Пробиотический потенциал штаммов propionibacterium freudenreichii и микробиологическая защита хлеба
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописи
ЛИ ХАО (КНР) ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ШТАММОВ PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗАЩИТА ХЛЕБА Специальность 03.00.07 – Микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва - 2009
Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научный консультант:
Рыжкова Евгения Петровна (03.00.07) доктор биологических наук Офциальные оппоненты:
Ушакова Нина Александровна доктор биологических наук кандидат биологических наук Бонарцева Гарина Александровна Ведущее учреждение: Московский государственный университет пищевых произ водств, кафедра «Биотехнология»
Защита диссертации состоится 23 октября 2009 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, корп.
12, Биологический факультет, аудитория 557.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан “ 10 ” сентября 2009 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Н.Ф. Пискункова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Выявление микроорганизмов-пробиотиков, изучение их пробиотически значи мых свойств, исследование воздействия на физиологию макроорганизма (животного и человека), создание новых способов применения как биоконсервантов пищевых про дуктов – всё это в целом современная обширная проблема, которую решают специали сты разных областей. Актуальность её определяется стремлением людей к экологиче ским (биологическим) подходам в поддержании здоровья: сокращению применения химических препаратов (химиотерапия) и любых ксенобиотков, включая антибиотики.
И это действительно возможно: лечение многих заболеваний достигается с помощью пробиотиков именно потому, что они настраивают (регулируют) иммунную систему человека (животных), способны нормализовать микробиоту желудочно-кишечного тракта благодаря избирательной антимикробной активности (без антибиотиков), вызы вать апоптоз некоторых опухолей. Последнее относится и к пропионовокислым бакте риям (ПКБ), действующим, например, против аденокарциномы прямой кишки [Jan et al., 2004]. Все эти наблюдения и достигнутые результаты исследователей в Мире по сути иницированы русским учёным, лауреатом Нобелевской премии 1908 г, И. И.
Мечниковым, который в своё время «вылечил Балканы» от желудочно-кишечных забо леваний с помощью только одной полезной бактерии: Lactobacillus delbrueckii.
Понятие «пробиотик» в настоящее время расширяется по смыслу по сравнению с первоначальным [Rolfe, 2000;
Шендеров, 2001;
Nomoto, 2005;
Cуворов, 2007;
Adams, Huang, 2008] и по определению ВОЗ (2002) подразумевает живой микроорганизм, по ступивший в организм естественным путём, улучшающий его общее физиологическое состояние. Пробиотики в настоящее время условно подразделяют на три категории:
антимикробные, иммуномодулирующие и метаболические [Суворов, 2007]. Возможно и комплексное воздействие пробиотических микроорганизмов. Пробиотики могут быть индигенными (резидентными, автохтонными) или транзиторными, которые проявляют неспецифическую слабую адгезию на эпителии и не колонизируют его.
Пробиотическое действие обусловлено видом микроорганизма, его метаболиз мом. Биологической особенностью классических ПКБ (по сравнению, например, с МКБ) является способность продуцировать ряд метаболитов-нутрицевтиков, включая витамины группы В, в том числе фолиевую кислоту, витамин В12 [Воробьёва, 1976;
Hugenholtz, 2002] и бифидогенные факторы [Kaneko et al., 1994;
Isawa et al., 2002;
War minska-Radiko et al., 2002], выделение пропионовой кислоты (пропионатов) и полипеп тидов, обладающих антимикробными [Holo et al., 2002] и антимутагенными свойствами [Vorobjeva, 2000], наличие в клетках ферментов-антиоксидантов [Краева, Воробьёва, 1981] и другое. В последнее время выявляется штаммовая специфичность пробиотиче ских эффектов микроорганизмов [Warminska-Radiko, 2002;
Lan et al., 2007;
Kekkonen et al., 2008]. Поэтому выявление новых пробиотиков, в том чиле среди штаммов P. freude nreichii, актуально.
Микробиологическая защита пищевых продуктов от порчи всегда актуальна и является альтернативой применению вредных для человека химических препаратов и дорогостоящих физических факторов. Она во все века применялась человеком (эмпи рически, без знания микробиологии), например, сыроделие, в котором ПКБ участвуют, зародилось как способ консервирования молочного белка, казеина, а не как производ ство деликатесов. Вместе с тем, разработки новых способов ведут к улучшению ре зультатов в плане эффективности защиты пищевых продуктов и её безопасности, осо бенно если в основе способов лежит знание биологии микроорганизмов. Именно это актуально.
Классические или «молочные» пропионовокислые бактерии в настоящее время активно прокладывают себе путь в обоих этих направлениях.
Безопасность P. freudenreichii признаётся Европейским комитетом (European Food Safety Authority, EFSA), основанном в 2002 году: статус QPS (Qualified presumtion of Safety, http://www.efsa.europa.eu/EFSA/en.html). Комитет США (Food and Drug Administra tion) также недавно включил эту бактерию в список GRAS (Generally Recognized AS Safe) под номером: 21 CFR133.195 [Lan et al., 2007].
Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось обнаружение действия исследуемых штаммов классических пропионовокислых бактерий (р. Propionibacterium) в качестве пробиоти ков, начальное изучение их пробиотически значимых свойств и разработка новых спо собов защиты пшеничного хлеба от гнилостного поражения.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) идентифицировать имеющиеся в лаборатории штаммы ПКБ с применением молеку лярно-биологическиго метода (сиквенс фрагментов гена 16S рРНК) и филогенетиче ского анализа;
2) исследовать жизнеспособность штаммов пропионовокислвх бактерий в условиях модели желудочно-кишечного тракта;
3) испытать штаммы ПКБ на животных в отношении их действия как возможных про биотиков;
4) оценить пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов пропионовокис лых бактерий: их иммунотропую, антимикробную, антиоксидантную активности, а также способность к образованию некоторых специфических полезных экзометаболи тов;
5) разработать основы накопительной заквасочной технологии производства пшенич ного хлеба, устойчивого к бактериальной деструкции («картофельной болезни») Научная новизна работы Биология классических пропионовокислых бактерий достаточно полно изучена.
Она позволяет прогнозировать их активность в качестве пробиотиков. P. jensenii уже признана эубиотиком, способным к адгезии на слизистой и размножению в ЖКТ [Adams, Huang, 2008]. Вместе с тем адгезия и колонизация эпителия рассматривается как полезное, но необлигатное пробиотическое свойство. Более важным является вы живаемость и функциональная активность полезного для человека (животного) транзи торного микроорганизма в ЖКТ. Научные предпосылки указывают на штаммовую де терминированность тех или иных свойств бактерий-пробиотиков. Штаммы P.
freudenreichii ещё не получили статуса истинного или автохтонного пробиотика (эу биотика), однако немногочисленные испытания, в том числе и проведённые в нашей работе, свидетельствуют о пробиотическом действии этой бактерии на организм жи вотного. Важное значение работы состоит в оценке и обобщении имеющейся в лите ратуре информации по биологии и пробитически значимым свойствам классических ПКБ.
Новизна настоящей работы состоит, во-первых, в оригинальной оценке выжи ваемости бактерий - кандидатов в пробиотики в агрессивной среде ЖКТ при использо вании разработанной нами модели, а также в обнаружении положительного воздейст вия P. freudenreichii на организм животного на примере птицы;
во-вторых, в выявлении пробиотически значимых свойств (в жидких культурах, культуральных жидкостях и в суспензиях живых клеток) новых изолятов классических ПКБ, которые были филогене тически идентифицированы нами как штаммы P. freudenreichii. Так, показано, что P.
freudenreichii подавляет развитие как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, причём в нейтральной среде, за счёт пропионатов и бактериоцин-подобных веществ. Проведена оценка внеклеточного содержания витамина В12 и активности не которых экзоферментов. Впервые выявлены антиоксидантные свойства жидких куль тур P. freudenreichii, что существенно для их пробиотического действия в ЖКТ, и пока зана иммунотропная активность клеток бактерии (результаты получены практически одновременно с финскими исследователями). Эти наблюдения свидетельствуют о воз можности реализации биологии классических ПКБ в ЖКТ животных, определяющей пробиотические эффекты.
В-третьих, при разработке заквасочного способа применения бактерии для за щиты пшеничного хлеба от гнилостного поражения обнаружили способность P.
freudenreichii развиваться на мучной среде только вслед за МКБ. Установили, что тро фическая цепь между Lactobacillus delbrueckii и P. freudenreichii на мучной среде дей ствует. Предварительное культивирование термофильной молочнокислой бактерии обеспечивает развитие пропионовокислой культуры, предположительно, вследствие накопления лактатов и ферментативной модификации белков мучной среды с образо ванием стимуляторов её роста.
Практическая значимость работы Полученные научные результаты показывают целесообразность использования наших штаммов P. freudenreichii в пробиотических препаратах.
Исследованные штаммы P. freudenreichii готовы для испытаний в качестве про биотических препаратов, которые могут быть применены как в животноводстве, так и в клиническом или профилактическом питании пациентов-добровольцев. Поскольку данные бактерии, скорее всего, транзиторные пробиотики, их потребление должно быть перманентным (периодическим) при высокой исходной концентрации клеток (не менее 108 - 109) и их экзометаболитов.
Выявленные пробиотические эффекты и свойства исследуемых штаммов P.
freudenreichii позволяют использовать их в пищевой промышленности в качестве био консервантов не только с уверенностью в безопасности, но и достигая обогащения пи щевых продуктов клетками-пробиотиками и их полезными экзометаболитами.
Разработан способ приготовления пшеничного хлеба, устойчивого к «карто фельной болезни», с использованием пропионовокислой закваски, которую можно на капливать в условиях хлебозаводов перед внесением в дрожжевое тесто на мучной сре де в требуемом количестве. Этот удобный и экономичный способ включает трофиче скую цепь между L. delbrueckii и P. freudenreichii. Он даёт возможность накапливать пропионовокислую закваску в нестерильных условиях (без контаминаций), которая содержит натуральные пропионаты, в геометрической прогрессии путём её двукратно го разбавления свежей мучной средой, предварительно ферментированной L.
delbrueckii. Способ испытан в условиях, соответствующих производственным. Достиг нуты практически важные результатов в хранении хлеба и улучшении его качества (способ патентуется).
Апробация результатов Результаты диссертационной работы были доложены на Всероссийском симпо зиуме «Автотрофные микроорганизмы». Москва. МГУ имени М.В. Ломоносова, биоло гический факультет, декабрь 2005;
на Международном Конгрессе «Пробиотики, пре биотики, синбиотки и функциональные продукты питания». Санкт-Петербург, май 2007 г.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Исследуемые штаммы безопасны для животных и человека на основании их принадлежности к Propionibacterium freudenreichii.
2. Выживаемость исследуемых штаммов P. freudenreichii в в модельной пищевари тельной системе даёт возможность их применения в качестве метаболизирую щих пробиотиков.
3. Пробиотическое действие в отношении животного организма выявлено на при мере двух исследуемых штаммов.
4. Пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов P. freudenreichii: им мунотропная, антиоксидантная, избирательная антимикробная активности, а также образование полезных внеклеточных соединений (в том числе бактерио цин-подобных веществ, витамина В12 и некоторых экзоферментов) служат объ яснению их общего пробиотического действия.
5. Применение ПКБ для защиты пшеничного хлеба от поражения гнилостными бактериями на основе заквасочной технологии (в крупномасштабном производ стве хлеба) может быть успешно реализована с использованием трофической цепи между L. delbrueckii и P. freudenreichii.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, получено положи тельное решение по заявке на Патент РФ.
Объём и структура диссертации Диссертация содержит: Введение, Обзор литературы, раздел Объекты, материа лы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список цитируемой ли тературы (всего 141 наименование), Список публикаций соискателя. Работа изложена на 174 страницах, включает 16 таблиц, 28 рисунков и список сокращений.
Работа выполнена в рамках Договора № 5 (2006-2009 гг) о научном и учебно методическом сотрудничестве между Биологическим факультетом МГУ имени М.В.
Ломоносова и Институтом систематики и экологии животных СО РАН (куратор Сереб ров В.В.).
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Оъекты, материалы и методы В работе использовали штаммы классических бактерий р. Propionibacterium (ра бочее обозначение Pr 1- Pr 7), ранее изолированные из Швейцарского сыра, которые фенотипичеcки существенно различаются между собой. Для их видовой идентифика ции применили молекулярно-биологический метод, основанный на ПЦР гена 16S рРНК и включающий анализ продуктов ПЦР при помощи электрофореза в геле агаро зы, выделение, очистку и секвенирование фрагментов генов длиной более 1300 нуклео тидов. Филогенетический анализ штаммов ПКБ на основе установленной последова тельности генов проведён с использованием базы данных GenBank по последователь ностям генов 16S рРНК. Работу проводили на базе Центра «Биоинженерия» РАН.
Культивирование бактерий р. Propionibacterium Pr 1 - Pr 7 проводили при 30о С периодическим способом (в колбах Эрленмейера, 70% заполнение объёма) при свобод ном доступе воздуха (статичная культура, концентрация кислорода ~ 0,024 мМ или 0, мг/л) на жидких средах нескольких вариантов, а также на «твёрдой» среде.
ГКС = глюкозо-кукурузная среда («богатая»), на которой поддерживали, вре менно (до 3-х месяцев при + 6оС) хранили культуры ПКБ и использовали в опытах.
ГКС-тв = среда ГКС с добавлением агара и мела. Инкубирование засеянной ГКС-тв на чашках Петри проводили в течение 5 - 6 суток при 30оС в анаэростате.
ЛКС = лактатно-кукурузная среда имела тот же состав, что и ГКС, но вместо глюкозы был взят лактат натрия.
мСС = минимальная синтетическая или глюкозо-минеральная среда содержала глюкозу, соли и витамины: пантотенат кальция, тиамин и биотин. Концентрация хло ристого кобальта – 1,0 мг/л. Вода дист.;
рН 6,8–7,0. Время культивирования варьирова ли от 48 до 96 часов.
пСС-А = полусинтетическая среда: глюкозо-минеральная среда (мСС), обога щённая триптоном или пептоном, содержит 1,0 мг/л хлористого кобальта.
пСС-Б = то же, соль кобальта – 0,1 мг/л.
Выживаемость штаммов P. freudenreichii в агрессивной среде ЖКТ оценивали используя в качестве реактора (модельный ЖКТ) резервуар, содержащий овсяные хло пья «Геркулес» в качестве пищи, желудочный сок (аптечный) или/и эмульсию желчи (аптечной) в разных сочетаниях. Время инкубирования варьировали. Температуру под держивали равной 36,6оС. Перед контрольными высевами ПКБ рН среды доводили до нейтрального значения. Анализ микробиологической чистоты культур проводили с по мощью светого микроскопа Laboval-4 (Zeiss, Germany) в фиксированных окрашенных препаратах. Количественную оценку роста осуществляли по А540 (Specol 10, Germany), а также по КОЕ/мл.
Пробиотические эффекты в отношении животного организма (на примере пере пелов) оценивали по показателям развития, сохранности и продуктивности птицы при ежедневном введении в питьевую воду КЖ штаммов Pr 2 и Pr 4 из расчета 0,1 мл на голову в сутки в течение 10 суток. Выборка птицы по принципу аналогов составила голов. Базой для испытаний служила перепелиная ферма: физиологический двор ГНУ СибНИПТИЖ СО Россельхозакадемии.
Иммунотропную активность исследуемых штаммов ПКБ выявляли и измеряли по концентрации цитокинов, образуемых в крови ex vivio [Рябичева и др., 2006] под влиянием введённых клеток ПКБ. Концентрацию цитокинов определяли с помощью наборов для иммуноферментного анализа производства ЗАО «Вектор-Бест» (п. Коль цово, Новосибирская обл.). Положительным контролем являлся комерческий препарат «Иммунал». Количественным параметром служило соотношение концентрации цито кина в пробе с препаратом к концентрации цитокина в пробе без препарата, т.е. отно шение индуцированной продукции цитокинов к спонтанной продукции (индекс стиму ляции, ИС).
Обнаружение внеклеточного витамина В12 (суммарных корриноидов) у штам мов P. freudenreichii Pr 1 - Pr 7, выращенных на пСС, с увеличнной концентрацией хло ристого кобальта (5,0 мг/л), было сделано спектрофотометрическим сканированием их КЖ, а также растворов белков, сконцентрированных после высаливания сульфатом ам мония из КЖ. Критерием присутствия корриноидов служило появление абсорбции в области длины волны 360 нм в результате обработки препаратов раствором нитрита натрия [Канопкайте, 1978;
Pratt, 1982;
Канопкайте, Рачкус, 1991]. Измерение концен трации корриноидов (суммарных соединений группы витамина В12) в КЖ проводили микробиологическим методом с тест-культурой E. coli 113-3, ауксорофу по В12 или метионину. Чувствительность метода – 0,025 нг.
Общую активность протеолитических ферментов свежеприготовленных культу ральных жидкостей ПКБ (в нейтральных и кислых условиях) измеряли спектрофото метрическим методом с использованием искусственного субстрата: азоказеина, кото рый в своём составе содержит азокраситель, высвобождаемый при гидролизе белка [Vinokurov et al., 2006]. Измерение активности выполнили в Отделе биохимии белков Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ имени М.В. Ло моносова.
Суммарную активность липолитических ферментов в КЖ штаммов ПКБ, выра щенных на мСС, измеряли также по гидролизу хромогенного субстрата – пара нитрофенилбутирата. Метод основан на спектрофотометрическом измерении концен трации пара-нитрофенола, который выделяется при гидролизе синтетического субстра та под действием липазы. Анализ проводили в лаборатории проф. С.П. Синеокого (ВКПМ).
Антимикробную активность штаммов P. freudenreichii исследовали по отноше нию к некоторым микроорганизмам-мишеням, которые культивировали при 30оС на следующих средах:
МКБ-пСС или МРС - полусинтетическая cреда для молочнокислых бактерий (г/л) глюкоза – 20;
пептон – 10;
дрожжевой экстракт – 5,0;
(NH4)2SO4 – 5,0;
КН2РО4 – 1,5;
MgSO4·7H2O – 0,5;
Ca(NO3)2·4H2O – 0,1;
микроэлементы (мг/л) MnSO4·5H2O – 5, или MnCl2·4H2O – 4,0;
ZnSO4·7H2O – 0,01;
FeCl3·6H20 – 0,005;
вода дист., рН 6,8.
Среда А для Вacillus sp. и Pseudomonas sp. (г/л) глюкоза – 20;
(NH4)2SO4 – 5,0;
KH2PO4 – 1,5;
MgSO4·7H2O – 0,5;
Ca(NO3)2·4H2O – 0,1;
микроэлементы (мг/л);
вода дистиллированная;
рН 6,8-7,0.
Среда В для E. сoli и Pseudomonas sp. (г/л): глюкоза – 20;
пептон– 1,0;
(NH4)2SO – 3,0;
KH2PO4 – 1,0;
MgSO4·7H2O – 0,25;
дрожжевой экстракт – 1,0;
микроэлементы (мг/л) MnSO4 ·5H2O – 5,0 или MnCl2·4H2O – 4,0;
ZnSO4·7H2O – 0,01;
FeCl3·6H20 – 0,005;
вода дистиллированная;
рН 6,8-7,0.
Среда С для S. cerevisiae (г/л) глюкоза – 60, (NH4)2SO4 – 5.0, KH2PO4 – 1.5, MgSO4·7 H2O – 0.5, Ca(NO3)2· 4 H2O – 0,1, кукурузный экстракт –1,0, микроэлементы (мг/л): MnSO4 ·5H2O – 5.0 или MnCl2·4H2O – 4,0;
ZnSO4·7H2O – 0,01, FeCl3·6H20 – 0,005, вода дистиллированная;
рН 6,8-7,0.
Плотные среды, используемые для газонов бактерей-мишеней при анализе АНМФ: Вacillus subtilis и B. cereus культивировали на среде А с добавлением 2% агара, поддерживали на скошенном картофельном агаре. Аэробный рост газонов бацилл – ч при 30оС. На поверхность среды наносили по 1 капле жидких культур.
B. coagulans растили на среде: (%) NaСl – 1,0;
пептон – 1,0 с добавлением бульона Хоттингера [Стоянова и др., 2006]. Аэробный рост – 24 ч при 55оС.
Pseudomonas sp. и E. сoli растили также аэробно на плотной среде В при 30о ме нее суток.
Для молочнокислых бактерий на чашках использовали среду МРС с добавлени ем агара (2%) и мела (0,5%). L. plantarum и L. fermentum растили анаэробно (в анаэро статах), остальные МКБ – в присутствии воздуха. Выращивали в течение двух суток.
Качественный и количественный анализ ЛЖК (пропионовая и уксусная кислоты) проводили методом газовой хроматографии с использованием аппаратно програмируемого комплекса на базе газового хроматографа «Кристалл 2000М», производитель СКБ «Хроматэк», г. Йошкар-Ола, Россия. Параметры колонки НР FFAP составляли 50 х 0,32 х 0,5 мм. Детектор – пламенно-ионизационный. Образцы готовили путем перевода солей ЛЖК в форму кислоты. Концентрацию молочной кислоты измеряли методом ВЭЖХ.
Выявление бактериоцин-подобных веществ (БПВ). Культуры выращивали на разных средах. В первом опыте – на ГКС в течение 4-х суток. В последующих опытах по выявлению бактериоцинов – на мСС в течение 5 - 6 суток. КЖ штаммов ПКБ получали центрифугированием культур при 17000 об/мин (30000g), 20 мин с охлаждением. Центрифуга фирмы «Beckman» (США), модель J2-21. Диализ проводили в 0,02 М К-фосфатном буфере с использованием бензоилированных диализных мешков фирмы «Sigma» (США) с размером пор, пропускающих молекулы от 1200Да и менее. Осаждение полимеров из КЖ культур, выращенных на мСС, проводили постепенным добавлением (на магнитной мешалке) насыщенного раствора сульфата аммония до конечной концентрации насыщения 77% при комнатной температуре.
Осадки собирали на мембранных фильтрах с диаметром пор 0,4 мкм, перерастворяли в 0,02 М К-фосфатном буфере рН 7,0, диализовали ночь при 6оС. Диализное соотношение 1:200. Измеряли концентрацию белка и обрабатывали протеиназой К фирмы «Amresco» (США)/«Helicon» (Россия). Для выявления БПВ использовали метод диффузии в агар: в лунки ( = 0,8 см) на свежезасеянных газонах вносили препараты штаммов Pr 1 - Pr 7 по 0,1 мл КЖ. Два часа выдерживали при комнатной температуре и затем инкубировали при 30оС 18-20 ч или 42-48 ч (МКБ). Контроль за микробиологической чистотой культур ПКБ и микроорганизмов-мишеней проводили путём световой микроскопии с помощью микроскопа LABOVAL-4 (Carl Ceizz, Yean).
Рост жидких культур измеряли на спектрофотометре “Specol”, model 10, Germany, при 540 нм и прямым подсчётом клеток в поле микроскопа и по КОЕ/мл.
А540 (по суспензии клеток Pr 4) в 1 см кювете = 0,301 мг/мл АСБ = 3,3 х 108 КОЕ/мл.
Для оценки антиоксидантной активности использовали жидкие культуры штам мов P. freudenreichii (Pr 2) и P. freudenreichii (Pr 4), выращенные на мСС в течение 72 ч при 30оС при свободном доступе воздуха с периодической нейтрализации образуемых кислот. Концентрация живых клеток в конце культивирования составляла (3-4) x КОЕ/мл. Для измерения антиоксидантной активности штаммов бактерии использовали электрохимический метод катодной вольтамперометрии. Методика эксперимента за ключалась в получении вольтамперограмм катодного восстановления кислорода с по мощью портативного программируемого анализатора «Антиоксидант» (фирма «Поли ант», г. Томск). В основе метода лежит модельная реакция электровосстановления О2, протекающая на индикаторном электроде по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в тканях и клетках организмов, способных к кислородному дыханию. В дан ном способе (рН в измерительной ячейке 6,8-7,0) рассматривается одноэлектронное восстановление кислорода с образованием активных кислородных радикалов О2-.
Снижение их концентрации в растворе регистрируется по уменьшению катодного тока ЭВ О2 на ртутно-пленочном электроде в области потенциалов от 0 до – 0,7 В. Измере ния проводили на каф. биофизики Томского гос. университета.
В процессе разработки способа приготовления хлеба, устойчивого к «картофель ной болезни, использовали следующие мучные среды:
Мучная среда 1 (оМПЗ) или «осахаренная» мучная пшеничная заварка. Для при готовления оМПЗ пшеничную 2 сорта заваривали водой с температурой 85-90°С (соот ношение мука:вода=1:3). После охлаждения заварки до 55°С вносят ферментные пре параты -амилазы (Bakezyme P500BG, пр-во фирмы DSM, Германия) и глюкоамилазы (Bakezyme AG800BG, производство фирмы DSM, Германия) в количестве 0,001% и 0,01% к массе муки в заварке соответственно. Продолжительность гидролиза при тем пературе 55° С 1,5 часа.
Мучная среда 2 (МС 2). Среду готовили путем заваривания муки кипящей дрожжевой водой в том же соотношении и после охлаждения обрабатывали амилазами, как описано выше, а также протеолитическими ферментами (DSM Bakery Ingredients;
Bakezyme B 500 (нейтральная бактериальная протеаза). Дозировка: 0,5 - 3,0 г/100кг.
Водный экстракт осахаренной мучной среды (ЭМС). Для приготовления ЭМС оМПЗ центрифугировали: 45 мин при 9000 тыс. об/мин. В результате получали про зрачный водный раствор, сводный от нерастворимых компонентов оМПЗ.
Экстракт мучной среды оМПЗ, предварительно ферментированный с помощью L. delbrueckii, обозначен как ЭМС/LD.
Lactobacillus delbrueckii штамм 40 получен из коллекции ГосНИИ ХП. Штамм депонирован в ВКПМ под номером В-3887. Бактерию поддерживали на солодовом сусле (12%) с дробиной, культивируя 24 - 48 ч при 50 - 52оС. Выращенную культуру хранили при 6 - 10оС. В опытах L. delbrueckii культивировали (18 - 20 ч при 50оС) на оМПЗ.
Моделирование процесса накопления закваски на основе ПКБ для внесения её в дрожжевое пшеничное тесто состояло в последовательном (поэтапном) двукратном разбавлении культуры P. freudenreichii, выращенной на ЭМС/Ld, с помощью этой же среды. Значение рН сразу после разбавления поддерживали нейтральным. Накопление закваски в условиях, соответствующих производственным, проводили на натуральной нестерильной оМПЗ (без центрифугирования). Подавление развития контаминирующих муку молочнокислых бактерий достигалось предварительной 2 ч экспозицией смеси (на каждом этапе) в присутствии молочной кислоты, образованной L. delbrueckii.
Световую микроскопию фиксированных окрашенных препаратов проводили с помощью микроскопа Laboval-4, Zeiss, Germany. Компьютерное изображение получено с помощью микроскопа Axioskop (Zeiss, Germany) системы автоматического анализа изображений KS 300, Zeiss (Germany). Увеличение при съемке х1000.
Статистическую обработку полученных результатов выполняли с применением разных подходов в зависимости от количества повторных измерений. Среднее арифметическое значение со стандартным отклонением вычисляли в опытах с большим количеством вариант (программа SigmaPlot 3.02). Медиану (Ме), т.е. среднее по величине показание с максимальным отклонением (в %), использовали в экспериментах с тремя повторностями [Венчиков, Венчиков, 1974].
Результаты исследования 1. Секвенирование фрагментов 16S рРНК и филогенетический анализ исследуемых штаммов ПКБ На основании подробного сравнительного филогенетического анализа с ис пользованием базы данных GenBank были получены pезультаты, позволившие найти положения новым штаммам на филогенетическом дереве [Van de Peer, De Wachter, 1994]. Уровень гомологии последовательностей анализируемых штаммов с типовым штаммом P. freudenreichii DSM 4902T (GenBank AC number Y10819) был высоким, более 99 % (для Pr 4 = 99,6%). Все исследуемые штаммы вошли в кластер, образо ванный имеющимися в базе данных штаммами вида P. freudenreichii, включая типо вые штаммы двух подвидов этого вида: P. freudenreichii ssp. freudenreichii и P. freu denreichii ssp. shermanii (рис. 1). Штаммы Pr 1 - Pr 7 имели близкие последовательно сти генов 16S рРНК с высоким процентом сходства между собой (99,3 - 99,6%). При этом секвенированные фрагменты генов 16S рРНК изучаемых штаммов обнаружили высокий уровень гомологий с аналогичными последовательностями различных штаммов P. freudenreichii (99,1 - 99,9%). Ранее столь же высокий уровень сходства генов 16S рРНК (доступных из базы данных GenBank) был обнаружен между штам мами, принадлежащими к различным видам рода Propionibacterium: не только P.
freudenreichii, но и других, например, P. acidipropionici (98,9-100%) и P. acnes (98,1 100%). Следовательно, обнаруженный нами уровень сходства генов 16S рРНК ис следуемых штаммов с известными представителями вида P. freudenreichii соответст вует наблюдаемым уровням внутривидового сходства у других видов рода Propionibacterium. Согласно существующим представлениям [Stackebrandt, Goebel, 1994], этот уровень соответствует внутривидовому. При этом уровень сходства по следовательностей изучаемых штаммов с представителями других (помимо P. freu denreichii) видов рода Propionibacterium был заметно ниже (91,1 - 95,7%). На осно вании полученных данных можно идентифицировать изучаемые штаммы Pr 1 - Pr 7 как представителей вида P. freudenreichii.
Штамм Pr 4 был заявлен в GenBank и зарегистрирован как P. freudenreichii RVS 4-irf (International GenBank AC number EU418709). Штаммы Pr 2 (P. freudenreichii RVS 2-ims) и Pr 4 (P. freudenreichii RVS-4-irf) депонированы в ВКПМ.
Рис. 1. Филогенетическое положение штаммов P. freudenreichii Pr 1 - Pr 2. Пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов P. freudenreichii и их действие на макроорганизм 2.1. Выживаемость штаммов P. freudenreichii в условиях модельного (неполного) ЖКТ Наблюдали, что все семь штаммов исследуемых ПКБ росли на ГКС после их предварительного инкубирования (3 ч при температуре тела) в присутвии желудочного сока, который вводили в среду до конечного значения рН 2,5 - 3,0, или 0,5 - 1,0 % эмульсии желчи (конечный рН 8,0 - 8,4) после нейтрализации среды способны к росту.
Данные представленные на рис. 2, показывают, что после инкубирования клеток в условиях «желудка» или «тонкого кишечника», жизнеспособность культуры Pr 4 со хранялась. Снижение роста ПКБ на богатой среде по сравнению с контролем, очевидно, вызвано гибелью или инактивированием части клеток в агрессивных условиях.
Оценили уровень выживаемости ПКБ в неполном модельном ЖКТ (по концен трации живых клеток) в результате последовательного инкубирования в условиях «же лудка» (3 ч, смесь А) и, после нейтрализации кислот, «тонкого кишечника» (5 ч, смесь Б). Перед вторым этапом инкубирования смеси хранили в течение ночи при 6оС и при нейтральном значении рН (табл. 1).
Рис. 2. Способность P. freudenreichii Pr 4 к росту на богатой среде (ГКС) после инкуби рования в условиях искусственного желудка и (параллельно) тонкого кишечника:
1- контроль: рост на ГКС, в качестве посевного материала (10%) использовали 3-х су точную культуру, выращенную на ГКС;
2 - опыт: рост на ГКС после экспозиции культу ры в реакторе с желудочным соком (модель “желудок”). 3 - опыт: рост на ГКС после экспозиции с желчью (модель «тонкий кишечник»).
Таблица 1.
Выживаемость P. freudenreichii Pr 4 в условиях модельного (неполного) ЖКТ Повторные До начала экспозиции После экспозиции (независимые) (без инкубации), (инкубация в смесях АБ), эксперименты контроль 0-времени опыт КОЕ/мл log % по log КОЕ/мл log % по log 9 1. 2,8 х 10 9 100 4,6 х 10 6 66, 3,7 х 109 1,0 х 2. 9 100 6 66, 9,7 х 108 9,1 х 3. 8 100 5 62, 3,7 х 109 1,0 х Среднее (Ме) Таким образом, на примере P. freudenreichii штамм Pr 4 мы показали, что ПКБ более чем на 60% (по log КОЕ/мл) могут сохранять жизнеспособность в ЖКТ. Выжи вание в агрессивной среде ЖКТ клеток пропионовокислых бактерий – важное условие для проявления их пробиотического (метаболически обусловленного) действия в ЖКТ, а также основание для изучения их пробиотически значимых свойств.
2.2. Действие штаммов P. freudenreichii на макроорганизм Мы провели испытания двух штаммов классических ПКБ (P. freudenreichii, Pr и Pr 4) на развитие, сохранность и продуктивность птицы (перепелов). В результате проведённых исследований под влиянием введённой КЖ пропионовых бактерий на блюдали увеличение сохранности поголовья птицы, прирост живой массы и сокраще ние расхода кормов. Данные, полученные в экспериментах, представлены в таблице 2.
Таким образом, введение культуральной жидкости (экзометаболитов) штаммов P.
freudenreichii в рацион животных обеспечивает повышение сохранности особей, стимулирует их развитие, снижает расходы корма на единицу продукции. По сути, в данном случае мы констатируем положительное действие экзометаболитов ПКБ, которые содержатся в культуральной жидкости, но не рассматриваем здесь вопрос о функции собственно живых клеток ПКБ в ЖКТ птиц.
Таблица 2.
Эффект культуральной жидкости P. freudenreichii двух штаммов на состояние птицы (перепела) в условиях фермы при введении в рацион Группа I II III Контрольная опытная опытная опытная Сохранность, % 91 95 96 Живая масса в начале опыта, г 8,4±0,08 8,3±0,09 8,2±0,10 8,2±0, Живая масса в конце опыта, г 169,0±2,7 175,6±2,4 177,5±2,8 172,2±3, Прирост живой массы, г:
Абсолютный 160,4±3,7 167,3±4,2 169,3±4,8 164,0±2, Среднесуточный 2,67±0,02 2,79±0,03 2,82±0,04 2,73±0, % к контролю 100 104,3 105,6 102, Потреблено кормов на 1 голову, кг 0,890 0,880 0,891 0, Затраты корма на 1 г прироста, г 5,55 5,26 5,26 5, Контроль — птицу содержали на стандартном рационе I группа — птице дополнительно скармливали КЖ штамма Pr II группа — птице дополнительно скармливали КЖ штамма Pr III группа — птице (в качестве контроля) скармливали среду Блаурока.
Последнее требует специального изучения, однако полученные результаты позволяют прогнозировать положительный эффект цельных культур классических ПКБ на физиологию животных (и человека). Результаты данного эксперимента – показатель пробиотического потенциала классических пропионовокислых бактерий вида P.
freudenreichii, а именно исследуемых штаммов.
2.3. Иммунотропные свойства исследуемых штаммов P. freudenreichii Ранее было известно, что кожные (cutaneous) ПКБ, например, P. acnes и некото рые другие виды, способны проявлять иммунотропные свойства в отношении организ ма животного и человека [Воробьёва, 1995]. Мы впервые наблюдали, что все семь ис следуемых штаммов, которые принадлежат классической («молочной») ПКБ, P.
freudenreichii, обладают иммунотропной активностью (в разной степени), и это являет ся проявлением одного из её пробиотических свойств. В исследовании применили мо дель ex vivo, в которой оценивали образование цитокинов в крови человека под дейст вием клеток исследуемых штаммов классической ПКБ. Полученные результаты по об разованию разных цитокинов (их абсолютные концентрации) под действием клеток семи штаммов представлены в рукописи диссертации. Результаты были получены в трёх независимых опытах при трёхкратном повторении измерений для каждого штам ма. Стимуляция синтеза цитокинов (некоторых интерлейкинов ИЛ, интерферона ИНФ г, фактора некроза опухолей, ФНО-а) клетками ПКБ как правило превышала таковую препаратом «Иммунал», особенно в отношении синтеза ФНО-а. В табл. 3 представле ны данные по ИС в отношении некоторых цитокинов.
Таблица 3.
Индекс стимуляции (ИС*) образования некоторых цитокинов под действием клеток ПКБ (2 мкг/мл сырой биомассы) в системе ex vivo Препарат ПКБ Индекс стимуляции образования цитокинов ИЛ 1-РА ИЛ-8 ФНО-а ИНФ-г 6,61 18,2 295,9 2, Pr 6,13 22,5 247,2 2, Pr 5,30 18,1 515,21 0, Pr 5,51 18,3 641,51 0, Pr 6,57 11,2 275,63 0, Pr 4,71 20,4 566,86 0, Pr 5,78 16,9 632, 67 0, Pr Иммунал (мкг/мл):
0, 300 8,65 2,80 0, 0, 30 4,46 2,95 0, 0, 3,0 1,60 2,51 0, * ИС рассчитывали относительно показаний спонтанно образованных цитокинов в ка ждом отдельном эксперименте. Данные представляют собой медиану при отклонениях менее 10% для трёх вариант типичного из трёх независимых экспериментов.
Подтверждением полученным нами результатам служит работа, выполненная в Финляндии независимо и практически одновременно с нашей. На изолированных мо нонуклеарных клетках крови человека in vitro установлена способность клеток разных бактерий-пробиотиков (в том числе P. freudenreichii JS), взятых в соотношении 1: (клетки бактерий: моноциты), индуцировать синтез цитокинов. Эта способность сильно варьировала у разных штаммов бактерий [Kekkonen et al., 2008]. Для клеток другой классической пропионовокислой бактерии: P. jensenii 702, недавно показаны адъю вантные эффекты (на крысах) в отношении вакцины на основе Mycobacterium tubercu losis [Adams, Huang, 2008].
2.4. Внеклеточный витамин В12 (корриноиды) и некоторые ферменты культуральной жидкости штаммов P. freudenreichii Экзометаболиты пробиотиков непосредственно влияют на метаболизм макроор ганизма-хозяина в результате их всасывания в кровь, но и микроорганизмы, состав ляющие микробиоту ЖКТ, находятся под их влиянием. Среди экзометаболитов про биотиков есть не только ингибиторы, так и стимуляторы (например, бифидогенные факторы) роста бактерий. ПКБ образуют широкий спектр метаболитов (см. таблицу 1 в рукописи диссертации), полезных для человека. Особое место среди них занимает ви тамин В12, который в животном организме участвует в двух метаболических процессах:
биосинтезе метионина и катаболизме жирных кислот через пропионил-КоА. Он содер жится внутри клеток ПКБ [Рыжкова (Иордан), 2003].
Мы попытались измерить его внеклеточное содержание в среде (мСС с повы шенным содержанием соли кобальта) с тем, чтобы в предварительном плане оценить его доступность для клеток эпителия в ЖКТ. Наши исследования цельной КЖ и осаж дённых из неё белков показали, что в среду выделяется очень малое количество соеди нений группы витамина В12. Оно на 3 - 4 порядка ниже, чем в клетках бактерии (по рас чётам на единицу объёма культуры) и составляет 0,1 - 0,3 пг/мл. Поэтому ПКБ как ис точник внеклеточного витамина может иметь реальное значение, только если цельная культура будет поступать в ЖКТ в сконцентрированном виде.
Вместе с тем, КЖ штаммов P. freudenreichii проявили разную по величине про теолитическую активность (ПА), которая зависела от состава среды, времени культиви рования и рН культуральной жидкости (рис. 3). При этом соотношение общих ПА (в 100 мкл КЖ) для штаммов в целом сохранялось. После вычетания контроля и с учетом концентрации белка в КЖ мы рассчитали удельные активности протеаз, которые выра жали как А440/мг белка. Активность КЖ в нейтральных условиях была наибольшей у штамма Pr 2 (0,3);
средней у штаммов Pr 1, 5 - 7 (0,13 - 0,16 - 0,2 - 0,16 соответствен но) и наименьшей у штамма Pr 4 (0,1). В кислых условия (рН 4,5) активность КЖ у всех штаммов была ниже, чем при значении рН, равном 7,0. Пробиотическое значение ПА штаммов P. freudenreichii может заключаться в протеолизе трудноперевариемых белков, например, коллагена или гликопротеидов, если цельная культура будет посту пать в ЖКТ животного в сконцентрированном виде.
Липолитическую активность, которая в принципе свойственна классическим ПКБ, развивающимся в сырах, выявить не удалось, возможно, из-за культивирования бактерий в данных условиях опытах на минимальной среде без индукторов.
Рис. 3. Протеолитическая активность КЖ штаммов ПКБ. А. 48-ч культуры;
Б. 96-ч культуры Обозначения:
- на ГКС, рН=7 ;
- на ГКС, рН7;
-на мСС, рH=7;
-на мСС, рH7;
ГКС;
- мСС 2.5. Избирательная антимикробная активность исследуемых штаммов P. freudenreichii Поддержание (регуляция) баланса микробиоты в ЖКТ – сложный и малоизу ченный процесс. Однако именно он рассматривался как первейшая функция пробиоти ков [Rolfe, 2000;
Шендеров, 2001]. Здесь возникает двойственная проблема: пробио тики должны подавлять развитие нежелательных микроорганизмов в ЖКТ, но, по крайней мере, не влиять негативно на состояние автохтонных пробиотиков. Пробиоти ки условно подразделяют на иммуномодулирующие, метаболические и антимикробные [Суворов, 2007]. Классические ПКБ и, в частности P. freudenreichii, можно отнести ко всем трём категориям. Антимикробная активность имеет большое значение для норма лизации физиологического состояния животного и человека путём регулирования мик робиоты ЖКТ.
Мы выявили подавляющее действие P. freudenreichii семи исследуемых шаммов (Pr 1- Pr 7), в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Некото рые из них (E. coli) могут вызывать дисбаланс микробиоты ЖКТ (колит). Другие имеют прямое отношение к порче пищевых продуктов (бациллы, псевдомонады). Отметим, что определённые штаммы Bacillus subtilis являются пробиотиками для животных, пе реваривающих клетчатку (работы группы д.б.н. Н.А Ушаковой), поэтому в случае по давления их развития ПКБ совместное их применение в комплексных препаратах неце лесообразно.
Испытывали цельные жидкие культуры штаммов ПКБ, выращенных на пСС среде при нейтральном значении рН. Наблюдали зоны подавления роста для следую щих бактерий-мишеней: Bacillus subtilis 40, B. cereus 9, Pseudomonas putida 96, Ps. aeru ginosa 50, E. coli 85, E. coli 109. Эффект подавления был наиболее выражен в отноше нии B. subtilis, Ps. putida и отсутствовал для B. coagulans (здесь не показано). На рис. выборочно представлены качественные данные по антибактериальной активности се ми штаммов P. freudenreichii. Подавление роста патогенных энтеробактерий: Yersinia entercolitica, Salmonella sp. и Listeria monocytogenes, разными штаммами классических ПКБ ранее установили исследователи из Польши [Warminska-Radiko et al., 2001;
2002;
Laniewska-Troekenhem et al., 2004]. Антагонистическое действие ПКБ против некото рых мицелиальных грибов (плесеней) констатировано в Швеции [Lind et al., 2007].
Важным фактом оказалась толерантность L. casei к культуре P. freudenreichii, указы вающая на возможную биосовместимость МКБ и ПКБ. При нейтральном значании рН антимикробными факторами (АНМФ) исследуемых штаммов P. freudenreichii явились пропионаты и впервые обнаруженные у изучаемых штаммов бактериоцин-подобные вещества.
Ps. putida 9 E. coli B. subtilis Рис. 4.
Влияние культур P. freudenreichii (Pr 1 - Pr 7 ) на рост некоторых бактерий-мишеней на плотных средах. Нижние фото: (слева) «вертикальный» штрих - L.casei C1;
(cрава) «вертикальный» штрих - P. freudenreichii Pr Мы установили действующие концентрации пропионата натрия, вызывающие 90% по давление роста, на некоторые микроорганизмы-мишени, растущие на жидких средах.
Данные выборочно представлены на рис. 5. Наибольшую чувствительность проявили штаммы р. Bacillus и Pseudomonas. Достаточно устойчивыми к П-Na в высокой концен трации (0,5% и более) оказались дрожжи и молочнокислые бактерии (МКБ).
Выявленные разные действующие концентрации пропионата косвенным обра зом позволяют прогнозировать эффективность штаммов P. freudenreuchii как антимик робных агентов в ЖКТ (в толстом кишечнике при рН, близком к нейтральному) против тех или иных микрорганизмов. Кроме того эти данные важны для применения ПКБ в качестве биоконсервантов.
Bacillus subtilis 140 Pseudomonas aeruginosa Рост, % к контролю 50 (1) Ps. putida 96 (2) Рост, % к контролю 80 70 50 20 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Концентрация пропионата, % Концентрация пропионата, % S. cerevisiae Y Рост, % к контролю E. сoli Рост, % к контролю 0 0.5 1 1.5 0 0.1 0.2 0.3 0. Концентрация пропионата, % Концентрация пропионата, % Рис. 5. Выявление действующих концентраций пропионата натрия как АНМФ на рост микроорганизмов-мишений Испытание КЖ P. freudenreuchii в аналогичных опытах с бациллами как мише нями показало её более сильное действие по сравнению с чистым пропионатом, взятом в тех же концентрациях, что и в КЖ. Это указывало на образование клетками данной пропионовой бактерии других АНМФ помимо пропионатов. Впервые у наших штаммов обнаружили антибактериальные экзометаболиты, отличные от ЛЖК и их солей, которые, предположительно, имеют полипептидую природу (молекулярная масса – более 1200 кДа) и действуют в нейтральной среде (Таблица-схема 4). Эти бактериоцин-подобные вещества (БПВ) проявили ингибирующее действие в отношении бактерий рр. Васillus (штаммы Pr 1, Pr 4 - 7);
Escherichia (coli) - штамм Pr 6;
Lactobacillus: L. casei ( Pr 3), L. acidophilus (Pr 1, 3, 5);
L. plantarum (Pr 1);
L. brevis (Pr 1 - 6). Действия бактериоцин-подобных веществ различались, если препараты были получены при культивировании штаммов P. freudenreichii на разных средах (богатой или минимальной) и по-разному приготовлены. Оно также зависело от штамма бакте рии-мишени.
Таблица-схема 4.
Выявление антибактериального действия белковых препаратов из КЖ штаммов ПКБ, выращенных на минимальной среде Бактерии- Propionibacterium freudenreichii мишени Pr 1 Pr 2 Pr 3 Pr 4 Pr 5 Pr 6 Pr Bacillus subtilis 40 B. cereus 9 B. coagulans Pseudomonas putida Ps. aeruginosa 50 ?
E. coli E. coli 109 Lactobacillus. casei ? ?
С L. acidophilus 146 ? L. brevis 5 L. brevis 78 L. plantarum A63 L. plantarum L. fermentum - выявлена активность БПВ. - Препараты обработаны протеиназой К (контроль на белок). Пропуск - активности нет.
2.6. Антиоксидантные свойства жидких культур штаммов P. freudenreichii Снижение избыточной концентрации активных форм кислорода в организме животного (человека) благоприятно отражается на его жизнедеятельности. Клетки дан ной бактерии обладают ферментами антиоксидантной защиты: супероксиддисмутазой, каталазой и пероксидазой. В пробиотическом отношении важно, чтобы не только клет ки-пробиотики защищали себя, но культура в целом, в случае её потребления макроор ганизмом, обладала антиокислительными возможностями. С использования высоко чувстительного метода катодной вольтамперометрии на примере двух штаммов выяви ли выраженную антиоксидантную активность жидких культур P. freudenreichii (рис. и табл. 5).
Таким образом, новые штаммы P. freudenreichii проявляют пробиотическое дей ствие на макроорганизм и обладают свойствами, частично объясняющими это дейст вие. Исследование не ограничивается полученными результатами и требует продолже ния, однако представленные штаммы классической пропионовокислой бактерии на ос новании выявленных свойств можно отнести к пробиотикам всех трёх категорий.
Рис. 6. Вольтамперограммы электровосстановления кислорода в отсутствие (1) и в присутствии (2–6) образца культуры P. freudenreichii (штамм Pr 2) при разбавлении 1:100 (А), 1:20 (B) и 1:10 (C) и при времени опыта t=4 мин (2), t=8 мин (3), t=12мин (4), t=16 мин (5) t=20 мин (6) Таблица 5.
Значения кинетического критерия антиоксидантной активности К образцов жидких культур ПКБ и питательной среды (n = 3, P = 0,95) Разбавление Кsr, мкM / мин Sr Наименование образца P. freudenreichii RVS-2-ims:
образец Iа 1:100 0,41 0, 1:20 1,62 0, 1:10 4,12 0, образец Iб 1:100 0,53 0, 1:20 1,84 0, 1:10 1,84 0, P. freudenreichii RVS-4-irf:
образец Iа 1:100 0,51 0, 1:20 1,53 0, 1:10 3,68 0, образец Iб 1:100 0,41 0, 1:20 1,56 0, 1:10 3,82 0, Питательная среда 1:100 0,12 0, 1:20 0,24 0, 1:10 0,38 0, Кsr - кинетический критерий антиоксидантной активности;
отражает количество про реагировавших с анализируемым образцом кислородных форм во времени Sr – относительное стандартное отклонение:
3. Разработка способов применения P. freudenreichii для защиты пшеничного хле ба от «картофельной болезни», вызываемой развитием бацилл P. freudenrichii как биоконсервант пищевых продуктов перспективна и уже дав но применяется, если учесть древнее сыроделие как стихийный способ консервирова ния молочного белка-казеина. Эту бактерию относят к «пищевым» микроорганизмам, а с учётом её пробиотических свойств применение в защите продуктов от порчи стано вится особенно привлекательным. Отметим, что в отличие от молочной и уксусной ки слот пропионовая кислота (пропионаты) как антимикробный фактор активна и при нейтральном значении рН. Последнее важно для протекции пищевых продуктов без их подкисления. При этом в результате воздействия ПКБ на пищевой субстрат (продукт) происходит его обогащение веществами-нутрицевтиками.
Положительный эффект пропионовой кислоты (пропионата) и ПКБ в защите хлеба от гнилостного поражения известен давно. Проблема состоит в способе примене ния в крупномасштабном производстве. Мы предложили разные подходы: производст во биомассы ПКБ на подходящих для пищевых продуктов средах с обеспечением вы сокого уровня образования пропионатов, получение водных растворов пропионовой кислоты/пропионата путём сбраживания сахаров суспензиями клеток ПКБ. Иммобили зация клеток ПКБ, с их реактивацией, для получения пропионовой и уксусной кислот была разработана в нашей лаборатории ранее. Эти способы требуют отдельных произ водств.
Способ защиты хлеба должен быть экономичным и удобным для хлебозаводов.
В России давно применяют так называемую заквасочную технологию на основе молоч нокислых бактерий, которая позволяет накапливать закваску (перед внесением её в дрожжевое тесто при замесе) в геометрической прогрессии путём двукратного поэтап ного разбавления свежей мучной средой.
Мы установили, что ПКБ, в отличие от МКБ, слабо развиваются на обычной мучной среде и постепенно «вымываются» из неё при разбавлениях. В результате про ведённой работы по её обогащению (с использованием в опытах водного экстракта мучной среды, ЭМС) удалось «заставить» ПКБ удваивать биомассу в течение требуе мого периода времени для поэтапного разбавления, однако этот подход имел ограниче ния.
Успешным оказался способ с предварительным выращиванием на мучной среде L. delbrueckii: в этом случае лактат служит субстратом для ПКБ. По нашим наблюдени ям (и в соответствии с литературными сведениями) в результате развития L. delbrueckii может происходить модификация белков муки с образованием пептидов-стимуляторов для роста ПКБ. Кроме того 2-ч экспозиция с молочной кислотой (на каждом этапе, пе ред нейтрализацией среды) препятствовует развитию в нестерильной натуральной закваске контаминирующих МКБ, обычно вытесняющих ПКБ.
Модельные опыты проводили с применением ЭМС/Ld, т.е. ферментированного с помощью L. delbrueckii водного экстракта осахаренной мучной заварки, оМПЗ (рис. 7), а затем использовали натуральную нестерильную мучную среду для культивирования P. freudenreichii RVS-4-irf вслед за L. delbrueckii 40. В последнем случае условия были близки производственным. Натуральная закваска на основе двух культур длительно сохраняла неизменными исходные параметры (концентрацию клеток ПКБ и пропиона тов), а также и микробиологическую чистоту (рис. 7). Выпеченный пшеничный хлеб не только значительно дольше не портился: (в камере ускоренного старения): в 4,5 раза по сравнению с контролем, но и обладал улучшенными органолептическими (приятный ореховый аромат, сдобный вкус) и физическими свойствами (больший объём и порис тость).
Рис. 7. Модель накопительной закваски на основе МКБ + ПКБ: поэтапное удвоение биомассы P. freudenreichii на среде ЭМС/ld после её двукратного разбавления той же средой и инкубирования.
а б Рис. 8. Световая микроскопия комплексной закваски натуральной мучной среды на основе L. delbrueckii и P. freudenreichii RVS-4-irf: а – первый этап;
б – пятый этап Таким образом, исследованные штаммы P. freudenreichii проявили пробиотиче ское действие на животной организм, частично выживали в условиях агрессивной сре ды ЖКТ и обладали существенными пробиотическими свойствами. Учитывая признан ную безопасность бактерии, её биопротекторные возможности, мы рекомендуем по крайней мере два наших штамма: P. freudenreichii RVS-2-ims и P. freudenreichii RVS-4 irf и для испытаний на добровольцах в функциональном (клиническом) питании, и для биоконсервирования пищевых продуктов.
ВЫВОДЫ 1. Филогенетический анализ семи штаммов р. Propionibacterium, изолиро ванных и фенотипически охарактеризованных ранее, позволил установить их принадлежность к одному и том же виду: P. freudenreichii, несмотря на существен ные фенотипические различия. Принадлежность к этому виду свидетельствует о безопасности данных бактерий для животных и человека. Два штамма: RVS-2-ims и RVS-4-irf, депонированы в ВКПМ;
последний заявлен и зарегистрирован в In ternational GenBank (AC number EU418709).
2. На примере P. freudenreichii штамм RVS-4-irf c использованием модель ного (неполного) желудочно-кишечного тракта показали, что пропионовокислые бактерии способны сохранять жизнеспособность, при этом концентрация живых клеток снижается с 109 до 106.
3. Проведены испытания действия штаммов P. freudenreichii RVS-2-ims и RVS-4-irf на организм животного (птицы). Пробиотический эффект штаммов об наружен.
4. Выявлены и частично изучены пробиотически значимые свойства иссле дуемых штаммов:
- иммунотропные (по стимуляции образования цитокинов в крови в системе ex vivo);
- избирательные антимикробные на основе пропионатов и бактериоцин-подобных ве ществ, действующих в нейтральных условиях;
- антиокислительные (показано для жидких культур методом катодной вольтамперо метрии);
- экзометаболитные и экзоферментные (низкое внеклеточное содержание витамина В может быть существенным в сконцентрированных препаратах;
протеолитическая ак тивность проявляется как в кислых, так и в нейтральных условиях).
Для испытаний и применения в качестве пробиотических препаратов могут быть рекомендованы штаммы P. freudenreichii RVS-2-ims и RVS-4-irf как наиболее изу ченные и эффективно действующие.
5. Разработан новый способ применения P. freudenreichii в заквасочной тех нологии производства пшеничного хлеба для его защиты от гнилостных бактерий («картофельной болезни» хлеба): он включает последовательное культивирование на мучной среде L. delbrueckii и пропионовокислой бактерии.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Поландова Р.В., Быковченко Т.Б., Рыжкова Е.П., Данилова И.В., Хао Ли (КНР), Шестаков А.И. Состояние и перспективы использования пропионовокислых бактерий в производстве пшеничного хлеба // Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 5. С.
54-57.
2. Рыжкова Е.П., Ли Хао, Быковченко Т.В., Данилова И.В., Поландова Р.Д. Микро биологическая защита пшеничного хлеба с использованием трофической цепи Lactoba cillus delbrueckii и Propionibacterium freudenreichii // Биотехнология. 2009. № 2. С. 29 37.
3. Драчева Л.В., Дорожко Е.В., Аврамчук О.А., Короткова Е.И., Рыжкова Е.П., Ли Хао, Данилова И.В. Вольтамперометрическое исследование антиоксидантной активности жидких культур пропионовокислых бактерий // Вестник Московского университета.
Биология. 2009. № 4. (в печати).
4. Поландова Р.Д., Быковченко Т.В., Ли Хао (КНР), Данилова И.В., Александрийская Г.В., Рыжкова Е.П. Способ предотвращения заболевания хлеба картофельной болезнью // Патент РФ (Регистрационный № 2008146213 от 25.11.2008, положительное решение).
5. Данилова И.В., Ли Хао., Быковченко Т.В., Рыжкова Е.П. «Пропионовокислые бак терии в защите пищевых продуктов от посторонней микробиоты». Тезисы и доклад на Всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы». МГУ, биологический факультет, декабрь 2005. Москва. Макс Пресс. 2005. С. 87.
6. Данилова И.Д., Ли Хао (КНР), Мао Ю (КНР), Рыжкова Е.П.
«Биосовместимость пропионовокислых бактерий с другими пробиотическими культу рами». Тезисы и доклад на Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, син биотки и функциональные продукты питания». Санкт-Петербург, 15-16 мая 2007 г.
Опубликовано в журнале «Клиническое питание» 2007. № 1-2. А37.
--------