Оптимизация приемов микроразмножения и сохранения лимона in vitro
На правах рукописи
Самарина Лидия Сергеевна ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИЕМОВ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ И СОХРАНЕНИЯ ЛИМОНА IN VITRO Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссий ском научно-исследовательском институте цветоводства и субтропических культур Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Сочи) кандидат сельскохозяйственных наук
Научный консультант:
Коломиец Татьяна Михайловна
Официальные оппоненты:
Калашникова Елена Анатольевна доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева», профессор на кафедре генетики и биотехнологии Молканова Ольга Ивановна кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник, ФГБУН Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук, заведующая лабораторией биотехнологии растений ФГБУН Институт физиологии растений
Ведущая организация:
им. К.А. Тимирязева Российской академии наук
Защита диссертации состоится 25 сентября 2013 года в 16-00 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграр ном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел/факс: (499) 976-24-92, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева Автореферат разослан 23 августа 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Цитрусовые культуры занимают третье место в ми ре по распространению среди плодовых культур (FAO, 2009). Основными цит русо-производящими странами являются США, Япония, Испания, Италия и другие, с теплым влажным климатом.
Среди субтропических районов земного шара особое место принадлежит субтропикам Краснодарского края, которые по своему географическому поло жению (43–44о с. ш.) являются самыми северными в субтропическом земледе лии. В результате многолетних исследований по возделыванию и селекции цитрусовых на базе ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии создана коллекция, в которой собраны все виды рода Citrus, имеющие важнейшее экономическое значение – всего более 120 таксонов (Зорин, Лаврийчук, 1964;
Фогель, 2008;
Кулян, 2012). Лимон (Citrus limon (L.) Burm.) – один из наиболее ценных видов рода Citrus, пользующийся большим потребительским спросом на рынке.
Наряду с известными лечебными и диетическими свойствами лимон обладает высокими декоративными качествами. При благоприятных условиях растения лимона могут цвести круглый год и с успехом использоваться для внутреннего озеленения.
Вместе с тем, Черноморское побережье России является зоной рискован ного цитрусоводства, так как повторяющиеся периодические холодные зимы представляют собой угрозу для промышленных посадок. К тому же, в послед ние годы в результате развития г. Сочи как горно-климатического курорта и столицы XXII зимних Олимпийских игр сельскохозяйственные площади со кращаются, в том числе и под цитрусовыми культурами.
Привлечение в исследования современных методов биотехнологии моет помочь решить стоящие проблемы. Культивирование растений in vitro в состо янии замедленного роста имеет свои преимущества: высокая степень надежно сти сохранения ценных генотипов, экономия площади, трудовых ресурсов, воз можность безопасного обмена гермоплазмой с другими коллекциями (Citrus ge netics…, 2008).
Известно, что разработка большинства зарубежных протоколов микро размножения и сохранения цитрусовых in vitro проведена на сеянцах (Barlaas, Skene, 1982;
Marin, Duran Villa, 1999;
Chaturvedi et al., 2002;
Avenido et al., 2004;
Jajoo, 2009;
Benabdesselam, 2011;
Chen, 2012 и др.). При этом способе сохране ния сортовые особенности утрачиваются и растения зацветают через 5–10 и бо лее лет. В этой связи актуальным является вопрос разработки и оптимизации надежных приемов сохранения взрослых (неювенильных) тканей, а также изу чение органогенного потенциала различных типов эксплантов в условиях in vitro на примере С. limon для сохранения геноресурсов и использования их в селекционных целях.
Объекты исследований: Citrus limon (L.) Burm., сорта: Новоафонский, Ударник, Бесколючий;
Citrus x meyeri лимон Мейера коллекции ГНУ ВНИИ ЦиСК Россельхозакадемии.
Цель исследований: оптимизировать приемы микроразмножения и со хранения лимона in vitro для создания депонированной коллекции и дальней шего использования ее в селекционной работе.
Задачи исследований:
1. Определить эффективный способ стерилизации побегов. Выявить воз можные пути прямого морфогенеза эксплантов лимона in vitro.
2. Оптимизировать минеральную основу и гормональный состав пита тельной среды для микроразмножения лимона.
3. Установить оптимальный режим хранения микропобегов лимона in vitro.
4. Оценить эффективность ISSR-праймеров для определения генетиче ской стабильности сортов в процессе хранения лимона in vitro.
5. Разработать протокол поддержания депонированной коллекции лимона в культуре тканей.
Новизна исследований. Впервые установлена возможность использова ния микропрививки лимона для повышения продуктивности микроразмноже ния. Выявлены сортовые особенности микроразмножения лимона. Модифици рована минеральная основа среды для размножения. Определены оптимальные сроки и условия среднесрочной консервации микропобегов. Для определения жизнеспособности растений при хранении лимона in vitro впервые использован метод медленной индукции флуоресценции хлорофилла. В процессе хранения in vitro изучена жизнеспособность лимона, в зависимости от типа экспланта.
Впервые с помощью ISSR праймеров проведена оценка полиморфизма изучен ных сортов лимона.
Практическая значимость. Оптимизация приемов клонального микро размножения цитрусовых позволит создать и поддерживать резервную коллек цию, сохранить на небольших производственных площадях накопленный гено фонд для дальнейшего использования в селекционных и практических целях.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Микропрививка – как способ омоложения эксплантов от взрослых рас тений лимона;
2. Условия культивирования и составы питательных сред на всех этапах – от введения in vitro до адаптации ex vitro;
3. Оптимизированы приемы клонального микроразмножения и средне срочного хранения микропобегов лимона in vitro.
Апробация работы и публикация результатов исследований. Резуль таты исследований докладывались и обсуждались на ежегодных отчетных сес сиях ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии, Сочи, 2009 – 2012 гг., на конфе ренции «Научное обеспечение АПК», Краснодар, 2011 г., на летней школе мо лодых ученых «AgroBioTech», Москва, 2012, на Всероссийской выставке «Зо лотая Осень», Москва, 2011 г., на конкурсе научно-исследовательских проектов молодых ученых «AllTech Young Scientist», 2012 г., конкурсе инновационных проектов молодых ученых «У.М.Н.И.К.», Краснодар, 2011 г. По теме диссерта ции опубликовано 11 печатных работ, из них четыре – в изданиях, рекомендо ванных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страни цах печатного текста, состоит из введения, 6 глав, рекомендаций для практиче ского применения, выводов и 6 приложений. Работа содержит 18 таблиц, 35 ри сунков. Список литературы включает 218 источников, в том числе 185 на ино странных языках.
Личный вклад автора. Автором обосновано направление научно практических исследований, проведены исследования по оптимизации условий микроразмножения и сохранения лимона in vitro, определены возможные пути прямого органогенеза различных типов эксплантов, обобщены и проанализиро ваны результаты исследований, разработаны рекомендации для практического применения результатов исследования.
Глава 1. КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ ЦИТРУСОВЫХ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ В главе рассматриваются вопросы основных биологических особенностей цитрусовых культур и актуальные вопросы культуры тканей как инструмента биотехнологии цитрусовых культур, а именно: проблема получения стерильной культуры, микроразмножение цитрусовых из различных типов эксплантов, во просы сохранения гермоплазмы.
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ Объекты исследований. Citrus limon (L.) Burm., сорта: Новоафонский, Ударник, Бесколючий, Citrus x meyeri лимон Мейера коллекции ГНУ ВНИИ ЦиСК Россельхозакадемии. Работа проводилась на базе ГНУ ВНИИЦ и СК Россельхозакадемии с 2009 по 2012 гг.
Методы исследований.
Получение стерильной культуры микропобегов. Источник эксплантов – донорные растения открытого грунта возрастом 6 – 10 лет. Экспланты для введения в культуру: 1. Вегетативные почки с сегментом побега длиной 0,5 – 0,7 см, 2. Меристемы молодых побегов, 3. Семена зрелых плодов (для получе ния подвоев).
Побеги стерилизовали с использованием различных веществ: гипохлори та Ca (7 %), сулемы, диацида, велтолена, новодеза (0,2-0,5 %), доместоса (10 %) в сочетании с тетрациклином (0,1-0,2 %).
Микропрививку осуществляли по методике L. Navarro (Navarro, 2008) модифицированной. В качестве подвоя выступали сеянцы лимона Мейера, вы ращенные in vitro. Основа питательной среды – DKW с добавлением регулято ров роста БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л.
Микроразмножение. На данном этапе изучали: 1. Влияние минеральной основы: МС (Murasige et al., 1962), WPM (Lloyd et al., 1980) DKW (Driver et al., 1984) и комбинированной минеральной основы (КМО – МС с пониженным со держанием нитрата аммония (250 мг/л) без нитрата калия, но с добавлением сульфата аммония 1500 мг/л);
2. Влияние регуляторов роста (БАП, кинетин, ГК, тидиазурон, НУК – в различных комбинациях) на размножение микропобегов;
3.Возможность повышения коэффициента размножения путем повторяющихся микропрививок. Измеряли коэффициент размножения и прирост микропобегов через 1,5 месяца культивирования.
Сохранение in vitro. В качестве модельного сорта использовали лимон Новоафонский. Минеральная основа питательной среды для культивирования МС (или МС) с добавлением БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л, сахарозы 25,0 г/л, агара 7,0 г/л. Хранение растущих образцов проводили в двух режимах: 1. В стандартных условиях при температуре + 22 ± 2 оС и освещении 5 000 люкс ( клк);
2. В условиях климатической камеры при температуре + 10 ± 2 оС, осве щении 1 000 люкс (1 клк). Пробирки закрывали фольгой и герметично заматы вали пленкой (Высоцкая, 1994).
Изучение фотосинтетической активности проводили методом медленной индукции флуоресценции хлорофилла (на приборе LPT-3С) и методом А.А.
Шлыка (1972). В процессе хранения измеряли прирост (разница между конеч ной и начальной высотой микропобегов) и индекс жизнеспособности Fm/F_t, где Fm – максимум флуоресценции, F_t – стационарный уровень флуоресцен ции.
Оценка эффективности ISSR праймеров. Анализ проводили на базе ла боратории мониторинга генетической эрозии растительных ресурсов ВНИИ растениеводства имени Н.И. Вавилова (г. Санкт-Петербург). Кроме сортов ли мона в анализ был включен каламондин (Citrus microcarpa Bunge) с целью определить степень различий между лимонной группой и этим видом с точки зрения оценки эффективности ISSR-праймеров. ДНК выделяли из листьев двухмесячных, адаптированных к нестерильным условиям растений и из листь ев 10-летних донорных растений – источников эксплантов. Степень сход ства/различия ISSR-фрагментов у образцов оценивали с помощью коэффициен та попарного сходства по Dice (Dice, 1945) и визуализировали методом UPGMA с помощью программного обеспечения DARwin5.9 (Perrier et al., 2006). Укоре нение микропобегов проводили на питательной среде МС с использованием ауксинов НУК и ИМК.
Все эксперименты проводили в трех-четырех повторностях, по 15–20 об разцов в каждой. Статистический анализ полученных данных проводили по ме тодике Б.А. Доспехова (1985) и с помощью программы MS Excel 2007.
Глава 3. ПОЛУЧЕНИЕ СТЕРИЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ И ПРЯМОЙ ОРГАНОГЕНЕЗ ЭКСПЛАНТОВ ЛИМОНА 3.1. Получение стерильной культуры. Вегетативные почки – наиболее надежный тип эксплантов с точки зрения генетической стабильности сортов.
Однако получение стерильной культуры из этих эксплантов проблематично из за высокого уровня эндофитной контаминации. В связи с этим изучали различ ные варианты стерилизации побегов. Наиболее высокий процент стерильных почек получен в вариантах IVб (0,3 % велтолен 25 минут), VIIа и VIIб (тетра циклин 0,1-0,2 % 10 мин + Доместос 10 % 15 мин) (табл. 1). Различия между этими тремя вариантами несущественны, и выход стерильных эксплантов со ставил 27,7 – 33,0 %.
Таблица 1.
Выход жизнеспособных эксплантов в результате стерилизации побегов лимона (средний по сортам) Вариант Стерилизующие вещества Выход стерильных эксплантов, % Гипохлорит Са 7% 20 мин 9,4 ± 1, I Сулема 0,2% 10 мин 15,9 ± 3, II Диацид 0,2 % 15 мин 13,2 ± 3, III Велтолен 0,2% 25 мин 12,0 ± 2, IVа Велтолен 0,3% 25 мин 27,7 ± 4, IVб Велтолен 0,5% 25 мин 1,4 ± 0, IVв Новодез 0,2% 25 мин 9,9 ± 1, Vа Новодез 0,3% 25 мин 15,7 ± 2, Vб Новодез 0,5% 25 мин 4,8 ± 1, Vв Доместос 10% 15 мин 12,8 ± 1, VI Тетрациклин 0,1 % 10 +Доместос 10 % 15мин 28,4 ± 3, VIIа Тетрациклин 0,2 % 10 мин +Доместос 10 % 15мин 33,0 ± 4, VIIб Для повышения выхода стерильных эксплантов в питательную среду до бавляли тетрациклин. Добавление 400 мг/л тетрациклина позволило повысить процент стерильных эксплантов до 65,4 % по сравнению с контролем, а органо генез стерильных почек составил 48,5 %. Таким образом, добавление тетра циклина в питательную среду повысило выход стерильных жизнеспособных эксплантов на 20,8 % (табл. 2).
Таблица 2.
Эффективность получения стерильной культуры и органогенез почек лимона сорта Ново афонский (стерилизация 0,3 % Велтолен 25 мин) Антибиотик в питательной Выход стерильных Органогенез, % среде, мг/л эксплантов, % Без антибиотика 27,7 27, Тетрациклин 200 33,2 31, Тетрациклин 400 65,4 48, Тетрациклин 900 77,6 24, 3.2. Особенности органогенеза эксплантов лимона.
Органогенез из пазушных почек. Пазушные почки от 6-летних растений лимона характеризовались более активным побегообразованием, по сравнению с 10-летними. Срок наступления массового роста (СНМР) 10-летних почек был на 7-9 дней больше, чем у почек 6-летних донорных растений, а частота побе гообразования была на 2-19 % ниже, в зависимости от сорта (табл. 3). В даль нейшем побеги росли неактивно.
Таблица 3.
Влияние генотипа и возраста донорных растений на частоту и продолжительность побегооб разования из почек лимона Сорт Возраст дерева, лет СНМР, дней Побегообразование, % Бесколючий 15,5 ± 0, 6 84, 22,4±0, 10 76, Ударник 17,2±0, 6 61, 26,5±0, 10 59, Новоафонский 20,4±0, 6 83, 29,2±0, 10 64, Мейер 12,6±0, 6 87, 19,0±0, 10 85, Для повышения ростовой активности использовали альтернативный спо соб прямого органогенеза – микропрививку.
Органогенез лимона путем микропрививки. В результате микропрививки на подвой лимон Мейера через 10-20 дней образовывалась общая сосудистая система и меристемы трогались в рост (рис. 1). Меристемы от in vitro культиви руемых почек приживались лучше, чем меристемы из открытого грунта (in vivo). Приживаемость составила 65,8-81,6 % и 21,4-35,1 %, соответственно. Раз личия между сортами несущественны (табл. 4).
2 мм А Б В х Рис 1. Микропрививка лимона Новоафонский на лимон Мейера:
А, Б – образование общей проводящей системы (через 10 дней);
В – начало роста (через 20 дней).
В результате дисперсионного анализа установлено, что доля влияния сор та на приживаемость меристем составила лишь 5 %, в то время как влияние ис точника привоя – 92 % (табл. 4). Все полученные данные достоверны Fф F05.
Таким образом, в результате микропрививки были получены высокие показате ли приживаемости, что делает этот способ перспективным для дальнейшего культивирования лимона in vitro.
Таблица 4.
Приживаемость микропрививки на подвой лимон Мейера (%, НСР05=8,33).
Сорт привоя Источник привоя in vivo in vitro Новоафонский 25,5 75, Бесколючий 21,4 73, Ударник 24,8 65, Мейер 35,1 81, Результаты дисперсионного анализа Фактор Доля влияния фактора, % Fф F Сорт привоя 19,62 2,99 4, Источник привоя 1134,74 4,24 92, Взаимодействие 3,05 2,99 0, Глава 4. КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ЛИМОНА IN VITRO 4.1. Микроразмножение побегов из пазушных почек. Для повышения эффективности культивирования in vitro микропобегов из пазушных почек оп тимизировали состав питательной среды. Из четырех базовых сред наиболее эффективными оказались КМО и DKW, где коэффициент размножения (1,8 – 2,8) существенно превышал контроль (на среде МС – 1,4 – 1,7) (рис. 2).
Рис. 2. Коэффициент размножения микропобегов в зависимости от мине ральной основы питательной среды (БАП 2,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л).
При изучении влияния регуляторов роста установлено, что наиболее эф фективными для размножения вариантами оказались VII и VIII (табл. 5).
Таблица 5.
Коэффициент размножения микропобегов из почек лимона в зависимости от регуляторов роста в питательной среде (базовая среда КМО) Концентрации регуляторов роста, мг/л Контроль НУК 0,5 БАП БАП+ГК без регу- БАП Кинетин ТДЗ Генотип ляторов 1,0 2,0 3,0 1,0 2,0 1,0+1,0 2,0+2,0 0,01 0, роста I II III IV V VI VII VIII IX X Ново 1,0 1,4 1,7 1,2 1,1 1,1 1,9 2,4 1,2 1, афонский Бесколю 0,9 1,2 1,7 1,4 1,0 1,2 1,8 2,4 1,5 1, чий Ударник 1,0 1,2 1,7 0,9 1,1 1,4 1,7 2,1 1,6 1, Мейер 1,0 1,2 1,3 1,0 0,9 1,1 1,6 1,9 1,1 1, Значения F критерия и НСР при 0,05% уровне значимости Фактор F факт. F теор. НСР Доля фактора,% Сорт 25,21 4,40 0,1 Регуляторы роста 109,31 8,58 0,1 Взаимодействие 5,36 2,18 0,2 Наибольший коэффициент размножения микропобегов был получен при добавлении в среду БАП 2 мг/л + ГК 2 мг/л и составил в зависимости от сорта 1,9-2,4 побега на эксплант через 1,5 месяца культивирования. На питательных средах с другими комбинациями регуляторов роста коэффициент размножения принимал меньшие значения, но при этом он был выше, чем в контрольном ва рианте. Проведенная статистическая обработка результатов опыта достоверно показала, что различия между вариантами существенны и наиболее оптималь ной питательной средой для размножения является КМО с добавлением БАП мг/л + ГК 2 мг/л.
Следует отметить, что, в целом, микропобеги из пазушных почек взрос лых растений лимона характеризовались низкими значениями коэффициента размножения. В связи с этим изучали возможность повышения их продуктив ности путем микропрививки.
4.2. Микропрививка как способ размножения лимона В наших экспериментах способность к омоложению микропобегов про верялась с помощью сравнения роста привоя от 1го, 2го и 3го циклов субкуль тивирования в микропрививке. Характер роста и размножения микрочеренков, полученных от каждого цикла, сравнивали с микропобегами и сеянцами от 10 летнего лимона Новоафонский in vitro. В целом, микропобеги привоя характе ризовались более быстрым ростом, чем побеги, полученные из почек взрослых растений. После третьего цикла микропрививки коэффициент размножения микрочеренков в 2 раза превышал аналогичный показатель микропобегов из пазушных почек растений-доноров и составил 4,6 шт/побег, тем самым при ближаясь к сеянцам (рис. 3).
Рис. 3. Коэффициент размножения микропобегов лимона в зависимости от их источника и цикла субкультивирования Также отмечено, что коэффициент размножения микропобегов из почек взрослых растений после третьего пассажа существенно не повышался. Таким образом, с помощью перепрививок происходила активизация ростовых процес сов, связанная с физиологическим омоложением. Следовательно, данный путь морфогенеза открывает большие возможности для массового размножения и оздоровления генотипов лимона.
ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ СОХРАНЕНИЯ МИКРОПОБЕГОВ ЛИМОНА IN VITRO 5.1. Оптимизация режимов и условий хранения in vitro.
Высокие показатели роста микропобегов являются главной целью микро размножения, но для длительного хранения in vitro необходимо определить условия, замедляющие рост побегов без потери их жизнеспособности. В про цессе хранения in vitro было установлено, что микропобеги из пазушных почек взрослых растений характеризовались низкой жизнеспособностью. Через 4 ме сяца на среде МС осталось 83,0–88,1 %, а на среде МС – 76,6–81,8 % жизне способных микропобегов лимона Новоафонский (табл. 6). При этом их средний прирост составлял 4,7 и 2,3 мм, соответственно. Спустя 10 месяцев хранения на этих средах при стандартных световом и температурном режимах большая часть микропобегов погибла.
Таблица 6.
Влияние сроков хранения микропобегов in vitro на рост и жизнеспособность лимона сорта Новоафонский Среда Продолжительность Прирост, мм Выжило консервации, мес. микропобегов, % 6,4±0, 2 93,9–98, 4,7±0, 4 83,0–88, МС 1,9±0, 6 60,0–65, 0,3±0, 8 34,0–40, 10 0 13,6–15, 5,0±0, 2 81,3–88, 2,3±0, 4 76,6–81, МС 0,5±0, 6 48,0–54, 8 0 20,4–25, 10 0 5,0–7, *± ошибка выборочной средней С целью повышения продолжительности хранения без пересадок на све жую среду определяли наиболее оптимальный тип эксплантов: микропобегов от микропрививки, сеянцев и микропобегов от взрослых растений-доноров ли мона Новоафонский. Через 4 месяца хранения наибольший прирост был отме чен у сеянцев (14,8 мм) и у микропривитых растений (12,0 мм) на среде МС при стандартных условиях освещения и температуры (табл. 7). У микропобегов из почек отмечен наименьший прирост (4,7 мм). В условиях пониженного све тового и температурного режима (1 клк и t +10 ± 2oC) прирост снижался: от 0, (побеги из почек) до 4,3 (сеянцы) мм.
Таблица 7.
Прирост и индекс жизнеспособности у микропобегов лимона Новоафонский через месяца хранения 5 клк, +22±2 оС 1 клк, +10±2 oC Тип экспланта Индекс жизне- Индекс жизне Прирост (мм) Прирост (мм) способности способности Почки взрослых 4,7 ± 0,7 1,33 ± 0,09 0,0 ± 0,0 1,73 ± 0, растений Сеянцы 14,8 ± 2,5 1,81 ± 0,08 4,3 ± 1,0 2,46 ± 0, Микропривитые 12,0 ± 1,4 1,61 ± 0,17 3,8 ± 0,5 1,99 ± 0, растения *± ошибка выборочной средней Таким образом, хранение в условиях пониженных температуры и осве щения более оптимально для замедления роста микропобегов, чем культивиро вание при стандартных условиях. Этот вывод подтверждается индексами жиз неспособности. При интенсивности освещения 1 клк и t +10 ± 2oC этот показа тель был выше, чем при 5 клк и t +22 ± 2oC. Наибольший индекс жизнеспособ ности отмечен у сеянцев и составил 1,81–2,46. У микропривитых растений от мечены меньшие его значения – 1,61–1,99. И наименьшим индексом жизнеспо собности характеризовались микропобеги из почек – 1,33–1,63.
В зависимости от типа эксплантов определяли оптимальную продолжи тельность хранения in vitro без пассирования. Наибольшее количество жизне способных микропобегов (95 %) через 12 месяцев хранения наблюдалось у се янцев (рис. 4).
Рис. 4. Выход жизнеспособных микропобегов лимона Новоафонский на среде МС при 1 клк и +10 ± 2oC (n=120) Оптимальный срок хранения микропривитых растений составил 10 меся цев. К 12 месяцу хранения количество их снизилось до 85 %. У микропобегов из почек резкое снижение жизнеспособности происходило после 4 месяцев хранения in vitro и к 12 месяцу осталось лишь 40 % жизнеспособных побегов.
Таким образом, наибольшей продолжительностью хранения in vitro без пасси рования характеризовались сеянцы и микропривитые побеги.
Важным показателем, отражающим особенности физиологической адап тации растений к различным факторам среды, является пигментный состав ли стьев. При изучении содержания хлорофилла a (Ch a) и каротиноидов в листь ях сеянцев лимона отмечено постепенное снижение этих пигментов в процессе хранения in vitro. Однако, было обнаружено, что в условиях пониженных тем пературы и освещенности это снижение происходило медленнее, чем при хра нении в обычных условиях (рис. 5).
В условиях пониженной температуры и освещения содержание хлоро филла а снижалось с 1,81 до 1,56 мг/г, то есть на 0,25 мг/г сырой массы листьев через 6 месяцев культивирования. В стандартных условиях хранения за анало гичный период количество хлорофилла а снижалось с 1,59 до 1,18 мг/г – в среднем на 0,41 мг/г. На 12-й месяц хранения при стандартных условиях со держание этого пигмента составляло 1,14 мг/г, то есть снизилось на 0,45 мг.
Каротиноиды Ch a Рис. 5. Динамика содержания хлорофилла а и каротиноидов (мг/г сырого вещества) в процессе хранения сеянцев лимона сорта Новоафонский in vitro (на среде МС + БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л) Концентрация каротиноидов с 1-го по 3-й месяц хранения при понижен ных температуре и освещении практически не изменялась, ее снижение на 0, мг происходило с 3-го на 6-й месяцы культивирования. В стандартных услови ях хранения происходил постепенный спад каротиноидов с 1,14 до 0,82 мг/г, то есть их концентрация снизилась на 0,32 мг за 12 месяцев хранения.
Анализ изменения содержания пигментов показал, что условия понижен ной температуры (+10 оС) и интенсивности освещения (1000 люкс) более опти мальны для сохранения фотосинтетического аппарата и пластических веществ в листьях микропобегов лимона, и, как следствие, более высокого уровня жизне способности микропобегов. Такие условия позволяют сохранять их 10 –12 ме сяцев без пассирования.
4.3. Анализ внутрисортового полиморфизма. В процессе хранения кол лекций in vitro важным является вопрос генетической стабильности сортов. Для идентификации сортов лимона и степени их стабильности при хранении in vitro изучали эффективность девяти ISSR праймеров. В результате анализа трех сор тов лимона – Новоафонский, Бесколючий и Ударник в сравнении с формой ка ламондина Citrus x microcarpa Bunge, с помощью девяти ISSR праймеров в сумме получили 92 четких фрагмента высокой интенсивности (табл. 8). Коли чество таких фрагментов варьировало от 7 (праймер М6) до 17 (праймер М3) при арифметическом среднем 10,2. Число полиморфных фрагментов варьиро вало от 0 (праймер М13С) до 13 (М 3) и в среднем составляло 4,8, то есть 47 %.
Таблица 8.
Уровень полиморфизма девяти ISSR праймеров у Citrus limon (L.) Burm и Citrus mitis Blan.
Праймер Количество фрагментов Полиморфизм, % Всего Полиморфных М1 (AC)8СG 12 9 М3 (GA)8(C/T)C 17 13 М6 (CAC)5 7 1 М7 (CAG)5 8 1 М8 (GTG)5 9 4 М9 (GACAC)4 9 8 М10 (CA)6(A/G)G 10 4 М13С (AGC)4C 9 0 М13Т (AGC)4T 11 3 Среднее 10,2 4,8 Всего 92 43 На электрофореграмме праймера М1 видны различия между каламонди ном (дорожка 1) и лимонной группой (дорожки 2 – 9), а также различия между сортами Бесколючий, Ударник и Новоафонский (рис. 6).
МР Рис. 6. МР – маркер размера;
1 – Каламондин, 2 – Бесколючий Мат., 3 – Бесколючий in vitro1, 4 – Бесколючий in vitro2, 5 – Ударник Мат., 6 – Ударник in vitro1, 7 – Новоафонский Мат., 8 – Новоафонский in vitro1, 9 – Новоафон ский in vitro2, В результате проведенного кластерного анализа методом UPGMA все сорта разделяются на отдельные кластеры. Выявлено, что микропобеги после хранения in vitro 6 месяцев (обозначены in vitro1) и 12 месяцев (in vitro2) иден тичны исходным маточным растениям (Мат.1) (рис. 7).
Рис. 7. UPGMA дендрограмма лимона и каламондина на основе коэффициентов попарного сходства по Dice, 1945.
У сортов Бесколючий и Новоафонский после 12 месяцев хранения in vitro, и у сорта Ударник после 6 месяцев хранения не было выявлено генетиче ских отклонений от исходных маточных растений. Таким образом ISSR прай меры позволяют оценить генетическую стабильность изученных сортов.
Глава 6. УКОРЕНЕНИЕ И АДАПТАЦИЯ ПОБЕГОВ К НЕСТЕРИЛЬНЫМ УСЛОВИЯМ Изучение влияния ИМК и НУК в питательной среде на длину корневой системы микропобегов из пазушных почек показало, что при добавлении толь ко НУК длина корней была больше, чем когда использовали сочетание двух ауксинов (рис. 8). Максимальные показатели длины корней у всех сортов наблюдали в варианте с 3,0 мг/л НУК, при этом длина составляла 4,2 – 5,2 см. В этом варианте между сортами различия несущественны.
Рис. 8. Длина корневой системы (см) микропобегов лимона на среде МС через 30 дней культивирования.
Количество корней, образованных у микропобегов зависело от нали чия/отсутствия ИМК в питательной среде. Оно было больше в вариантах, где присутствовали два ауксина. Там же, где был только НУК, количество корней на микропобег было значительно меньше (рис. 9). Максимальным этот показа тель оказался в вариантах с НУК 1,0 – 2,0 мг/л + ИМК 1,0 мг/л и в среднем по сортам составил 3,1 – 3,8 корней на микропобег.
Рис. 9. Количество корней на микропобег (шт) у лимона на среде МС через 30 дней культивирования.
Таким образом, наиболее оптимальным сочетанием регуляторов роста в питательной среде МС является НУК 1,0 – 2,0 мг/л + ИМК 1,0 мг/л. Такая комбинация позволяет получить 83,7 – 95,1 % укорененных микропобегов с длинной корневой системы 4,2 – 5,2 см и количеством корней на побег 3,1 – 3, штук. В результате наших исследований были получены укорененные, адапти рованные к нестерильным условиям растения, готовые к высадке в теплицу или для выращивания в комнатной культуре.
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ С целью получения полноценных растений лимона, микроразмножения и сохранения их в культуре тканей предлагается следующая последовательность операций (рис. 10):
1. Для введения в культуру тканей:
а) Молодые побеги весеннего (апрель – май) прироста освободить от ли стьев, промыть с хозяйственным мылом и в проточной воде в течение 30 минут.
Затем в условиях стерильного помещения обработать побеги 0,3 % растворе Велтолен 25 мин, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистил лированной водой. Сегменты побегов длиной 0,7 см с почкой помещаются вер тикально на питательную среду – МС + 0,1 мг/л БАП + 0,5 мг/л НУК + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л. Культивирование при световом режиме 16/8 – 5 клк, t +22±2 оС до получения микропобегов.
б) Для получения сеянцев – семена стерилизуют 0,3 % раствором велто лен 30 мин. Стерильными инструментами снимают обе семенные оболочки, и помещают семядоли на питательную среду МС + БАП 1,0 мг/л + НУК 0,1 мг/л + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л, световой режим 16/8 – 5 клк, t + 22 ± 2 оС.
в) Для получения побегов путем микропрививки отдельно готовят подвой и привой. Подвой – сеянцы лимона четырех недель культивирования in vitro, привой – микропобеги из пазушных почек in vitro. Сеянцы декапитируют, оставляя 1,0 – 1,5 см эпикотиль, на месте среза которого делают L-образный разрез коры длиной 1 – 2 мм. В этот разрез помещают привой – меристему с 2– 3 примордиями. Микропривитые побеги помещают на среду DKW + БАП 0, мг/л + НУК 0,5 мг/л + сахароза 30,0 г/л+ агар 7,0 г/л, и культивируют при све товой режиме 16/8 – 5 клк, t + 22 ± 2 оС.
2. Для омоложения микропобегов проводят цикл из не менее трех микро прививок, продолжительностью 2-3 месяца каждый. В каждой последующей прививке используют почки предыдущего привоя. После третьей перепрививки микрочеренки привоя высаживают на среду для размножения.
3. Для микроразмножения микропобеги культивируют на среде DKW (или КМО) + БАП 2,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л свето вой режим 16/8 – 5 клк, t + 22 ± 2 оС.
4. Для депонирования in vitro используют следующие условия – среда МС + БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л, сахароза 20,0 г/л, освещение 16/8 – 1 клк, t + 10 ± 2 оС.
5. Для укоренения микропобеги помещают на среду МС + НУК 2,0 мг/л + ИМК 1,0 мг/л + сахароза 20,0 г/л + агар 7,0 г/л, световой режим 16/8 – 5 клк, t + 22 ± 2 оС.
6. Адаптацию следует проводить в 2 этапа: 1. Высадка укорененных рас теньиц в адаптационные камеры с вермикулитом, закрытые полиэтиленовой пленкой;
2. Высадка на стеллажи или в горшки в тепличные или комнатные условия.
ВЫВОДЫ 1. Установлен эффективный режим стерилизации побегов взрослых рас тений лимона – обработка 0,3% раствором Велтолен 25 мин и добавление анти биотика тетрациклина 400 мг/л в питательную среду.
2. Оптимизирован минеральный и гормональный состав питательной сре ды для микроразмножения лимона – КМО + БАП 2,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л.
3. Установлено, что после трех циклов микропрививки в почках происхо дит активизация ростовых процессов, и коэффициент размножения лимона по вышается в 2 раза, что является критерием физиологического омоложения.
Микропрививка является наиболее перспективным способом микроразмноже ния и сохранения лимона in vitro.
4. Выявлены оптимальные условия, позволяющие сохранять микропобеги лимона in vitro 10–12 месяцев на среде МС + БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л, при температуре + 10 ± 2 оС, освещении 1 000 люкс, фотопериоде 16/8 часов.
5. Определена эффективность ISSR праймеров для оценки генетической стабильности сортов лимона в процессе хранения in vitro. У сортов Новоафон ский, Бесколючий и Ударник не было выявлено генетических отклонений после 6-12 месяцев хранения in vitro.
6. Разработан и рекомендован для практического применения протокол поддержания депонированной коллекции лимона в культуре тканей.
Рис. 10. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА микроразмножения и сохранения Citrus limon (L.) Burm. в условиях in vitro Молодые побеги весеннего прироста - Микроразмножение - DKW + БАП 2,0 мг/л + ГК стерилизация - 0,3 % Велтолен 20 мин, 2,0 мг/л + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л световой режим 16/8 – 5 клк, t + 22 ± 2 оС.
трижды промывка стерильной дистводой.
Высадка в питомник Анализ генетической стабильности сортов, депонированных в коллекции in vitro, с по мощью ISSR маркеров.
Регенерация побегов - МС + 0,1 мг/л Укоренение - МС + НУК БАП + 0,5 мг/л НУК + сахароза 25,0 2,0 мг/л + ИМК 1,0 мг/л + Введение в куль г/л + агар 7,0 г/л. Культивирование сахароза 20,0 г/л + агар 7, туру пазушных по- при световом режиме 16/8 – 5 клк, t + г/л, световой режим 16/8 – чек 5 клк, t + 22 ± 2 оС.
22 ± 2 оС Хранение - МС БАП 0,1 мг/л + НУК 0, мг/л, сахароза 20,0 г/л, освещение 16/8 – клк, t + 10 ± 2 оС.
Введение в культуру семян – Подвой – сеянцы лимона 4-х недель культ-я in vitro, привой – 2-х недельные регенеранты пазушных почек. Среда DKW + БАП 0,1 мг/л + стерилизация 0,3 % велтолен НУК 0,5 мг/л + сахароза 30,0 г/л+ агар 7,0 г/л, световой режим 16/8 – 25 минут клк, t + 22 ± 2 оС.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Samarina, L. S. Regeneration and micropropagation of lemon cultivars in vitro from nodal explants / L. S. Samarina [et al.] // Russian Agricultural Science – 2010. – 36(6). – P. 417-420.
2. Самарина Л. С. Биотехнология цитрусовых культур: достижения и пер спективы (обзор) / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец, В. М. Горшков // Садовод ство и виноградарство. – 2011 г. – № 6. – С. 27-30.
3. Самарина, Л. С. Оценка регенерационной способности эксплантов цит русовых in vitro / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец, В. М. Горшков // Садовод ство и виноградарство. – 2011. – Вып. 24, № 6. – С. 23-26.
4. Самарина Л. С. Идентификация размноженных in vitro сортов лимона и регенерантов семядолей с помощью ISSR маркеров / Л. С. Самарина, Е. К. По токина // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2013. – № 1. – С. 39-41.
5. Самарина, Л. С. Особенности микроразмножения C. limon в условиях in vitro / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец // Материалы IX молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветерина рии». – ВНИИ СБ, Москва – 2009. – С. 25-26.
6. Горшков В. М. Экологические и биологические особенности основных видов рода Citrus для промышленного возделывания / В. М. Горшков, Л. С.
Самарина, Т. М. Коломиец // Субтропическое и южное садоводство России. – 2009. – Т. 2. – С. 250-255.
7. Самарина, Л. С. Регенерация лимона in vitro из стеблевых почек и ну целлярных зародышей / Л. С. Cамарина, Т. М. Коломиец // Сб. тез. IV науч. практ. конф. молодых ученых «Научное обеспечение АПК». – Краснодар, г. – С. 220-222.
8. Горшков, В. М. Последствия погодных стрессов для цитрусовых куль тур на примере Citrus unshiu Marc. в прибрежно-черноморской зоне субтропи ков / В. М. Горшков, Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец // Сб. тез. Всероссийский симпозиум «Растение и стресс», Москва, 2010. – С. 115-116.
9. Самарина, Л. С. Медленнорастущие коллекции in vitro как способ со хранения цитрусовых культур в российских субтропиках / Л. С. Самарина, Т.
М. Коломиец // Сб. тез. Всероссийский симпозиум «Растение и стресс», Москва, 2010. – С. 311-312.
10. Самарина, Л. С. Микроклональное размножение цитрусовых культур и их подвоев / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец, Н. С. Налбантова // Сб. тез. VI науч.-практ. конф. молодых ученых «Научное обеспечение АПК». – Краснодар, 2012 г. – С. 51-53.
11. Самарина, Л. С. Разработка приемов культивирования цитрусовых in vitro / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец, Н. С. Налбантова // Сб. трудов ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии. – 2012. – Вып. 46. – С. 175-179.
12. Samarina, L.S. In vitro conservation of Citrus limon (L.) Burm. / L.S. Sa marina, [et al.] // Biological Agriculture & Horticulture, UK (in press).
Благодарности. Автор выражает особую благодарность своему научному руководителю кандидату с.-х. наук Коломиец Татьяне Михайловне, за неоце нимую помощь в написании диссертации и в достижении результатов. Также отдельная благодарность за оказанные содействие и консультативную помощь в выполнении данной работы д.с-х.н. Горшкову В.М., к.б.н. Карпун Н.Н., к.б.н.
Гутиевой Н.М., д.б.н. Малюковой Л.С., д.с.-х.н. Бесединой Т.Д., к.б.н. Маля ровской В.И., к.б.н. Слепченко Н.А., д.с.-х.н, чл.-корр. Россельхозакадемии Рындину А.В., и другим сотрудникам ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии.
Отдельная благодарность сотрудникам ФГБУН Института физиологии расте ний им. К.А. Тимирязева к.б.н. Бургутину А.Б., к.б.н. Моисеевой Н.А. за де тальное изучение работы, ценные замечания и оказанную консультативную по мощь, а также сотрудникам РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева к.б.н. Чередни ченко М.Ю., д.б.н. Соловьеву А.А., д.б.н. Карлову Г.И. Автор выражает от дельную благодарность оппонентам д.б.н. Калашниковой Е.А. и к.б.н. Молка новой О.И. за детальное изучение работы и ценные замечания.
Отдельное спасибо автор адресует к.б.н. Потокиной Е.К. и сотрудникам лаборатории мониторинга генетической эрозии растительных ресурсов ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова за помощь в проведении ISSR анализа.