Биологические особенности грибов рода candida, изолируемых из вагинального биотопа женщин репродуктивного возраста

На правах рукописи

ДРОБКОВА ВЕРА АНАТОЛЬЕВНА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГРИБОВ РОДА CANDIDA, ИЗОЛИРУЕМЫХ ИЗ ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА 03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермская государственная ме дицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агент ства по здравоохранению и социальному развитию, Пермь

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Тимашева Ольга Анатольевна доктор медицинских наук Несчисляев Валерий Александрович Ведущая организация Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН, Оренбург

Защита состоится _ ноября 2010 г. в_часов на заседании диссер тационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики мик роорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д.13.

Факс (342)280-32- Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эколо гии и генетики микроорганизмов УрО РАН Автореферат разослан «» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последние десятилетия техногенные воздействия на современные экосистемы, внедрение в медицинскую практику достижений фармакологии привели к значительным изменени ям как биоценоза самого человека, так и этиологической структуры ин фекционной патологии. На смену традиционным возбудителям пришли условно патогенные микроорганизмы, ранее сравнительно редко прояв лявшие свои болезнетворные свойства (Бухарин О.В. и соавт., 2007, 2009;

Mark Cichocki, R.N., 2009). Такие микроорганизмы отличают более выраженные адаптивные способности, а наряду с высокой природной резистентностью к антимикробным препаратам – относительно быстрое развитие приобретаемой, в том числе дозозависимой устойчивости.

В этом одна из глобальных причин роста грибковых заболеваний, кото рыми сегодня, по данным Всемирной организации здравоохранения, страдает каждый пятый житель планеты. В ряду возбудителей микозов грибы рода Candida занимают одну из ведущих позиций (Кубась В.Г., 2004;

Шелковая Н.Г., 2007;

Calderone R.A., 2009). Эти микромицеты могут быть причиной широкого спектра заболеваний – от неопасных поражений слизистой оболочки до жизнеугрожающих инвазивных про цессов в любых органах. Среди всех микотических поражений организ ма второе место (после онихомикоза) приходится на кандидомикоз кожи и слизистых оболочек, до 20% случаев которого составляет урогени тальная локализация процесса. Только в США ежегодно регистрируется 13 миллионов случаев вульвовагинального кандидоза (Kent H.L., 1999).

При этом наиболее важной современной тенденцией следует признать возрастание роли мочеполовых путей в качестве первичного источника грибковых инфекций, в том числе у реанимационных больных с канди демией (Елинов Н.П., 2004;

Pfaller M.A., 1996).

К числу важнейших медико-социальных проблем относится инфек ционная патология репродуктивной системы женщины, в структуре кото рой грибковые поражения играют весьма существенную роль. Однако, статистически достоверной информации о распространенности вагиналь ного кандидоза практически нет, так как в большинстве случаев заболева ние не выделяется из прочих дисбиотических процессов, часто регистри руемых во влагалищном биотопе сексуально активных женщин. Согласно кооптированным данным (Анкирская А.М. и соавт, 2009), частота выде ления грибов в популяции женщин групп повышенного риска увеличи лась с 3-4% в 60-70-е годы прошлого до 17-20% в начале XXI века. Грибы Candida albicans составили 83,7-86%, не-albicans виды – 14-16,3% без вы раженной тенденции к росту или снижению. Более 90% грибов C. albicans и C. parapsilosis сохранили чувствительность к имидазолам и триазолам.

Среди "проблемных" видов (C. glabrata, C. krusei) нечувствительные штаммы в основном имели дозозависимую чувствительность, которая может быть преодолена увеличением курсовой дозы препарата. Однако есть сведения, указывающие на более значительные изменения и в видо вой структуре возбудителей кандидозной инфекции влагалища, и в их устойчивости к антимикотическим препаратам (Веселов А.В. и соавт., 2005, 2008;

Meis J., et al, 2000;

Pappas P.G., et al, 2004;

Seidler M., 2006;

Shuford J., 2007).

Вагиниты, обусловленные сочетанным воздействием не менее двух факторов, например бактериального вагиноза и кандидозного вульвоваги нита, встречаются достаточно часто, составляя от 10 до 30% всех случаев инфекционных заболеваний влагалища. Результат взаимного влияния воз будителей трудно предсказуем, но в большинстве случаев клиническая картина искажается, что затрудняет диагностику и выбор адекватной те рапии (Байрамова Г.Р.и соавт., 2001;

Мирзабалаева А.К. и соавт., 2004;

Бебнева Т.Н., 2006;

Fidel P.L. et al, 2004;

Linda O., Eckert, 2006). Более то го, до настоящего времени не разработаны четкие рекомендации, позво ляющие оценить роль изолируемых из вагинального содержимого грибов рода Candida, колонизация слизистых которыми у практически здоровых людей колеблется от 15 до 40% и может возрасти до 80% на фоне какой либо патологии в условиях длительной госпитализации. Считается, что Candida-инфекция может выступать в роли маркера общего дисбактерио за (Сергеев А.Ю., 2000). Присутствуя в биоценозе, они взаимодействуют с другими видами условно-патогенных микроорганизмов и представителя ми нормофлоры, изменяя факторы персистенции и вирулентности по следних (Бухарин О.В., 2002;

Morales D.K., Hogan D.A. 2010). В микроб ных ассоциациях между разными видами возбудителей возникают неод нозначные взаимоотношения, что может существенно повлиять на харак тер инфекционного процесса (Долгушина В.Ф. и соавт., 2004;

Karagozov I.

et al., 2004;

Zhou X. et al., 2004, Mijac V.D. et al., 2006). В настоящее время нет единого мнения о том, какой вклад вносят различные микроорганиз мы в формирование избыточной грибной колонизации слизистых оболо чек (Хомич Ю.С. и соавт., 2006). До сих пор открытым остается и вопрос об антагонистической активности дрожжевых грибов в отношении услов но патогенных бактерий (Перунова Н.Б., 2006). В контексте вагинальных инфекций практически отсутствуют систематизированные сведения о пленкообразующей способности грибов Candida и формировании ими, в том числе, смешанных с условно патогенными бактериями биопленок (Валышев А.В. и соавт., 2009).

До последнего времени при определении этиологии неспецифиче ских инфекций решающее значение придавалось численности обнару женных условно патогенных микроорганизмов в пораженном органе, а в случае микстинфекции – установлению количественных соотношений между ассоциантами (Бухарин О.В. с соавт., 1998, 2002). Вместе с тем, в подобных ситуациях многими исследователями (Семенов А.В, 2009;

Ва хитов Т.Я., 2007 Barefoot S.F. et al., 1994, Mearns-Spragg A. et al., 1998, Yan L. et al., 2003, Dubuis C., Haas D., 2007) более существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности и оценка ха рактера взаимоотношений, складывающихся между сочленами микроб ных сообществ в том или ином биотопе. Особое внимание при этом уде ляется продукции ряда ферментов (Odds F.C., 2008;

Bernardo S.M., 2008;

Gaillardin C., 2010), уровень которой может колебаться в широких преде лах в зависимости от условий, существующих в макроорганизме и созда ваемых in vitro, что приводит к искажению истинной картины, характери зующей вклад изолируемых штаммов в инфекционный процесс. Отсутст вие стандартов по набору изучаемых параметров и условиям их определе ния для грибов рода Candida делает необходимым накопление и обобще ние максимально большего количества наблюдений в этой области для выработки четких критериев, позволяющих однозначно охарактеризовать патогенность штамма, разграничивая кандидоз и кандидоносительство.

Цель настоящего исследования: совершенствование лабораторной диагностики вагинальной кандидозной инфекции на основе изучения ви дового состава, биологических особенностей изолируемых грибов рода Candida, а также характера их взаимоотношений с сопутствующей мик рофлорой.

Основные задачи исследования:

1. Изучить частоту встречаемости грибов рода Candida в составе микрофлоры влагалища женщин репродуктивного возраста в период 2005–2009 гг.

2. Оценить видовой спектр и чувствительность к антимикотическим препаратам изолируемых грибов рода Сandida в динамике.

3. Определить особенности микроскопической картины при изучении нативного материала, а также морфологических и культуральных свойств штаммов Сandida, изолируемых из вагинального биотопа.

4. Изучить основные факторы патогенности грибов (морфологиче ская трансформация, фосфолипазная и протеолитическая активность), пленкообразование и влияние абиотических факторов (длительность ин кубации, рН, Т°) на их проявление.

5. Проследить особенности взаимодействия основных представите лей условно патогенной грибковой и бактериальной флоры влагалища.

Научная новизна исследования. На основе комплексного анализа фенотипических характеристик обоснован новый подход к определению этиологической значимости грибов рода Candida, изолируемых при мик робиологическом исследовании вагинального содержимого. Показаны отличия морфологических и биохимических свойств штаммов в зависи мости от их роли в биотопе (комменсал – возбудитель инфекционного процесса), что позволяет систематизировать изоляты по их способности колонизировать, либо вызывать инфекционный процесс в макроорганизме на этапе скрининга. Впервые изучено влияние абиотических факторов на проявление патогенных свойств «вагинальными» культурами C. albicans.

Подобраны условия (состав среды для культивирования, рН, температура инкубации) для проведения экспериментов in vitro, наиболее приближен ные к жизнедеятельности грибов в макроорганизме. Впервые установлено разнонаправленное изменение пленкообразующей активности C. albicans под влиянием абиотических факторов и бактериальных метаболитов, а также интенсивности формирования смешанных биопленок в зависимости от взаимоотношений, складывающихся между микроорганизмами ассоциантами (антагонизм – нейтрализм – синергизм).

Теоретическая и практическая значимость. Выработан новый подход к оценке этиологической значимости Candida spp. при их обнару жении в исследуемом материале, учитывающий биологические особенно сти изолятов и условия их культивирования. Предложен новый способ оценки взаимоотношений между микроорганизмами, населяющими ваги нальный биотоп, с учетом изменения их пленкообразующей активности при совместном культивировании. Это позволит врачу практического зве на здравоохранения адекватно интерпретировать получаемые результаты микробиологического обследования и оценивать состояние микробиоце ноза влагалища женщин репродуктивного возраста.

Результаты исследования могут быть использованы как один из кри териев диагностики вульво-вагинального кадидоза и прогнозирования микотических осложнений при оценке репродуктивного здоровья жен щин, прежде всего в период прегравидарной подготовки и при наступле нии беременности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В многолетней динамике (2005-2009гг.) наметилась стабилизация показателей инфицированности женщин репродуктивного возраста гри бами рода Candida, в видовой структуре которых устойчиво доминируют представители C. albicans. При этом регистрируется множественная ле карственная устойчивость не-albicans видов и увеличение дозозависимой чувствительности к флуконазолу среди C. albicans.

2. Биологические особенности Candida spp., вызывающих инфекцион ные процессы во влагалище, обусловливают необходимость комплексного подхода к оценке этиологической значимости изолируемых штаммов с уче том их количества, морфо-функциональных характеристик, набора факто ров патогенности и влияния условий культивирования на их проявление.

3. О характере взаимоотношений, складывающихся в вагинальном биотопе между компонентами грибково-бактериальных ассоциаций, мож но судить по результатам сравнительного анализа показателей, характери зующих интенсивность формирования ими моно- и смешанных биопленок in vitro.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены и обсуждены на V Молодежной школе-конференции с между народным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009), IV Международной научной конференции молодых уче ных-медиков (Курск, 2010), заседании Пермского отделения Всероссий ского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Пермь, 2008, 2010), XII Международном конгрессе МАКМАХ/ESCMID по антимикробной терапии (Москва, 2010).

Диссертация апробирована на расширенном заседании научного ко ординационного Совета по микробиологии ГОУ ВПО «ПГМА им. ак.

Е.А. Вагнера Росздрава» от 30 сентября 2010 г.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Внедрение в практику. Результаты работы внедрены в практику ЦВПП МСЧ №9, применяются в работе бактериологических лабораторий МУЗ ГКБ №7, ГУЗ КПКД №1 «Фтизиопульмонология». Материалы дис сертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО Пермская государст венная медицинская академия им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава № государ ственной регистрации темы 01.2.00709666.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литерату ры, главы материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 190 источников, из них 82 отечественных и 108 зарубежных авторов. Работа иллюстриро вана 27 таблицами и 18 рисунками.

Список принятых сокращений: УПМ – условно патогенные микро организмы, МТ – морфологическая трансформация, ФЛА – фосфолипаз ная активность, ПА – протеазная активность, ФЛ – фосфолипаза, ОП – оптическая плотность, ЦК – цитологический коэффициент.

Благодарности. Автор выражает благодарность заведующей бакте риологической референс-лаборатории МУЗ ГКБ №7 Авдеевой Н.С. за предоставленные образцы и помощь в проведении микологических иссле дований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Для реализации поставленных задач представляемое исследование было разделено на ретроспективную, клинико-лабораторную и экспери ментальную части.

С целью получения статистически значимых данных о частоте встре чаемости грибов рода Candida в составе микрофлоры влагалища женщин репродуктивного возраста, их видовой структуре и чувствительности к антимикотическим препаратам был проведен ретроспективный анализ 5306 историй болезни и амбулаторных карт пациенток, пролеченных либо проходивших профилактические осмотры на базе акушерско-гинеколо гического отделения МУЗ ГКБ №7 г. Перми.

В клинико-лабораторную часть данного исследования было включе но изучение 250 образцов вагинального секрета. На первом этапе прово дили цитологическое и бактериоскопическое исследование традиционны ми методами (Федоров Р.В. и др., 1995;

Интерпретация результатов цито логического исследования при урогенитальных инфекциях: Метод. реко мендаци. – Пермь, 1998). Состояние микробиоценоза влагалища оценива ли по следующим критериям: общая микробная обсемененность, домини рующие морфотипы, наличие дрожжевых клеток, бластоспор, нитей псев домицелия, эпителиальных и «ключевых» клеток, лейкоцитов. В качестве дополнительных были использованы следующие тесты: определение суммарного количества лейкоцитов и эпителиальных клеток (СК);

опре деление цитологического коэффициента (ЦК) по соотношению числа лей коцитов к эпителиальным клеткам (Трухина Е.В., 2005). Морфометриче ские характеристики клеток и колоний получали с помощью компьютер ной микроскопии с использованием установки OLYMPUS (производство Япония) при увеличениях 1001,3610 и 40,8510 соответственно.

Для выделения и идентификации микробных культур использовали соответствующие питательные среды производства Дагестанского инсти тута питательных сред г. Махачкала и НПО «Биомед» г. Пермь, а также хромогенные среды (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия): для мо лочнокислых бактерий (лактобациллы и стрептококки) – среда МРС;

эн терококков – среда Калины;

стафилококки выделяли на желточно-солевом агаре и HiCrome Aureus Agar Base;

энтеробактерии определяли при высе ве на среду Эндо и HiCrome ЕСС Agar;

анаэробы – на обогащенной среде для контроля стерильности, разлитой «высоким столбом» по пробиркам.

Выделенные бактериальные культуры идентифицировали на основании изучения морфологических, тинкториальных, биохимических свойств с использованием наборов стандартных энтеро-, стафило- и стрептотестов (производство «Lachema», Чехия).

При углубленном микологическом и экспериментальном исследова нии грибы рода Candida выделяли и изучали их свойства в соответствии с Тилевой Е.А. (2003 г.) на жидкой и плотной среде Сабуро, HiCrome Candida Agar, а также на плотной среде Сабуро с добавлением желтка (продукция фосфолипаз) и бычьего альбумина (продукция протеаз).

Особенности взаимодействия C.albicans с бактериями-ассоциантами изучали традиционными методами совместного культивирования (Баже нов Л.Г., 1997;

Эйсфильд Д.А, 2002) и отсроченного антагонизма (Глуша нова Н.А. с соавт., 1999), а также по оригинальной методике, учитываю щей пленкообразующую способность моно- и смешанных культур (при оритетная справка № 2010127885 от 06.07.2010).

Статистическая обработка полученных результатов проведена вариа ционно-статистическими методами в программе Statistica 6.0 фирмы StatSoft (США). Различие показателей оценивали с помощью параметри ческого t-критерия Стьюдента. Для оценки связи двух признаков рассчи тывали величину статистического критерия Хи-квадрат, а силу связи при знаков измеряли коэффициентом сопряженности (информативности) Пирсона. Результат считали достоверным при p0,05.

Результаты работы и их обсуждение Последнее десятилетие характеризуется ростом оппортунистических инфекций, причем спектр значимых УПМ расширяется, и повышается значе ние в генезе инфекционно-воспалительных заболеваний, в том числе при их объединении в ассоциации. Выполненные нами исследования подтверждают существующие на современном этапе представления (Анкирская А.М. и со авт, 2009;

Calderone R.A., 2009) о роли грибов рода Candida, в том числе при патологических процессах в урогенитальном тракте. Среднемноголетний показатель инфицированности грибами влагалища женщин за период 2005– 2009 гг. составил 16,5±1,1%. Его колебания были незначительными: макси мальный уровень (18,6%), отмечен в 2005 г., в последующие два года не сколько снизился (до 15,2%) и вновь начал расти, но к концу 2009 г. так и не достиг отмеченного максимума (рис. 1).

% 2005 2006 2007 2008 Рис. 1. Доля женщин, инфицированных грибами рода Candida в 2005-2009 гг.

Темп прироста за 5-летний период наблюдений составил 1,4%. Одна ко, расчет границ достоверности прямолинейной тенденции показал, что разница в показателях инфицированности влагалища случайна (p 0,05).

Это говорит о стабилизации ситуации по распространенности грибов рода Candida на изучаемой территории.

Доминирующим видом, как и можно было ожидать, оставался С. аlbicans. Частота его выделения из влагалища за 5-летний период су щественно не изменялась (p 0,05) и составила в среднем 87,2±1,1%, хотя по ряду территорий исследователи отмечают снижение доли изолятов этого вида до 65-70%.

Сравнение частоты встречаемости отдельных не-albicans видов пока зало динамичность их видового спектра. Так, к 2008 г. доля C. parapsilosis возросла в 2 раза, при том, что количество изолируемых из вагинального отделяемого штаммов C. guilliermondii уменьшилось в 5 раз (p 0,5).

В 2008-2009гг. уменьшилась в 1,8 раза доля C. glabrata, в 3 раза доля C. tropicalis. (p 0,5). Удельный вес C. krusei и C. kefyr на протяжении всего периода наблюдения оставался относительно стабильным.

Чаще всего грибковые культуры входили в состав микробных ассоциа ций, доля монокультур не превышала 28,3±1,8%. Более чем в половине слу чаев в ассоциациях обнаруживали Staphylococcus spp. (66±2,7%), на втором месте по частоте встречаемости были различные виды энтеробактерий.

Каждый второй штамм С. аlbicans и каждый третий C. tropicalis, C. parapsilosis были чувствительны ко всем выбранным антимикотикам (табл. 1). Хорошей чувствительностью к нистатину, амфотерицину и клот римазолу отличались С. albicans и C. kefyr (более 80%). В то же время, бо лее половины изолированных штаммов C. glabrata и C. guilliermondii были устойчивы ко всем фунгицидным препаратам взятого спектра. В динамике наблюдений прослеживается тенденция роста устойчивости С. аlbicans к фунгицидным препаратам, так количество штаммов чувствительных ко всем 4 антимикотикам сократилось в 1,4 раза (с 63,6% в 2005-2006 гг. до 44,8% в 2008 г.).

Таблица Доля грибов Candida (%), чувствительных к антимикотическим препаратам взятого спектра Препараты, M±m Виды Нистатин Амфотерицин Клотримазол Флуконазол С. albicans 86,7±1,4 83,9±1,5 93,8±1,0 87,8±1, C. glabrata 39,6±3,6 41,6±13,7 52,1±13,9 27,0±12, C. parapsilosis 59,2±10,7 68,1±10,2 64,2±10,5 42,6±10, C. tropicalis 63,9±12,4 58,3±12,7 72,2±11,6 44,4±12, C. krusei 64,2±10,7 65,0±10,7 86,7±7,6 53,3±11, C. kefyr 93,8±8,5 87,5±11,7 81,3±13,8 56,3±17, C.guilliermondii 41,7±18,6 50,0±18,9 50,0±18,9 4,2±7, Особое внимание было обращено на частоту выделения грибов, устой чивых и имеющих дозозависимую чувствительность к флуконазолу – препа рату выбора при кандидозной инфекции гениталий. С 2006 года отмечен рост количества штаммов С. аlbicans с дозозависимой чувствительностью к флу коназолу с 12% до 27,9%, в то время как число культур устойчивых к этому препарату оставалось примерно на одном уровне (p 0,05).

Достоверно оценить динамику изменения чувствительности не аlbicans видов не представлялось возможным из-за малого количества изолированных культур. Эффективным in vitro антимикотиком в отноше нии всех видов Candida spp. оставался клотримазол.

Микроскопическое изучение вагинальных мазков, с последующим культуральным изучением соименных образцов влагалищного отделяемого, позволило проследить характерные особенности цитологической картины, морфологии клеточных и мицелиальных форм грибов, качественного и ко личественного состава ассоциантов, что позволило классифицировать ис следованные образцы на две основные группы: I группа характерна для микроценоза, не сопровождающегося воспалительной реакцией, расценен ная нами как вариант нормоценоза или дисбиотических реакций во влага лище, где обнаруженные клетки грибов лишь подчеркивали их выражен ность (кандидоносительство);

во II-й группе, где прослеживались явные признаки воспалительной реакции, доминировали гифальные формы гри бов и наблюдались существенные изменения в составе сопутствующей микрофлоры – мы расценили участие C. аlbicans в качестве возбудителей инфекционного процесса (вагинального кандидоза) (рис.2).

а б Рис. 2. Варианты микроскопической картины вагинальных мазков:

а – в I группе, б – во II группе.

Экспериментальное сравнительное изучение проявления патогенного потенциала представителями C. аlbicans, изолированными при различных состояниях, под влиянием различных абиотических факторов позволило установить следующее (табл. 2). Формирование псевдомицелия в услови ях, типичных для бактериального вагиноза (рН=7,0 и Т=37С), происхо дило значительно активнее, в особенности у изолятов, отнесенных нами к патогенным вариантам (Ki=0,694;

2=91,5;

p 0,0001). Способность к морфологической трансформации при температуре окружающей среды, либо при уровне рН=4,0, характерном для нормоценоза, когда грибы оце ниваются как представители транзиторных УПМ, проявляло менее поло вины тестируемых культур C. albicans. В обеих группах обнаружена пря мая корреляционная зависимость проявления филаментации от продол жительности инкубации: умеренная при Т=25С (Ki=0,686;

2=166,1;

p 0,00001 в первой группе;

Ki=0,636;

2=109,5;

p 0,0001 во второй группе) и сильная при Т=37С (Ki=0,760;

2=219,3;

p 0,0001 в первой группе;

Ki=0,805;

2=206,7;

p 0,0001 во второй группе).

Сравнительный статистический анализ показателей, характеризую щих фосфолипазную и протеолитическую активность, показал однотип ность зависимости их проявления от условий эксперимента. Установлены статистически значимые различия в сроках проявления ФЛА при различ ных условиях культивирования в группах изолированных грибов. Так, в первой группе прослеживали слабую зависимость продукции экзофермен та от продолжительности инкубации (Ki=0,360), которая во второй группе была еще менее выражена (Ki=0,249), поскольку более 80% штаммов продуцировали ФЛ уже на 2 сутки. При оценке протеолитической актив ности в первой группе также отмечена слабая зависимость от продолжи тельности инкубации (Ki=0,463), в то время как во второй группе такая связь не установлена (Ki=0,165;

p 0,0001). Следует отметить, что досто верных различий между количеством штаммов, продуцирующих фосфо липазу и протеазы на средах с рН=7,0 и рН=5,6 при обоих температурных режимах в группах изолированных грибов не выявлено (p 0,05) в то время как доля изолятов, проявивших фосфолипазную активность на сре дах с рН=7,0 и 5,6, достоверно выше чем при рН=4,0 (p 0,0001). В груп пе этиопатогенов количество штаммов с указанными свойствами при рН=7,0 и рН=5,6 при Т=37С достоверно выше, чем в группе комменсалов (p 0,0001). Статистический анализ полученных данных, позволил нам с большой долей вероятности предположить, что оптимум активности про дукции протеаз и фосфолипаз для вагинальных штаммов C. albicans, со ответствует рН=5,6 и 7,0 и Т=37С (зависимость продукции протеаз Ki=0,701;

2=58,6;

p 0,0001 и Ki=0,642;

2=46,7;

p 0,0001;

продукции фосфолипаз Ki=0,592;

2=38,3;

p 0,0001 и Ki=0,710;

2=60,6;

p 0,0001).

Таблица Проявление факторов патогенности штаммами C. albicans из групп сравнения при различных условиях через 48 ч культивирования %±m штаммов из I группы %±m штаммов из II группы Фактор Т=25° Т=37° Т=25° Т=37° патогенности рН=4,0 рН=5,6 рН=7,0 рН=4,0 рН=5,6 рН=7,0 рН=4,0 рН=5,6 рН=7,0 рН=4,0 рН=5,6 рН=7, Морфологическая 0 1,2±1,2 1,2±1,2 2,5±1,7 46,9±5,5* 59,3±5,5* 0 2,2±2,2 2,2±2,2 4,4±3,1 66,7±7,0* 73,3±6,6* трансформация Фосфолипазная 0 2,5±1,7 2,5±1,7 7,4±2,9 53,1±5,5* 58,0±5,5* 0 4,4±3,1 4,4±3,1 6,7±3,7 73,3±6,6* 80,0±6,0* активность Протеазная 0 1,2±1,2 1,2±1,2 4,9±2,4 22,2±4,6 29,6±5,1 0 2,2±2,2 2,2±2,2 6,7±3,7 31,1±6,9 37,8±7, активность * различия показателей сравниваемых групп достоверны (p 0,05) Развитие прикрепленных сообществ – одна из основных стратегий выживания микроорганизмов и в окружающей среде, и в организмах инфицируемых хозяев. Пленкообразование у грибов мало изучено, а данные о пленкообразующей способности грибов рода Candida spp.

весьма противоречивы. Вместе с тем общепризнанно, что биопленки лежат в основе многих затяжных и хронических инфекционных процес сов, что характерно для развития кандидозной инфекции влагалища.

В нашем исследовании отмечен высокий уровень проявления этого свойства у C. albicans, изолированных из вагинального отделяемого женщин с проявлениями кандидозной инфекции, в то время как при кандидоносительстве у большинства культур способности к формирова нию биопленок не обнаружено (соответственно 82±4,3% и 29,4±5,1%).

Установлено, что проявление этого свойства значительно зависело от температуры (рис. 3).

0, ОП 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 25 °С 37 °С 25 °С 37 °С Группа 1 Группа Рис. 3. Проявление пленкообразующей способности штаммами C. albicans при разной температуре культивирования.

Так, показатель оптической плотности биопленок, сформированных при Т=37 С, в первой группе в среднем составил 0,42±0,03, во второй 0,81±0,04, в то время как при Т=25 С – соответственно 0,77±0,04 и 0,54±0,04 (p 0,05).

При культивировании грибов на питательных средах с различным уровнем рН в обеих группах в большинстве случаев отмечали рост пока зателя интенсивности пленкообразования при рН=7,0 в сравнении с рН=4,0 и рН=5,6 (рис.4.). Реакция в проявлении пленкообразующей спо собности на изменение рН среды у разных штаммов C. albicans индивидуальна.

1, 0, 0, 0, 0, рН = 4,0 рН = 5,6 рН = 7,0 рН = 4,0 рН = 5,6 рН = 7, Группа Группа Рис. 4. Проявление пленкообразующей способности штаммами C. аlbicans при разных рН среды Как свидетельствуют многочисленные исследования различных ав торов, развитие инфекционного процесса зависит не только от особенно стей инфицируемого организма и инфекта, но в значительной степени от качественного и количественного состава «сочленов» микробного сооб щества, которое формируется в колонизируемом биотопе. Для оценки взаимоотношений между ними согласно предлагаемой нами методике сравнивали усредненные показатели оптической плотности элюата из биопленок смешанных и монокультур. Если наблюдали аддитивный эф фект, т.е. показатель смешанной биопленки (ОП mix) достоверно не отли чался от суммы показателей каждого тестируемого штамма (ОП 1+ОП 2) – регистрировали нейтральный характер, если показатель ОПmixОП1+ОП2 – синергический характер, если показатель ОП mixОП1+ОП2 – антагони стический характер в межмикробном взаимодействии. В табл. 3 в качестве примера приведены результаты исследования двух типичных для каждой группы наблюдения представителей C. albicans при взаимодействии с рядом референс-штаммов из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича, поскольку наиболее часто в составе микробных ассоциаций обнаруживали представителей именно этих таксонов. В наших наблюдениях при изучении формирования сме шанных пленок грамположительными и грамотрицательными бактериями с исследуемыми штаммами C. albicans, были выявлены все три типа взаи модействия: индифферентный (нейтрализм), стимулирующий (синергизм) и ингибирующий (антагонизм) с преобладанием синергичных отношений.

Типы взаимодействия – антагонизм, синергизм и нейтрализм – в микробных ассоциациях складываются под влиянием различных факто ров, в том числе синтеза бактерицидных веществ, других продуктов об мена и компонентов самих клеток, которые могут оказывать не только сходное, но и разнонаправленное действие на уровень пленкообразования.

В зависимости от природы микроорганизмов, воздействие может осуще ствляться преимущественно за счет микробных клеток и их компонентов, либо выработки экзометаболитов, а также возможно сочетание двух этих механизмов. Мы предположили, что изменение интенсивности пленкооб разования при совместном культивировании грибов с бактериальными штаммами и их метаболитами, можно использовать для расшифровки ха рактера межмикробных взаимоотношений, формирующихся в вагиналь ном биотопе, где присутствующие в нем микроорганизмы, как правило, структурированы в сложные сообщества. Более того, нам представляется, что, используя такой подход, можно оценивать разные стороны взаимо действия микробов-ассоциантов. В первом случае – оценивается характер отношений, складывающихся между ассоциантами анализируемого био топа, во втором – удается индивидуализировать возможные механизмы воздействия бактерий на тестируемые грибковые культуры.

Таблица Сравнительная оценка изменения интенсивности пленкообразования в присутствии клеток и культуральных фильтратов тест-штаммов Моно-пленки E. coli K. pneumoniae P. aeruginosae S. aureus S. haemolyticus C. albicans Контроль Штаммы ОПУПМ 0,171±0,004 0,187±0,002 0,766±0,024 0,170±0,005 0,260±0,005 0,206±0,002 0,147±0, ОПC.albicans C. albicans 0,256±0,02 0,413±0,009 0,420±0,024 0,597±0,019 0,149±0,008* 0,139±0,034* 0,149±0,025* 0,147±0, 1 группа C. albicans 2,156±0,104 1,547±0,047 0,373±0,028* 0,962±0,079 1,970±0,08* 2,344±0,067 0,174±0,022* 0,147±0, 2 группа Культуральные фильтраты C. albicans 0,256±0,02 0,149±0,008* 0,175±0,036* 0,453±0,034* 0,239±0,028 0,264±0,025 - 0,119±0, 1 группа C. albicans 2,156±0,104 1,504±0,064* 1,612±0,075* 2,686±0,174* 2,087±0,22 2,125±0,23 - 0,119±0, 2 группа * – p 0, Таким образом, сравнительное изучение биологических свойств гри бов рода Candida (морфологическая трансформация, продукция фермен тов – фосфолипаз и протеаз, способность к пленкообразованию) в услови ях, типичных для нормоценоза и неспецифических инфекционных про цессов во влагалище, а также для окружающей среды, позволяет более адекватно оценивать этиологическую значимость изолируемых культур, что, в свою очередь, способствует дифференциальной диагностике канди доносительства и вульво-вагинального кандидоза. Изменение интенсив ности пленкообразования при совместном культивировании штаммов C. albicans и бактерий-ассоциантов отражает характер складывающихся между ними взаимоотношений, что может указывать на развитие смешан ной неспецифической инфекции влагалища, а также повышенный риск хронизации инфекционного процесса. Комплексный подход к оценке ин фицированности влагалища женщин репродуктивного возраста грибами рода Candida с учетом перечисленных показателей будет способствовать повышению эффективности проводимого лечения.

ВЫВОДЫ 1. Среднемноголетний показатель инфицированности грибами влага лища женщин репродуктивного возраста за период 2005-2009 гг. составил 16,5%, с темпом прироста 2,29 на 1000 обследованных (1,4%). Расчет гра ниц достоверности прямолинейной тенденции указывает на стабилизацию ситуации по распространенности потенциальных возбудителей вагиналь ного кандидоза.

2. Установлено, что за период наблюдений в видовой структуре грибов рода Candida, колонизирующих вагинальный биотоп, устойчиво доминиро вали представители С. аlbicans, доля которых составляла 84,3-88,9% от всех изолируемых культур. При этом у 27,3% установлена дозозависимая чувст вительность к флуконазолу, а более половины не-аlbicans видов отличала множественная лекарственная устойчивость.

3. Предложено классифицировать варианты микроскопической кар тины вагинальных мазков на две основные группы: I группа (44,4%) – без признаков воспалительной реакции (ЦК = 1–1,2;

L+E 10, при наличии бластоспор Candida spp. не более 10 в поле зрения) – кандидоносительст во, II-группа (55,6%) с признаками воспалительной реакции (ЦК 1,2;

L+E 10, при наличие бластоспор Candida spp. более 10 в поле зрения и характерными филаментациями) – кандидозная инфекция.

4. В группе возбудителей вагинального кандидоза показана зависимость проявления изученных факторов патогенности от температуры, рН среды и сроков инкубации (МТ 2 = 487,4;

ФЛА 2 = 139,5;

ПА 2 = 138,8;

p 0,00001);

у комменсалов от действия абиотических факторов существенно зависела только морфологическая трансформация (МТ 2= 346,4;

p 0,00001) 5. При 48-часовой экспозиции в условиях, типичных для кандидозной инфекции влагалища и бактериального вагиноза (Т=37°, рН=5,6-7), у штаммов С. аlbicans, относящихся к группе возбудителей, способность к пленкообразованию и изученные факторы патогенности фенотипически проявлялись достоверно чаще, по сравнению с культурами, изолирован ными при кандидоносительстве (способность к пленкообразованию 82±4,3% против 29,4±5,1%, переход в гифальную форму 73,3±6,6% штам мов против 59,3±5,5%;

проявление фосфолипазной активности 80,0±0,6% культур против 58,0±5,5%).

6. Для определения характера взаимоотношений С. аlbicans и бакте рий-ассоциантов, изолируемых из влагалища женщин репродуктивного возраста, предложен и апробирован новый методический подход, основан ный на комплексной оценке пленкообразования смешанными культурами, в присутствии грибов и бесклеточных культуральных фильтратов бактерий, а также микроскопического изучения сформированных при этом биопленок.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ 1. Карпунина Т.И., Олина А.А., Машуров М.Г., Чемурзиева Н.В., Дробкова В.А. Фосфолипазы оппортунистических грибов: их возможная роль в патогенезе и диагностике микозов // Проблемы медицинской мико логии. – 2006. –Т. 8. – №4. – С. 41-47.

2. Карпунина, Т.И., Олина А.А., Машуров М.Г., Чемурзиева Н.В., Дробкова В.А. Особенности диагностики вагинального кандидоза, ассо циированного с возбудителями неспецифических вагинитов // Пермский медицинский журнал. – 2007. – Т.24. – №1-2. – С. 62-67.

Публикации в других сборниках и журналах 3. Карпунина Т.И., Олина А.А., Машуров М.Г., Дробкова В.А.

К дифференциальной диагностике и этиотропной терапии кандидозной инфекции влагалища // Стратегия и тактика борьбы с внутрибольничными инфекциями на современном этапе развития медицины: материалы меж дунар. конгр. – Москва, 2006. – С. 86–87.

4. Карпунина Т.И., Олина А.А., Машуров М.Г., Дробкова В.А.

Сложности диагностики и лечения вагинального кандидоза, ассоцииро ванного со стафилококковой инфекцией // Вестник Российской военно медицинской академии. Приложение. – 2007. – Ч. 1. – №1(17). – С. 487.

5. Дробкова В.А., Карпунина Т.И., Исаева Н.В. Влияние грибов рода Candida на возникновение и развитие донозологических форм внутри больничных инфекций у рожениц и новорожденных. // Современные про блемы эпидемиологии. Сборник статей, посвященный 65-летию кафедры эпидемиологии Нижегородской Государственной Медицинской Акаде мии. –2007.– С. 58.

6. Дробкова В.А. Опыт определения взаимного влияния грибов C. albicans и условно патогенных бактерий, изолированных из вагиналь ного биотопа // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. – 2009. – №4. Ма териалы 2-го Международного конгресса по пробиотикам. – М. 13.

7. Дробкова В.А. Карпунина Т.И. Видовой состав и чувствитель ность к антимикотикам грибов рода Candida у гинекологических больных.

// III Всероссийская конференция «Проблемы женского здоровья и пути их решения» – Москва, 2009.

8. Дробкова В.А. Биологические свойства грибов рода Candida, изо лированных при вагинальных инфекциях // Материалы V Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» – Москва, 2009. – С. 23-24.

9. Дробкова В.А. Карпунина Т.И. Видовой спектр и биологические свойства грибов рода Candida, изолированных из влагалища женщин репродуктивного возраста // Современные проблемы инфекционной па тологии человека. Сборник научных трудов. – Минск, 2009. – Вып. 2. – С. 244-248.

10. Дробкова В.А. Динамическая характеристика видового спек тра и чувствительности грибов рода Candida к антимикотическим пре паратам при дисбиотических процессах во влагалище // Материалы IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков. – Курск, 2010 – Т.1 – С. 353-355.

11. Дробкова В.А., Карпунина Т.И. Пленкообразующая способность грибов Саndida albicans, колонизирующих вагинальный биотоп. // Клини ческая микробиология и антимикробная химиотерапия. Приложение. – 2010. – Т.12. – № 2. – С. 25-26.

ДРОБКОВА ВЕРА АНАТОЛЬЕВНА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГРИБОВ РОДА CANDIDA, ИЗОЛИРУЕМЫХ ИЗ ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА Автореферат _ Подписано в печать 15.10.2010. тираж 110 экз. Усл. печ. л. 1, Формат 6084/16. Набор компьютерный. Заказ № 547/2010.

Отпечатано в типографии ИД “Пресстайм” Адрес: 614025, г. Пермь, ул. Героев Хасана,