Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода lactobacillus
На правах рукописи
ТОЧИЛИНА АННА ГЕОРГИЕВНА БИОХИМИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА LACTOBACILLUS 03.00.04 – биохимия 03.00.07 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Нижний Новгород – 2009 2
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор Н. А. Новикова доктор медицинских наук К.Я. Соколова
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор А.П. Веселов кандидат биологических наук И.С. Горлова
Ведущая организация:
Нижегородская государственная медицинская академия
Защита состоится « »_2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском госуниверситете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского
Автореферат разослан «_»2009 года
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.С. Корягин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Микроорганизмы рода Lactobacillus широко распространены в природе, а некоторые виды являются важнейшими представителями микробиоты организма человека [Бондаренко В.М. и др, 2003]. Лактобациллы длительное время привлекают внимание ученых – биохимиков, микробиологов, медиков, экологов, ввиду их потенциального значения для поддержания гомеостаза системы «человек-окружающая среда», сохранения здоровья населения, профилактики и лечения многих заболеваний различной этиологии.
В настоящее время известно, что главным конечным продуктом метаболизма лактобацилл является и кислота. У D- L-молочная гомоферментативных лактобацилл лактат составляет 90% всех продуктов брожения. У представителей гетероферментативных видов в качестве конечных продуктов также образуется молочная кислота и углекислый газ [Шлегель Г., 1987]. Благодаря продукции органических кислот, перекисей и бактериоцинов многие штаммы лактобацилл проявляют выраженную антагонистическую активность в отношении патогенных и оппортунистических микроорганизмов [Quadri L.E., 2002;
Kleerebezem, 2004]. Бактерии рода Lactobacillus усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, омыляют жиры, препятствуют микробному декарбоксилированию пищевого гистидина и повышению количества гистамина [Воробьв А.А.и др, 1999]. В то же время актуальным является получение новых знаний о молекулярно-генетической структуре и биологических свойствах лактобацилл.
Биохимические и морфологические свойства лактобацилл являются в настоящее время основным и единственным критерием межродовой и видовой идентификации этих микроорганизмов. Альтернативой классической биохимической идентификации может стать метод генотипирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработка новых и оптимизация известных молекулярно-генетических методик индикации и точной видовой идентификации бактерий рода является Lactobacillus актуальной, практически значимой и своевременной задачей, которой уделяется большое внимание как отечественными, так и зарубежными исследователями. Однако, несмотря на углубленное изучение этого вопроса на настоящий момент еще отсутствует оптимальная унифицированная лабораторная методика на основе ПЦР, позволяющая проводить индикацию и идентификацию видов рода Наряду с индикацией и Lactobacillus.
идентификацией лактобацилл чрезвычайно важной остается проблема их использования в ряде отраслей микробиологической промышленности (пищевой, фармацевтической). В настоящее время ведется поиск новых биотехнологических подходов к культивированию продуцентов, превосходящих по эффективности раздельное, например совместное культивирование ряда видов микроорганизмов-продуцентов в случае, когда целевым продуктом является многокомпонентный препарат. Необходимым условием успешной реализации этого технологического подхода является наличие симбиотических отношений бактерий-продуцентов. При осуществлении принципа совместного культивирования наиболее пристального внимания заслуживает вопрос контроля динамики роста и количества всех штаммов на разных стадиях процесса. В этой ситуации применение унифицированных молекулярно-генетических методик на основе ПЦР позволит избежать трудоемкого и длительного процесса идентификации бактерий классическим методом.
Цель исследования На основе изучения биохимических свойств и структуры генома разработать унифицированный метод на основе ПЦР для индикации и видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus и исследовать их межштаммовые взаимоотношения.
Задачи 1. Изучить биохимические свойства новых штаммов лактобацилл (сахаролитические свойства).
2. На основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения, представленных в GenBank, подобрать композицию универсальных праймеров для индикации бактерий рода Lactobacillus.
3. Провести оценку сравнительной эффективности различных методов выделения ДНК из клеток бактерий рода Lactobacillus – ферментативного лизиса, кипячения и нуклеосорбции, для последующего проведения ПЦР.
4. Установить нуклеотидную последовательность фрагмента гена 16S рРНК следующих штаммов пробиотических лактобацилл: L. plantarum 8 RA-3, L. fermentum 39 и L. casei 583.
5. Разработать схему видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием «гнездовой» ПЦР специфического фрагмента индикации.
6. Провести сравнение метода видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием ПЦР и классического биохимического метода.
7. На основе изучения биологических (межштаммовых взаимодействий) и популяционно-ростовых свойств микроорганизмов рода Lactobacillus определить композицию биосовместимых штаммов для осуществления процесса совместного культивирования при создании нового многокомпонентного пробиотика и отработать методологию контроля динамики роста с использованием ПЦР.
Научная новизна Разработана новая методика ПЦР для индикации бактерий рода Lactobacillus, основанная на оригинальных (авторских) родоспецифичных праймерах FLg, RLgI и RLgII, составивших предмет патентования.
Впервые установлены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК штаммов L. plantarum 8 RA-3, L. casei 583, L. fermentum 39, которые депонированы в GenBank под номерами FJ210723, FJ210724, что расширило международную базу нуклеотидных FJ210725, последовательностей генома лактобацилл.
Создана унифицированная схема видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием гнездового варианта ПЦР, включающая авторский праймер для идентификации L. delbrueckii.
При изучении межштаммовых взаимоотношений 10 штаммов лактобацилл впервые установлена биосовместимость бактерий L. plantarum и Эффективность совместного выращивания, RA-3 L. fermentum 39.
установленная нами, обосновала создание симбиотика на основе этих лактобацилл с использованием принципа совместного культивирования (Патент №2280465, приоритет от 25.10.2004).
С помощью разработанной методики определены параметры контроля динамики роста новой композиции биосовместимых штаммов вида L. plantarum 8 RA-3 и L.fermentum 39 при совместном культивировании.
Практическая значимость работы Полученные результаты позволили обосновать новые области применения ПЦР при подборе штаммов-продуцентов на этапе идентификации и для контроля штаммового состава на всех этапах производства пробиотических препаратов. Разработанная методология родовой и видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus позволит усовершенствовать контроль технологического процесса на предприятиях по производству фармакопейных препаратов, БАД к пище и продуктов питания на основе молочнокислых микроорганизмов и поставить на новый методический уровень контроль мультиштаммовых пробиотических продуктов на соответствие НТД в органах Роспотребнадзора и Центрах сертификации.
Положения, выносимые на защиту 1. Разработанные методики на основе специфической амплификации фрагмента гена 16S рРНК позволяют проводить индикацию и видовую идентификацию пробиотических штаммов лактобацилл, сопоставимую с их классической биохимической идентификацией.
2. Штаммы L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39, относящиеся к двум разным подгруппам гетероферментативных лактобацилл, обладают синергидными взаимоотношениями, что обосновало их использование в качестве штаммов-продуцентов пробиотиков в условиях технологии совместного культивирования.
3. Разработанный метод полимеразной цепной реакции с использованием «контрольных разведений» бактериальных культур является адекватным для оценки динамики роста L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 в условиях совместного культивирования.
Апробация работы Основные положения и результаты работы были доложены на конкурсе молодых ученых, проводимом в рамках IV съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 2007 г.), на заседаниях Ученого Совета и проблемных научно-практических семинарах Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (2005-2008 гг.).
Структура и объем диссертации Материалы диссертации изложены на 148 страницах машинописного текста, иллюстрированы 17 рисунками и 15 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 185 источников, из которых 108 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования В исследовании использовали:
16 штаммов рода Lactobacillus, Bifidobacterium и Streptococcus в том числе L.plantarum 8RA-3, L.plantarum 38, L.fermentum 39, L.fermentum 90-ТС-4, B.bifidum 1, B.bifidum 791, разрешенные ГИСК им. Л.А. Тарасевича в качестве производственных;
коммерческие лиофильно высушенные препараты: «Линекс» (фирма «Lek»), «Бифидумбактерин» и «Бификол» «Микроген») и (фирма коммерческие кисломолочные продукты: «Активия» и «Актимель» (фирма Danon);
«Иммунеле» (фирма Вимм-Билль-Данн);
нуклеотидные последовательности гена 16S рибосомной РНК бактерий рода Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Carnobacterium, Propionibacterium, собранные в базе данных GenBank/ EMBL/DDBJ. Всего проанализировано 43 последовательности;
компьютерные программы BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov\ BLAST), Oligo 4.0, Mega v.3.0, Mega v.4.0 (www.megasoftware.net);
питательные среды для культивирования и дифференциации молочнокислых бактерий. Для выращивания культур бактерий рода Lactobacillus использовали модифицированные питательные среды МРС (среда J. C. De Man, M. Rogosa и E. Sharpe): полужидкую, содержащую 0,15% агара (МРС-2) и плотную, содержащую 2% агара (МРС-4).
Определение принадлежности выделенных бактерий к роду Lactobacillus проводили по ГОСТ 10444.11-89 «Продукты пищевые. Методы обнаружения молочнокислых микроорганизмов»: по отношению к окраске по Граму, подвижности, наличию каталазы. Определение ферментации углеводов проводили с использованием дисков с углеводами и бульона с бромкрезоловым пурпурным производства «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», Индия.
Для выделения ДНК использовали 12-ти часовую культуру, предварительно стандартизированную согласно стандарту мутности, равному 10 единицам. Выделение ДНК проводили с использованием метода кипячения, метода с использование лизоцима и метода нуклеосорбции Boom R. et al, 1990;
Yost C.K. et al, 2000;
Torriani S. et al, 2001.
В работе использовали праймеры, сконструированные в настоящей работе, а также предложенные в научной литературе Ward L.J. et al, 1999;
Walter J. et al., 2000;
Chagnaud P., 2001.
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 31100 и набора реагентов ABI Prism Big Dye Terminator v. 3.1., согласно рекомендациям производителя в совместной работе с к.б.н. Голицыной Л.Н. и к.б.н. Парфеновой О.В.
Нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК использовали для идентификации штаммов лактобацилл в программе BLAST [www.ncbi.nlm.nih.gov\ BLAST].
Исследование биосовместимости лактобацилл проводили методом совместного культивирования на плотной питательной среды МРС. Были исследованы 10 штаммов лактобацилл.
Особенности динамики развития микробной популяции L.plantarum 8RA 3 и L.fermentum 39 при условиях совместного и раздельного культивирования изучали методом серийных разведений на жидкой среде МДС, путем высева на плотную среду МДС-м и постановки ПЦР в контрольных точках культивирования (3, 6, 9, 12, 24, и 27 часов). Длительность фаз роста культуры определяли графически. Показатели роста культур – удельную скорость роста по количеству жизнеспособных клеток рассчитывали с помощью критерия Иерусалимского [Гланц С., 1999].
Статистическую обработку данных осуществляли общепринятым методом с использованием коэффициента Стъюдента [Гланц С., 1999].
Результаты и их обсуждение 1. Изучение биохимических свойств вновь выделенных штаммов рода Lactobacillus Изучение биохимических свойств лактобацилл, в частности способности ферментировать углеводы, является основой для видовой идентификации этих бактерий. В этом разделе работы представлены данные об изучении биохимических свойств 10 штаммов 7 видов бактерий рода Lactobacillus ( культур), выделенных в лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков из фекалий здоровых детей первого года жизни: L. casei 577, L.
plantarum 30, L. delbrueckii 76, L. rhamnosus 1790, L.acidophilus 1660, L. casei 583, L. plantarum 1862, L. paracasei spp. paracasei 6, L. rhamnosus 7, L. rhamnosus Необходимо отметить, что первичное установление способности 526.
ферментировать сахара, многоатомные спирты и гидролизовать глюкозиды и видовая идентификация этих микроорганизмов была проведена в 1990 году при их выделении с использованием доступных и актуальных на тот момент тест систем и питательных основ. Нашей задачей является расширенное изучение биохимических свойств этих штаммов с использованием коммерческих стандартизированных тест-систем фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», Индия.
Изученные микроорганизмы относятся к двум разным биохимическим группам: виды относятся к группе L. delbrueckii, L. acidophilus гомоферментативных лактобацилл, а виды L. casei, L. plantarum, L. paracasei, L. rhamnosus – к группе факультативно-гетероферментативных лактобацилл.
Метаболизм сахаров у представителей этих групп принципиально отличается: в первом случае генетически детерминирован гликолитический путь, во втором – пентозофосфатный. Гомоферментативные лактобациллы неспособны сбраживать пентозы, что подтверждено нашими исследованиями (табл. 1).
В результате работы нами был изучен спектр утилизируемых субстратов:
углеводов, в том числе олигосахарид раффиноза, метаболизм которого вновь выделенными штаммами не был изучен ранее, многоатомных спиртов (сорбит, маннит) и глюкозидов (салицин, эскулин). Из таблицы 1 видно, что наибольшее количество субстратов утилизируют лактобациллы, принадлежащие к группе факультативно-гетероферментативных лактобацилл. Это связано с тем, что гомоферментативные лактобациллы неспособны сбраживать пентозы, а гетероферментативные микроорганизмы обладают двумя путями метаболизма сахаров, при этом сбраживание гексоз происходит по гликолитическому пути, а пентоз – по пентозофосфатному.
Таблица Биохимические свойства вновь выделенных штаммов лактобацилл Виды Целлобиоза Мелибиоза Раффиноза Мелецитоз Арабиноза Трегалоза Галактоза Мальтоза Сахароза Манноза Салицин Эскулин Ксилоза Лактоза Маннит штамма Сорбит Номер аа Гомоферментативные лактобациллы АЩГ L. acidophilus + + + + - + - + + + + - - - + L. acidophilus 1660 + + + + - + - + + + - - - - + L. delbrueckii 76 + - + - - - - - - - - - - - - ssp. bulgaricus Факультативно-гетероферментативные лактобациллы L. casei 583 + + + + + + - - + + + - + - + + L. casei 577 + + + + + + - - + + + - + - + + L. paracasei 6 + + + + + + - - + + + - + - + + ssp. paracasei L.plantarum 30 + + + + + + + + + + + - + - + + L.plantarum 1862 + + + + + + + + + + + + + - + + L. rhamnosus 1790 + + + + + + - - + + + - + - + + L. rhamnosus 526 + + + + + + - - + + + - + - + + L. rhamnosus 7 + + + + + + - - + + + - + - + + Практический и научный интерес представляет изучение способности лактобацилл к утилизации раффинозы. Этот углевод относится к группе фосфоолигосахаридов (ФОС), используется в составе пробиотических препаратов в качестве пребиотического компонента. Способность к утилизации этого олигосахарида зависит от наличия или отсутствия специфических гликозил-гидролаз. Раффинозу утилизировали штаммы, относящиеся к виду L. plantarum и L.acidophilus, у видов L. casei, L. paracasei, L. delbrueckii утилизации этого олигосахарида не наблюдалось.
При проведении видовой идентификации по спектру изученных свойств возникли трудности при дифференциации видов L. casei, L. paracasei spp.
paracasei и L. rhamnosus, так как их биохимические свойства сходны, отличием является лишь способность к росту при 15С и 450С. Подобные сложности при использовании биохимического метода обуславливают актуальность разработки альтернативных методов идентификации на основе молекулярно генетических характеристик.
2. Разработка методики индикации бактерий рода Lactobacillus на основе специфической амплификации нуклеиновых кислот Индикация и идентификация молочнокислых бактерий классическими биохимическими методами затруднена, так как предусматривает выделение чистой культуры и, соответственно, занимает достаточно длительный отрезок времени (до 8 суток), в связи с чем неудобна для практических лабораторий и, тем более, не удовлетворяет требованиям текущего оперативного контроля продуктов питания. В связи с вышеизложенным очевидно, что разработка унифицированной схемы индикации и идентификации бактерий молочнокислого брожения, в частности широко применяемых в микробиологической промышленности микроорганизмов рода Lactobacillus, представляется актуальной задачей, имеющей большое научно-практическое значение.
На первом этапе работы с использованием программы Mega v.3.0 и Mega v.4.0 нами был проведен сравнительный анализ 43 выровненных полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения. Пример анализа показан в таблице 2.
По результатам анализа сконструированы новые универсальные праймеры для индикации бактерий рода Lactobacillus также на основе гена 16S рРНК: FLg, RLg I, RLg II.
Пара праймеров FLg - RLg I фланкирует фрагмент гена 16S рРНК, расположенный с 48 по 785 нуклеотид, размер получаемого фрагмента – п.н. Размер фрагмента, получаемого при работе с парой праймеров FLg - RLg составляет 612 п.н. Эта пара праймеров фланкирует фрагмент гена 16S II рРНК, расположенный с 48 по 660 нуклеотид. Позиции указаны по последовательности гена 16S рРНК L. casei BCRC10697.
Таблица Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения в регионе прямого родового праймера FLg Источник Нуклеотидные последовательности (5, 3,) аtg FLg caa gtc gag cga gyt L. delbrueckii JSQ2 --- --- --- --- --- -- Bifidobacterium sp. --- --- --- --a --g tga Leuconostoc sp. --- --- --- --a --c -ca Lactococcus sp. t-a gg- ag- -cc -tc c- Streptococcus sp. --- --- --a --a --c tga Carnobacterium sp. --- --- --- --a --c t- Propionibacterium sp. c-- --- agt cg- aac cgg Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на 12 штаммах бактерий, из них 9 штаммов рода Lactobacillus, 2 штамма рода Bifidobacterium и 1 штамм рода Streptococcus.
(рис.1) 1 12 3 4 1 2345М 1 – L. plantarum 8RA-3;
2 – L. fermentum 39;
3 – Bifidobacterium bifidum 1;
4 – Sreptococcus thermophilus 17 T;
5 – отрицательный контроль (DEPC H2O);
6 – маркер размерности ДНК (п.н.).
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения с использованием пары праймеров FLg - RLg I (1) и FLg – RLg II(2) Представленные олигонуклеотиды могут составлять основу для разработки тест-систем, позволяющих проводить индикацию бактерий рода Lactobacillus в однораундовой и двухраундовой полугнездовой ПЦР.
Конструирование универсальных праймеров для амплификации фрагмента 16S рРНК лактобацилл позволило наработать фрагмент, размер которого достаточен для получения геномных характеристик, отсутствующих у штаммов, которые использовались в нашей работе. Было проведено секвенирование фрагмента гена 16S рРНК бактерий L. plantarum 8 RA-3, L.
casei 583 и L. fermentum 39, полученного при использовании пары праймеров FLg - RLg II. Нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК штаммов L. plantarum 8 RA-3, L. casei 583, L. fermentum 39, депонированы в GenBank под номерами FJ210723, FJ210724, FJ210725.
В работе были апробированы 3 метода выделения геномной ДНК: метод кипячения, многоэтапный метод с применением ферментативной обработки и метод нуклеосорбции. Для выделения ДНК использовали 12-ти часовую культуру. Культуры предварительно стандартизировали согласно стандарту мутности, равному 10 единицам. Данное значение оптической плотности бактериальной взвеси соответствует 109 микробных клеток в миллилитре раствора. Порог аналитической чувствительности ПЦР при использовании метода кипячения составил 10000 ГЭ/мл, при использовании метода ферментативной обработки - 100-1000 ГЭ/мл пробы, при использовании метода нуклеосорбции - 10-100 ГЭ/мл пробы. Этот метод был апробирован на различных промышленных препаратах и продуктах функционального питания, содержащих лактобациллы. (рис.2).
Представленные результаты свидетельствуют о высокой эффективности метода нуклеосорбции для выделения ДНК лактобацилл из различных субстратов и дальнейшей постановки ПЦР.
М 1 2 3 4 5 1 – «Активия»;
2 – «Иммунеле»;
3 – «Лактобактерин»;
4 – «Линекс»;
5 – отрицательный контроль (DEPC H2O);
6 – Положительный контроль (ДНК L.
plantarum 8RA-3);
М – маркер размерности ДНК, выраженный в п.н.
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК генома представителей рода Lactobacillus, содержащихся в различных субстратах 3. Разработка унифицированной схемы видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦР гена 16S рРНК и ее апробация Для создания унифицированной схемы видовой идентификации лактобацилл нами был использован принцип гнездовой ПЦР на основе фрагмента 737 п.н., получаемого в результате амплификации ДНК с использованием праймеров FLg и RLg I.
На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ представленных в научной литературе праймеров для идентификации L.
plantarum, L. fermentum, L. acidophilus, L. casei и L. rhamnosus. Праймеры были проверены на специфичность и наличие нуклеотидных замен путем анализа выровненных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК различных видов бактерий молочнокислого брожения и анализа сиквенсов фрагментов гена 16S рРНК штаммов L. plantarum 8 RA-3, L. fermentum 39 и L.casei 583, установленных в рамках проведенной работы. Олигонуклеотиды FERM 1, PLANT1 и CASE3 были модифицированы с учетом выявленных нуклеотидных замен. Для идентификации L. delbrueckii был сконструирован новый праймер, находящийся в области последовательности, фланкированной FLg – RLg I (RLg II). Вновь разработанный праймер FLd обладает низкой степенью гомологии относительно соответствующих регионов ДНК других бактерий молочнокислого брожения, что обеспечивает его специфичность.
Все олигонуклеотиды являются прямыми, составляют систему с праймерами RLg I и RLg II и позволяют в монопостановке или, в ряде случаев, в мультиплексной постановке, проводить идентификацию 6 видов промышленно-значимых лактобацилл (рис. 3).
753 п.н.
RLg I FLg 16SрРНК 599 п.н.
Aci 16S1 RLg II 590 п.н.
FLdel 570 п.н.
F rham 569 п.н.
CASE 567 п.н.
PLANT 452 п.н.
FERM Рис.3. Унифицированная комплексная схема видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus методом гнездовой ПЦР.
Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на 12 штаммах бактерий, из них 9 штаммов рода Lactobacillus, 2 штамма рода Bifidobacterium, 1 штамм рода Streptococcus и Escherichia. Оптимизированные и вновь разработанные праймеры легли в основу унифицированной комплексной схемы идентификации бактерий L. fermentum, L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. delbrueckii с использованием гнездовой ПЦР. Разработанная схема позволяет существенно повысить специфичность и чувствительность анализа, использование единого обратного праймера RLg II для идентификации всех 6-ти видов удобно, как с практической, так и с экономической точки зрения.
Проведена параллельная идентификация видов L. plantarum, L.fermentum, L.acidophilus, L. delbrueckii, L. casei, L. rhamnosus с использованием полимеразной цепной реакции и классического биохимического метода идентификации на основе сахаролитической активности (табл.3).
Таблица Результаты параллельной идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием биохимического метода и методики на основе «гнездовой» ПЦР № Штамм Идентификация Идентификация биохимическим методом методом гнездовой ПЦР 1 L. plantarum 8 RA-3 L. plantarum L. plantarum 2 L. plantarum 30 L. plantarum L. plantarum 3 L.fermentum 39 L.fermentum L.fermentum L. fermentum 90 ТC- 4 L.fermentum/ L. vaginalis L.fermentum L.acidophilus АЩГ 5 L.acidophilus L.acidophilus 6 L. delbrueckii 76 L. delbrueckii L. delbrueckii 7 L. casei 583 L. casei/ L. paracasei spp. L. casei paracasei / L. rhamnosus 8 L. rhamnosus 7 L. rhamnosus/ L. casei/ L. casei L. paracasei spp. paracasei 9 L. rhamnosus 1790 L. rhamnosu/s L. casei/ L. rhamnosus L. paracasei spp. paracasei Из таблицы видно полное совпадение результатов идентификации. В ряде случаев, когда биохимическая идентификация не выявляла четких различий в близкородственных штаммах по спектру утилизируемых углеводов, метод ПЦР позволил уточнить видовую принадлежность близкородственных штаммов.
4. Применение ПЦР для характеристики популяционно-ростовых свойств микроорганизмов рода Lactobacillus Применение метода совместного культивирования требует анализа межштаммовых взаимодействий микроорганизмов в условиях in vitro.
Пригодными для совместного культивирования считают биосовместимые штаммы, т.е. штаммы взаимоотношения которых расцениваются как симбиоз, мутуализм, нейтрализм или синергизм.
Известен опыт совместного культивирования комбинаций видов L. plantarum - L. salivarius и L.fermentum - L. salivarius, что свидетельствует об их высокой способности к сосуществованию [Головач Т.Н., 2004]. Совместное культивирование штаммов L. fermentum 39, L. plantarum 38 и L. paracasei 37, напротив, было неэффективно и приводило к снижению количества живых клеток микроорганизмов всех трех видов в конечном продукте [Лихачева А.Ю., 1992].
Проведено изучение межштаммовых взаимодействий 10 штаммов рода Lactobacillus: L. plantarum 8 RA-3, L.fermentum 39, L.acidophilus АЩГ3, L.
fermentum 90 ТC-4. Штаммы L. casei 577, L. plantarum 30, L. delbrueckii 76, L.
rhamnosus 1790, L.acidophilus 1660, L. casei 583 выделены из кишечника здоровых людей в лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков Нижегородского НИИЭМ и свойства их изучены лишь фрагментарно. По результатам анализа исследуемые штаммы были разделены нами на 3 условные группы: штаммы с сильной антагонистической активностью, штаммы – слабые антагонисты и штаммы со средней антагонистической активностью. К группе биосовместимых лактобацилл со средней антагонистической активностью нами были отнесены следующие штаммы: L. plantarum 8 RA-3, L. fermentum 39, L. fermentum 90 ТC-4, L.
acidophilus АЩГ3, L. casei sp. casei 583, L. acidophilus 1660 (рис. 4).
Межвидовая антагонистическая активность бактерий рода Lactobacillus Штаммы с сильной Штаммы со средней Штаммы со слабой антагонистической антагонистической антагонистической активностью активностью активностью L. plantarum 8 RA-3 L. casei L. plantarum L. fermentum L. delbrueckii L. fermentum 90 ТС- L. rhamnosus L. acidophilus АЩГ L. casei L. acidophilus Рис. 4. Схема, демонстрирующая разделение штаммов лактобацилл по степени антагонистической активности Данные о межвидовых взаимоотношениях, полученные нами, позволили выделить группу бактерий рода Lactobacillus, наиболее перспективных в отношении совместного культивирования. Наибольший интерес из этой группы лактобактерий представляют штаммы L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39, так как обладают выраженным антагонизмом по отношению к условно патогенным микроорганизмам и устойчивостью к спектру антибактериальных средств, недетерминированной плазмидами [Соколова К.Я. и др., 2004]. В нашем исследовании установлена высокая степень биосовместимости этих штаммов, что определило целесообразность их использования в составе стартерной культуры для совместного культивирования. Указанные штаммы имеют сходный оптимум рН и температуры культивирования (370С), общие источники углеводного и белкового питания, устойчивы к действию бактериоцинов друг друга и собственных. На следующем этапе работы проведено изучение динамики роста двух штаммов бактерий рода Lactobacillus:
L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 в условиях раздельного и совместного культивирования с использованием двух методических подходов. С целью контроля титра каждого штамма в смешанной популяции и при раздельном способе культивирования была применена вновь разработанная методика индикации и идентификации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦР.
Реакцию проводили в 2 стадии: родоспецифичная ПЦР с использованием праймеров FLg и RLgI и видоспецифичная ПЦР с использованием праймеров FERM 1, PLANT 1 и RLgII. Кроме этого, нами была использована дифференциально-диагностическая среда МДС-м, позволяющая проводить дифференциацию и подсчет колоний лактобацилл L. plantarum 8 RA-3 и L.
fermentum 39 в смешанной популяции. Для контроля данных метода ПЦР и среды МДС-м применяли титрование проб путем десятичных разведений на жидкой среде МДС-2.
Высевы на среды МДС-м и МДС, и отбор проб для ПЦР проводили в отдельных контрольных точках - 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 24 ч, 27 ч культивирования.
Выбор контрольных точек основывался на опыте предыдущих исследований и позволял проследить длительность и характер всех фаз роста микробной популяции.
В первой контрольной точке (через 3 часа инкубации) количество микроорганизмов в 1 мл среды составляло 1х104 КОЕ/мл во всех трех вариантах (I- монокультура L. plantarum 8 RA-3;
II – монокультура L. fermentum 39;
III- смешанная культура L. plantarum 8 RA-3 + L. fermentum 39). Далее по ходу опыта не отмечено существенных различий в динамике роста всех трех вариантов культивирования. Через 6 часов роста количество КОЕ/мл во всех вариантах составило 1х107, через 9 часов – 1х108, через 12 часов – 1х1010. В точках, соответствующих 24 и 27 часам культивирования плотность микробной популяции снижалась и составляла 1х109 КОЕ/мл. Длительность лаг-фазы во всех вариантах составляла 3 часа (с 3 по 6 час культивирования), длительность экспоненциальной фазы роста – 6 часов (с 6 по 12 час), затем наблюдался выход на плато – стационарная фаза роста (рис.5,А).
Для всех трех вариантов была определена удельная скорость роста (µ) в течение лаг- и лог фазы. Установлена близкая удельная скорость роста популяции в условиях совместного и раздельного культивирования (p0.05).
Значение "конечной точки" lg KOE/мл lg КОЕ/мл 3 6 9 12 24 3 6 9 12 24 время, ч время, ч L. fermentrum в монокультуре А Б L. platarum + a fermentum L. fermentum в монокультуре L. plantarum + L. fermentum lg КОЕ/мл 12 Значение "конечной точки" lg KOE/мл 0 3 6 9 12 24 3 6 9 12 24 время, ч L. plantarum в монокультуре время, ч L. plantarum + L. fermentum L. plantarum в монокультуре L. plantarum + L. fermentum Рис. 5. Развитие микробной популяции L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum при совместном и раздельном культивировании по данным классической микробиологии (высев на среду МДС-м)(А) и по данным ПЦР (Б).
Использование ПЦР позволило определить «конечные точки» (последнее разведение микробной культуры, в котором при постановке ПЦР присутствует ампликон) для каждого контрольного часа культивирования (рис.5, Б). Таким образом была прослежена динамика роста штаммов L. plantarum 8 RA-3 и L.
fermentum 39 при совместном культивировании. С использованием этих данных были определены рекомендуемые контрольные разведения. Наличие ампликонов в этих разведениях при проведении ПЦР служит показателем количества искомого штамма в культуре.
Параллельное использование двух методических подходов – молекулярно-биологической методики на основе ПЦР и классического посева с использованием среды МДС-м позволило точно установить картину динамики роста штаммов-продуцентов в процессе совместного культивирования, характеризовать их взаимодействия как синергидные и доказать целесообразность создания пробиотического препарата на их основе с применением принципа совместного культивирования.
Поставленный опыт позволил определить контрольные разведения, т.е.
десятикратные разведения бактериальных культур из которых целесообразно производить высевы на питательные среды и отбирать культуры для постановки родоспецифичной ПЦР в соответствующих периодах культивирования.
Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что в рамках представленной работы с использованием штаммов лактобактерий с охарактеризованными биохимическими свойствами создана методика индикации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦР гена 16S рРНК;
подобран наиболее эффективный метод выделения ДНК лактобацилл;
установлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК пробиотических штаммов лактобацилл L. fermentum 39, L. plantarum 8RA-3 и L. casei 583;
предложена унифицированная комплексная схема видовой идентификации 6-ти промышленно-значимых видов рода Lactobacillus: L. fermentum, L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. delbrueckii с использованием гнездовой ПЦР;
вновь созданная методика эффективно апробирована с использованием референтных штаммов лактобацилл, показана достоверная сопоставимость методики идентификации на основе ПЦР и классического биохимического метода;
получены новые данные о межвидовых взаимоотношениях промышленно-значимых лактобацилл;
выделена группа биосовместимых видов, перспективных в отношении совместного культивирования;
обоснована возможность применения методики в полуколичественном варианте для контроля видового состава и титра штаммов-продуцентов пробиотических препаратов.
ВЫВОДЫ 1. На основе изучения биохимических свойств 11-ти вновь выделенных штаммов лактобацилл определена их видовая принадлежность (2 штамма отнесены к виду Lactobacillus acidophilus, 1 штамм – к виду L. delbrueckii, 2 штамма идентифицированы как L. casei, 1 штамм как L. paracasei, штамма как L.plantarum, 3 штамма как L. rhamnosus).
2. Подобрана новая композиция универсальных олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента гена 16S рРНК бактерий рода Lactobacillus различных биохимических групп.
3. Впервые установлена нуклеотидная последовательность участка гена 16S рРНК штаммов лактобацилл L. plantarum 8 RA-3, L. casei 583, L.
fermentum 39.
4. Показана высокая эффективность выделения ДНК лактобацилл из различных субстратов методом нуклеосорбции.
5. Разработана унифицированная схема видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием гнездового варианта ПЦР.
6. Впервые установлена биосовместимость штаммов L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 и показана близкая удельная скорость роста популяции в условиях совместного и раздельного культивирования (p0.05).
7. Показана возможность применения метода на основе ПЦР с использованием «конечных точек» для контроля динамики роста L.
plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 в условиях совместного культивирования.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:
1. Точилина А.Г. Новые молекулярно-биологические технологии для идентификации пробиотических микроорганизмов/ Точилина А.Г., Соловьева И.В., Новикова Н.А., Соколова К.Я., Белова И.В., Иванова Т.П. // Доклады Всероссийской научно-технической конференции «Приоритетные направления развития науки и технологий». – Тула, 2007. – С. 52-54.
2. Точилина А.Г. Индикация и идентификация бактерий рода Lactobacillus с использованием полимеразной цепной реакции/ Точилина А.Г., Новикова Н.А., Соколова К.Я., Соловьева И.В., Белова И.В., Иванова Т.П.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2008, №3. – С. 69-73.
Статьи, доклады, тезисы докладов региональных и II.
всероссийских конференций:
1. Новикова Н.А. Разработка метода индикации лакто- и бифидобактерий на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции / Новикова Н.А., Мочалова А.Г., Соколова К.Я., Соловьева И.В., Голицына Л.Н., Новиков Д.В.
Материалы международной конференции «Пробиотики, пребиотики, // синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы». – М., 2004. – С.59-60.
2. Точилина А.Г. Перспективы применения ПЦР для индикации промышленно- значимых штаммов молочнокислых бактерий / Точилина А.Г., Новикова Н.А., Соколова К.Я., Соловьева И.В.// Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний». – Н.Новгород: Изд-во ННГУ им. Н.И.
Лобачевского, 2006. – с. 241-245.
3. Точилина А.Г. Разработка экспресс-метода для видового контроля штаммов-продуцентов многокомпонентных пробиотиков / Точилина А.Г., Новикова Н.А., Соловьева И.В., Соколова К.Я., Белова И.В., Иванова Т.П. // Материалы 4-го съезда общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова, г. Пущино. – 2006. – С.263-264.
4. Точилина А.Г. Совершенствование методов микробиологического контроля БАД к пище / Точилина А.Г., Новикова Н.А., Соколова К.Я. // Журнал «Клиническое питание». Материалы Международного конгресса по пробиотикам. – 2007. – №1-2.
5. Соловьева И.В. Новые биотехнологические аспекты конструирования жидких форм симбиотиков / Соловьева И.В., Соколова К.Я, Григорьева Г.И., Точилина А.Г., Белова И.В., Иванова Т.П.// Доклады Всероссийской научно технической конференции «Приоритетные направления развития науки и технологий». – Тула, 2007. – С. 50-52.