Использование соевого шрота для получения биологически активных веществ и оценка их функциональной активности
На правах рукописи
Хабибулина Наталья Викторовна Использование соевого шрота для получения биологически активных веществ и оценка их функциональной активности Специальность: 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук
Москва 2012
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева
Научный консультант: Доктор химических наук, доцент Красноштанова Алла Альбертовна
Официальные оппоненты: Доктор технических наук, доцент кафедры «Аналитическая химия» Московского государственного университета пищевых производств Милорадова Елена Васильевна Кандидат технических наук, доцент отдела биосинтетических и биокаталитических нанотехнологий ферментов, дрожжей, органических кислот и БАД Всероссийского научно-исследовательского института пищевой биотехнологии РАСХН Курбатова Елена Ивановна
Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР)
Защита состоится «22» мая 2012 г. в 15 ч. 00 мин. на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д. И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д. 9, в аудитории 433 (конференц-зал).
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан «19» апреля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 Шакир И.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Одним из наиболее перспективных видов растительного сырья, характеризующегося высоким содержанием биологически активных веществ, является соя. Площади посевов сои в мире постоянно растут, в 2010 году они составили 70 млн. га, а объем продукции, произведенной из соевых бобов, превысил 200 млн. т [Толоконников В.В., 2010].
Технологии переработки соевых бобов основаны на извлечении из них различных компонентов: масел, белков, различных биологически активных соединений.
Традиционно, соя представлена на рынке такими продуктами, как соевое масло, соевые молоко и молочные продукты, концентраты, изоляты и гидролизаты белка, при этом ассортимент продуктов на основе сои постоянно расширяется. В последние годы сою стали использовать не только в пищевой промышленности (при производстве мясных и кондитерских продуктов, в хлебопечении), но и в лечебно-профилактическом питании;
при создании БАД;
медицине и фармацевтике для производства препаратов, подавляющих активность протеаз, антиканцерогенных препаратов, при осуществлении гормонозаместительной терапии и др. [Храмцов А.Г., 2003]. Расширение спектра отраслей, в которых используются соевые продукты, обуславливает актуальность исследовательских работ, направленных на ее глубокую переработку.
Особое внимание уделяют таким продуктам, как изолят белка, изофлавоноиды и ингибиторы протеаз. Общим недостатком существующих технологий их выделения из сои является узкая направленность на получение одного целевого продукта с образованием большого количества трудноутилизируемых отходов, характеризующихся наличием ценных соединений.
Разработка технологии переработки соевого шрота, предусматривающей полу чение в рамках одной технологической схемы ряда биологически активных веществ, обладающих высокой функциональной активностью (изолята белка, изофлавоноидов и ингибиторов протеаз) является актуальной с позиции снижения себестоимости от дельных продуктов (полупродуктов) и повышения рентабельности и экологичности производства.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка основ технологии переработки соевого шрота с получением изолята белка сои, изо флавоноидов, ингибиторов протеаз и оценка их функциональной активности.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
подобрать последовательность стадий переработки соевого шрота, позволяю щую получить отдельные фракции, содержащие высокомолекулярную фрак цию белковых веществ, изофлавоноиды и ингибиторы протеаз, в рамках техно логии получения изолята белка сои;
провести исследование и сравнительный анализ различных методов очистки фракции изофлавоноидов;
подобрать условия фракционирования, выделения и очистки препаратов со евых ингибиторов протеаз из обогащенной ими фракции;
разработать основы технологии получения ингибиторов протеаз и изофлавоноидов на основе полупродуктов, образующихся при выделении изолята белка, и провести технико-экономические расчеты эффективности разработанной технологии;
оценить функциональную активность ингибиторов протеаз и изофлавоноидов с позиции повышения выживаемости микробных клеток при воздействии на них жестким ультрафиолетом и пероксидом водорода на примере дрожжей Sac charomyces cerevisiae;
оценить функциональную активность изофлавоноидов с точки зрения их влия ния на каталитическую активность ферментов.
Научная новизна.
Разработан способ получения биологически активных веществ сои (изофлавоноидов и ингибиторов протеаз) на основе полупродуктов, образующихся в технологии производства изолята белка. Подтверждена экономическая целесообразность применения жидкость-жидкостной экстракции для достижения требуемой степени очистки концентрата изофлавоноидов.
Показано, что введение соевых ингибиторов протеаз и изофлавоноидов в культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae повышает выживаемость клеток при воздействии на них жестким ультрафиолетом и пероксидом водорода.
Установлено влияние соевых изофлавоноидов на каталитическую активность промышленных ферментных препаратов за счет образования водородных связей и гидрофобных взаимодействий.
Практическая значимость.
Разработан способ выделения биологически активных веществ сои (ингибиторов протеаз, изофлавоноидов), предусматривающий введение в технологию переработки соевого шрота в изолят белка дополнительных технологических стадий, позволяющих получить фракцию изофлавоноидов с содержанием основного вещества не менее 70 %, ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирк с содержанием сырого протеина 95 и 89 %, соответственно.
На основании полученных экспериментальных данных разработан лаборатор ный регламент и исходные данные для проектирования опытной установки перера ботки соевого шрота в рамках комплексной технологии. Проведена ориентировочная технико-экономическая оценка эффективности реализации предлагаемой технологии при расчетной мощности производства 5 000 тонн/год по соевому шроту.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на Международной конференции молодых ученых «Успехи в химии и химической тех нологии» (Москва, 2008, 2010);
6-ой Международной конференции «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, 2009);
V и VI Московском Международ ном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011);
3-ей конференции молодых ученых и специалистов «Обеспечение качества и безопасности продукции агропромышленного комплекса в современных социально экономических условиях (Москва, 2009);
конкурсе проектов молодых ученых в Рам ках 15-ой Международной выставки химической промышленности и науки «Химия 2009» (Москва, 2009);
I-ой Международной конференции Российского Химического Общества им. Д.И.Менделеева «Ресурсо- и энергосберегающие технологии в химиче ской и нефтехимической промышленности» (Москва, 2009);
Международной конфе ренции молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, мо дификация и переработка высокомолекулярных соединений – V Кирпичниковские чтения» (Казань, 2009);
VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Мо сква, 2009);
Московской международной научно-практической конференции «Био технология: экология крупных городов» (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 11 тезисов докладов, подана заявка на патент.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введе ния, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка ци тируемой литературы, включающего 221 наименование, в том числе 133 иностранных авторов, 4 приложения. Основной текст работы изложен на 152 страницах машино писного текста, включает 27 таблиц, 53 рисунка.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы охарактеризована практическая значимость сои для на родного хозяйства;
рассмотрена общая характеристика и биохимический состав со евых бобов;
описаны технологии переработки соевого сырья и получения основных соевых белковых продуктов. Описаны свойства и роль биологически активных ком понентов сои – ингибиторов протеаз и изофлавоноидов, рассмотрены современные способы их выделения и области применения. На основе проведенного анализа на учно-технической и патентной литературы сделан вывод о целесообразности прове дения исследований по разработке способа получения биологически активных соевых компонентов – изофлавоноидов и ингибиторов протеаз – совместно с изолятом белка.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основным объектом исследования являлся соевый шрот с содержанием сырого протеина 52 %, индексом растворимости азота 43,2 % (от сухих веществ) и содержа нием общих углеводов 29,7 %. Микробные объекты исследования: дрожжи Candida tropicalis и Endomycopsis fibuligera из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ им.
Д.И. Менделеева.
Содержание белковых веществ в растворах определяли методом Лоури, общее содержание углеводов – методом Дюбуа, общее содержание азотсодержащих веществ – методом Къельдаля, содержание нуклеиновых кислот – методом Спирина, опреде ление индекса растворимости азота – методом водной экстракции [Шакир И.В. и др., 2008]. Качественное и количественное определение изофлавоноидов проводили мето дами, основанными на образовании комплексов изофлавоноидов с хлоридами железа (III) и алюминия [Лобанова А.А. и др., 2004]. Активность протеолитических фермен тов и рибонуклеазы определяли в соответствии с [Worthington Enzyme Manual, 1965].
Липолитическую активность оценивали титриметрическим методом [Tietz N.W., 1989]. Ферментативный гидролиз субстратов осуществляли в аппарате с мешалкой и рубашкой при рН-статировании и заданной температуре. Эффективность гидролиза казеината натрия и дрожжевой РНК оценивали по увеличению содержания низкомо лекулярной фракции (молекулярная масса 2 кДа), не осаждаемой 50 %-ной трихло руксусной кислотой. Молокосвертывающую активность определяли согласно ГОСТ Р 52688-2006, антиоксидантную активность – пат. РФ 2144674 C1.
Молекулярно-массовое распределение белковых веществ определяли методом гель-хроматографии с использованием колонки диаметром 1 см и высотой 20 см, за полненной полимерным гелем марки Сефадекс. Электрофоретическое определение белков проводили по методу Лэммли [Остерман Л.А., 1985].
Фракционирование белоксодержащих растворов проводили в лабораторной ячейке при рабочем давлении 0,2 МПа с использованием плоских (УПМ-100, УПМ 20) и половолоконных мембранных элементов (ВПУ-100ПА, ВПУ-20ПА).
Ионообменную хроматографию проводили в статических и динамических ус ловиях, в качестве элюента использовали водные растворы хлорида натрия, соляной кислоты, гидроксида натрия и этилового спирта.
Культивирование микроорганизмов проводили в глубинных условиях в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (объем питательной среды 100 мл) при постоянном встряхивании и температуре 28-30 0C. Накопление микробной биомассы определяли прямым подсчетом клеток в камере Горяева и гравиметрическим методом. Определение острой токсичности препаратов проводили с тест-культурой Tetrahymena pyriformis.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использо ванием методов математической статистики, включенных в пакет программ «Excel» и «Statistica 6.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Разработка основ технологии совместного получения изолята белка, ингиби торов протеаз и изофлавоноидов сои Выбор последовательности стадий извлечения белковой фракции и фракции изо флавоноидов из соевого шрота Распространенной и успешно внедренной технологией глубокой переработки сои является получение изолята из соевых бобов, поэтому именно она была взята за основу разрабатываемой технологии совместного получения биологически активных веществ сои (изолята белка, изофлавоноидов и ингибиторов протеаз). Принципиальная схема получения изолята белка сои включает стадии обезжиривания соевых бобов органическими растворителями с получением соевого шрота, экстракции белковых веществ, ультрафильтрацию экстракта, осаждение высокомолекулярной фракции белка из концентрата и последующую очистку целевого продукта.
При разработке технологии получения ингибиторов протеаз и изофлавоноидов совместно с изолятом белка следует принимать во внимание специфические свойства ингибиторов протеаз (невысокую молекулярную массу) и изофлавоноидов (хорошую растворимость в этиловом спирте). В связи с этим, были предложены два варианта принципиальных схем совместного получения биологически активных веществ сои (рис.1), отличающиеся последовательностью стадий извлечения изофлавоноидов и белковых веществ. Согласно первой схеме, на первом этапе предусматривается экстракция белковых веществ из соевого шрота, затем этиловым спиртом из твердого остатка экстрагируются изофлавоноиды, согласно второй последовательность стадий обратная. Далее белковые экстракты, полученные по обеим схемам, обрабатываются согласно принципиальной схеме получения изолята белка.
Полученные результаты (табл. 1) свидетельствуют о том, что содержание белковых веществ в белковых экстрактах сопоставимо, при этом в случае второй схемы содержание сырого протеина в осадке белка, получаемом осаждением из концентрата, выше (62 и 72 % для схем 1 и 2, соответственно), что упрощает его очистку при получении изолята белка. Кроме того, при обработке согласно второй схеме содержание изофлавоноидов в спиртовом экстракте в 2,4 раза выше. Это позволяет рассматривать последовательность стадий получения фракций, обогащенных биологически активными веществами, согласно блок-схеме 2 более перспективной.
Поскольку ингибиторы типа Баумана-Бирк является спирторастворимыми, при осуществлении технологических стадий согласно блок-схеме 2 они частично переходят в экстракт изофлавоноидов, что подтверждается результатами гель хроматографии. При этом основная масса ингибиторов протеаз содержится в пермеате, образующемся после ультраконцентрирования белкового экстракта.
Блок-схема Блок-схема Соевый Экстракция Твердый Соевый шрот изофлавоноидов остаток шрот Экстракция Экстракция Твердый Экстракция белковых Спиртовой изофлавоноидов остаток белковых веществ экстракт веществ Спиртовой На получение Белковый Белковый экстракт изофлавоноидов экстракт экстракт На получение Ультра Ультра- Пермеат изофлавоноидов Пермеат фильтрация фильтрация На получение На получение ингибиторов Концентрат Концентрат ингибиторов протеаз протеаз На получение На получение изолята белка изолята белка Рис.1. Подбор последовательности стадий переработки соевого шрота, позволяющих получить фракции высокомолекулярных белковых веществ, изофлавоноидов и ингибиторов протеаз Таблица 1.
Состав полупродуктов, получаемых при подборе последовательности стадий переработки соевого шрота Белковые Снижение Снижение Изофла- Общие Показатели вещества, активности активности воноиды, углеводы, г/л трипсина, химотрипсина, г/л г/л Анализируемые % % полупродукты Блок- белковый экстракт 16,3±0,74 51,3 36,1 0,13±0,01 18,0±0, схема концентрат 35,4±0,81 43,8 25,7 0,09±0,01 22,1±0, 1 пермеат 3,5±0,09 64,8 43,8 0,15±0,01 15,3±0, экстракт 1,2±0,07 7,1 6,9 6,8±0, 0,11±0, изофлавоноидов Блок- белковый экстракт 13,4±0,63 38,3 21,9 0,02±0,01 10,9±0, схема концентрат 29,7±0,76 38,5 20,8 0,02±0,01 13,0±0, 2 пермеат 2,9±0,10 56,4 37,2 0,01±0,01 9,1±0, экстракт 1,8±0,08 20,5 14,8 13,4±0, 0,26±0, изофлавоноидов Получение очищенной фракции изофлавоноидов Спиртовой экстракт изофлавоноидов, полученный в соответствии с выбранной последовательностью стадий, помимо целевого продукта содержит примеси ингиби торов Баумана-Бирк, низкомолекулярных пептидов и углеводов, для очистки от кото рых была предложена последовательность стадий (рис.3), предусматривающая реге нерацию экстрагента (методом вакуум-выпаривания во избежание инактивации био логически активных веществ), отделение примеси ингибиторов Баумана-Бирк осаж дением в изоэлектрической точке, последующую очистку осветленного концентрата изофлавоноидов от балластных веществ.
Проведение стадии вакуум-выпаривания и осаждения позволяет получить оса док ингибито-ров Баумана-Бирк с содержанием сырого протеина 35 %, который далее направляют на стадию выделения ингибиторов.
Спиртовой Осаждение ингибиторов Концентрат Вакуум экстракт Баумана-Бирк изофлавоноидов выпаривание изофлавоноидов Очищенный Осветленный Очистка концентрат концентрат изофлавоноидов изофлавоноидов Рис.2. Блок-схема получения очищенного концентрата изофлавоноидов из экстракта изофлавоноидов Полученный освет Таблица 2.
Состав полупродуктов, образующихся при получении ленный концентрат изо очищенной фракции изофлавоноидов флавоноидов содержит 1, Фракция Содержание, г/л г/л основного вещества, Белковые вещества Углеводы Изофлавоноиды что в 4 раза выше, чем в (из них исходном спиртовом низкомолекулярной фракции, % от экстракте, однако характе общего) ризуется значительным Спиртовой количеством сопутствую экстракт 1,8±0,06 (38,9) 13,5±0,35 0,3±0, щих углеводов и белковых изофлавоноидов Концентрат веществ (табл. 2), поэтому 9,1±0,43 (38,9) 67,4±1,84 1,3±0, изофлавоноидов требуется его очистка от Осветленный указанных соединений.
концентрат 2,7±0,09 (78,8) 49,4±1,48 1,2±0,0, Для получения очищен изофлавоноидов ного концентрата изофлавоноидов в настоящей работе были опробованы методы ионного обмена и жидкость-жидкостной экстракции.
Очистка осветленного концентрата изофлавоноидов методом ионного обмена Для очистки осветленного концентрата изофлавоноидов методом ионного обмена были выбраны сорбенты полистирольной природы (катиониты: С-106, С-145, С-150, КУ-2х8;
аниониты: А847С, A100S, АВ-17х8) и карбоксиметилцеллюлоза (волокнистая, Н+-форма, «РЕАХИМ»). При подборе оптимальных условий проведения ионного обмена для каждого сорбента варьировали такие параметры, как: режим (статический, динамический), соотношение сорбента и сорбируемой фракции, содержание компонентов в исходной фракции, рН исходного раствора, продолжительность процесса, природу элюентов и последовательность обработки ими.
Проведенные исследования показали, что для всех сорбентов степень сорбции изофлавоноидов в подобранных условиях составляет не менее 70 %. Десорбцию следует проводить ступенчато: на первом этапе десорбируют белковые вещества и углеводы (элюенты 1М HCl для катионитов и 1M NaCl для анионитов и карбоксиметилцеллюлозы), на втором – изофлавоноидов (элюент – 80 %-ый этиловый спирт). Наилучшие результаты были достигнуты в случае катионитов при использовании ионообменной смолы С-150, анионитов – А847С, однако наиболее перспективным является использование карбоксиметилцеллюлозы, с помошью которой удается достичь практически полной очистки концентрата изофлавоноидов от примесных веществ (табл. 3).
Таблица 3.
Очистка осветленного концентрата изофлавоноидов от белковых веществ и углеводов в ди намических условиях методом ионного обмена Фракция Сорбент С-150 А847С Карбоксиметилцеллюлоза Содержание, % от исходного Белко- Белко- Белко Угле- Изофла- Угле- Изофла- Угле- Изофла вые вые вые воды воноиды воды воноиды воды воноиды вещества вещества вещества Несорбиро ванная 38,6 68,4 4,6 22,3 64,8 9,1 76,2 91,2 28, фракция Промывная 18,0 15,0 10,0 4,1 14,3 8,2 6,8 2,4 3, вода 1ый элюат 36,2 16,6 1,2 36,2 20,9 7,5 17,0 6,4 6, 2ой элюат 7,2 - 84,2 37,4 - 75,2 - - 60, Очистка осветленного концентрата изофлавоноидов методом жидкость жидкостной экстракции Альтернативным способом очистки осветленного концентрата изофлавоноидов является жидкость-жидкостная экстракция, основанная на различной растворимости белков, углеводов и изофлавоноидов в воде и органических растворителях. При исследовании очистки осветленного концентрата изофлавоноидов варьировали такие параметры, как: соотношение органическая фаза (этилацетат) – водная фаза (осветленный концентрат изофлавоноидов), температура, продолжительность процесса, рН исходного концентрата и введение модифицирующих добавок к этилацетату (ко-растворители – н-бутанол и изоамиловый спирт).
Таблица 4.
Очистка концентрата изофлавоноидов методом жидкость-жидкостной экстракции Объемное Содержание в органической фазе, Объемное Содержание в органической фазе, % соотношение % от исходного соотношение от исходного этилацетат/ этилацетат/ Белковые Углеводы Изофла- Белковые Углеводы Изофла н-бутанол изоамиловый вещества воноиды вещества воноиды спирт 10/0 39,9 17,8 89,4 10/0 39,9 17,8 89, 8/2 25,7 3,4 95,8 9/1 22,7 7,4 89, 6/4 17,2 0 97,9 7/3 19,1 0 96, 5/5 21,2 0 96,8 5/5 23,9 0 91, 4/6 20,4 1,3 97,1 3/7 28,8 2,5 91, 2/8 27,4 2,5 97,5 1/9 42,5 3,7 88, 0/10 49,8 1,4 93,0 0/10 45,3 1,6 90, Показано, что при проведении процесса в наилучших условиях (соотношение органической и водной фаз 3:1, экстракция смесью этилацетат/н-бутанол в соотношении 6:4 при комнатной температуре и рН исходного раствора 2,0) можно получить очищенный концентрат изофлавоноидов с содержанием основного вещества не менее 70 % (табл. 4).
Сравнение методов очистки осветленного концентрата изофлавоноидов Сравнение методов очистки осветленного концентрата изофлавоноидов показал, что оба метода позволяют получить фракцию изофлавоноидов с содержанием основного вещества не менее 70 %, однако более высокой степени очистки можно достичь методом ионного обмена при использовании в качестве сорбента карбоксиметилцеллюзозы. Тем не менее, с экономической точки зрения (затраты на сырье при проведении ионного обмена в 15 раз выше, а потери целевого продукта достигают 39 %) для промышленной реализации в данном случае более целесообразным является метод жидкость-жидкостной экстракции (табл. 5).
Таблица 5.
Очистка осветленного концентрата изофлавоноидов методами ионного обмена и жидкость жидкостной экстракции Способ Подобранные условия Содержание Выход, % Затраты на очистки основного от сырье, руб./г вещества в исходного изофлавонодов очищенном концентрате, % Ионный Разбавление исходного концентрата в 5 раз, обмен динамический режим, 40 % карбоксиметилцеллюлозы по массе, рН 2,0, продолжительность сорбции – 1 час, первый 98 61 элюент 1М NaCl (2 объема колонки), второй элюент 80 % этиловый спирт (2 объема колонки) Жидкость- Органическая фаза:водная фаза=3:1, жидкостная комнатная температура, рН 2,0, экстракция продолжительность экстракции 30 мин, состав 73 98 органической фазы – этилацетат/н-бутанол 6:4.
Выделение и очистка соевых ингибиторов протеаз В соответствии с выбранной схемой обработки соевого шрота, ингибиторы протеаз вследствие невысоких молекулярных масс накапливаются главным образом в пермеате, образующемся на стадии ультрафильтрации белкового экстракта. Посколь ку содержание ингибиторов в этом полупродукте невелико, что усложняет процедуру их выделения и очистки, необходимым этапом является повышение их содержания, что может быть достигнуто проведением рецикла по пермеату. Однако при осуществ лении рециклов возможно накопление токсичных веществ в белковых экстрактах, и, как следствие, в изоляте, поэтому необходим подбор числа стадий возврата пермеата на стадию экстракции белковых веществ. В результате экспериментов было установ лено, что максимально возможное количество рециклов без образования токсичных продуктов равно трем, при этом увеличение содержания ингибиторов в пермеатах подтверждается результатами гель-хроматографии (табл. 6).
Фракционирование ингибиторов протеаз ультрафильтрацией Фракция, обогащенная ингибиторами протеаз, после стадии ультрафильтрации белкового экстракта, содержит смесь ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирк (табл. 5).
Основываясь на различии в молекулярных массах (для ингибиторов Кунитца 20- кДа, для ингибиторов Баумана-Бирк – 8-13 кДа) и различной растворимости ингибиторов в органических растворителях, для их фракционирования и очистки была предложена схема, предусматривающая: разделение ингибиторов ультрафильтрацией, очистку получаемых фракций диафильтрацией, осаждение ингибиторов органическими растворителями с их последующим переосаждением (рис. 3).
Ультрафильтрация при использовании мембраны с отсекаемой молекулярной массой 20 кДа не позволяет разделить ингибиторы полностью. Для достижения необ ходимой полноты разделения необходимо проведение двукратной диафильтрации, при этом содержание ингибитора Баумана-Бирк в концентрате снижается до незначи тельного количества (табл. 7).
Таблица 6.
Состав полупродуктов, получаемых при рециркуляции пермеата Анализируемые Белковые Низкомолекулярная Общие Снижение Снижение Острая полупродукты вещества, фракция, % от углеводы, активности активности токсичность г/л общего содержания г/л трипсина, % химотрип- изолята белковых веществ сина, % Исходная экстракция Экстракт не токсичен 14,0±0,43 8,91 10,6±0,36 27,0 34, Концентрат 30,1±0,91 8,63 13,0±0,42 17,3 24, Пермеат 2,9±0,09 12,27 9,2±0,31 41,8 49, Первый рецикл Экстракт не токсичен 17,2±0,52 14,90 18,5±0,49 32,6 43, Концентрат 33,8±0,98 8,73 20,5±0,64 21,9 30, Пермеат 4,1±0,10 16,09 15,5±0,46 52,8 59, Второй рецикл Экстракт не токсичен 21,1±0,62 19,56 29,8±0,78 39,8 52, Концентрат 37,3±1,20 9,07 28,4±0,77 25,5 36, Пермеат 5,9±0,15 18,21 22,7±0,71 70,3 67, Третий рецикл Экстракт не токсичен 24,6±0,71 26,24 38,5±1,31 46,0 61, Концентрат 40,6±1,42 11,01 36,4±1,28 30,4 42, Пермеат 7,0±0,19 20,70 28,2±0,81 78,6 74, Четвертый рецикл Экстракт токсичен 28,2±0,82 34,62 48,7±1,42 52,4 69, Концентрат 44,3±1,53 13,11 45,1±1,21 36,0 48, Пермеат 8,4±0,23 23,04 35,7±1,11 85,1 81, Концентрат и Фракция, обогащенная Диафильтрация Ультрафильтрация пермеат ингибиторами протеаз Осаждение Очищенные Очищенные фракции Переосаждение органическими концентрат ингибиторов протеаз растворителями и пермеат Рис.3. Блок-схема получения ингибиторов протеаз из обогащенной ими фракции Получение очищенных препаратов ингибиторов протеаз Выделение ингибиторов протеаз из соответствующих фракций может быть осуществлено осаждением органическими растворителями, причем в случае ингибитора Кунитца исследует использовать этиловый спирт, а ингибитора Баумана Бирк – ацетон. Поскольку при очистке концентрата изофлавоноидов также получается фракция ингибиторов Баумана-Бирк, перед осаждением соответствующие фракции следует объединить.
При подборе оптимальных условий осаждения ингибиторов протеаз варьировали гидромодуль этанола и ацетона, а также изучали динамику осаждения.
Удовлетворительная степень осаждения (85 %) достигается при продолжительности процесса 5 часов.
Полученные субстанции содержали примеси (доля сырого протеина не превышала 80 и 35 % в случае ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирк, соответственно), для удаления которых были предложены дополнительные стадии диафильтрации и переосаждения.
Таблица 7.
Состав полупродуктов, получаемых при ультрафильтрации и диафильтрации (УПМ-20) Анализируемые Общий белок по Низкомолекулярная Общие Снижение Снижение полупродукты Лоури, г/л фракция, % от углеводы, активности активности общего содержания г/л трипсина, химотрипсина, белковых веществ % % Исходный пермеат 7,04 20,70 28,23 75,6 88, Ультрафильтрация Концентрат 17,4±0,51 13,8±0,41 36,1±0,71 42,5 57, Пермеат 3,4±0,12 50,2±0,43 25,4±0,46 30,0 70, Диафильтрация - Концентрат 14,6±0,46 9,3±0,23 23,1±0,62 37,1 22, Диафильтрат 2,8±0,11 83,9±0,45 12,8±0,72 2,0 33, Диафильтрация - Концентрат 12,8±0,32 7,9±0,21 11,6±0,53 32,9 13, Диафильтрат 2,0±0,07 86,2±0,52 11,7±0,61 4,7 11, Диафильтрация - Концентрат 11,1±0,29 5,5±0,17 6,4±0,41 29,0 9, Диафильтрат 1,2±0,06 89,9±0,57 5,1±0,32 2,5 3, В результате прове Таблица 8.
денных исследований уста Осаждение и очистка ингибиторов протеаз новлено, что для очистки Условия Фракция Содержание, % от стадии исходного ингибиторов Кунитца Ингибиторы Ингибиторы достаточно переосаждения, Кунитца Баумана в то время как для Бирк ингибиторов Баумана-Бирк Осаждение ингибиторов Кунитца Этанол Осадок 88 15 необходимы предвари 2:1, 5 Надосадочная 12 тельная диафильтрация часов жидкость объединенной фракции Переосаждение ингибиторов Кунитца ингибиторов и последующее Этанол Осадок 76 2:1, 5 Надосадочная 12 13 переосаждение (табл. 8).
часов жидкость Полученные очищенные Диафильтрация объединенной фракции ингибиторов Баумана-Бирк фракции с содержанием Вода 1:1, Очищенная фракция - мембрана Диафильтрат - 0 сырого протеина не менее УПМ- 89 % для ингибиторов Осаждение ингибиторов Баумана-Бирк Баумана-Бирк и 95 % для Ацетон Осадок - ингибиторов Кунитца, не 1:1, 5 Надосадочная - часов жидкость обладают острой токсич Переосаждение ингибиторов Баумана-Бирк ностью, а их ингибирующая Ацетон Осадок - активность соответствует 1:1, 5 Надосадочная - известным аналогам.
часов жидкость Технико-экономическая оценка разработанной технологии получения био логически активных веществ из соевого шрота На основании проведенных исследований разработана принципиальная схема комплексной переработки соевого шрота, включающая следующие основные стадии:
• экстракцию изофлавоноидов из соевого шрота этиловым спиртом;
• регенерацию этанола и последующую очистку концентрата изофлавоноидов жид кость-жидкостной экстракцией;
• экстракцию белковых веществ из твердого остатка, образовавшегося на стадии спиртовой экстракции;
• получение очищенных фракций высокомолекулярных соевых белков, ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирк ультрафильтрацией и диафильтрацией;
• выделение изолята белка и ингибиторов протеаз осаждением из соответствующих фракций (рис. 4).
Соевый шрот Регенерация экстрагента, осаждение Очищенный Экстракт Экстракция этиловым ингибитора Баумана- концентрат изофлавоноидов спиртом, сепарация Бирк, жидкость- изофлавоноидов жидкостная экстракция Твердый остаток Кислотная экстракция, Ультрафильтрация, Фракция Ингибиторы ультрафильтрация, диафильтрация, ингибиторов Кунитца диафильтрация, осаждение, протеаз осаждение переосаждение Ингибиторы Баумана-Бирк Изолят белка Рис. 4. Принципиальная блок-схема переработки соевого шрота с получением изолята белка, соевых изофлавоноидов и ингибиторов протеаз Таблица 9. В рамках разра Технико-экономические показатели комплексной переработки батываемой техноло соевого шрота (5 000 тонн/год) с получением биологически активных гии образуются жидкие веществ (изолята белка, концентрата изофлавоноидов и ингибиторов отходы, представляю протеаз) щие собой диафильтра № Единица Значение по п/п Наименование показателя измерения казателей ты со стадий очистки Капитальные затраты тыс руб 1 150 целевых продуктов, а Полная себестоимость также кубовые остатки тыс руб 2 851 годового выпуска после отгонки этанола Себестоимость единицы продукции и ацетона. Для сни тыс. руб/м - концентрат изофлавоноидов 538, жения нагрузки на тыс. руб/т - изолят белка 3 43, тыс. руб/т очистные сооружения - ингибиторы Кунитца 318, тыс. руб/т - ингибиторы Баумана-Бирк 574,0 была исследована Стоимость годового выпуска про принципиальная воз тыс. руб/т 4 1 335 дукции можность биодеграда Прибыль годовая тыс руб 5 483 ции данных стоков Рентабельность а) производственных фондов 6 % 49,0 культурами микроор б) продукции % 36, ганизмов на примере Срок окупаемости год 7 1,86 Candida tropicalis и капитальных вложений Endomycopsis fibuligera.
Полученные результаты (степень усвоения субстрата не менее 50 %, содержание сырого протеина в биомассе до 32 %) свидетельствуют о возможности переработки стоков микробиологическим путем, в том числе и в биомассу кормового назначения.
Технико-экономическая оценка разработанной технологии комплексной пере работки соевого шрота мощностью 5 000 тонн/год по сырью (табл. 9) показала, что внедрение разработанной технологии позволит получить до 480 млн. руб./год прибы ли при сроке окупаемости, не превышающем 2 года.
II. Исследование функциональной активности соевых изофлавоноидов и ингибиторов протеаз Анализ литературы показывает, что соевые изофлавоноиды и ингибиторы протеаз обладают антиканцерогенным, антиоксидантным, противовоспалительным, радиопротекторным и др. действием [Dittmann, K.H., 1998;
Messina, M., 2002]. Также анализ их строения позволяет предположить, что их функциональная активность может проявляться в повышении выживаемости клеток при действии на них жестким ультрафиолетом или пероксидом водорода, кроме того, изофлавоноиды могут выступать в роли модификаторов ферментов.
Влияние ингибиторов протеаз и изофлавоноидов на выживаемость клеток микроорганизмов Исследование влияния соевых ингибиторов протеаз и изофлавоноидов на выживаемость дрожжей осуществляли на примере культуры Saccharomyces cerevisiae при воздействии на нее жестким ультрафиолетовым излучением ( = 250 нм) и пероксидом водорода.
Таблица 10.
Влияние соевых изофлавоноидов и ингибиторов протеаз на выживаемость клеток дрожжей Условия эксперимента Выживаемость, Условия эксперимента Выживаемость, % % Концентрация Продолжительность Концентрация Концентрация защитного облучения, с защитного пероксида агента, мг/л агента, мг/л водорода, % Контроль 0 0 100 0 0 0 1,0 63,7±2,11 0 0,5 43,5±1, 0 2,5 27,0±1,08 0 1,5 12,0±1, Изофлавоноиды 10 15 57,1±1,86 10 0,5 76,5±2, 10 30 20,6±1,45 10 1,5 54,3±2, 50 15 73,6±1,84 50 0,5 85,9±2, 50 30 30,4±1,41 50 1,5 65,3±1, Ингибиторы Кунитца 100 15 71,5±2,04 100 0,5 77,6±1, 100 30 22,3±1,03 100 1,5 55,0±1, 1000 15 80,1±1,63 1000 0,5 89,5±1, 1000 30 34,6±1,14 1000 1,5 79,1±1, Ингибиторы Баумана-Бирк 100 15 78,1±2,87 100 0,5 79,4±1, 100 30 42,1±2,13 100 1,5 51,8±1, 1000 15 85,6±1,69 1000 0,5 87,1±1, 1000 30 57,2±1,74 1000 1,5 66,2±1, Эксперимент выполняли следующим образом: проводили предынкубацию ингибиторов протеаз или изофлавоноидов (в концентрациях 0,01-1 г/л и 5-50 мг/л, соответственно) с суточной культурой дрожжей (плотность популяции 107- млн.кл./мл), затем воздействовали или ультрафиолетовым излучением в течение 0- с, или пероксидом водорода в концентрации 0,1-2,5 %.
Результаты исследования (табл. 10) показали, что введение в культуру ингибиторов протеаз и изофлавоноидов во всем диапазоне параметров (концентрация ингибиторов протеаз 0,01-1,00 г/л, изофлавоноидов - 5-50 мг/л, пероксида водорода – 0,1-2,5 %, время облучения 0-30 с) повышает выживаемость дрожжей в 1,2-4,7 раз.
Полученные результаты могут быть обусловлены антиоксидантным действием изофлавоноидов и ингибиторов протеаз (полученные соединения замедляют скорость аутоокисления адреналина на 10-25 %).
Влияние изофлавоноидов на каталитическую активность промышленных гидролитических ферментных препаратов Анализ литературы и Таблица 11.
Влияние концентрации изофлавоноидов и продолжительности химической структуры изо предынкубации на степень гидролиза субстратов флавоноидов показывает, что Фермент/ Концентра- Предынкубация Предынкубация они могут выступать в роли субстрат ция с ферментным с субстратом модификаторов ферментов.
изофлаво- препаратом ноидов, Влияние изофлавоноидов на мин. Степень мин. Степень моль/л*105 гидролиза, гидролиза, каталитическую активность % % ферментов оценивали на Трипсин/ 0 0 24,8±1,14 0 24,8±1, примере таких промышлен казеинат 2,4 0 19,8±1,23 0 19,8±1, натрия 23,6 0 15,7±1,04 0 15,7±1,04 ных гидролитических фер 23,6 10 8,1±0,45 10 16,4±0, ментных препаратов, как:
23,6 20 4,5±0,23 20 23,0±0, трипсин, рибонуклеаза, пеп 23,6 30 2,6±0,25 30 23,9±1, син, сычужный фермент, РНК-аза/ 0 0 28,9±1,35 0 28,9±1, дрожжевая 2,4 0 38,8±1,47 0 38,8±1,47 панкреатин (рассматривался РНК 23,6 0 51,7±1,63 0 51,7±1, в качестве источника липа 23,6 10 24,0±1,23 10 32,8±1, зы). Критерием эффектив 23,6 20 11,4±1,01 20 60,0±1, ности процесса для трипсина, 23,6 30 8,3±0,69 30 61,0±1, Панкреатин/ 0 0 10,6±0,86 0 10,6±0,45 РНКазы и панкреатина являя оливковое 2,4 0 14,1±0,78 0 14,1±0, лась степень гидролиза суб масло 23,6 0 25,9±0,74 0 25,9±0, стратов (казеината натия, 23,6 10 23,5±1,51 10 28,4±1, дрожжевой РНК, оливкового 23,6 20 24,7±1,78 20 42,4±2, масла), для пепсина и сычуж 23,6 30 23,5±1,64 30 42,4±2, ного фермента – скорость створаживания молока.
В ходе эксперимента варьировали такие параметры, как: концентрация изофлавоноидов, продолжительность предынкубации изофлавоноидов с ферментным препаратом или субстратом, а также оценивали влияние изофлавоноидов на температурный и рН-оптимумы каталитической активности ферментных препаратов.
Влияние изофлавоноидов на каталитическую активность ферментных препаратов В ходе проведенных экспериментов установлено, при добавлении в реакционную среду изофлавоноидов каталитическая активность РНК-азы, панкретина, сычужного фермента и пепсина повышается, в то время как трипсина – снижается (табл. 11, 12).
Также показано, что предынкубация оказывает заметный эффект на степень гидролиза (скорость створаживания) соответствующих субстратов, причем максималь ный эффект достигается для одних систем в случае предынкубации изофлавоноидов с субстратом (дрожжевая РНК, оливковое масло), для других – изофлавоноидов с фер ментом (трипсин, пепсин, сычужный фермент).
Влияние изофлавоноидов на температурные и рН-зависимости каталитической активности ферментных препаратов Помимо влияния на каталитическую активность, изофлавоноиды также оказывают действие на температурные и рН-зависимости каталитической активности промышленных ферментных препаратов. При этом установлено, что для РНК-азы и трипсина происходит смещение температурного оптимума в сторону более высоких температур, для РНК-азы также наблюдается смещение значения оптимума рН в нейтральную область. При этом для РНК-азы и панкреатина область оптимальных значений расширяется, для трипсина – сужается (табл. 13).
Полученные результа Таблица 12.
Влияние концентрации изофлавоноидов и продолжительности ты могут быть обусловлены образованием водородных предынкубации на активность сычужного фермента и пепсина Фермент/ Концентра- Предынкубация Предынкубация связей и гидрофобными субстрат ция с ферментным с субстратом взаимодействиями в системах изофлаво- препаратом изофлавоноиды/фермент или ноидов, мин. Активность, мин. Активность, моль/л*105 от от % % изофлавоноиды/субстрат, что контроля контроля подтверждено результатами Пепсин/ 0 0 100 0 УФ- и ИК-спектрометрии.
молоко 11,8 0 121,9±2,45 0 121,9±2, Сходство строения изофла 23,6 0 111±3,02 0 111±3, 11,8 5 102,0±1, 5 127,7±2,78 воноидов с другими модифи 11,8 15 95,5±2,11 15 95,8±2, каторами ферментов – алки 11,8 30 95,9±2,43 30 94,8±2, локсибензолами, также спо Сычужный 0 0 100 0 собными образовывать водо фермент/ 11,8 0 110,2±1,78 0 110,2±1, молоко 23,6 0 101,8±1,45 0 101,8±1,45 родные связи и гидрофобные 11,8 10 114,6±1,63 10 100,6±2, взаимодействия с фермента 11,8 20 102,1±1,79 20 103,8±1, ми и субстратами, позволяет 11,8 30 98,0±2,04 30 98,2±1, предположить схожесть ме ханизмов действия обеих групп соединений. Эта гипотеза подтверждается результа тами апробации кинетической модели взаимодействия [Красноштанова А.А., 2009], разработанной для алкилоксибензолов, применительно к изофлавоноидам. Показано, что модель, разработанная для алки- Таблица 13.
локсибезолов, адекватно описывает Влияние изофлавоноидов на температурный и рН поведение системы в присутствии зависимости каталитической активности ферментных изофлавоноидов. препаратов Ферментативный Условия Оптимальные Таким образом, показано, что процесс условия соевые изофлавоноиды и Т, 0С рН ингибиторы протеаз являются Гидролиз без изофлавоноидов 65 7, соединениями, обладающими высо- дрожжевой РНК с изофлавоноидами 70* 7, кой биологической активностью: Гидролиз без изофлавоноидов 40 повышают выживаемость клеток казеината натрия с изофлавоноидами 45** 8** Гидролиз без изофлавоноидов 37 микроорганизмов при действии на оливкового с изофлавоноидами 37* 7* них жесткого ультрафиолетового масла излучения и пероксида водорода (на Створаживание без изофлавоноидов 35 5, молока примере культуры Saccharomyces с изофлавоноидами 35 5, пепсином Кроме того, изо cerevisiae). Створаживание без изофлавоноидов 35 5, флавоноиды оказывают влияние на молока с изофлавоноидами 35 5, каталитическую активность про- сычужным ферментом мышленных ферментов (на примере * - расширение, ** - сужение РНКазы, трипсина, панкреатина, пепсина и сычужного фермента).
ВЫВОДЫ Разработаны основы технологии переработки соевого шрота с получением изолята 1.
белка сои, изофлавоноидов и ингибиторов протеаз, включающей стадии экстрак ции, ультрафильтрации, диафильтрации, осаждения и переосаждения.
Проведен сравнительный анализ очистки фракции изофлавоноидов ионным обме 2.
ном и жидкость-жидкостной экстракцией по технологическим и экономическим показателям. Показана предпочтительность жидкость-жидкостной экстракции (со отношение органической (этилацетат/н-бутанол 6:4) и водной фаз 3:1, рН 2,0, про должительность 30 минут, температура 25 0С), позволяющей получить фракцию изофлавоноидов с содержанием основного вещества 73 % при затратах на сырье не более 195 руб./г изофлавоноидов.
Подобраны условия выделения ингибиторов протеаз из отходов производства изо 3.
лята белка сои, включающего стадии мембранного разделения, диафильтрации, осаждения и переосаждения из водно-спиртовых и водно-ацетоновых растворов.
Получены фракция ингибиторов Кунитца, содержащая 95 % сырого протеина (1 мг ингибирует 1,5 мг трипсина с активностью 300 ед. TAME/мг фермента);
фракция ингибиторов Баумана-Бирк, содержащая 89 % сырого протеина (1 мг ингибирует 0,35 мг трипсина с активностью 300 ед. TAME/мг фермента и 0,7 мг химотрипсина с активностью 40 ед. BTEE/мг фермента).
Показано, что ингибиторы протеаз и изофлавоноиды повышают выживаемость 4.
клеток микроорганизмов (на примере дрожжей Saccharomyces cerevisiae) при воз действии на них жестким ультрафиолетом ( = 250 нм, 0-30 с) и пероксидом во дорода (0,1-1,5 %) в 1,2-4,7 раза.
Исследовано влияние изофлавоноидов на каталитическую активность промышлен 5.
ных ферментных препаратов (на примере трипсина, РНКазы, панкреатина, пепсина и сычужного фермента). Подтверждено, что изофлавоноиды являются модифика торами ферментов, при этом степень гидролиза субстратов в случае РНКазы и пан креатина возрастает в 1,5-4 раза, в случае трипсина снижается в 2 раза, активность молокосвертывающих ферментов повышается на 15-30 %. Установлено, что влия ние изофлавоноидов на каталитическую активность ферментов обусловлено обра зованием водородных связей и гидрофобными взаимодействиями.
Проведена ориентировочная технико-экономическая оценка реализации разрабо 6.
танной технологии. При расчетной мощности производства 5 000 тонн/год по со евому шроту прибыль составляет не менее 480 млн. руб./год при сроке окупаемо сти, не превышающем 2 года.
Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:
Хабибулина, Н.В. Зависимость биологических эффектов от химической структуры 1.
флавоноидов / Насибов Р.С., Хабибулина Н.В., Козлов К.Г. // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2010. №2/1. С. 260.
Хабибулина Н.В., Красноштанова А.А. Заявка на патент «Способ защиты дрожжей 2.
Saccharomyces cerevisiae от стрессорных воздействий различной природы» №2012106867, приоритет от 27.02. Хабибулина, Н.В. Изучение кинетики накопления и инактивации ингибиторов трипсина 3.
и химотрипсина из белого лепестка. Разработка технологии получения соевых ингибито ров трипсина и химотрипсина / Н.В. Хабибулина // IV Международный конгресс моло дых ученых по химии и химической технологии. Москва. 2008. Том XXII, №13. С. 76-80.
4. Хабибулина, Н.В. Получение ингибиторов трипсина и химотрипсина из отходов производства соевого изолята / Н.В. Хабибулина, А.А. Красноштанова // 6-я Меж дународная конференция «Сотрудничество для решения проблемы отходов».
Харьков. 2009. С. 149-151.
5. Хабибулина, Н.В. Разработка научных основ технологии получения соевых инги биторов трипсина и химотрипсина / Н.В. Хабибулина, А.А. Красноштанова // V Московский Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 2009 г. ч.1. С. 411 – 412.
6. Хабибулина, Н.В. Исследование процесса получения ингибиторов пищеваритель ных ферментов на основе отходов производства изолята белка сои / Н.В. Хабибу лина, А.А. Красноштанова // 3-я Конференция молодых ученых и специалистов «Обеспечение качества и безопасности продукции агропромышленного комплекса в современных социально-экономических условиях». Москва. 2009 г. С.236-238.
7. Хабибулина, Н.В. Разработка научных основ технологии получения соевых инги биторов трипсина и химотрипсина из отходов производства изолята белка сои / Н.В. Хабибулина, А.А. Красноштанова // 15-я международная выставка химиче ской промышленности и науки «ХИМИЯ-2009», Конкурс проектов молодых уче ных. Москва. 2009 г. С. 40-41.
8. Хабибулина, Н.В. Разработка научных основ технологии получения соевых ингиби торов трипсина и химотрипсина из отходов производства изолята белка сои / Н.В. Ха бибулина, А.А. Красноштанова // I-я Международная конференция Российского Хими ческого Общества им. Д.И.Менделеева «Ресурсо- и энергосберегающие технологии в химической и нефтехимической промышленности». Москва. 2009 г. С. 71-72.
9. Хабибулина, Н.В. Исследование процесса очистки экстракта изофлавоноидов от белковых веществ / Н.В. Хабибулина, А.А. Красноштанова, В.И. Панфилов // Хи мическая промышленность сегодня. – 2012. – № 5. – с. 34-38.
10. Хабибулина, Н.В. Изучение процесса получения и очистки фракции соевых изо флавоноидов совместно с изолятом белка сои / Н.В. Хабибулина // VI Между народный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии. Москва.
2010. Том XXIV, №11(116). С. 46-50.
11. Хабибулина, Н.В. Изучение эффективности применения соевых ингибиторов трип сина и химотрипсина в качестве антистрессовых агентов / Н.В. Хабибулина, А.А.
Красноштанова // XIII Международная конференция молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомо лекулярных соединений – V Кирпичниковские чтения». Казань. 2009. С. 365.
12. Хабибулина Н.В. Исследование процесса получения соевых изофлавоноидов из от ходов производства изолята белка сои / Н.В. Хабибулина, О.Ю. Костина, К.С. Закиева, А.А. Красноштанова // Московская Международная научно-практическая конферен ция «Биотехнология: экология крупных городов». Москва. 2010. С. 241-242.
13. Хабибулина, Н.В. Исследование эффективности применения соевых изофлавонои дов в качестве антистрессорных агентов / Н.В. Хабибулина, А.А. Красноштанова // VIII Международная конференция «Биоантиоксидант». Москва. 2010. С. 486-487.
14. Хабибулина, Н.В. Разработка научных основ технологии совместного получения изо флавоноидов, изолята белка и ингибиторов протеолитических ферментов из белого лепе стка / Н.В. Хабибулина, А.А. Красноштанова // VI Московский Международный Кон гресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2011. ч.1. С. 329-330.