Морфофизиологические изменения корней озимой пшеницы в связи с деструкцией цитоскелета при действии индукторов морозоустойчивости
На правах рукописи
МАКАРОВА Марина Валерьевна МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОРНЕЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ В СВЯЗИ С ДЕСТРУКЦИЕЙ ЦИТОСКЕЛЕТА ПРИ ДЕЙСТВИИ ИНДУКТОРОВ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ 03.00.12 – физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Казань – 2007 2
Работа выполнена на кафедре физиологии и биотехнологии растений биолого почвенного факультета ГОУ ВПО «Казанский государственный университет им. В.И.
Ульянова-Ленина».
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Хохлова Людмила Петровна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чиков Владимир Иванович доктор биологических наук, Клячко Нелла Леопольдовна
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва» (г. Саранск)
Защита состоится «9» ноября 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета К 002.005.01 по присуждению учёной степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН (420111, г. Казань, а/я-30, ул.
Лобачевского, 2/31).
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Казанского научного центра РАН.
Автореферат разослан «6» октября 2007 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Б. Иванова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Исследование физиологической роли цитоскелета в формировании стресса у растений относится к перспективной, но малоисследованной области клеточной биологии. Необходимость новых знаний в этом направлении обуславливает возможность повышения устойчивости растений к различным абиотическим и биотическим стресс-факторам, манипулируя состоянием цитоскелетных структур. Основные компоненты цитоскелета – тубулиновые микротрубочки (МТ), актиновые микрофиламенты (МФ) и ассоциированные с ними белки образуют в растительных клетках сильно разветвлённую, высокодинамичную сеть филаментных полимерных белков – структурный остов, контролирующий субклеточную организацию и целостность клеток (Васильев, 1996;
Baskin, 2000). Являясь полифункциональной надмолекулярной системой, цитоскелет играет ключевую роль в процессах роста и развития растений, определяя форму клеток и органов, микроструктуру тканей и влияя на деление, полярность, дифференцировку, различные типы подвижности клеток, а также на везикулярный транспорт веществ, процессы эндо- и экзоцитоза (Barlow, Baluska, 2000;
Samaj et al., 2004;
Клячко, 2005).
Данные по изучению влияния цитоскелет-разрушающих ядов на растения (Morejohn, Fosket, 1991), взаимодействий цитоскелетных белков с интермедиатами сигнальных путей (Nick, 1999;
Staiger, 2000), а также результаты молекулярно генетического анализа тубулиновых мутантов растений с изменёнными морфогенетическими признаками (Емец, Блюм, 1999;
Abe et al., 2004) свидетельствуют о том, что регулирующая функция МТ и МФ в ростовых и формообразовательных процессах связана с их участием в сигнальных системах и экспрессии генов (Volkmann, Baluska, 1999;
Smith, 2003;
Клячко, 2004;
2006). Однако вопрос о том, каким образом реализуется цитоскелетный контроль морфофизиологических ответов растений, адаптирующихся к низким температурам и развивающих устойчивость к ним под влиянием стрессового фитогормона – абсцизовой кислоты (АБК), во многом остаётся не выясненным. В то же время показано, что эти два фактора вызывают в клетках озимой пшеницы глубокую физико-химическую реорганизацию цитоскелета и её генотипическую обусловленность, включая изменение экспрессии генов и состава изотипов тубулиновых белков (Хохлова, Олиневич, 2003;
Abdrakсhamanova et al., 2003).
В настоящее время для выяснения участия цитоскелетных структур в различных процессах широко используется фармакологический подход, основанный на регистрации чувствительности изучаемых процессов к специфическим антицитоскелетным ядам (Morejohn et al., 1987;
Mathur, Hlskamp, 2002).
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в выяснении особенностей цитоскелетного контроля роста и морфогенеза корней у разных генотипов озимой пшеницы при закаливании к холоду и действии абсцизовой кислоты.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
изучить влияние высокоспецифического ингибитора полимеризации тубулиновых белков растительных клеток - оризалина на рост, биомассу и число корней проростков отличающихся по морозоустойчивости сортов озимой пшеницы в условиях разной продолжительности холодового закаливания и после обработки АБК;
провести морфо- и цитогистологический анализ корней и колеоптилей, обработанных оризалином, и выявить сортоспецифические эффекты препарата;
провести электрофорез и иммуноблотинг тубулиновых и актиновых белков в экстрактах корней разных сортов озимой пшеницы при температурном и гормональном воздействиях;
выяснить зависимость рост-альтерирующего и морфогенного эффектов оризалина от содержания тубулиновых и актиновых белков и их соотношения;
исследовать влияние холодового закаливания и АБК на оризалин-индуцированные изменения водоудерживающей способности корней разных сортов;
изучить отдельное и совместное действие ингибиторов полимеризации тубулиновых (оризалина) и актиновых (цитохалазина Д и латрункулина Б) белков на водоудерживающую способность корней незакалённых, закалённых к холоду и АБК обработанных проростков.
Научная новизна работы. Впервые показано, что при выращивании проростков отличающихся по морозоустойчивости сортов озимой пшеницы на растворе высокоспецифического ингибитора полимеризации тубулиновых белков растительных клеток – оризалина по-разному изменяются морфофизиологические характеристики корней. Эти изменения проявились в уменьшении длины корней, в радиальном набухании их кончиков вследствие появления луковицеобразных утолщений, накоплении биомассы и в повышении водоудерживающей способности корней. В большей степени изменялись клетки коровой паренхимы, которые приобретали округлую или неправильную форму и сильнее всего увеличивались в размерах, что указывает на потерю полярности клеточного роста. Наибольшее апикальное расширение оризалин-обработанных корней, как и ингибирование их линейного роста отмечено у растений среднеморозоустойчивого сорта, в корнях которых, по данным иммуноблотинга, больше содержалось актиновых и тубулиновых белков по сравнению с мало- и высокоморозоустойчивым сортами. Показано, что закаливание растений к холоду и экзогенная АБК сортоспецифично снижали или устраняли ростингибирующий и морфогенный эффекты антицитоскелетного агента на корни. При этом синергетическое действие этих факторов отмечено у маломорозоустойчивого сорта. На основании полученных результатов выдвинуто новое представление о том, что зависимость процессов роста и морфогенеза корней от содержания цитоскелетных белков (актина и тубулинов) является сортоспецифической и более выраженной у растений со средним уровнем морозоустойчивости, характеризующихся высокой экологической пластичностью.
Научно-практическая значимость работы. Проведённые исследования способствуют созданию теоретических основ функционирования цитоскелета как важнейшей сенсорной структуры клеток, влияющей на развитие термоадаптивного потенциала растений. Выявленные в работе некоторые сортовые различия в морфофизиологических ответах корней на оризалин, свидетельствующие об обратной зависимости исследуемых показателей от морозоустойчивости сорта, представляют интерес для разработки новых цитоскелет-зависимых критериев устойчивости растений к низким температурам на более широком наборе сортов озимой пшеницы.
Обнаруженные сортоспецифические эффекты экзогенной АБК необходимо учитывать как при составлении научных программ, так и при практическом применении регуляторов роста растений гормонального типа действия.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Международной научной конференции «New Geometry of Nature» (Казань, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003), на V съезде ОФР и Международной конференции «Физиология растений – основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на годичном собрании ОФР и Международной научной конференции «Проблемы физиологии растений Севера» (Петрозаводск, 2004), на первой Международной научно практической конференции «Медбиотек – 2005. Биологические и медицинские технологии: от научных результатов – к инновационным разработкам» (Москва, 2005), на годичном собрании ОФР и Международной научной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), на Всероссийской научной конференции «Современные аспекты экологии и экологического образования» (Казань, 2005), на втором Международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), на итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (Казань, 2005, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, включая иллюстративный материал и список цитируемой литературы, и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. В работе представлено 28 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает наименований, из которых 244 – иностранных.
1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектом исследований служили первичные или зародышевые корни (главный, первого и второго порядка) 7-15-суточных проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) трёх контрастных по морозоустойчивости сортов: Безостая 1 маломорозоустойчивый, Мироновская 808 - среднеморозоустойчивый, Альбидум – высокоморозоустойчивый. Часть экспериментов проводили на колеоптилях. Корни представляют собой удобную и информативную модель для выяснения роли цитоскелета в процессах роста и морфогенеза клеток и их ответных реакций на различные воздействия. Это связано с тем, что корни состоят из клеток, находящихся на разных стадиях роста и содержащих основные типы цитоскелетных структур, характерных для растений. Кроме того, корни проявляют высокую чувствительность к цитоскелетным антагонистам.
Растения выращивали в лабораторных условиях в кюветах на водопроводной воде при освещённости 100 Вт/м2 и 12-часовом фотопериоде.
Эксперименты проводили в соответствии с двумя схемами опытов (рис.1, 2), которые включали низкотемпературное закаливание разной продолжительности в течение 3-х (рис.1) и 7-ми суток (рис.2) при 30С. Незакалённые растения выращивали при 230С. К половине незакалённых 5-7-суточных проростков добавляли в среды выращивания растворы оризалина (10 мкМ) и АБК (30 мкМ), на которых они росли отдельно или вместе с этими препаратами 2-3 суток. В вариантах с закаливанием ингибитор или гормон добавляли за сутки до действия низких температур.
В отличие от ранее проведённых на кафедре опытов (Хохлова и др., 2004), в которых корни подвергали непродолжительной обработке раствором оризалина путём инкубации в течение 3-х часов, в наших экспериментах использовали длительное выращивание растений на растворе ингибитора в течение 2-3 суток.
Рис.1. Схема опытов при 3-суточном Рис.2. Схема опытов при 7-суточном закаливании. закаливании.
В работе был использован методический подход, основанный на модификации структурного состояния цитоскелета in situ с помощью ингибиторов полимеризации тубулиновых и актиновых белков и последующей регистрации исследуемых показателей.
Методический подход Модификация структурного состояния цитоскелета in situ с помощью ингибиторов полимеризации тубулиновых и актиновых белков – оризалина, цитохалазина Д и латрункулина Б Определение ростовых и Цитогистологический анализ Морфологический биометрических показателей кончиков корней и колеоптилей анализ целых корней (длина, число и сухой методами световой микроскопии корней (визуальные вес корней) и микрофотографии наблюдения) Определение интегрального Изучение актин физиологического показателя микротрубочковых водного обмена - взаимодействий водоудерживающей способности методом двойного (ВС) тканей/клеток корней ингибиторного (рефрактометрия) анализа Определение ростовых и биометрических показателей корней. Измеряли длину корней (главного, первого и второго порядка) у 20 растений каждого варианта, число корней подсчитывали у 10 растений и определяли их биомассу путём высушивания при 1050С до постоянного веса.
Водоудерживающую способность (ВС) корней определяли рефрактометрическим методом (Гусев, 1960) по содержанию воды, оставшейся в образцах после инкубации в течение 1,5 ч в гипертоническом 20%-ном растворе индифферентного осмотика ПЭГ 6000 с осмотическим потенциалом -0,65 МПа. Количество оставшейся воды определяли по разности между общим содержанием воды в навеске и содержанием отнятой воды.
Для расчёта извлекаемой из ткани воды использовали измеренный на рефрактометре (ИРФ-454Б) показатель преломления раствора ПЭГ-6000. Содержание общей и оставшейся воды рассчитывали в граммах на грамм сухого вещества.
Морфологический и цитогистологический анализы колеоптилей и кончиков корней проводили, используя визуальные наблюдения, световую микроскопию и микрофотографию. Подготовку образцов осуществляли по стандартной методике, описанной в работе (Паушева, 1988). Колеоптили и кончики корней длиной около 7- мм помещали в стеклянные бюксы с фиксатором Навашина и оставляли на 24 ч. Затем образцы отмывали дистиллированной водой в течение 3 ч. Проводку осуществляли, последовательно наливая в бюксы с образцами через каждый час растворы этанола в возрастающих концентрациях (10%-96%) и смеси бутанола с этанолом. Пропитывание тканей парафином в бюксах происходило в течение 2-3 недель, затем готовили парафиновые блоки с образцами. Продольные и поперечные срезы толщиной 20 мкм делали на микротоме (МС-2, Россия), для их окрашивания использовали гематоксилин («Serva», Германия). Срезы просматривали под световым микроскопом NU 2 (“Carl Zeiss Jena”, Германия) с помощью фотонасадки. Микрофотографирование срезов кончиков корней длиной 2,5-3 мм проводили на плёнке Микрат Изопан (Россия).
Цитоскелетные белки в экстрактах корней изучали методами одномерного ДДС Na электрофореза и иммуноблотинга (Olinevich et al., 2002). Содержание белков в пробах определяли по Bradford (1976). Разделение полипептидов проводили в ПААГ (10%) с ДДС-Na, используя прибор для электрофореза Mini-ProteinR II dual slab cell system («Bio-Rad», США). Для вестерн-блот анализа полипептиды переносили на PVDF (поливинилидендифторид) – мембраны и инкубировали в растворах моноклональных -, -тубулиновых (№356 и №357, «Amersham», Швеция) и актиновых (№350, «Amersham») антител. В качестве вторичных антител использовали антимышиный IgG («Promega» и «Caltag Laboratories», США), конъюгированный с щелочной фосфатазой. На конечном этапе мембраны обрабатывали хемилюминесцентным раствором (Substrat Kit, «Bio-Rad»). Идентификацию белков проводили флюорографически.
проводили с Изучение актин-микротрубочковых взаимодействий использованием двойного ингибиторного анализа (Collings et al., 1996, Tominaga et al., 1997). Для этого корни инкубировали в растворах блокаторов полимеризации тубулиновых и актиновых белков при их отдельном и совместном действии. Были проведены две серии экспериментов, в которых наряду с оризалином в качестве актинсвязывающего агента использовали либо цитохалазин Д (10 мкМ), либо латрункулин Б (1 мкМ), тестирующим параметром актин-микротрубочковых взаимодействий являлась ВС клеток/тканей. При этом о наличии контактов между актиновыми и тубулиновыми структурами и взаимовлиянии одних компонентов на другие судили по реакции ВС на совместное и отдельное действие цитоскелет модифицирующих агентов.
Статистическую обработку данных проводили с применением общепринятых математических методов (расчёт средних арифметических значений и их стандартных ошибок, определение критерия Стьюдента) средствами вычислительной программы Microsoft Excel.
Проведённые исследования были поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований (грант №04-04-49318) и Академией наук РТ (фонд НИОКР, грант №03-3.9-115/2004).
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Влияние оризалина на биометрические характеристики корней разных сортов озимой пшеницы в связи с закаливанием к низким температурам и обработкой АБК Из данных рис.3. следует, что под влиянием оризалина (без АБК) происходило уменьшение длины корней незакалённых проростков в среднем на 21% - у главных и на 28% - у корней первого и второго порядка (табл.1), что указывает на ингибирование их линейного роста и вовлечение цитоскелета в ростовые процессы корней. До закаливания у маломорозоустойчивого сорта Безостой 1 рост корней подавлялся сильнее (на 33,3%), а у высокоморозоустойчивого Альбидум 114 – в меньшей степени (на 10,6%), то есть установлена обратная зависимость между ростингибирующим действием препарата и уровнем морозоустойчивости сорта. Наибольшее замедление роста, вызываемое оризалином, отмечено у более коротких корней первого и второго порядка (рис.3).
Следует отметить, что торможение ростовой функции корней коррелировало с оризалин-индуцированным накоплением их биомассы (табл.2). У маломорозоустойчиво го сорта выявлено не только наибольшее замедление линейного роста корней, но и более значительное накопление их сухого веса (на 41,2%) под влиянием антицитоскелетного препарата.
На фоне АБК степень ингибирования роста незакалённых корней к оризалину существенно уменьшалась, особенно у Безостой 1 и Мироновской 808, что может быть связано со снижением содержания тубулиновых белков (рис.13) и начавшейся стабилизацией цитоскелета под влиянием гормона (Хохлова, Олиневич, 2003). Именно у этих сортов АБК также ослабляла эффект препарата на накопление биомассы Таблица 1. Влияние оризалина на длину корней незакалённых (230С) и закалённых (30С, 3 сут) проростков, % ингибирования Зародышевые корни Первого Первого Главный и Главный и Варианты второго второго порядка порядка +АБК -АБК Безостая Незакалённые 33,3 43,1 10,8 4, Закалённые 34,0 40,0 5,9 3, Мироновская Незакалённые 20,0 27,1 2,6* 3,2* Закалённые 25,3 27,5 12,8 14, Альбидум Незакалённые 10,6 14,3 12,5 9, Закалённые 11,2 15,9 19,8 16, * Увеличение длины Рис.3. Влияние оризалина на длину корней незака лённых (230С) и закалённых (30С, 3 сут) пророст ков:
- контроль, - оризалин (10 мкМ), 1 – глав ные корни, 2 – корни первого и второго порядка.
Таблица 2. Влияние оризалина и абсцизовой кислоты (АБК) на сухой вес корней незакалённых (230С) и закалённых (30С, 3 сут) проростков Безостая 1 Мироновская 808 Альбидум Сухая мас- Изменение Сухая мас- Изменение Сухая мас- Изменение Варианты са корней, сухой мас- са корней, сухой мас- са корней, сухой мас % от сы, % от % от сы, % от % от сы, % от сырого веса контроля сырого веса контроля сырого веса контроля НЕЗАКАЛЁННЫЕ (230С) - АБК Контроль 5,1±0,2 100 5,6±0,2 100 5,1±0,1 Оризалин 7,2±0,9 141,2 6,6±0,1 117,9 5,7±0,2 111, +АБК Контроль 4,8±0,2 100 5,4±0,1 100 6,8±0,5 Оризалин 5,7±0,4 118,8 5,7±0,2 105,6 7,6±0,3 111, ЗАКАЛЁННЫЕ (30С, 3 сут) - АБК Контроль 7,5±0,1 100 6,2±0,3 100 7,5±0,4 Оризалин 7,5±0,7 100,0 6,0±0,1 96,8 8,4±0,5 112, + АБК Контроль 7,2±0,3 100 6,7±0,5 100 8,4±0,6 Оризалин 6,8±0,2 94,4 7,5±0,4 111,9 8,8±0,5 104, корней (табл.2), вероятно, за счёт частичного восстановления их ростовой функции (рис.3). При 3-суточном закаливании сохранялась та же направленность, что и у корней незакалённых растений: ростингибирующий эффект препарата снижался с повышением морозоустойчивости сорта. При совместной обработке низкими температурами и АБК гормон снимал ингибирующее действие гипотермии на длину корней в большей степени у Безостой 1, в меньшей – у Мироновской 808, а у Альбидум 114 чувствительность корней к оризалину в этих условиях повышалась (рис.3, табл.1).
В следующей серии опытов наряду с 3-суточной закалкой растения подвергали более длительному действию низких температур в течение 7 суток, что соответствовало оптимальному периоду для полного прохождения первой фазы закаливания (Туманов, 1979). Обнаружено укорочение главных корней незакалённых проростков под влиянием оризалина, которое возрастало в ряду Альбидум 114 (16,1%) Безостая 1 (23,9%) Мироновская 808 (28,2%) (рис.4, табл.3). По сравнению с результатами опытов (рис.3, табл.1) в этих экспериментах наибольшее уменьшение длины корней отмечено у среднеморозоустойчивого сорта, который характеризовался повышенным уровнем тубулиновых белков (рис.13). АБК, как и более длительное закаливание (30С, 7 сут), значительно снижала рост-замедляющее действие препарата на первичные корни исследуемых сортов (рис.4). Следует отметить, что АБК и закаливание (без оризалина), в отличие от предыдущих опытов, вызывали уменьшение длины корней, а на фоне ингибитора снижение ростовой функции корней в основном усиливалось, но в меньшей Таблица 3. Влияние оризалина на длину корней незакалённых (230С) и закалённых (30С, 7 сут) проростков, % ингибирования Зародышевые корни Первого Первого Главный и Главный и Варианты второго второго порядка порядка +АБК -АБК Безостая Незакалённые 23,9 18,4 15,3 4, Закалённые 3,6 4,1 13,7 6,3* Мироновская Незакалённые 28,2 18,2 2,9 7, Закалённые 20,3 8,6 15,2 3, Альбидум Незакалённые 16,1 20,4 5,3* 4,3* Закалённые 2,1 13,8 4,7 8, * Увеличение длины Рис.4. Влияние оризалина на длину корней незака лённых (230С) и закалённых (30С, 7 сут) пророст ков:
- контроль, - оризалин (10 мкМ), 1 – глав ные корни, 2 – корни первого и второго порядка.
степени, чем у гормон-необработанных и незакалённых растений (рис.4). По видимому, эти результаты свидетельствуют о функциональном участии цитоскелета в АБК- и температуро-опосредованном торможении линейного роста растений.
При совместном действии гормона и низких температур отмечено разнонаправленное изменение ростовой функции корней исследуемых сортов (рис.4), вероятно, обусловленное неодинаковым содержанием АБК в клетках корней этих сортов и ослаблением роли гормона на более позднем этапе закаливания (Veisz et al., 1996).
2.2. Морфогенные эффекты оризалина на корни разных сортов озимой пшеницы, адаптированных к низким температурам и обработанных АБК 2.2.1. Влияние оризалина на морфологию целых корней Вышерассмотренные биометрические результаты по изучению влияния оризалина на длину корней в основном совпадают с визуальными морфологическими наблюдениями, представленными на рис.5. Видно, что оризалин вызывает укорочение корней и образование на их кончиках луковицеподобных утолщений (известных в литературе под названием свэллинг) у незакалённых проростков всех трёх сортов. По размеру эти апикальные расширения были больше у корней Мироновской 808 (рис.5), что может быть связано с более высоким содержанием в клетках корней Незакалённые (230С) Закалённые (30С, 3 сут) +АБК +АБК -АБК -АБК А Б В к о к о к о к о Рис.5. Влияние оризалина на морфологию корней проростков разных сортов озимой пшеницы, выращенных на воде и растворе АБК: А – Безостая 1, Б – Мироновская 808, В – Альбидум 114;
к – контроль, о – оризалин.
этого сорта тубулинов (рис.13), являющихся мишенями для ингибитора.
По литературным данным, набухание апексов корней обусловлено ингибированием полимеризации МТ, поскольку оризалин, связываясь с тубулином, препятствует образованию новых МТ и, кроме того, вызывает разборку и исчезновение присутствующих в клетках тубулиновых структур (Morejohn et al., 1987). В клетках корней риса Giani с сотр. (1998) наблюдали исчезновение кортикальных МТ, сопровождающееся изодиаметрическим набуханием клеток и расширением апексов.
Низкотемпературное закаливание, как и АБК, ослабляло оризалин-индуцированное набухание кончиков корней и особенно у среднеморозоустойчивого сорта. После совместной обработки растений гормоном и гипотермией деформирующие эффекты ингибитора на апексы корней Безостой 1 и Мироновской 808 практически исчезали, сохраняясь, хотя и в меньшей степени, при раздельном действии данных факторов. Это свидетельствует о синергетическом (взаимоусиливающем) влиянии гипотермии и гормона на морфологию кончиков корней менее морозоустойчивых сортов по сравнению с высокоморозоустойчивым (рис.5).
2.2.2. Сравнительное изучение эффектов оризалина на морфогенез колеоптилей и кончиков корней На примере среднеморозоустойчивого сорта был проведён сравнительный цитогистологический анализ колеоптилей и кончиков корней. Из рис.6, где показаны продольные срезы кончиков корней, видно, что оризалин вызывал образование апикальных утолщений, начиная с меристематических клеток, интенсивно распространяющихся на зону растяжения. При этом клетки становились округлыми, часто неправильной формы и сильно увеличивались в размерах, что указывает на потерю полярности клеточного роста. Наиболее чёткое изменение формы клеток и их увеличение проявились на поперечных срезах корней (рис.7).
прокамбий прокамбий центральный центральный цилиндр цилиндр эндодерма эндодерма первичная кора первичная кора ризодерма ризодерма наибольшее апикальное утолщение корней апикальная апикальная меристема меристема корневой чехлик корневой чехлик ОРИЗАЛИН (10 мкМ) КОНТРОЛЬ Рис.6. Продольный срез кончиков корней проростков Мироновской 808, выращенных на воде (контроль) в течение 4 суток и растворе оризалина (10 мкМ, 3 сут).
У колеоптилей отмечено лишь небольшое увеличение диаметра их основания и размера паренхимных клеток при обработке оризалином (рис.7).
Морфогистологические данные подтверждаются визуальными наблюдениями, согласно которым препарат в большей степени ингибировал рост корней, чем колеоптилей (рис.8). Таким образом, можно заключить, что более высокая чувствительность корней к деструктивному действию оризалина, чем колеоптилей, возможно, связана с менее стабильным цитоскелетом в корнях, о чём свидетельствует более низкое соотношение актиновые/тубулиновые белки (Хохлова и др., 2004).
паренхима эндодерма первичной коры ризодерма элементы протоксилемы паренхима центрального цилиндра прокамбий паренхима лист сосудистый пучок сосудистый пучок листа колеоптиля прокамбий ризодерма паренхима центрального цилиндра паренхима эндодерма первичной коры КОРЕНЬ КОЛЕОПТИЛЬ Рис.7. Поперечные срезы кончика корня и основания колеоптиля проростков Мироновской 808:
А – контроль (вода, 4 сут), Б – оризалин (10 мкМ, 3 сут).
Рис.8. Проростки озимой пшеницы Мироновской 808, выращенные на воде (контроль) в течение 4 суток и растворе оризалина (10 мкМ, 3 сут).
Оризалин Контроль КОНТРОЛЬ 2.2.3. Цитогистологический анализ индуцированного оризалином апикального утолщения корней Для более детального исследования апикальных деформаций был проведён цитогистологический анализ продольных срезов апексов корней, подвергнутых действию низких температур и АБК. Из микрофотографий видно (рис.9, 10), что оризалин-индуцированное утолщение кончиков возрастало в ряду Альбидум Безостая 1 Мироновская 808 и было наибольшим у незакалённых и закалённых растений среднеморозоустойчивого сорта. В радиальном направлении изменялись все клетки корня, но особенно клетки коровой паренхимы, которые приобретали округлую или неправильную форму и более всего увеличивались в размерах, что указывает на потерю полярности клеточного роста. В большей степени вызываемые ингибитором изменения происходили в переходной зоне (постмитотическая меристема и дистальная часть элонгации), то есть на участках длиной 2,5-3 мм от кончика корня. По мнению Baluska с сотр. (2001), именно эта зона перехода является разновидностью сенсорной зоны, которая даёт возможность растущему апексу постоянно контролировать действие разных условий окружающей среды и влиять на соответствующие ответные реакции корней – замедление или стимуляцию их роста.
Важно, что направленность сортовых различий в реакции корней на оризалин, которая усиливалась в ряду Альбидум 114 Безостая 1 Мироновская 808 (рис.9), была Безостая 1 Мироновская 808 Альбидум -АБК +АБК к о к о к о К О К О К О (230С) Рис.9. Продольные срезы кончиков корней незакалённых проростков разных сортов озимой пшеницы, выращенных на средах без АБК и с АБК: к – контроль, о – оризалин, (увеличение x29).
сходной с действием данного ингибитора на ростовые процессы корней (рис.4, 5). Этот результат можно рассматривать как указание на зависимость цитоскелетной регуляции роста и морфогенеза корней от уровня морозоустойчивости.
АБК заметно уменьшала влияние оризалина на набухание кончиков корней Безостой 1 и Мироновской 808, в то время как на апексы корней Альбидум 114 не оказывала существенного влияния (рис.9). Низкотемпературное закаливание также снижало морфогенное действие препарата у всех трёх сортов (рис.10). Такие эффекты гормона и гипотермии могут быть связаны со стабилизацией цитоскелета, на что указывает снижение деполимеризующего влияния оризалина и криостресса (-70С, 2 ч) на МТ и появление новых холодостойких популяций МТ с изменённым составом изо типов (Abdrakchamanova et al., 2003;
Хохлова, Олиневич, 2003). Однако в этих условиях более утолщенными, по-прежнему, были кончики корней Мироновской 808.
Безостая 1 Мироновская 808 Альбидум -АБК +АБК к о к о к о К О К О К О Рис.10. Продольные срезы кончиков корней закалённых проростков (30С, 7 сут) разных сортов озимой пшеницы, выращенных на средах без АБК и с АБК : к – контроль, о – оризалин, (увеличение x29).
АБК почти полностью нивелировала реакцию закалённых корней на оризалин только у Безостой 1, поскольку у этого сорта расширение апекса не было отмечено (рис.10), то есть синергизм гормона и гипотермии прослеживался наиболее сильно. У Мироновской 808 синергизм этих двух факторов обнаруживался в меньшей степени, а у Альбидум наблюдали его отсутствие. Полученные результаты свидетельствуют о том, что наибольшая способность экзогенного гормона к восстановлению нарушенного оризалином морфологического состояния кончиков корней сильнее проявляется при закаливании у маломорозоустойчивого сорта, что, по-видимому, связано с меньшим содержанием в клетках Безостой 1 эндогенной АБК, в отличие от более выносливых сортов (Veisz et al., 1996).
2.3. Влияние антицитоскелетных препаратов на водоудерживающую способность (ВС) корней разных сортов озимой пшеницы при низкотемпературном закаливании и действии АБК 2.3.1. Изменение ВС корней, обработанных оризалином В связи с тем, что имеются данные о влиянии цитоскелета на процессы внутри- и межклеточного транспорта воды (Wayne, Tazawa, 1988;
Жолкевич и др., 2001;
Волобуева и др., 2001) и на осмотическую проницаемость клеток растений (Bochkareva et al., 2005), представляло интерес выявить сходство и различия при действии АБК и закаливания на водный обмен корней, в частности, на ВС, которая является интегральным физиологическим показателем водного обмена растений, влияющим на ростовые процессы.
При проведении первой серии опытов с 3-суточным закаливанием обнаружено оризалин-индуцированное снижение ВС корней незакалённых проростков Безостой 1 и Альбидум 114 (рис.11), которое, возможно, обусловлено изменением состояния клеточной воды за счёт дегидратации филаментов цитоскелета и связанных с ним клеточных структур. Не менее важной причиной уменьшения ВС у этих сортов может быть усиление водопроницаемости мембран (Khokhlova et al., 1997), связанное со структурной реорганизацией аквапоринов вследствие замедления процессов их эндоцитоза (Elkjaer et al., 1995). У Мироновской 808, наоборот, выявлено повышение ВС корней относительно контроля (рис.11). Такое влияние оризалина на способность корней удерживать воду у этого сорта, вероятно, объясняется повышенным содержанием актина в клетках Мироновской 808 (рис.13), в результате чего может происходить закупорка водных каналов полимеризованными фрагментами актиновой сети, образующимися при различных стрессах (Collings et al., 1994;
1996). При совместной обработке гормоном и низкими температурами (30С, 3 сут) выявлено их синергетическое действие только у Безостой 1, о чем свидетельствует почти полная потеря чувствительности ВС корней к оризалину по сравнению с понижающим эффектом этих факторов по отдельности (рис.11).
Рис.11. Влияние оризалина и абсцизовой кислоты (АБК) на ВС корней незакалённых (230С) и закалённых (30С, 3-7 сут) проростков: контроль, - оризалин ( мкМ).
В серии опытов при более продолжительном 7-суточном закаливании сортовые различия у незакалённых проростков были несколько сглажены в результате уменьшения реакции ВС на ингибитор (рис.11). В этих опытах оризалин вызывал однонаправленное повышение ВС корней незакалённых проростков исследуемых сортов по сравнению с предыдущими экспериментами, что может быть обусловлено возрастными особенностями растений и более значительным вкладом в мембранный транспорт воды реорганизующихся актиновых филаментов.
2.3.2. Совместное действие оризалина и цитохалазина Д (или латрункулина Б) на ВС корней Поскольку для сохранения структурной целостности и стабильности цитоскелета большое значение имеют актин-микротрубочковые взаимодействия, то для их изучения мы использовали двойной ингибиторный анализ (Collings et al., 1996;
Tominaga et al., 1997).
Установлено, что чувствительность, в данном случае степень изменения ВС корней закалённых проростков, к одновременной обработке оризалином и цитохалазином Д, по сравнению с эффектом одного лишь цитохалазина Д, была меньше, чем до закаливания (сильнее это проявилось у Безостой 1) (рис.12, табл.4). Следовательно, на фоне гипотермии оризалин снимал «цитохалазиновый» эффект, но в меньшей степени, чем у незакалённых растений, что может указывать на менее значительное влияние тубулинового цитоскелета на актиновый и свидетельствовать о меньшем деструктивном действии МТ на актиновые филаменты. Кроме того, при адаптации к холоду прослеживается влияние и актинового цитоскелета на тубулиновый, поскольку цитохалазин Д у всех трёх сортов устранял эффект оризалина. По-видимому, эти Таблица 4. Степень изменения ВС незакалённых (230С) и закалённых (30С, сут) проростков под влиянием оризалина (О) и цитохалазина Д (ЦХ Д) (отн.ед.) Варианты -АБК +AБK -АБК +AБK Незакалённые Закалённые Безостая О -0,56 -0,18 -0,14 -0, ЦХ Д +0,07 -0,82 -0,37 -0, О+ЦХ Д -0,61 -1,33 -0,61 -0, Мироновская -0,32 -0,10 -0,18 +0, О +0,09 -0,23 -0,04 +0, ЦХ Д -0,20 -0,50 -0,11 +0, О+ЦХ Д Альбидум -0,28 -0,22 -0,08 -0, О -0,11 -0,27 -0,11 -0, ЦХ Д -0,41 -0,56 -0,28 -0, О+ЦХ Д Рис.12. Влияние оризалина и цитохалазина Д на ВС корней незакалённых (230С) и закалённых (30С, 7 сут) проростков: - контроль, - оризалин ( мкМ), - цитохалазин Д (10 мкМ), - оризи лин + цитозалазин Д.
результаты являются отражением того, что низкие температуры упрочняют актин микротрубочковую сеть, причём доминирующая роль в этом процессе, скорее всего, принадлежит МТ.
При использовании экзогенной АБК чувствительность ВС корней к совместной обработке ингибиторами уменьшалась по отношению к цитохалазину Д и усиливалась относительно одного оризалина (особенно у Безостой 1) по сравнению с гормон необработанными проростками (рис.12, табл.4). В связи с этим на фоне АБК, очевидно, влияние тубулиновой сети на актиновую ослабевает и возрастает действие актиновых компонентов на тубулиновые. Учитывая данные о деструктивном эффекте гормона на компоненты цитоскелета – уменьшение содержания тубулиновых белков и МТ, интенсивности их флуоресценции, а также разрушение МФ (Олиневич, Хохлова, 2002), можно полагать, что АБК ослабляет актин-микротрубочковые контакты в результате деполимеризации актиновых филаментов.
Латрункулин Б в большинстве случаев действовал аналогично цитохалазину Д (данные не представлены). Однако этот агент сильнее, чем цитохалазин Д, влиял на способность корней удерживать воду и значительнее изменял ВС. По-видимому, латрункулин Б является более специфичным ингибитором полимеризации МФ, что отмечено и в литературе (Ayscough, 1998).
2.4. Содержание цитоскелетных белков в корнях при температурном и гормональном воздействиях Учитывая, что анизотропный рост клеток и морфогенез растений зависят от полностью сформированного цитоскелета, главным образом, от МТ, МФ и связанных с ними белков (MAPs и ABPs) (Barlow, Baluska, 2000), в своей работе мы изучали тубулиновые и актиновые белки в экстрактах корней с помощью вестерн-блот анализа у растений 4-х вариантов: незакалённые без АБК, незакалённые с АБК, закалённые без АБК, закалённые с АБК.
Вестерн-блот-анализ с использованием моноклональных антител к тубулину и актину позволяет по интенсивности окрашивания полос на иммуноблотах судить о содержании белков (Giani et al., 1998). Интенсивность сигналов от тубулинов и актинов в экстрактах корней среднеморозоустойчивого сорта была больше, чем у двух других сортов (рис.13), и это указывает на более высокое содержание цитоскелетных белков в корнях Мироновской 808. Не было обнаружено заметных различий в уровне тубулинов и актина между незакалёнными и закалёнными растениями.
Обработка незакалённых проростков АБК уменьшала количество тубулиновых белков в корнях всех исследуемых сортов, а актиновых – только у менее морозоустойчивых, в то же время актин Альбидум 114 оказался малочувствительным к действию экзогенного гормона (рис.13). При сравнении эффектов АБК на содержание цитоскелетных белков сделано заключение о большей стабильности актиновых структур, чем тубулиновых в корнях Альбидум 114, а также актинов этого сорта, в отличие от других сортов. Показано, что МФ различных растений выдерживали холодовой стресс от 00С до 40С без изменения своей структуры, а МТ в этих условиях разрушались (Quader et al., 1989;
Astrom et al., 1991). Ингибиторный эффект АБК на тубулины и актины может быть следствием снижения синтеза цитоскелетных белков, вызываемого деструкцией цитоскелетной сети (Jiang et al., 1996;
Олиневич, Хохлова, 2003).
При совместном действии низких температур и АБК уровни тубулинов и актина были больше, чем у растений, обработанных одной лишь АБК, то есть холодовое закаливание снимало эффект гормона, причём значительнее у Альбидум 114 в экспериментах с тубулинами и у Мироновской 808 в опытах с актином (рис.13). По видимому, влияние гипотермии на цитоскелетные белки проявляется только после изменения гормонального статуса клеток и связано с наиболее полным восстановлением организации цитоскелета в результате снижения содержания АБК и ослабления её роли на завершающих этапах низкотемпературной адаптации проростков.
Рис.13. Иммуноблоты цитоскелетных белков корней проростков разных сортов озимой пшеницы.
А – Безостая 1, Б – Мироновская 808, В – Альбидум 114. 1 – незакалённые (230С), без АБК;
2 – незакалённые, с АБК;
3 – закалённые (30С, 7 сут), без АБК;
4 – закалённые, с АБК. Концентрация белка в каждой аликвоте 15 мкг.
-тубулины -тубулины актин 2.5. Зависимость ростингибирующего и морфогенного эффектов оризалина от содержания цитоскелетных белков Согласно довольно распространённой точке зрения рост клеток растяжением зависит от кортикальных МТ (Lloyd, Chan, 2004), однако, существуют и другие механизмы цитоскелетного контроля, связанные с вовлечением актиновых филаментов в процессы полярного клеточного роста. В ранее проведённых нами исследованиях показано, что 3-часовая инкубация корней в растворе оризалина, вызывая деполимеризацию МТ в разных зонах корня, не повлияла на размер и форму клеток (рис.14) (Хохлова и др., 2003). Однако после продолжительного выращивания растений на растворе оризалина (2-3 сут) мы наблюдали заметное замедление линейного роста корней и морфологические деформации их кончиков. Для объяснения зависимости реакции корней и их апексов на оризалин от содержания цитоскелетных белков следует иметь в виду сообщения о тесной физической колокализации МТ и МФ (Collings et al., 1998;
Hasezawa et al., 1998) и влиянии деполимеризации/разборки одной цитоскелетной сети на полимерное состояние и организацию другой (Tominaga et al., 1997;
Volkmann, Baluska, 1999). В связи с этим можно полагать, что обнаруженные нами при длительном действии оризалина торможение ростовых процессов корней и радиальное расширение их апексов вызваны разборкой именно актиновых структур, запускаемой деструкцией взаимодействующих с ними МТ. Основанием для такого предположения является установленное в опытах возрастающее ингибирование оризалином роста корней и утолщение их кончиков в ряду Альбидум 114 Безостая 1 Мироновская 808 (рис.4, 9), которое соответствует таким же сортовым различиям в содержании актина (рис.13). Следовательно, чем больше в корнях содержится актина, тем значительнее ростингибирующее и морфогенное влияние антимикротрубочкого агента на корни.
При закаливании чувствительность корней и их апексов к оризалину снижалась, но содержание тубулинов и актина практически не изменялось (рис.13). По-видимому, это свидетельствует об отсутствии прямой зависимости морфофизиологических ответов корней закалённых растений от массы цитоскелетных белков. Вместе с тем более низкая реакция корней на оризалин при адаптации к холоду, возможно, связана со стабилизацией цитоскелета (Олиневич, Хохлова, 2002;
Abdrakchamanova et al., 2003) и усилением вследствие этого актин-микротрубочковых контактов, на что указывают полученные нами результаты двойного ингибиторного анализа.
Рис.14. Иммунофлуоресцентная визуализа ция тубулинового цитоскелета в клетках зон меристемы (а,б), растяжения (в,г) и начала дифференцировки (д, е) корней контрольных (а, в, д) и опытных (б, г,е) обработанных оризалином (10 мкМ, 3 ч) проростков Мироновской 808 (Хохлова и др., 2003).
В отличие от низких температур, АБК, в основном, уменьшала содержание цитоскелетных белков (рис.13) и в то же время снимала ростингибирующий и морфогенный эффекты оризалина на корни. Из этого следует, что ростовые и формообразовательные процессы корней при действии АБК контролируются уровнем тубулинов и актина, поскольку, чем их меньше, тем меньше корни реагируют на оризалин. Дополнительным фактором, снижающим чувствительность АБК обработанных корней к оризалину, может быть повышение стабильности МТ за счёт избирательной деструкции компонентов тубулинового цитоскелета (Хохлова, Олиневич, 2003) и, судя по данным двойного ингибиторного анализа, ослабления ассоциированности между МТ и МФ из-за деполимеризации последних. Сортовые различия проявились в том, что в корнях Альбидум 114 тубулинов было меньше, чем в корнях двух других сортов, а уровень актина не изменялся после обработки АБК (рис.13), и это сопровождалось наименьшей реакциией апекса корня на оризалин (рис.10).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Согласно общепринятой точке зрения, рост и морфогенез растений контролируются высокой динамичностью взаимодействий основных компонентов цитоскелетной сети – тубулиновых микротрубочек (МТ), актиновых микрофиламентов (МФ) и ассоциированных с ними белков (MAPs и ABPs) как между собой, так и с клеточной стенкой (Tominaga et al., 1997;
Blancaflor, 2000;
Baluska et al., 2003). При этом в процессах клеточного роста предпочтение отдаётся динамичности кортикальной F актиновой сети (Volkmann, Baluska, 1999;
Hepler et al., 2001).
Принимая во внимание эти сведения, мы полагаем, что обнаруженные в работе нарушения клеточного роста и морфологии корней, вплоть до апикального утолщения, в ответ на продолжительное действие оризалина вызваны разборкой актиновых филаментов, запускаемой деполимеризацией взаимодействующих с ними МТ.
Основанием для такого предположения является установленное в опытах возрастающее ингибирование оризалином роста корней и утолщение их кончиков в ряду Альбидум 114 Безостая 1 Мироновская 808, которое соответствовало таким же сортовым различиям в содержании актина. Зависимость морфологических ответов корней на вызываемую оризалином деструкцию МТ от содержания цитоскелетных белков можно представить следующим образом. Повышенный уровень тубулинов в корнях Мироновской 808 по сравнению с другими сортами приводит к более сильному разрушению тубулинового цитоскелета и, следовательно, - к более значительной разборке связанной с ним кортикальной актиновой сети. Возникающие при этом нарушения трансмембранных взаимодействий F-актина с клеточной стенкой будут способствовать наибольшим эффектам апикального утолщения корней и вместе с тем интенсивному торможению их роста, что мы и наблюдали у среднеморозоустойчивого сорта.
Анализ имеющихся в литературе сведений и собственных экспериментальных данных позволил представить в виде схемы (рис.15) последовательность событий, отражающих зависимость процессов роста, морфогенеза и водообмена корней от структурного состояния цитоскелета. При составлении данной схемы мы исходили из существующего представления, согласно которому полярный рост и создание специфических форм клеток в большей степени контролируется актиновым цитоскелетом и, прежде всего, кортикальной F-актиновой сетью, тесно связанной с сигнальными путями плазмалеммы и кортикальными МТ (Barlow, Baluska, 2000;
Staiger, 2000;
Клячко 2004, 2006).
Высокоспецифический ингибитор полимеризации тубулиновых белков клеток растений – оризалин Деструкция мембранного тубулина и кортикальных МТ Ослабление взаимодействий тубулинового цитоскелета с плазматической мембраной Уменьшение механического напряжения, повышение подвижности и деполяризация мембраны Активация и увеличение Изменение активности «времени жизни» Са2+-каналов Rop ГТФаз Усиление потоков Са2+ в цитоплазму и увеличение содержания цитозольного Са2+ RIC - белки Включение Са2+-зависимых киназных каскадов Arp 2/ Фосфорилирование – дефосфорилирование MAPs и ABPs Разборка кортикальной F-актиновой сети и цитоплазматических тяжей МФ Изменение направленного Замедление циклозиса, Нарушение функционирования транспорта секреторных трансмембранных осмосенсора везикул к зонам роста и взаимодействий F (AQPs+актин), повышение их эндо-/экзоцитоза актина с клеточной ВС и тургора клеток стенкой Увеличение объёма, размера клеток и потеря полярности роста Радиальное набухание апекса, ингибирование линейного роста и укорочение корней Рис.15. Механизм действия оризалина на рост и морфогенез корней: Rop ГТФазы – малые ГТФазы;
MAPs – белки, ассоциированные с МТ;
ABPs – актин-связывающие белки;
RIC – белки, взаимодействующие с малыми ГТФазами;
Arp2/3 – актин-белковый комплекс;
AQPs – аквапорины;
ВС – водоудерживающая способность.
ВЫВОДЫ При выращивании проростков отличающихся по морозоустойчивости сортов озимой 1.
пшеницы на растворе высокоспецифического ингибитора полимеризации тубулиновых белков растительных клеток – оризалина впервые обнаружены сортовые различия в морфофизиологических изменениях корней, которые проявились в неодинаковом замедлении их линейного роста, увеличении биомассы и луковицеобразном утолщении кончиков, а также повышении водоудерживающей способности (ВС).
Цитогистологический анализ показал, что под действием оризалина происходило 2.
изменение в радиальном направлении всех клеток корня, но особенно коровой паренхимы;
последние приобретали округлую или неправильную форму и более всего увеличивались в размерах вследствие потери полярности клеточного роста.
Реакция корней на оризалин была более выраженной, чем колеоптилей.
3.
Впервые установлено, что содержание тубулинов и актина в корнях 4.
среднеморозоустойчивого сорта было больше по сравнению с мало- и высокоморозоустойчивым сортами. Холодовое закаливание нивелировало ингибирующий эффект АБК на цитоскелетные белки.
Деформирующее влияние оризалина на корни (укорочение, набухание апексов) 5.
возрастало в ряду высоко- мало- среднеморозоустойчивого сортов и коррелировало с содержанием актина в корнях. Это позволяет предполагать генотипически детерминированную зависимость морфофизиологических ответов корней на антимикротрубочковый агент от разборки актинового цитоскелета.
Низкотемпературное закаливание проростков, как и АБК, снижало или устраняло 6.
рост-замедляющий и морфогенный эффекты оризалина на корни. Наблюдаемое синергетическое действие гипотермии и АБК в большей степени характерно для корней маломорозоустойчивого сорта.
У закалённых и обработанных гормоном растений отмечены по-разному 7.
происходящие изменения ВС корней при совместном использовании ингибиторов тубулинового и актинового цитоскелета – оризалина и цитохалазина Д (или латрункулина Б) по сравнению с влиянием каждого из них по отдельности. По видимому, эти различия обусловлены модификацией актин-микротрубочковых контактов – усилением (гипотермия) или ослаблением (АБК).
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Бондарева, А.И. Оризалин-индуцированные морфофизиологические изменения проростков озимой пшеницы / А.И. Бондарева, М.В. Макарова // Итоговая научно студенческая конференция 2001 г.: Тез. докл. – Казань: Изд-во КГУ, 2002. – С.6.
2. Морфофизиологические ответы растений в связи с модификацией цитоскелета / Л.П.
Хохлова, Н.Ю. Тараканова, Е.В. Рычкова, А.И. Бондарева, М.В. Макарова // Международная конференция «Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты»: Тез. докл. – Сыктывкар. – 2002. – С.237-238.
3. Макарова, М.В. Сортовые особенности ответов растений озимой пшеницы на оризалин при температурном и гормональном воздействиях / М.А. Макарова // Итоговая научно-студенческая конференция 2002 г.: Тез. докл. – Казань: Изд-во КГУ, 2003. – С.11.
4. Хохлова, Л.П. Морфофизиологические ответы растений на действие антимитотичес кого препарата оризалина / Л.П. Хохлова, О.В. Олиневич, М.В. Макарова // Доклады РАН. – 2003. – Т.390, №1. – С.122-126.
5. Morphofunctional approach at the study of the cytoskeleton role in the thermoadaptive potential in plants with different genotype / Khokhlova L.P., Olinevich O.V., Makarova M.V. et al. // Proceedings of the Joint International Scientific Conference “New Geometry of Nature”. – Kazan. – 2003. – Р.144-155.
6. Роль цитоскелета в морфофизиологических ответах растений на действие адаптогенных факторов / Л.П. Хохлова, О.В. Олиневич, М.В. Макарова, М.А.
Бочкарёва // Тез. докл. 5 съезда ОФР и Международной конференции «Физиология растений – основа фитобиотехнологии». – Пенза. – 2003. – С.352-353.
7. Макарова, М.В. Морфофизиологические ответы растений на действие антимитотического агента – оризалина, являются генотипически детерминирован ными / М.В. Макарова, А.И. Бондарева, М.А. Бочкарёва // Материалы XLI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно технический прогресс». – Новосибирск. – 2003. – С.24.
8. Системные исследования цитоскелета в связи с адаптацией растений к низким температурам / Л.П. Хохлова, О.В. Олиневич, М.В. Макарова, М.А. Бочкарёва // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков». – Ярославль. – 2003. – С.139-141.
9. Роль цитоскелета в водном обмене растений разных генотипов озимой пшеницы / Л.П. Хохлова, О.В. Олиневич, М.В. Макарова, Л.Ш. Граханцева // Тез. докл.
годичного собрания ОФР и Международной научной конференции «Проблемы физиологии растений Севера». – Петрозаводск. – 2004. – С.195.
10. Биотехнологические аспекты фундаментальных исследований цитоскелета:
идентификация маркеров стресс-устойчивости растений / Л.П. Хохлова, О.В.
Олиневич, П. Ник, М.В. Макарова и др. // Материалы первой Международной научно-практической конференции «Медбиотек – 2005. Биологические и медицинские технологии: от научных результатов – к инновационным разработкам».
– Москва. – 2005. – С.115-119.
11. Новые диагностические маркеры стресс-устойчивости растений / Л.П. Хохлова, О.В.
Олиневич, М.В. Макарова, М.А. Бочкарёва // Материалы Всероссийской научной конференции «Современные аспекты экологии и экологического образования». – Казань: Изд. центр. КГУ, 2005. – С.493-496.
12. Цитоскелетный контроль роста и морфогенеза разных генотипов озимой пшеницы в связи с индукцией морозоустойчивости / Л.П. Хохлова, О.В. Олиневич, М.В.
Макарова, М.А. Бочкарёва // Тез. докл. годичного собрания ОФР и Международной научной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». – Вологда. – 2005. – С.176.
13. Морфофизиологические изменения корней разных генотипов озимой пшеницы в связи с деструкцией цитоскелета / Л.П. Хохлова, О.В. Олиневич, М.В. Макарова, М.А. Бочкарёва // Физиология растений. – 2006. – Т.53, № 3. – С.418-430.
14. Хохлова, Л.П. Реорганизация цитоскелета при действии на растения низких температур / Л.П. Хохлова, М.В. Макарова // Учёные записки КГУ. – 2006. – Т.148, кн.3. – С.65-88.
15. Макарова, М.В. Биосенсорика корней разных генотипов озимой пшеницы в связи с деструкцией цитоскелета при температурном и гормональном воздействиях / М.В.
Макарова, Л.П. Хохлова // Тез. докл. годичного собрания ОФР и конференции «Физиология растений фундаментальная основа современной – фитобиотехнологии». – Ростов-на-Дону. – 2006. – С.120.