Разработка гибкой малоотходной технологии переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов

На правах рукописи

Дудникова Елена Андреевна Разработка гибкой малоотходной технологии переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов Специальность: 03.00.23 – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук

Москва 2009 г.

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико технологического университета им. Д. И. Менделеева.

Кандидат химических наук, доцент

Научный консультант:

Красноштанова Алла Альбертовна Доктор технических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Строгов Семён Ефимович Доктор химических наук, профессор Розанцев Эдуард Григорьевич

Ведущая организация: Научно - технический центр «Лекарства и биотехнология» (НТЦ «Лекбиотех»)

Защита состоится «17» февраля 2009 г. в 1230 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д. И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д.

9, в аудитории 443.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д. И. Менделеева

Автореферат диссертации разослан «» января 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 Шакир И. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время пищевая промышленность является одним из лидирующих направлений народного хозяйства Российской Федерации.

Наиболее высокие темпы развития наблюдаются в мясоперерабатывающей промышленности. Существенное увеличение масштабов производства в данной отрасли ставит вопрос о переработки образующихся отходов, одним из которых является поджелудочная железа крупного рогатого скота. Выход биомассы поджелудочной железы при убое 1000 голов крупного рогатого скота составляет 250 кг, что для среднего мясокомбината приводит к образованию 3545 тонн данного отхода в год.

Несмотря на то, что поджелудочная железа используется для выделения инсули на, опита, панкреатина, рибонуклеазы, карбоксипептидазы Б и других практически зна чимых препаратов, полная переработка сырья при этом не достигается. Так известно, что при производстве трипсина остаётся до 85 % от исходной массы поджелудочной железы, а при производстве рибонуклеазы не менее 80 % (Баурина М. М., 2002). Таким образом, существующие технологии не позволяют переработать поджелудочную железу в полном объёме.

Следует отметить, что поджелудочная железа является ценным сырьём для био технологической промышленности, поскольку содержит гидролитические ферменты, среди которых наибольшее практическое значение имеют карбоксипептидаза Б и рибо нуклеаза, используемые в пищевой промышленности и медицине. Потребность в кар боксипептидазе Б для России составляет около 40 кг/год, а в рибонуклеазе – кг/год и т. д., причем, промышленное производство ряда гидролитических ферментов, содержащихся в поджелудочной железе не налажено (Хомов В. В., 2001). Выделение данных ферментов является многостадийным процессом из-за необходимости введения дополнительных стадий их очистки от примесных гидролаз. К таким гидролазам относят ся амилолитические, липолитические и протеолитические ферменты, области применения которых, в настоящее время значительно расширяются за счет использования в пищевой, микробиологической промышленности, при производстве синтетических моющих средств, поэтому потребность в этих ферментных препаратах постоянно растёт.

Таким образом, разработка технологии полной комплексной переработки подже лудочной железы с получением максимального количества субстанций гидролаз являет ся актуальным. Данные ферментные препараты после соответствующей очистки могут найти применение в различных отраслях промышленности, включая пищевую и меди цинскую. Однако, процесс такой переработки поджелудочной железы, безусловно, при ведёт к образованию больших объёмов жидких стоков, что значительно осложнит рабо ту сооружений биологической очистки предприятий мясоперерабатывающего комплек са. Поэтому важным аспектом разрабатываемой технологии должна стать минимизация образующихся твёрдых и жидких отходов.

Целью настоящей работы явилась разработка научных основ технологии гибкой малоотходной переработки поджелудочной железы с получением субстанций гидроли тических ферментов.

В задачи работы входило:

1. Изучение количественных закономерностей стадии извлечения ферментов из подже лудочной железы, установление последовательности ее обработки различными экстра гентами, что обеспечило бы минимальные потери активности каждого из них.

Список сокращений и обозначений: ПЖ – поджелудочная железа;

КРС – крупный рогатый скот;

ФП – ферментные препараты;

Кп Б – карбоксипептидаза Б;

РНК-аза – рибонуклеаза;

СВ – сухие вещества;

ВМФ – высокомолекулярная фракция;

НМФ - низкомолекулярная фракция;

Xs – степень осаждения.

2. Изучение количественных закономерностей стадий концентрирования и осаждения выделяемых гидролаз.

3. Разработка кинетических схем извлечения ферментов из биомассы поджелудочной железы, и на их основе предложить алгоритмы управления отдельными технологиче скими стадиями с целью модификации технологической схемы для получения одного или группы ферментов с максимальным выходом.

4. Разработка пути утилизации отходов, образующихся в технологической схеме ком плексной переработки ПЖ.

5. Проведение расчета технико-экономических показателей разрабатываемой технологии.

Научная новизна. Впервые показана возможность применения кинетических мо делей извлечения белковых веществ из биомассы микроорганизмов к процессам извле чения гидролитических ферментов из биомассы ПЖ.

Разработана единая схема последовательно-параллельных превращений для кине тического описания процесса извлечения белковых веществ, показана возможность её модификации для описания процессов извлечения отдельных фракций белковых веществ.

Предложены алгоритмы управления процессом экстракции гидролитических ферментов, позволяющие подобрать оптимальные условия извлечения индивидуального фермента с минимальными потерями остальных.

Проведено количественное изучение стадий ультрафильтрации и осаждения фер ментов из водных и водно-спиртовых растворов.

Показана перспективность переработки образующихся в данной технологии от ходов в продукт кормового назначения.

Практическая значимость. Разработана гибкая технологическая схема выделе ния субстанций ферментов карбоксипептидазы Б и рибонуклеазы с получением в каче стве попутной продукции субстанций липазы, -амилазы, протеолитического комплек са, что позволяет упростить известные технологии очистки карбоксипептидазы Б и ри бонуклеазы. Такой подход позволил повысить выход карбоксипептидазы Б в 2 раза, а рибонуклеазы в 3 раза, при этом качество получаемых субстанций соответствовало пре паратам пищевого назначения.

Установлено, что себестоимость получаемых препаратов в 22,5 раза ниже себе стоимости отечественных и зарубежных аналогов.

Показано, что предложенный способ утилизации стоков данной технологии по зволяет снизить их ХПК не менее чем в 3 раза, кроме того, количество твёрдого отхода биомассы ПЖ уменьшается на 70%.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на III и V Между народных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2005 г.;

Москва, апрель 2007 г.);

Международных конференциях «Успехи в химии и химической технологии» (РХТУ им. Д. И. Менделеева, Москва, ноябрь 2005 г.;

Моск ва, ноябрь 2006 г.;

Москва, ноябрь 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, в том числе одна статья из списка журналов, рекомендованных ВАК;

2 тезисов докладов в материа лах научных конференций;

подана заявка на патент.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзо ра литературы, описания материалов и методик проведения экспериментов и анализов, 7-ми глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсужде ние, выводов, списка литературы, 2 приложений. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, содержит 61 рисунок, 41 таблиц. Библиография включает наименований, из них 131 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы В обзоре литературы приводятся характеристики и свойства ферментов, входящие в состав ПЖ, описание и анализ способов получения ферментов из животного сырья и методы их очистки. Анализ литературы позволяет заключить, что существующие схемы комплексной переработки поджелудочной железы дают возможность получить не более 3-х субстанций ферментов и являются многостадийными. Кроме того, вопросы утилиза ции образующихся отходов в литературе не описаны.

2. Материалы и методы Основным объектом исследования являлась измельчённая до размера частиц мм свежезамороженная поджелудочная железа крупного рогатого скота Можайского мя сокомбината с содержанием 25 % сухого вещества (СВ) и сырого протеина 50 % по СВ.

В работе использовали химические реактивы квалификации не ниже «чда». Со держание сырого протеина определяли микрометодом Къельдаля;

истинный белок в биомассе – методом Барнштейна;

растворённые белковые вещества – по модифициро ванному методу Лоури. Активность -амилазы определяли спектрофотометрическим методом с применением 1 %-ного раствора крахмала в качестве субстрата и 3,5 динитросалициловой кислоты в качестве реагента, активность пересчитывали на мкмоль образовавшейся мальтозы. Активность липазы измеряли по количеству щёло чи, пошедшей на поддержание рН 8, в течение 56 мин. Общую протеазную актив ность определяли модифицированным методом Ансона с применением казеината на трия. Для определения активности трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы Б ис пользовали специфические субстраты метиловый эфир п-толуолсульфонил-L-аргинина (ТАМЕ);

этиловый эфир бензоил-тирозина (ВТЕЕ);

гиппурил-L-аргинин (НА) соответ ственно. Контроль проводили по увеличению оптической плотности при оптимальных условиях гидролиза при соответствующих длинах волн. Определение активности РНК азы проводили методом Калницкого. ХПК измеряли путём дихроматнометрического оп ределения окисляемости воды.

Исследование количественных закономерностей процесса экстракции ферментов из биомассы поджелудочной железы проводили в стеклянном аппарате ёмкостью до 1 л с мешалкой и рубашкой для подвода теплоносителя, штуцерами для установки термо метра и пробоотборника.

Для изучения процесса ультраконцентрирования использовали лабораторную ячейку с рабочим давлением 0,2 МПа с мембранными фильтрами УПМ-10, 20, 50 фир мы «Владипор» и модуль на основе полых волокон ВПУ-20 ПА.

Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки «Specord M-40».

Экспериментальные данные обрабатывали, используя стандартные программы интегрирования дифференциальных уравнений и оптимизации их параметров с после дующим сопоставлением результатов расчёта с экспериментом по критерию Фишера при уровне значимости 0,05 для проверки адекватности разработанных математических зависимостей эксперименту.

3. Экспериментальная часть 3.1 Исследование процесса экстракции гидролитических ферментов из ПЖ КРС Использованная в работе ПЖ содержит различные гидролитические ферменты, способные расщеплять белки, липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты (табл. 1). Ана лиз литературы показал, что данные гидролазы заметно отличаются по стабильности.

Наиболее стабильной является РНК-аза, далее следуют химотрипсин, трипсин и Кп Б, наименее стабильной – -амилаза. Из перечисленных ферментов наибольшую практиче скую ценность и, соответственно, стоимость имеют Кп Б и РНК-аза. Поэтому при разра ботке технологии комплексной переработки ПЖ целесообразно, в первую очередь, обеспечить максимальный выход именно этих ферментов. Согласно литературным дан ным для извлечения Кп Б используются растворы хлоридов натрия и кальция. Поэтому на первом этапе исследований изучили процесс экстракции Кп Б растворами этих солей при обработке 10 %-ой суспензии клеток ПЖ при температуре 30 °С и концентрации со ли 1 % масс. Было установлено, что в этих условиях выход Кп Б на уровне 24 % наблю дается при времени экстракции 3 ч.

Результаты эксперимента показали, что тип соли не оказывает принципиального влияния на выход Кп Б, поэтому, руководствуясь соображениями получения субстанций пищевого назначения, в качестве экстрагента был выбран хлорид натрия.

На первом этапе исследований была подобрана оптимальная концентрация хло рида натрия, обеспечивающая максимальный выход Кп Б (58 %). Она составляет 5 % масс. В табл. 1 представлен состав получаемого при этом экстракта, а также отработан ной биомассы ПЖ. Как видно из табл.1, экстракт содержит значительное количество других гидролаз, и, прежде всего, -амилазу, поэтому целесообразно извлекать из вод но-солевого экстракта в качестве побочного продукта -амилазу.

Таблица Характеристики исходной поджелудочной железы и полупродуктов, получаемых в ходе водно-солевой экстракции Остаточное содержание в Степень шламе ПЖ после водно- экстракции Харак- Состав солевой экстракции ферментов тери водно в раствор стики Показатель солевого исход- при обра % от исход- экстракта* Характери ной ботке соле ного содер стики ПЖ ПЖ жания* вым рас твором, % Сухие вещества (СВ), % 25 21 67 6,9 Сырой протеин, % по СВ 50 36 48 78 -Амилаза, ед./г СВ 1061 286 18 103 Липаза, ед./г СВ 132 89 41 6 КпБ, ед./г СВ 6923 3115 35 544 Трипсин, ед./г СВ 600 126 40 68 Химотрипсин, ед./г СВ 1700 510 37 170 Общая протеаза, ед./г СВ 10044 4821 32 746 РНК-аза, ед./г СВ 316300 240388 51 10845 * активности ферментов в экстракте приведены в ед./мл.

Следует отметить, что отработанная биомасса ПЖ характеризуется высоким оста точным содержанием Кп Б, трипсина, химотрипсина и РНК-азы. Кроме того, при прове дении водно-солевой экстракции удаётся извлечь не более 33 % по СВ. Таким образом, проблема снижения количества твёрдого отхода не решается. Поэтому необходимо раз работать способы доизвлечения субстанций ферментов.

При этом важное значение имеет установление последовательности обработки ПЖ различными экстрагентами, обеспечивающей получение максимального количества субстанций ФП с минимальными потерями активности каждого из них. По литератур ным данным протеазы (трипсин, химотрипсин, Кп Б) извлекают слабокислотными экст рагентами (рН 23), а РНК-азу – сильнокислотными (0,10,5 н. H2SO4). Поэтому, после обработки ПЖ водно-солевыми растворами необходимо проводить экстракцию слабо кислотными растворами, а затем сильнокислотными. Ранее проведённые исследования на кафедре биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева показали, что для извлечения ферментов из ПЖ целесообразно проводить её предварительную обработку органиче скими растворителями, что приводит к частичной дезинтеграции клеток и, соответст венно, увеличивает выход ферментов при более мягких условиях.

Поэтому на следующем Таблица Влияние экстрагента на выход Кп Б и липазы в зависимо- этапе исследований был прове сти от последовательности обработки ПЖ раствором хло- ден выбор органического рас ридом натрия и органическими растворителями творителя и обоснована после довательность обработки ПЖ Выход липазы, % от Выход Кп водно-солевым или органиче исходного содержа- Б, % от ис ским экстрагентом. Кроме того, ния ходного как показали предварительные содержа ния исследования, при этом проис Органический Из натив- Из ПЖ При водно- ходит извлечение липазы. В растворитель после об- солевой экс ной ПЖ табл. 2 приведены данные по тракции из работки выходу липазы и Кп Б в зави хлоридом ПЖ, обра- симости от последовательности ботанной натрия обработки ПЖ вышеуказанны орг. раство ми экстрагентами.

рителями Толуол 8 25 20 Полученные результаты Третбутиловый свидетельствуют, что обраба 25 40 спирт тывать ПЖ на первом этапе ор Этилацетат 40 30 ганическими растворителями Ацетон 23 68 нецелесообразно.

Этиловый спирт - 72 Таким образом, на основе проведённых исследований была предложена следующая схема обработки ПЖ:

спиртовая солевая слабокислотная сильнокислотная (1) экстракция экстракция экстракция экстракция Установив последовательность обработки, необходимо было изучить кинетику экстракций ферментов для выбора оптимальных условий их извлечения и разработки алгоритма управления процессом. На рис. 1 приведены кинетические кривые извлече ния ферментов из биомассы ПЖ, при этом на всех кривых имеются максимумы, что можно объяснить инактивацией ферментов, а так же на кривых экстракции липазы, хи мотрипсина, трипсина и Кп Б на начальных участках есть выраженные точки перегиба.

Аналогичные кинетические кривые были получены ранее сотрудниками кафедры био технологии РХТУ им. Д. И. Менделеева при изучении экстракции белковых веществ из микробной биомассы. Для этого процесса была предложена схема последовательно– параллельных превращений, состоящая теоретически из n-го количества промежуточ ных стадий извлечения высокомолекулярных белковых фракций и их частичного гидро лиза до низкомолекулярных пептидов:

Eкл k0 Ii k1......Ii ki Eр р kин Eин ki k PP k PP k PP (2), k PPp p 0 i PPp p PP0 PPi PP где: E кл, I1, Ii, Е р-р, Е ин – соответственно, концентрация ферментов в клетках ПЖ КРС, промежуточного интермедиата, активного фермента в растворе и инактивированного фермента;

k0, k1, ki-1, ki, k ин – эффектив ные константы скорости соответст 0, вующих стадий;

РР0, РР1, РРi, РРр-р – 0, концентрации низкомолекулярных 0, Степень экстракции Х пептидов, образующихся за счёт час 0, тичного гидролиза высокомолекуляр 0, ных белков;

k PP, k PP, k PP, k PPp p – 0,4 0 1 i эффективные константы скорости со 0, ответствующих стадий.

0, Так как все интересующие нас 0, ферменты извлекаются при обработке ПЖ водно-солевым экстрагентом, была 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 изучена кинетика их извлечения в ходе время, мин водно-солевой экстракции. На основе Рис. 1. Зависимость степени экстракции ферментов проведённых исследований было уста при обработке клеток ПЖ КРС (СВ – 10%) 5 % рас новлено, что схему (2) можно приме твором NaCl при 30 °С.

нить к извлечению белковых веществ Условные обозначения:

из биомассы ПЖ. В отличие от экс 1. Экспериментальные данные:

-амилаза;

липаза;

трипсин;

химотрипсин;

тракции микробных белков в иссле КпБ;

РНК-аза. дуемом процессе не наблюдается гид 2. Расчётные данные:

ролиз белков до низкомолекулярных -Амилаза;

липаза;

трипсин;

хи продуктов, что связано с более мягки мотрипсин;

Кп Б;

—РНК-аза ми условиями экстракции. Поэтому ис следование кинетики процесса в данном случае сводилось к установлению количества лимитирующих стадий извлечения высокомолекулярных белковых фракций.

Первичная обработка полученных кинетических кривых и оптимизация процесса по методу наименьших квадратов показала, что адекватное описание вышеприведённых кривых экстракции Таблица каждого из фер- Кинетические модели извлечения ферментов из биомассы ПЖ ментов достигается Количе при различном ко- ство личестве лимити- Фермент лимити- Схема превращений рующих стадий в рующих стадий схеме превращения -Амилаза Екл k E p p Еин k (2) (табл. 3). 1 0 ин Экспери- Липаза Е кл k I k Е р р Е ин k 2 0 ин ментальных дан Протеолити ные обрабатыва- Е кл k I k Е р р Е ин k ческий ком- 2 0 ин лись по следующей плекс схеме: по началь- Трипсин Е кл k I k Е р р Е ин k 2 0 ин ным скоростям оп Химотрипсин Е кл k I 1 k I 2 k Е р р Е ин k ределили k1;

kин на 0 ин 1 ходили при изуче- Кп Б Е кл k I k Е р р Е ин k 2 0 ин нии кинетики РНК-аза Е кл k E p p Е ин k 1 0 ин инактивации фер ментов в зависи мости от температуры. Были установлены зависимости эффективных констант схемы (2) от температуры и кислотности среды с использованием уравнения Аррениуса и специ фического кислотно-основного катализа. На рис. 1 видно, что схемы превращений (табл.

3) адекватно описывают экспериментальные данные.

Установленные закономерности извлечения ферментов для водно-солевой экс тракции были апробированы для последовательного извлечения ферментов из биомассы ПЖ вышеуказанными экстрагентами и показана справедливость применения вышеуста новленных кинетических схем для каждого случая. Таким образом, были разработаны кинетические схемы для подбора оптимальных условий выделения ферментов, варьируя которые можно достичь выхода одного из них на максимальном уровне. В табл. 4 при ведены оптимальные условия экстракции ферментов.

Таблица Оптимальные условия экстракции ферментов из биомассы ПЖ Степень экстракции, % Макси Тип экстракции Концентрация Экстрагент Время, час мальный Химотрипсин выход -Амилаза Т, °С Трипсин Фермент целевого Кп Б фермен та, % 2,53 68 50 68 Солевая 5% NaCl 1,5 73 - 40 45 -Амилаза Кп Б 2,53 55 68 50 68 Спиртовая Липаза 95% 20 12 78 - - - C2H5OH 3,54 - - 47 30 Трипсин 3,5 48,4 - - 31,3 46, Слабоки рН HCl Химот слотная 4,5 32,8 - 44,6 - 43, рипсин Кп Б 20 4 49,7 - 46,3 29,9 Сильно РНК-аза 0,25 н. 6 3,54 50 - - - H2SO кислотная Используя полученные кинетические модели, было установлено, что меняя время обработки биомассы ПЖ на стадии водно-солевой экстракции, можно получать экс тракт, обогащённый -амилазой (время экстракции 1,5 ч) или Кп Б (время экстракции 2,53 ч).

При извлечении комплекса протеаз слабокислотным экстрагентом можно варьи ровать температуру и время экстракции, и получать экстракты, обогащённые либо трип сином, либо химотрипсином, либо Кп Б. Таким образом, в ходе последовательной обра ботки ПЖ четырьмя типами экстрагентов можно добиться переработки биомассы ПЖ на 70 % по массе.

3.2. Исследования концентрирования ферментсодержащих экстрактов ультра фильтрацией на плоских мембранных элементах и осаждения субстанций фермен тов из ретантов Ферменты в полученных экстрактах находятся в смеси с низкомолекулярными соединениями липидной, углеводной и белковой природы, минеральными компонента ми (прежде всего хлоридом натрия, концентрация которого составляет 38 г/л). В разра батываемой технологии предполагается проводить выделение ферментов путём осажде ния в изоэлектрической точке. Эффективность осаждения в значительной степени опре деляется концентрацией в растворе целевого продукта. Поскольку во всех получаемых экстрактах концентрация белковых веществ не превышает 16 г/л, то не следует ожидать высокой степени осаждения ферментов. Поэтому перед осаждением необходимо про вести предварительное концентрирование экстрактов. Наиболее подходящим для наших целей явилось концентрирование с использованием баромембранных методов, в частно сти, ультрафильтрации.

На первом этапе были проведены исследования с применением плоских мембран ных элементов, что позволило выбрать оптимальный размер пор мембраны, а так же ус тановить основные закономерности процесса (зависимости дифференциальной селек тивности и удельной производительности мембранных фильтров от концентрации фер ментов в растворе). Это позволило определить значение концентрации гелеобразования, и, следовательно, максимально возможную степень концентрирования.

В ходе исследований ультрафильтрации для всех ферментсодержащих растворов были получены типичные зависимости диф ференциальной селективности и удельной производительности от логарифмической ак 0, 0, тивности фермента в ретанте (рис. 2, 3). На 0, зависимостях, приведенных на рис. 3, можно 0, выделить участок линейного падения, что 0, позволяет рассчитать величину концентра 0, ционной поляризации или гелеобразования, 0, при которой производительность мембран 0, ного аппарата равна нулю.

0, Для нахождения величин концентра ционной поляризации использовали уравне 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9, Ln A ние мембраны с идеальной селективностью:

Aгель Рис. 2. Типичная зависимость дифференциаль- G = ln (3), ной селективности процесса мембранного кон- Ар р центрирования ферментсодержащего растворов где: G – производительность, л/м2·ч;

– ко от их активности в ретанте (на примере трип эффициент массоотдачи, л/м2·ч;

Aгель – ак синсодержащего раствора).

тивность фермента в гелиевом слое, ед./мл;

УПМ 10;

УПМ 20;

УПМ Ар-р – активность фермента в растворе, G, л/м ·ч ед./мл.

Обработка экспериментальных дан ных по уравнению (3) позволяет найти зна чение и Aгель, а также по уравнению мате риального баланса:

n A mV = (4) 1 n A (1 ) рассчитать максимально возможную степень концентрирования по объёму (mV), исполь 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 зуя величину степени концентрирования по Ln A активности (nA). Дифференциальную селек Рис. 3. Типичная зависимость удельной произ тивность рассчитывали по формуле:

водительности процесса мембранного концен трирования ферментсодержащих растворов (на Ап = (1 ) 100 (5) примере трипсинсодержащего раствора).

Аисх УПМ 10;

УПМ 20;

УПМ Результаты расчетов приведены в табл. 5.

Таблица. Характеристики процесса ультраконцентрирования ферментсодержащих экстрактов на плоских мембранах Предельно до Рекомендуемые значе G,, пустимые значе Экстракт Марка ния для концентриро ния при гелеоб л л вания экстрактов разовании содержащий мембраны м2 ч м2 ч nА mV* nА mV* mV** -Амилазу УПМ - 20 0,70 16,7 3,37 7,1 - 2,6 8,0 8, Липазу УПМ - 20 0,74 29,8 7,68 15,6 - 2,9 8,5 8, Комплекс УПМ - 20 0,78 21,6 3,14 13,8 - 3,2 9,0 9, протеаз Трипсин УПМ - 20 0,87 24,4 3,56 45,9 - 3,7 6,3 6, Химотрипсин УПМ - 20 0,78 19,0 2,93 9,7 - 2,9 6,3 6, РНК-азу УПМ - 10 0,74 6,3 0,61 16,1 - 2,8 8,0 8, * рассчитанное значение по формуле (4);

** полученные значения из материального баланса Из представленных данных видно, что во всех случаях достигаемая степень кон центрирования составляет не менее 6 раз при относительно высокой селективности (7487 %). Достижение такой степени концентрирования на практике приведёт к резко му увеличению энергозатрат. Поэтому, оптимальные условия проведения процесса ультраконцентрирования можно подобрать только после изучения количественных за кономерностей осаждения ферментов и подбора активности ферментов в ретантах, обеспечивающих степень осаждения не менее 95 %.

Согласно литературным данным для осаждения ферментов используют метод вы саливания сульфатом аммония, что предполагает высокую расходную норму соли. В связи с чем, в наших исследованиях было предложено заменить его осаждением в изо электрической точке. Преимуществами метода осаждения являются простота аппара турного оформления и возможность в одну или несколько стадий получить осадки пре паратов с различной степенью чистоты. Его применение на практике ограничено только условиями, обеспечивающими стабильное образование осадков с заданным выходом, что связано с присутствием мешающих примесей в исходном растворе, наличие и вид которых зачастую невозможно проконтролировать.

При исследовании процесса осаждения ферментов было изучено влияние рН среды на степень осаждения (табл. 6). Из неё Таблица видно, что раздельное осаждение суб станций ферментов возможно. По- Оптимальное значение рН среды осаждения суб скольку водно-солевой ретант характе- станций гидролитических ферментов из ретантов Степень оса ризуется высоким содержанием как - Оптимальное ждения фер Фермент амилазы, так и Кп Б, то целесообразно рН осаждения мента, % выделять обе субстанции из этого кон -Амилаза 5,25,6 центрата. Было установлено, что Кп Б 3,53,8 амилазу вследствие ее высокой лабильно Трипсин 6,5 сти необходимо осаждать первой.

Химотрипсин 6,5 При разработке малоотходной тех РНК-аза 8,5 нологии очень важно исследовать со став образующихся надосадочных жидкостей (табл. 7) и предложить пути их переработки с целью довыделения субстанций ферментов. Надосадочная жидкость, полученная после осаждения -амилазы, характе Таблица ризуется высоким содержанием Характеристика надосадочных жидкостей, получае Кп Б, поэтому ее целесообразно мых после осаждения субстанций ферментов в ИЭТ объединить со слабокислотным Надосадочная жидкость после оса экстрактом перед ультракон ждения:

центрированием последнего и Состав экстракта трипсина и -амилазы Кп Б химотрипсина провести осаждение Кп Б из (рН 5,25,5) (рН 3,63,8) (рН 6,5) объединенного раствора. Надо СВ, % 4,37 1,34 4,15 садочная жидкость после осаж ВМФ 17,5 4 4,5 дения Кп Б из слабокислотного Белок, НМФ 27 15 31 экстракта обладает высокой г/л Общая 44 19 35 протеолитической активностью -Амилаза, ед./мл 44 - за счёт наличия в ней химот Липаза, ед./мл 6 - рипсина и трипсина. Однако, Кп Б, ед./мл 1328 148 как следует из табл. 6, степень Трипсин, ед./мл 93 96 их осаждения при таких актив Химотрипсин, 303 282 109 ностях не превышает 70 %, по ед./мл этому для выделения субстан Протеолитический 2046 1649 631 ций этих ферментов необходи комплекс, ед./мл мо подвергнуть их концентри РНК-аза, ед./мл 26615 20095 рованию с последующим осаж дением. Надосадочная жидкость, полученная после осаждения субстанций химотрипси на и трипсина, обладает РНК-азной активностью, поэтому её можно объединить с силь нокислотным экстрактом.

Таким образом, на данном этапе исследований была разработана принципиальная схема объединения основных жидких стоков, образующихся в технологической схеме, с целью максимального выделения субстанций ферментов и минимизации объёмов сточ ных вод.

3.3. Концентрирование ферментных растворов ультрафильтрацией на мембран ных фильтрах половолоконного типа Поскольку в промышленности широко используют половолоконные мембранные фильтры, вследствие их более высокой эффективности, то количественные закономер ности объединенных ферментсодержащих растворов были изучены именно на фильт рующих элементах данного типа.

Концентрирование на половолоконных аппаратах проводили с возвратом ретанта в исходную ёмкость при непрерывном отборе фиксированного объёма пермеата. В каче стве ультрафильтрационных волокон были выбраны волокна ВПУ-20 ПА, как наиболее близкие по диаметру пор к ранее подобранным мембранам УПМ-20 и УПМ-10.

Проведенные ранее исследования показали, что удельная производительность мо дуля на основе полых волокон марки ВПУ-20 ПА по воде достигает 192±5 л/(м2·ч). При ультраконцентрировании ферментсодержащих экстрактов данная величина в первые ча сы работы мембранного аппарата снижается и в дальнейшем, в течение практически не ограниченного времени сохраняется постоянной. Исследования по оптимизации пара метров процесса ультраконцентрирования для половолоконных мембран, проводились аналогично вышеизложенному для плоских мембран. Их результаты приведены в табл. 8.

Из представленных данных следует, что половолоконные ультрафильтрационные установки обладают более высокой производительностью (по сравнению с плоскими мембранами выше в 45 раз), кроме того, дифференциальная селективность по всем фер ментам составляет не менее 86 %. Таким образом, можно сделать однозначный вывод о целесообразности использования половолоконных ультрафильтрационных установок для очистки и концентрирования ферментсодержащих экстрактов. Помимо вышепере численных преимуществ, при работе с половолоконными мембранами удается снизить потери ферментов за счет упрощения процесса регенерации мембран с 30 % до 12 %.

Таблица Значение параметров концентрирования ферментсодержащих растворов на волокнах ВПУ-15 ПА Рекомендуемые значения, Предельно допустимые G, для концентрирования значения при л Экстракт, л экстрактов гелеобразовании содержащий м 2 час м 2 час nА mV* nА mV* mV** -Амилазу 0,99 23,67 3,82 4,8 5 4,3 4,3 4, Липазу 0,96 5,99 1,24 43 - 7,6 10,4 10, Кп Б 0,90 46,70 4,98 88 - 1,9 2,1 2, Трипсин 0,92 46,33 8,99 6,1 11 3,7 4,8 5, Химотрипсин 0,91 59,45 8,9 6,3 13 3,8 5,3 5, РНКазу 0,86 110,90 5,95 65000 - 4,3 9,5 9, При загрязнении разделительных аппаратов в результате продолжительной эксплуата ции их можно регенерировать водными растворами щелочей, ПАВ, кислот, перекиси водорода. Кроме того, на таких ультрафильтрах отсутствует необратимая сорбция биопо лимеров, что также снижает потери ферментов на стадии ультраконцентрирования.

3.4. Осаждение ферментов из водных растворов в изоэлектрической точке Получив с применением полово локонных ультрафильтров ферментсо 0, держащие ретанты, изучили количест 0, венные закономерности осаждения ферментов в ИЭТ из водных растворов 0, с целью составления научно 0, обоснованных рекомендаций его ис пользования на практике и выявления 0, Хs факторов, оказывающих на процесс 0, осаждения наибольшее влияние: вре мени образования осадков и начальной 0, концентрации ферментов в ретанте.

0, На рис. 4 приведены типичные кривые осаждения ферментов из вод 0, ных растворов. Их вид позволяет сде лать предположение, что процесс оса 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 ждения может быть описан схемой Время, мин превращений:

Рис. 4. Типичные кривые осаждения фермента на при мере осаждения РНК-азы в составе экстракта (концен 2фермент 0 (фермент 0 )2 (6), ' К трата) из раствора с различной концентрации отстаи- S ванием вблизи изоэлектрической точки (рН 8,5) Ус где: KS’ – константа равновесия, уста ловные обозначения:

навливающегося между осадком и Экспериментальные данные:

ферментом в растворе.

– 17680;

– 20379;

– 44200;

– 88402 (ед./мл).

В соответствии с уравнением (6) Расчётные данные — 17680;

20379;

44200;

88402 (ед./мл) величина степени осаждения должна быть связана с начальной активностью фермента (A0) соотношением:

ХS = К S' А0 (7) (1 Х S ) Вышеуказанное уравнение (6) в отсутствии равновесия можно представить в виде двух процессов, протекающих навстречу друг другу с разными скоростями, обусловлен ных, с одной стороны, образованием осадка, а с другой, его растворением:

k ( A0 ) 2 (8) 2A k Для зависимостей, приведенных на рис. 4 уравнение скорости образования осад ков будет иметь вид:

dX S = k1 A0 (1 X S ) 2 k 1 X S (9) d Таблица Оптимальные условия осаждения субстанций ферментов из Схема (6), уравнение ретантов (9) и значения констант данного уравнения опреде- Актив Температура, Максималь ляют кинетическую схему ность фер- Необходи Время но достигае мента в мая степень процесса осаждения фер- осажде- мая степень Фермент °С исходном концентри ментов в ИЭТ и позволяют ния, ч осаждения, растворе, рования дать рекомендации по оп- % ед./мл тимальному режиму про- -Амилаза 46 3,5 98 441 4, цесса осаждения и необхо- Кп Б 46 2,5 95 1515 димой степени концентри- Трипсин и рования ферментсодержа- Химотрип- 46 2 95 6307 5, син щих экстрактов (табл. 9).

РНК-аза 46 2,5 78 88400 3.5. Осаждение ферментов из водно-спиртовых растворов Осадки, полученные при осаждении из водного раствора, содержали примеси.

Для их очистки целесообразно применить переосаждение из водно-спиртового раствора.

Согласно литературным данным, липазу можно количественно осадить только из водно спиртового раствора, используя в качестве органического растворителя изопропанол.

Для осаждения остальных субстанций ферментов применяли этанол. Поэтому на сле дующем этапе исследований были изучены количественные закономерности осаждения ферментов из водно-спиртовых растворов. В качестве исследуемых параметров процес са были выбраны время образования осадков и гидромодуль.

Гидромодуль варьировали в диапазоне от 1 до 10. Схема образования осадков аналогична осаждению из водных растворов. Однако численные значения эффективных констант k1 и k-1 при изменении гидромодуля спирта не остаются постоянными, а ли нейно изменяются в зависимости от концентрации спирта в среде. Наличие линейных зависимостей значительно упростило проведение соответствующих расчетов по выбору оптимального гидромодуля для осаждения ферментов, который оказался равным 5 для РНК-азы, трипсина и химотрипсина, 8 для амилазы и 15 для КПБ.

3.6. Получение растворов ферментов, свободных от минеральных примесей и пиг ментов Альтернативным методом очистки субстанций ферментов является метод диа фильтрации, поэтому на следующем этапе исследований было проведено сравнение 2-х способов очистки ферментов: методом переосаждения из водно-спиртового раствора и диафильтрации (табл. 10).

Таблица Влияние способа очистки субстанций ферментов на выход и качество конечных продуктов Удельная ак Удельная тивность по- Опти- Удельная Наимено- активность Потери на Потери на сле переосаж- мальная активность вание суб- после перво- стадии стадии диа дения из вод- кратность после диа станции го осажде- переосаж- фильтрации, но-спиртового диафильт- фильтрации, ния, ед./г фермента дения, % % раствора, ед./г рации ед./г белка белка белка -Амилаза 4601 5890,8 5 5997,9 11 Липаза 1595 - - - 6 Кп Б 84390 41055 3 43987 9,6 Триписин и химот- 520614 - - - 8,6 рипсин РНК-аза 11197863 4093157 3 4093157 8 Как видно из приведённых данных, для амилазы можно использовать оба спосо ба, для Кп Б и РНК-азы очистку проводить только переосаждением. Качество субстан ций таких ферментов как липаза, трипсин и химотрипсин позволяет ограничиться одно кратным осаждением из соответствующих растворов.

3.7. Биоконверсия отходов, образующихся при комплексной переработке поджелу дочной железы крупного рогатого скота в продукт кормового назначения Разрабатываемая технология комплексной переработки биомассы ПЖ позволяет получать несколько ферментных препаратов:

-амилазу, липазу, протеолитический ком плекс (химотрипсин, трипсин, Кп Б) и РНК-азу. Однако следует отметить, что на стади ях выделения ферментов происходит образование значительных количеств отходов, ко торые существенно отличаются по составу.

Таким образом, в рамках разрабатываемой технологии при комплексной перера ботке ПЖ КРС, образуются отходы, которые можно разделить на 3 группы:

• отработанная биомасса ПЖ;

• жидкие стоки с высоким содержанием спирта;

• жидкие стоки.

Переработка отходов первой группы может быть осуществлена путем использо вания шлама биомассы ПЖ непосредственно на корм скоту, поскольку данный отход обладает сравнительной высокой питательной ценностью и является нетоксичным.

Отходы второй группы включают в себя значительное количество этанола (более 40 масс. %), поэтому их необходимо направить на стадию регенерации спирта с после дующим возвратом в основное производство, а кубовый остаток объединить с отходами третьей группы.

Отходы третьей группы содержат значительное количество органических веществ (~ 27 г/л), органические вещества как этиловый спирт, углеводы и др., а так же содержит ионы SO 42, Cl-, Na+. Такой состав позволяет рассматривать данный сток, как ценный субстрат для культивирования микроорганизмов.

Анализ литературы показал, что культура Yarrowia lipolytica способна высоко эффективно ассимилировать жировые отходы мясоперерабатывающей промышленно сти. В качестве модельного стока, образующегося в данной технологии, был выбран объединенный сток, получающийся на стадии ультрафильтрации исходных экстрактов – сток фильтратов. В качестве питательной среды использовали: сток фильтрата (А);

сток с дополнительным введением мине Таблица Ростовые характеристики дрожжей Y. lipolytica ральных компонентов до состава ми при культивировании на питательных средах, со- неральной основы среды Ридера (Б), а держащие концентрированный сток так же помимо введения минеральных А Б В компонентов, для поддержания опти µ, ч-1 0,15 0,17 0,18 мального соотношения азота и угле Максимально накоп- рода вносили глюкозу (30 г/л) (В), так 5,1 9,4 11, ленная биомасса, г/л как известно, что несбалансированное Исходное со- содержание белковых веществ и угле ВМФ 5, держание бел- водов может ингибировать рост дрож ковых ве- жей (табл. 11).

НМФ 21, ществ, г/л В результате проведённых ис Остаточное ВМФ 2,54 1,81 0,27 следований установлено, что обра содержание зующаяся биомасса характеризуется белковых ве- НМФ 10,32 12,81 8,65 сравнительно высоким содержанием ществ, г/л белковых веществ (4044 %) (табл. 9).

ХПК исх, мг О2/ л 131000 - Высокие показатели накопления био ХПК кон., мг О2/ л 90000 57000 массы Y. lipolytica в среде с большим Содержание сырого 40,0 40,1 43,2 содержанием NaCl могут быть связа протеина в биомассе, % ны с тем, что данная культура являет А – концентрированный сток фильтрата;

Б – сток с до ся умеренно галофильной. При этом полнительным введением минеральных компонентов до состава минеральной основы среды Ридера;

В – сток с удельная скорость роста составляет дополнительным введением минеральных компонентов 0,18 ч-1. Так же следует отметить, что до состава минеральной основы среды Ридера и глюкозой введение дополнительных минераль (30 г/л).

ных компонентов и источника углеро да небелковой природы положительно влияет на ростовые характеристики микроорга низмов и в результате максимальное накопление биомассы составляет 11,2 г/л. Кроме того, удаётся снизить значения ХПК в 22,5 раза.

Поскольку, как ука- Таблица зывалось ранее, на мясопе- Ростовые характеристики дрожжей Y. Lipolytica при культиви рерабатывающих комбина- ровании на питательных средах различного состава.

тах существует проблема Питатель Питатель утилизации образующихся Питатель- ная среда, ная среда, ная среда, содержащая жировых отходов, то сле- содержащая содержащая жировые дующим этапом исследо- жировые сток фильт- отходы отходы ваний явилось изучение ратов г/л и сток г/л биоконверсии смеси отхо- фильтратов µ, ч-1 0,26 0,15 0, дов – стоков, образующих Max накопленная ся при комплексной пере- 21,8 5,3 27, б/м, г/л работки ПЖ и жировых от сыр.

ходов мясопереработки. 49,251,4 40,647,4 48,450, Содержание прот.

Сточные воды – сток белковых ист. бе фильтратов – добавлялись в веществ, % 42,644,7 38,641,1 41,843, лок питательную среду в каче Цвет бежевый охра бежевый стве источника азота и фак Запах характерный для дрожжей торов роста, а основным Тест на острую токсич источником углерода явля- Не токс. Не токс. Не токс.

ность лись жировые отходы мя сопереработки в количестве 20 г/л. В результате установили, что удельная скорость рос та дрожжей на данной питательной среде достигает 0,25 ч-1, при этом максимальное на копление биомассы составляет 27,4 г/л, а содержание сырого протеина в биомассе не менее 48 % (табл. 12).

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о принципи альной возможности биоконверсии сточных вод, образующихся при переработке ПЖ, в продукты кормового назначения. При этом концентрированные стоки могут использо ваться не только в качестве основы питательной среды, но также и в виде дополнитель ного компонента питания микроорганизмов при биоконверсии жировых отходов мясо переработки, так как совместно использование данных стоков является наиболее эффек тивным.

На основе проведенных исследований была разработана гибкая технологическая схема комплексной переработки поджелудочной железы. Проведён расчёт технико экономических показателей комплексной переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота мощностью 40 т/год (ПЖ). В табл. 13 приведены рассчитанные значения себестоимостей субстанции ферментных препаратов и рекомендуемых цен в сравнении с известными ценами на субстанций такого же качества.

Таблица Сравнительная характеристика цен на субстанции ферментов Субстанция Активность, Годовой Цена по ка- Себестоимость, Рекомендуемая ферментов ед./г выпуск, талогу, тыс. тыс. руб./кг цена сбыта, кг руб./ кг тыс.руб./кг -Амилаза 5891 487 11,2 3,3 4, Липаза 1595 54 20,0 15,0 19, Кп Б 84390 117 230,0 115,0 149, Трипсин и 520614 54 31,6 15,8 20, Химотрипсин РНК-аза 11197863 36 42,0 21,0 27, ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1. Разработана ресурсосберегающая технология комплексной переработки биомассы под желудочной железы крупного рогатого скота с получением гидролитических ферментов:

карбоксипептидазы Б, рибонуклеазы, трипсина и химотрипсина, -амилазы, липазы.

2. Установлена последовательность обработки биомассы поджелудочной железы, обес печивающая выделение ферментов: карбоксипептидазы Б, рибонуклеазы, трипсина и химотрипсина, -амилазы, липазы, причем потери активности остальных не превыша ют 40 %.

3. Разработаны кинетические схемы стадий экстракции ферментов водно-солевыми, водно-кислотными и водно-спиртовыми экстрагентами, ультрафильтрации, осажде ния. Предложенные кинетические схемы позволили подобрать оптимальные условия выделения каждого фермента: для водно-солевой экстракции 5% масс. NaCl, 30 °С время экстракции: для -амилазы- 1,5 ч, для Кп Б – 2,53 ч;

спиртовой экстракции – 20 °С, 12 ч;

слабокислотной экстракции рН 2, для трипсина 30 °С 3,5 ч, для химот рипсина 30 °С 4,5 ч, для Кп Б 20 °С 4 ч;

для сильнокислотной экстракции выделения РНК-азы 0,25 н. H2SO4 при температуре 6 °С 3,54 ч.

4. Предложены способы очистки ферментных препаратов, основанные на применении методов диафильтрации и переосаждения, позволяющие получить субстанции пище вого назначения, с выходом 60 % от исходного содержания ферментов в ПЖ, что в 23 раза выше, чем по известным технологиям.

5. На основе предложенных кинетических схем подобраны варианты технологических схем получения ферментных препаратов с выходом не менее 60 %.

6. Предложены пути утилизации белоксодержащих отходов, образующихся в техноло гическом процессе, путём культивирования дрожжей рода Y. lipolytica с получением кормового белкового продукта с содержанием сырого протеина не менее 40 %.

7. Проведена технико-экономическая оценка разработанной технологической схемы.

Показано, что в условиях комплексного производства себестоимость каждого из по лучаемых ферментных препаратов не превышает 30 % от цены зарубежных аналогов.

Рентабельность производства составляет 34 %, срок окупаемости дополнительных капитальных вложений не превышает 2-х лет.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Дудникова Е. А. Изучение стадий экстракции амилазы, липазы и комплекса протеаз из поджелудочной железы крупного рогатого скота [Текст] / Е. А. Дудникова // Ус пехи в химии и химической технологии: Сб. науч. тр. – М.: РХТУ им. Д. И. Менде леева, 2005. – Т. XIX, № 5 (53). – с. 136;

20 см. – 160 экз. – c. 100 – 105.

2. Дудникова Е. А. Разработка стадий выделения и очистки ферментов при комплексной переработке поджелудочной железы крупного рогатого скота [Текст] / Е. А. Дудни кова // Успехи в химии и химической технологии: Сб. науч. тр. – М.: РХТУ им. Д. И.

Менделеева, 2006. – Т. XX, № 6 (64). – с. 136;

20 см. – 160 экз. – c. 15 – 18. – ISSN 1506-2017.

3. Дудникова Е. А. Разработка стадий выделения и очистки рибонуклеазы при ком плексной переработке поджелудочной железы крупного рогатого скота [Текст] / Е.

А. Дудникова // Успехи в химии и химической технологии: Сб. науч. тр. – Москва, 2007. – Т. XX, № 6 (64). – c. 15 – 18.

4. Dudnikova E. A. Elaborating Bases of Technology of Isolation of Amylase, Lipase and a Complex of Proteases from Cattle Pancreas [Text] / E. A. Dudnikova, A A. Krasnosh tanova, I A. Krylov // Industrial Application of biotechnology. – New York, Nova Science Publisher, 2006. – с. 28 – 37. – ISBN 1-60021-039-2.

5. Дудникова Е. А. Разработка основ комплексной переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота [Тезисы] / Е. А. Дудникова, А. А. Красноштанова, М.М.

Баурина, И. А. Крылов // Сборник трудов III Международного Конгресса «Биотехно логия: состояние и перспективы развития». – М., 2005, – с. 327.

6. Дудникова Е. А. Разработка технологии выделения и очистки ферментов проте олитического комплекса из поджелудочной железы крупного рогатого скота, в условиях ее комплексной переработки [Тезисы] / Е. А. Дудникова, А. А. Красно штанова, И. А. Крылов // Сборник трудов IV Международного Конгресса «Биотех нология: состояние и перспективы развития». – М., 2007. – с. 54.

7. Дудникова Е. А. Выделение -амилазы из биомассы поджелудочной железы крупного рогатого скота [Текст] / Е. А. Дудникова, А. А. Красноштанова, И. А. Крылов // Хи мическая технология. – М., 2008. – Т. 9, № 4. – с. 182 – 188.