата. Несмотря на прекращение миграции, фибробласты 0. Линейная скорость (µм мин-1) 0. 0. 0. 37°С 0. 0. 0 600 1200 1800 2400 3000 Время (мин) Рисунок 3 - Влияние температуры на линейную скорость движения эндотелиальных клеток по поверхности субстрата Примечание: Через 15 часов после начала эксперимента температура в инкубаторе микроскопа была повышена с 23°С до 37°С. Через 24 часа после этого температура была опущена опять до 23°С. Средняя линейная скорость составляет 0.15 м мин-1 при 23°С и 0. м мин-1 при 37°С (скорость съемки 12 кадров час-1, интервал между парами измерений - 1 час).
продолжают формировать ламеллы по краям клетки и сохраняют прочную связь с субстратом, что является доказательством физиологической активности и жизнеспособности исследуемых клеток.
Динамика подвижности немышечных миозинов 1е, 2в, 6, 7а и 10 на мембране живых клеток.
Миозин-1е - в начальной стадии синтеза миозина-1е наблюдалось равномерное распределение одиночных молекул на плазматической мембране, а со временем Рисунок 4 - Активное выдвижение ламеллы у фибробласта, трансфецированного миозином-1е Примечание: Край ламеллы сдвигается на 4 ?м за 100 секунд (2.4 ?м мин-1).
миозин-1е локализовался в местах клеточных выпячиваний (ламелл) (Рисунок 4), что свидетельствует о его непосредственном участии в процессе формирования и выдвижения ламеллы.
Значительная степень подвижности одиночных молекул миозина-1е в фибробластах и эндотелиальных клетках (усредненная латеральная подвижность (Dlat) при 37°С 0.1м2 с-1 и 0.18м2 с-1) свидетельствует о том, что он прикрепляется к фосфолипидам или белкам, плавающим на поверхности мембраны.
Присоединение миозина-1е к мембране до начала взаимодействия с актином имеет биологический смысл, поскольку присоединенные молекулы уже правильно ориентированы относительно актина [Axelrod D., 1992]. Кроме того, они сохраняют значительную степень подвижности и могут перемещаться к краю ламеллы в результате 2-х мерной диффузии на мембране. Как и в случае миозина-10, описанного ниже, можно предположить, что первоначальное связывание молекулы с подвижными элементами мембраны приводит к концентрации миозинов в специфических местах клетки – в филоподиях в случае миозина-10, и ламеллоподиях в случае миозина-1е.
Миозин-2b обнаружен в составе актиновых стрессовых волокон, связывающих удаленные части клетки [Kolega J., 1998]. При исследовании методом ФМПВО не было выявлено ни одиночных молекул, ни кластеров миозина-2b на поверхности плазматической мембраны, что подтверждает теорию о строго ограниченной локализации миозина-2b на стрессовых волокнах. 75% объектов, идентифицированных как миозин-2b, неподвижны, а ограниченная подвижность остальной фракции может быть объяснена влиянием шума на измерения координат объектов. Средняя подвижность составляет 0.015 м2 с-1, что близко к уровню пространственного шума, генерируемого при исследовании одиночных молекул GFP, прикрепленных к поверхности стекла через специфичные антитела.
Миозин-6 прочно связывался с мембраной везикул (Рисунок 5А), что соответствует представлениям об этом белке, как о биологическом моторе, ответственном за внутриклеточный транспорт [Wells A.L., 1999]. Некоторые из везикул перемещались вдоль актиновых филаментов во время видеосъемки.
В то же время, методом ФМПВО, обнаружена существенная фракция одиночных молекул миозина-6, связывающихся с плазматической мембраной.
Большинство молекул неподвижны (Рисунок 5Б, 5В), что свидетельствует о их присоединении или к неподвижным белкам на мембране, или присоединении одновременно и к мембране, и к цитоскелету клетки. Некоторые молекулы демонстрировали сложный тип подвижности – свободное движение с длительными остановками. Можно предположить, что миозин-6 участвует в ранних стадиях эндоцитоза или его присутствие на мембране необходимо для выполнения функций прикрепления клеток к субстрату [Millo H. 2004]. В большинстве случаев концентрация миозина-6 на мембране везикул значительно выше, чем на А А Б В 37°С Встречаемость (%) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0. Dlat (µm2 c-1) Рисунок 5 - Миозин-6 на плазматической мембране Примечание: А – Везикулы, помеченные миозином-6 в фибробласте Б - Одиночные молекулы миозина-6 на мембране фибробласта. Изображения получены методом ФМПВО.
В – распределение коэффициентов латеральной диффузии миозина-6 на мембране эндотелиальных клеток (черная линия) и фибробластов (серая линия).
плазматической мембране. До настоящего времени не известно, каким образом миозин-6 прикрепляется к своему грузу и, как это обнаружено в данной работе, к мембране клетки.
Появление миозина-7а на плазматической мембране вполне закономерно, поскольку его хвостовая часть состоит из двух пар MyTH4-FERM доменов, которые присоединяются к интегринам и другим трансмембранным белкам. Подвижность миозина-7а на плазматической мембране близка к нулю и в фибробластах, и в эндотелиальных клетках, что свидетельствует о том, что миозин-7а может присоединяться к нескольким «якорным» белкам одновременно, поскольку молекулы, состоящие из хвостовой части миозина-10 (одна пара MyTH4-FERM доменов и GFP) была более подвижна. Тем не менее, видеосъемка с чередованием периодов освещения и темноты свидетельствует о регулярном восстановлении числа флуоресцирующих молекул на базальной мембране после периодов темноты, когда обесцвеченные молекулы могут обменяться на флуоресцирующие молекулы из неосвещенных частей клетки (Рисунок 6). Следовательно, миозин-7а имеет флуоресценции (350 м ) Усредненный уровень 0 20 40 60 Время (с) Рисунок 6 - Восстановление уровня флуоресценции после темновых периодов в фибробласте, трансфецированном флуоресцирующим миозином- Примечание: 2-х минутные периоды темноты (перерывы в записи) отмечены вертикальными линиями.
существенную скорость диссоциации от трансмембранных белков, поскольку он не может обмениваться с неосвещенными частями клетки посредством латеральной диффузии из-за очень ограниченной подвижности, в то время пока молекулы присоединены к мембране клетки. Подобный способ обмена был описан ранее при изучении одиночных молекул ПГ123 миозина-10 в миобластах мыши [Mashanov G.I.
2004].
Миозин-10 и его субфрагменты. Миозин-10 состоит из головной части, способной присоединяться к актиновым филаментам и нескольких хвостовых доменов. В частности, плекстрин гомологичных доменов ПГ12 и ПГ3, которые связываются со специфическими фосфоиноцитолами PIP2 и PIP3, входящими в состав клеточных мембран. Миозин талин гомологичный домен и эризин-радиксин моэзин домен (MyTН4-FERM) находятся в хвосте миозина-10, (аналогично двойная последовательность этих доменов находится в хвосте миозина-7а).
Эксперименты с одиночными молекулами ПГ12 и ПГ123 свидетельствуют о существенных различиях в подвижности специализированных фосфоиноцитолов на мембране фибробластов и эндотелиальных клеток, где молекулы значительно более А 30 Б 37C 37C 25 ПГ12-HUVEC ПГ12-Fibro Встречаемость (%) Встречаемость (%) 35 ПГ3-Fibro 20 ПГ123-HUVEC - - - ПГ123-Fibro 15 10 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0. 2 -1 2 - D lat (µm c ) D lat (µm c ) Рисунок 7 - Сравнительная характеристика подвижности ПГ12, ПГ123 и ПГ доменов на мембране эндотелиальных клеток (А) и фибробластов (Б) при 37С подвижны (Рисунок 7). ПГ12 домен значительно менее подвижен на мембране фибробластов в сравнении с эндотелиальными клетками. Более того, у эндотелиальных клеток существуют две хорошо разделенные фракции молекул – подвижная и неподвижная (Рисунок 7а). В то же время у фибробластов наблюдается только одна фракция молекул, а распределение имеет экспоненциальную форму (Рисунок 7б), за исключением ПГ12 при температуре 23С, где заметно разделение фракций на подвижную и неподвижную. Следует отметить, что и экспоненциальное и двухмодовое распределение коэффициентов латеральной подвижности не соответствует классическому распределению для объектов, свободно диффундирующих в двухмерном пространстве [Saxton M.J. 1997]. Подобный результат также получен при изучении подвижности одиночных молекул полноразмерного миозина-1е, который имел значительный уровень подвижности и бимодальное распределение коэффициентов латеральной подвижности на мембране эндотелиальных клеток.
ПГ домены имеют достаточно ограниченное время связывания с фосфоиноцитолами мембраны и, следовательно, [Mashanov G.I., 2004] биохимическое изучение специфичности связывания разных ПГ доменов с фосфоиноцитолами PIP2 и PIP3 затруднено. Однако, поскольку подвижность ПГ3 в эндотелиальных клетках значительно меньше подвижности ПГ12 (Рисунок 7а) можно сделать вывод, что ПГ12 и ПГ3 домены присоединяются к различным фосфоиноцитолам. Согласно литературным данным фософиноцитол-4,5 бифосфат имеет ограниченную подвижность на мембране миоцитов предсердия [Cho H., 2005]. Следовательно, можно предположить, что ПГ3 присоединяется к PIP2, а ПГ к PIP3. Подвижность ПГ123 доменов лежит в промежутке или близка к подвижности ПГ12 или ПГ3 доменов. Следовательно, ПГ123 молекулы имеют два функциональных ПГ домена, которые могут присоединяться как к PIP2, так и к PIP молекулам в зависимости от их доступности на мембране клетки.
Наличие быстро и медленно движущихся молекул ПГ12 и ПГ123 доменов в эндотелиальных клетках подтверждает теорию «липидных плотиков», согласно которой в микро-участках мембраны, богатых холестерином вязкость значительно больше и подвижность молекул фосфолипидов, в частности фосфоиноцитолов, к которым прикрепляются ПГ домены, значительно ниже [Orr G., 2005]. Поскольку ПГ3 молекулы обладают значительно меньшей подвижностью, чем ПГ12, можно предположить, что фосфоиноцитолы-PIP2 сконцентрированы в богатых холестерином липидных плотиках в отличие от PIP3, которые равномерно распределены в мембране клетки.
Подвижность MyTН4-FERM доменов мала и близка к подвижности безглавого миозина-10 (0.045 м2 с-1), полноразмерного миозина-10 (0.038 м2 с-1) и миозина-7а (0.04м2 с-1). Можно сделать заключение, что большинство молекул MyTH4-FERM присоединяется к трансмембранным белкам, которые, в свою очередь прикреплены к экстраклеточному матриксу или к субстрату. Незначительная фракция одиночных MyTН4-FERM молекул могла «плавать» по поверхности мембраны. Следовательно, какая-то часть трансмембранных белков не прикреплена к субстрату и может перемещаться по плазматической мембране до момента присоединения к субстрату.
Близкие к нулю средние коэффициенты латеральной диффузии у всех субфрагментов миозина-10, обнаруженных на мембране фибробластов, характеризуют мембрану этих клеток, как хорошо структурированную, имеющую большое количество мест связывания с цитоскелетом и субстратом, в отличие от плазматической мембраны эндотелиальных клеток.
Общее количество связанных молекул миозина-10 и его субфрагментов на мембране эндотелиальных клеток значительно ниже на единицу площади мембраны, в сравнении с количеством связанных молекул на мембране фибробластов. Следовательно, эндотелиальные клетки имеют значительно более слабые адгезивные свойства, чем фибробласты и возможно, поэтому гораздо более подвижны на поверхности субстрата.
При использовании замедленной съемки обнаружено, что одиночные молекулы миозина-10 полностью неподвижны на поверхности клеточной мембраны или могут «плавать» по поверхности мембраны. Способностью к направленному перемещению обладают кластеры, состоящие из нескольких молекул миозина- (5), которые могут двигаться вдоль актиновых филаментов со скоростью 50-100 нм с-1, как это было сообщено ранее [Berg J.S., 2002].
Локализация и роль немышечных миозинов 1е, 2b, 6, 7а и 10 в фибробластах и эндотелиальных клетках.
Данные, полученные методом ФМПВО, подтверждают полученные другими способами данные о локализации и функциях миозинов 1е, 2b, 6, 7а и 10 в клетке.
Присоединение каждого из исследованных миозинов к определенным структурам позволяет сделать предположение о влиянии данного миозина на подвижность самой клетки или ее органелл. Так, миозин-1е, концентрируясь в ламеллоподиях стимулирует их образование, и, следовательно, стимулирует движение всей клетки [Bray D., 2001]. Миозин-2b, присоединяясь к стрессовым волокнам, обеспечивает их натяжение, поскольку стрессовые волокна остаются натянутыми при изменении формы клетки, что может быть объяснено действием активных генераторов силы.
Другие миозины в составе стрессовых волокон не обнаружены. Миозин-6, присоединяется к везикулам клетки, и, следовательно, обеспечивает их внутриклеточный транспорт вдоль актиновых филаментов у поверхности клеточной мембраны, что подтверждает участие этого миозина в опосредованном клатрином транспорте везикул [Buss F., 2001]. Исходя из того, что миозин-7а участвует в присоединении актинового цитоскелета к интегринам мембраны, а интегрины в свою очередь присоединяются к субстрату, на котором находится клетка, можно сделать вывод, что миозин-7а играет важную роль в адгезии и обеспечении механической связи между цитоскелетом клетки и цитоплазматической мембраной.
Миозин-10 концентрируется на кончиках филоподий и стимулирует их образование, а образование филоподий способствует образованию ламеллоподий и увеличению степени подвижности клетки [Bray D., 2001].
Подвижность отдельных молекул миозинов на мембране клетки, как и их локализация, определяется строением хвостовой части конкретного миозина. В частности – миозины 7 и 10 имеют в хвостовой части MyTH4-FERM-домены и имеют очень близкие значения латеральной подвижности на клеточной мембране близкие к нулю, что также характерно для фрагментов белка, содержащих только MyTH4-FERМ-домен. И миозин-1е, и миозин-10 могут присоединяться к фосфоиноцитолам мембраны, однако их подвижность существенно отличается. Так, подвижность полноразмерного миозина-10 определяет его присоединение к мембране через трансмембранные белки с помощью MyTH4-FERM-домена, а подвижность миозина-1е определяется подвижностью фосфоиноцитолов, «плавающих» в мембране клетки, поскольку в его хвостовой части отсутствуют другие мебраносвязывающиеся домены.
Динамика одиночных молекул на цитоплазматической мембране отличается у немышечных миозинов в каждом типе исследованных клеток (эндотелиальных клеток и фибробластов). Особенно это актуально для миозина-1е и плекстрин гомологичных доменов, которые присоединяются к фосфоиноцитолам мембраны, подвижность которых на мембране соответствует исследованному типу клеток.
На основании вышеперечисленных результатов миозин-1е и миозин-10 можно считать важным звеном в процессе миграции клеток, вследствие их участия в формировании ламеллоподий и филоподий. В то же время, миозины 6, прикрепляются к трансмембранным белкам, и, вероятно не участвуют в процессе миграции клеток.
Выводы 1. Для изучения подвижности клеток разработан метод темнопольной микроскопии низкого увеличения с замедленной съемкой в сочетании с автоматической трассировкой.
2. Клеточная подвижность зависит от типа исследуемых клеток, структуры цитоскелета и от скорости его перестроения. Подвижность фибробластов при 37°С в 5 раз ниже подвижности эндотелиальных клеток.
3. Миозины-1е, 6, 7а, 10, имеют ограниченное время связывания с плазматической мембраной. Каждый из вышеперечисленных миозинов имеет свое специфическое место локализации и функционирования в клетке.
4. Латеральная подвижность немышечных миозинов, прикрепляющихся к плазматической мембране, зависит не только от класса миозина, но и от свойств плазматической мембраны (типа клеток) а также, в некоторых случаях, от температуры.
5. Миозин 1-е сосредоточен в ламеллоподиях клетки и активно участвует в ее выдвижении. Отдельные молекулы миозина-1е на мембране имеют высокую латеральную подвижность, близкую к подвижности ПГ-доменов миозина-10.
6. Миозин-2b присоединяется к стрессовым актиновым волокнам, где он локализуется в кластерах, расположенных с правильными интервалами (0.5µм).
Молекулы миозина-2b неподвижны или двигаются вместе с актиновыми волокнами при перестроении цитоскелета клетки.
7. Миозин-6, ответственный за внутриклеточный транспорт везикул, также присоединяется и к плазматической мембране. Латеральная подвижность миозина- на мембране очень низка и близка к подвижности миозина-7.
8. Миозин-7а, содержащий две пары MyTH4-FERM доменов, как и изолированные MyTH4-FERM домены миозина-10 неподвижен на клеточной мембране, поскольку присоединяется к трансмембранным якорным белкам, связанным с субстратом и выполняет функции связывающего звена между цитоскелетом и трансмембранными белками.
9. Молекулы миозина-10, прикрепившиеся к специфическим фосфоиноцитолам мембраны ПГ123 доменами, способны быстро двигаться на мембране до момента, когда они прикрепятся к неподвижным трансмембранным якорным белкам, через MyTH4-FERM домен, или к актиновому филаменту цитоскелета через головную часть молекулы. После присоединения миозина-10 к актиновому цитоскелету происходит объединение молекул миозина-10 в комплексы и активное перемещение миозина-10 в кончики филоподий. Образование филоподий имеет важное физиологическое значение для последующего образования ламеллоподий и перемещения клеток.
10. Миозины 1е, 6, 7, 10, имеют значимый коэффициент диссоциации от мембраны. Молекулы могут перераспределяться на клеточной мембране, как в результате латеральной диффузии, так и в результате процесса «открепления – свободного плавания в цитоплазме - прикрепления на новом участке». Такой способ перемещения имеет преимущества в клетках с ограниченной подвижностью молекул на мембране, поскольку скорость диффузии белков в цитоплазме в десятки раз выше скорости латеральной диффузии на поверхности мембраны.
Список работ, опубликованных по теме диссертации Ненашева Т. А. Визуализация отдельных молекул флуорофоров в живой 1.
клетке / Т. А. Ненашева, Г. И. Машанов // Биофизика. - 2006. - Т.51, вып. 3. - С. 454 465.
2. Mashanov G. I. Cell biochemistry studied by single-molecule imaging / G. I.
Mashanov, T. A. Nenasheva, M. Peckham, J. E. Molloy // Biochemical society Transaction Journal. - 2006. - P. 983-988.
3. Nenasheva T. A. Myosin X mobility on cell membrane / T. A. Nenasheva, G. I.
Mashanov, T. Carter, M. Erent, D. Tacon, M. Peckham, R. Cheney, J. Molloy // Journal of Muscle Research and Cell Motility. - 2004. - V. 25. N. 3. - P. 252-253.
4. Mashanov G. I. Lateral mobility of myosin-X and its pleckstrin homology domains at cell membrane / G. I.Mashanov, T. A. Nenasheva, T. Carter, D. Tacon, R.
Cheney, M. Peckham, J. Molloy // FEBS workshop Modular Protein Domains :
материалы конф. - Seefeld (Austria), 2005. - P. 23.
5. Nenasheva T. A. Myosin-10 serves as dynamic link between cell membrane and the cytoskeleton / T. A. Nenasheva, T. Carter, D. Tacon, M. Peckham, R. Cheney, J.
Molloy, and G. I. Mashanov // Biological motility: Basic research and practice :
материалы конф. (11-15 мая 2006 г. Пущино). – Пущино, 2006. – C. 99–100.
6. Mashanov G. Mobility of Individual Protein Molecules at the Plasma Membrane / G. Mashanov, T. Nenasheva, T. Carter, M. Peckham, R. Cheney, J. Molloy // Biophysical Society Annual Meeting. – Baltimore, 2007. - P. Список сокращений ПГ – плекстрин гомологичный домен ФМПВО – Флуоресцентная Микроскопия Полного Внутреннего Отражения ASPT – Automatic Single Particle Tracing – модуль программы GMimPro для автоматического отслеживания траекторий отдельных молекул GFP – Green Fluorescent Protein –зеленый флуоресцентный белок медузы Aequorea Victoria Подписано в печать Формат 60х84/16. Объем 1,5 усл.-печ.л.
Тираж 100 экз. Заказ № Размножено с готового оригинал-макета в типографии АНО «Уральский центр академического обслуживания» 620219, г. Екатеринбург, ул. Первомайская,