Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и развитие ксилотрофных базидиомицетов

На правах рукописи

Лыков Юрий Сергеевич Влияние модификации лигноцеллюлозного субстрата на рост и развитие ксилотрофных базидиомицетов Специальность 03.02.12 – микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2011 Диссертационная работа выполнена в лаборатории биохимии кафедры биологии животных и ветеринарии ФГОУ ВПО «Пензенская ГСХА» и в Региональном Центре государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области ФГУ «ГосНИИЭНП», г. Пенза

Научный консультант: кандидат биологических наук, доцент Ильина Галина Викторовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Громовых Татьяна Ильинична кандидат биологических наук Сафрай Алла Иосифовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН» (г. Саратов)

Защита состоится 11 февраля 2011 г. в 15.30 на заседании диссертационного со вета Д 501.001.46 при Московском государственном университете им. М.В. Ло моносова по адресу:

119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологи ческий факультет, ауд. М-1, тел./факс: (495) 939-39-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Автореферат диссертации размещен на сайте www.bio.msu.ru Автореферат разослан «_» января 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Традиционно в культуре выращивается множество ви дов ксилотрофных базидиомицетов. В последние десятилетия все больше внимания обращает на себя группа грибов-ксилотрофов, обладающих лечебно профилактическими свойствами. Исследования, проводящиеся в этом направлении, позволили установить наличие лечебных свойств у значительного числа видов.

Перечень медицинских грибов постоянно растет, поскольку те или иные ценные свойства выявляются у новых видов. Кроме того, большое внимание уделяется изучению возможностей использования ферментных комплексов ксилотрофных базидиомицетов. Высокий окислительный потенциал и неспецифический характер ферментов лигнолитического действия позволяют использовать их для разрушения органических ксенобиотиков, очистки сточных вод, получения модифицированной древесины (Кадималиев и др., 2006;

Горбатова и др., 2007;

Королева, 2007). Естест венные местообитания в своем разнообразии представляют собой богатый природ ный резерват штаммов и видов, способных обладать уникальными индивидуаль ными особенностями. Это свидетельствует о необходимости мониторинга видового разнообразия ксилотрофных базидиомицетов в различных регионах и изучения их экологии. Большой интерес представляет влияние на ход развития гриба со сторо ны его природного субстрата. По мнению ряда авторов, лигнин, как компонент этого субстрата, может влиять на морфогенез культуры в естественных условиях (Фенгел, 1988). Довольно сложно создать условия, приближенные к природным, при выращивании видов и штаммов в культуре. В то же время одной из проблем практического грибоводства является поиск оптимальных субстратов для культи вирования, способных обеспечить максимальную реализацию природного потен циала вида в условиях культуры. Использование доступных древесных субстратов (опилок) не всегда обеспечивает нормальное развитие культуры и ее высокую про дуктивность. Кроме того, известно, что ксилотрофные базидиомицеты различаются по отношению к степени деструкции древесины, которую колонизируют (облигат ные и факультативные паразиты, сапротрофы). В связи с этим актуальным пред ставляется поиск путей подготовки субстрата для культивирования, с тем, чтобы оптимизировать развитие культур не только традиционных, но и вновь вводимых в искусственную культуру видов.

Цель и задачи исследований. Целью работы было изучение влияния модифи каций лигноцеллюлозного субстрата на процессы роста и развития видов ксило трофных базидиомицетов в чистой культуре.

Для достижения цели предполагалось решение следующих задач:

1. создать коллекцию видов ксилотрофных базидиомицетов, распространенных в районе исследований и отличающихся субстратной специализацией;

2. изучить культурально-морфологические особенности развития видов на тра диционных питательных средах;

3. изучить возможности культивирования и особенности развития видов ксило трофных базидиомицетов с различной субстратной специализацией в природе, а также вызывающих разные типы гнилей древесины, на экстрагированных опилках и их метоксилированных дериватах;

4. изучить влияние внесения в различные питательные среды различных по структуре источников целлюлозы и лигнина (нативных экстрагированных опилок и их метоксилированных дериватов) на процессы роста и развития культур;

5. определить роль нативного и дериватизированного лигнина, как компонентов субстратов, в регуляции плодоношения у перспективных в биотехнологии ви дов.

Научная новизна. Определено, что субстратная приуроченность ксилотроф ных базидиомицетов к древесине разной степени разложения определяет особенно сти их развития в чистой культуре. Впервые обнаружены возможности культиви рования видов, независимо от их субстратной специфичности в природе, на суб стратах, содержащих экстрагированные метоксилированные лигноцеллюлозные компоненты. Установлено стимулирующее влияние метоксильных групп лигнина на процесс синтеза эргостерина и плодоношение в культуре у грибов белой гнили.

Практическая значимость. Установлена целесообразность использования метанолизных (обогащенных метоксильными группами) лигноцеллюлозных ис точников в качестве компонентов питательных сред для культивирования ксило трофных базидиомицетов. Предложены рецептуры питательных сред для выращи вания биомассы мицелия, а также твердых органических субстратов для получения плодовых тел Ganoderma lucidum.

Положения, выносимые на защиту:

1. Процессы экстрагирования и метанолиза материала дубовых опилок обеспечи вают получение линоцеллюлозного субстрата, пригодного для культивирова ния ex situ видов ксилотрофных базидиомицетов независимо от их субстратной специфичности в природе.

2. Введение нативных и метоксилированных лигноцеллюлозных источников в рецептуру питательных сред интенсифицирует обменные процессы и стиму лирует развитие культур ксилотрофных базидиомицетов.

3. Метоксильные группы лигнина стимулируют накопление биомассы мицелия большинства видов ксилотрофных базидиомицетов, а также интенсифицируют процесс синтеза эргостерина у грибов белой гнили.

4. Включение в состав субстратов метоксилированных лигноцеллюлозных ком понентов стимулирует процессы образования примордиев (зачатков плодовых тел) у грибов белой гнили, а также способствует плодоношению при реализа ции интенсивной технологии культивирования.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на конферен циях: Всероссийской научно-практической конференции «Мониторинг природных экосистем» (Пенза, 2008);

Научно-практической конференции «Образование, нау ка, практика: инновационный аспект» (Пенза, 2008);

Научно-практической конфе ренции молодых ученых «Инновационные идеи молодых исследователей для агро промышленного комплекса России» (Пенза, 2009);

II Междисциплинарном Мико логическом форуме (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 – в печат ных изданиях перечня ВАК РФ, 1 работа находится в Центральной печати.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно спланированы и осуществ лены полевые и лабораторные исследования, проведены статистическая обработка и интерпретация данных, полученных в ходе выполнения работы.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 152 источни ка, и приложений, содержащих материалы статистической обработки. Текст изло жен на 157 страницах. Основная часть работы содержит 12 таблиц и 52 иллюстра ции (диаграммы, рисунки, фотографии).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава состоит из трех разделов. В первом разделе анализируются существующие взгляды относительно экологического статуса ксилотрофных базидиомицетов (Бондар цев, 1953;

Степанова, Мухин, 1979;

Мухин, 1985;

Бурова, 1986;

Стороженко и др., 1992;

Мухин, 1993;

Бондарцева, 2000). Рассматривается роль организмов этой группы в при родных экосистемах, факторы, определяющие трофическую структуру ксилотрофного микоценоза (Мухин, 1993;

Сафонов, 2003). Обсуждаются проблемы субстратной при уроченности к древесине различных пород и сукцессионной динамики видов на разных стадиях разложения древесины (Гордиенко, 1979;

Стороженко, 2002). Рассматриваются дискуссионные вопросы, связанные с трофическими стратегиями отдельных видов (Синадский, 1977;

Гарибова, 2005). Во втором разделе описана структура и свойства древесных субстратов, используемых грибами в природе, рассматривается структура, свойства и специфические особенности молекул лигнина (Фенгел, 1988;

Дудкин, 1991;

Азаров, 1999). Приводится описание хода биодеградации лигнина ксилотрофными базидиомицетами (Umezawa, Higuchi, 1988;

Akamatzu, 1990;

Leonowicz et al., 1991;

Gold, Alic, 1993), указывается на приоритетную утилизацию метоксильных групп в ходе этого процесса (Фенгел, 1988). Описаны процессы деструкции древесины грибами различных типов гнилей, с учетом особенностей их ферментативных комплексов (Kirk at al., 1986;

Rayner, Boddy, 1988;

Boominathan, Reddy, 1992 Blanchette, 1995;

Решетнико ва, 1997;

Королёва, 2006;

Ребриков, 2006 Айзенштадт, 2009). Третий раздел посвящен анализу трофических потребностей ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре.

Описаны традиционные и оригинальные подходы к выбору субстрата в зависимости от цели культивирования (Беккер, 1988;

Бухало, 1988;

Краснопольская, 2001;

Горшина, 2008;

Ковалёва, 2007;

Древаль, Бойко, 2009;

Антоненко и др., 2009;

Обрезкова и др., 2010;

Шахсеванимуджарад и др., 2010).

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проводились в течение 4-х лет (2006-2010 гг.) на базе биохимиче ской лаборатории Пензенской государственной сельскохозяйственной академии и Цен тральной экоаналитической лаборатории Регионального центра государственного эко логического контроля и мониторинга по Пензенской области. Исследования включали несколько этапов, в том числе полевые (сбор, определение, наблюдения в природе) и лабораторные: выделение чистых культур и весь комплекс исследований для решения поставленных задач.

Объектами исследования послужили 10 видов дереворазрушающих грибов, из числа широко распространенных на территории Пензенской области: Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilt (трутовик скошенный), Phellinus tremulae (Bondartsev) Bondartsev & P.N.

Borisov (ложнотрутовик осиновый), Fomitopsis pinicola (Sw.) P. Karst. (трутовик окайм ленный), Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill (трутовик серно-желтый), Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. (трутовик плоский), Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. (труто вик лакированный), Fomes fomentarius (L.) J.J. Kickx (трутовик настоящий), Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. (корневая губка) Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P.

Karst.(трутовик киноварно-красный), Fistulina hepatica (Schaeff.) Sibth (трутовик печё ночный). В эксперименты включено по три штамма каждого вида. Определение бази диом проводили с помощью определителей (Бондарцева, Пармасто, 1986), сбор и по следующее выделение чистых культур проводили по общепринятым методикам (Буха ло, 1988). При определении трофической специализации изученных видов грибов ис пользовали взгляды ряда учёных (Бондарцев, 1953;

Бондарцева, 1986;

Стороженко, 2002, 2007), а также личные наблюдения автора в районе исследований. При опреде лении степени разложения древесных субстратов использовали пятибалльную шкалу (Гордиенко, 1979). Описание колоний проводили при культивировании на сусло агаре при температуре +26°С (Stalpers, 1978), определяли средние скорости роста ли нейным методом (Билай, 1982) и ростовой коэффициент (Бухало, 1988). Культуры грибов, культивируемые в чашках Петри, инкубировали в термостате при +24 -+26С.

Культивирование в глубинных условиях осуществлялось в колбах Эрленмейера на эксцентриковой качалке при скорости вращения 225 об./мин с эксцентриситетом 2, см, и температуре +24 - +26С.

Дубовые опилки, используемые в опыте, были подвергнуты экстракции в аппа рате Сокслета спирто-толуольной смесью и диэтиловым эфиром в течение 8 часов (Оболенская, 1991), затем высушивались до постоянной массы на водяной бане с прямым холодильником. В дальнейшем половина этого материала была подвергнута процессу метанолиза, то есть обработке 0,3 % раствором НСl в метаноле при нор мальных условиях в течение 4 суток. Эта процедура позволяет увеличить число дос тупных метоксильных (-ОСН3) групп в молекуле лигнина, а также повысить содер жание всевозможных мономерных, димерных и олигомерных производных фенолов, которые могут образоваться посредством разрыва эфирных связей в молекуле лигни на (Закис, 1987). Определение содержания метоксильных групп в субстратах осуще ствлялось методом Цейзеля в модификации с применением газо-жидкостной хрома тографии (Закис, 1987). Использован газовый хроматограф «Varian CP 3800» с пла менно-ионизационным детектором, оснащённый капиллярной колонкой CP-Wax CB (полиэтиленгликоль). В части исследований в условиях глубинного культивиро вания использовали экстракты (перколяты) модельных соединений лигнина, полу ченных из нативных (не подвергнутых метанолизу) и метанолизных опилок (Груш ников, 1973;

Фенгел, 1988;

Оболенская, 1991;

Боголицин, 1994).

Общую оксидазную и общую пероксидазную активность определяли спектро фотометрически. О целлюлазной активности судили косвенно по осахариванию экст рагированных нативных и метанолизных опилок, определяя концентрацию глюкозы глюкозооксидазным методом и по убыли холоцеллюлозы (сумма целлюлозы и геми целлюлозы) в субстратах в конце периода культивирования.

Определение содержания целлобиозы в культуральной жидкости и эргостерина в мицелии грибов осуществлялось методом газо-жидкостной хроматографии (Гёрёг, 1985) на хроматографе «Кристалл-2000 М» с пламенно-ионизационным детектором, оснащённым набивной колонкой с насадкой – 5% SE-30 на инертоне с использовани ем соответствующих стандартов фирмы «Мerck».

Активность дегидрогеназ определяли с помощью гистохимической методики, основанной на индикаторных свойствах нитросинего тетразолия (Барыкина и др., 2000). Выгонка плодовых тел проводилась по общепринятым методикам при интен сивном способе культивировании на твердых органических субстратах.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью компьютерной программы для обработки и анализа статистических данных «Statistica 6.0». Для оценки достоверности влияния структуры и состава субстратов на определяемые параметры проводился дисперсионный анализ полученного массива данных (ANOVA), использовался t-критерий Стьюдента при уровне значимости 0,95 (Хала фян, 2007). В ходе работы велась фотодокументация.

3 ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ВИДОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ 3.1 Культурально-морфологические особенности исследованных видов Были изучены морфолого-культуральные особенности видов и штаммов. Ус тановлено высокое разнообразие этих показателей, причем выявлена тенденция связи между широтой субстратной приуроченности вида в природе и разнообра зием культурально-морфологических характеристик в условиях чистой культуры.

Виды-эвритрофы, встречающиеся в природе на древесине разных пород и разной степени разложения, имеют внутривидовые отличия в скоростях роста, макро- и микроскопических особенностях мицелия. Виды-стенотрофы более од нообразны в культуре. Однако для установления более четких закономерностей потребуется исследование значительно большего числа штаммов в пределах каж дого вида.

3.2 Особенности развития штаммов с различными трофическими стратегиями на традиционных питательных средах Проведенное сравнение средних скоростей роста и ростовых коэффициентов видов с различными трофическими стратегиями в природе на разных средах (КГА, сусло-агар) выявило отличия между облигатными паразитами, факульта тивными паразитами и факультативными сапротрофами (рис. 1). Так, средние скорости роста видов факультативных паразитов на сусло-агаре выше, чем обли гатных, почти в 3,5 раза (Р=0,0001), а факультативных сапротрофов – в 2,5 раза (Р=0,001). Следует отметить, что визуально заметное сравнительно более интен сивное развитие факультативных паразитов по сравнению с факультативными сапротрофами может объясняться большей долей аминного азота, наличием дос тупных сахаров (мальтозы) и присутствием витаминов группы В в сусло-агаре.

Выявлены отличия в динамике развития мицелия разных видов на указанных средах (рис. 2). Установлено, что более растянутая во времени фаза адаптации характерна для видов с паразитической стратегией в природе на картофельно глюкозном агаре.

С р ед н и е ск о р о сти р о ста, Р К, баллы м м /су т 4 2 ОП ФП ФС ОП ФП ФС Трофические стратегии видов Трофические стратегии видов СА КГА СА КГА Рис. 1 – Средние значения скоростей роста (слева) и ростовых коэффициентов (РК, справа) у видов ксилотрофных базидиомицетов разных трофических стратегий на разных агаризованных средах. Условные обозначения: ОП – облигатные паразиты;

ФП – факультативные паразиты;

ФС – факультативные сапротрофы С к о р о с т ь р о с т а, м м /с у т С к о р о сть р о ста, м м /су т 10 5 1 1 2 3 4 5 6 7 8 Сутки роста 1 2 3 4 5 6 7 8 Сутки роста F. hepatica, штамм Fh- F. hepatica, штамм Fh- H. annosum, штамм Han- H. annosum, штамм Han- F. pinicola, штамм Fpi- F. pinicola, штамм Fpi- Рис. 2 – Динамика скоростей роста мицелия видов ксилотрофных базидиомице тов – представителей разных трофических стратегий на разных средах (слева – сусло-агар, справа – картофельно-глюкозный агар, 26С) На основании полученных данных можно прийти к выводу о нецелесообраз ности использования крахмалистых питательных сред для культур паразитиче ских видов, и, напротив, сапротрофы лучше развиваются на средах, содержащих «пролонгированные» источники сахаров.

4 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ ИСТОЧНИКОВ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ЛИГНИНА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ШТАММОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ 4.1 Влияние различных по структуре комплексных источников целлюлозы и лигнина на рост и развитие мицелия ксилотрофных базидиомицетов В ходе исследований проведено изучение особенностей развития мицели альных культур изученных видов на субстратах из экстрагированных дубовых опилок, содержащих одинаковое количество целлюлозы, но формы лигнина с разной степенью конденсации молекулы (нативные и метанолизные опилки).

Содержание метоксильных групп в нативных опилках составляло 18,9 мг/г мате риала или 0,61 мМ/г;

содержание метоксильных групп в опилках, подвергшихся метанолизу, было более, чем вдвое выше и составляло 41,6 мг/г (1,32 мМ/г). Со держание холоцеллюлозы в образцах опилок было приблизительно на одном уровне и составляло от 78,7 до 81,6%.

Культуры всех изученных видов, независимо от субстратной специфичности и типа гнили развивались на опилочных субстратах. Даже виды, никогда не встречающиеся в природе на древесине дуба, росли и развивались на материале опилок. Этот факт мы объясняем результатом глубокого экстрагирования, кото рое позволило «обезличить» материал. Рост культур по сравнению с развитием на агаризованных средах был замедлен.

Мицелий, растущий на метанолизных опилках, характеризовался большей плотностью и лучше развитым воздушным мицелием, хотя темпы роста чаще были ниже, чем в альтернативном варианте (табл. 1).

Таблица 1 – Средние скорости роста мицелия штаммов изученных видов на стерильных дубовых опилках (мм/сут, 26С, повторность трехкратная) Вид, штамм Штаммы Особенности субстрата Нативные опилки Метанолизные опилки IO-1 3,7±0,3* 1,5±0, I. obliquus IO-2 3,6±0,4 1,5±0, IO-3 3,5±0,3 1,7±0, Pht-1 3,5±0,5 0,8±0, Ph. tremulae Pht-2 3,5±0,6 1,1±0, Pht-3 3,1±0,6 1,9±0, Fpi-1 1,5±0,3 2,5±0, F. pinicola Fpi-2 1,2±0,3 2,3±0, Fpi-3 1,8±0,4 2,1±0, РD-99 2,6±0,3 2,8±0, L. sulphureus РD-01 2,7±0,3 2,5±0, Аh-02 2,5±0,4 2,6±0, G-1 1,8±0,3 5,2±0, G. applanatum G-2 1,7±0,5 3,4±0, G-3 1,5±0,3 6,6±0, Gl-1 0,6±0,2 2,8±0, G.lucidum Gl-3 0,7±0,2 2,6±0, Gl-6 0,4±0,1 3,0±0, AH-96 5,2±0,5 5,0±1, F.fomentarius Nic-02 5,7±0,6 5,3±0, Lp-05 5,3±0,5 4,9±0, PyC-1 3,9±0,4 3,7±0, P.cinnabarinus PyC-2 4,0±0,4 3,8±0, PyC-4 4,1±0,4 3,5±0, Han-1 2,6±0,3 1,9±0, H. annosum Han-2 2,5±0,4 2,1±0, Han-3 2,8±0,4 1,9±0, Fh-1 5,2±0,7 3,6±0, F. hepatica Fh-1а 4,8±1,1 2,9±0, Fh-5 4,3±0,7 3,1±0, *жирным показаны достоверные отличия, Р0,05.

Исключение составили два изученных вида: L. sulphureus и P.cinnabarinus. У них, напротив, формировался более густой мицелий на нативных опилках и более тонкий – на метанолизных. Низкие скорости роста на метанолизном субстрате можно объяснить относительно более высоким содержанием фенольных соеди нений.

Установлено, что активнее осваивают метанолизный субстрат представители видов, чаще встречающихся в природе на древесине высокой степени разложе ния, причем вне зависимости от типа вызываемой гнили (рис.3).

Средняя скорость роста, мм/сут us us m s m ae um s la a riu uu tic tu in du re co ul os ta liq ar na hu m pa ci ni en nn ab la re.lu ob lp he pi m pp.a nn.t su F.

G F.

I.

fo Ph.a H ci L.

F.

P.

G Нативные опилки Метанолизные опилки Рис. 3 – Средние скорости роста видов ксилотрофных базидиомицетов на различных субстратах (среднее по трем штаммам каждого вида) Это достоверно отмечено для F. pinicola, G. applanatum, G. lucidum. Вероятно, эти виды эволюционно адаптированы к эффективному использованию обилия метоксиль ных групп в значительной степени разрушенной древесины. L. sulphureus, F.

fomentarius, F. hepatica, I. obliquus, чаще встречающиеся на живых деревьях, Ph.

tremulae, H. annosum – только на живых, древесина которых содержит относительно низкие концентрации метоксильных групп, лучше развиваются на нативных опилках.

4.2 Активность некоторых ферментов ксилотрофных базидиомицетов при твердофазном культивировании Интерес представляло сравнение ферментативной активности культур при их раз витии на экстрагированных опилках и их метанолизных дериватах, для чего на 13- сутки роста проведено ее определение.

У F. pinicola, G. applanatum, G.lucidum, т.е. видов с широкой трофической специализацией, общая оксидазная активность выше на метанолизном субстрате, чем на нативном (табл. 2). Однако на метанолизных опилках снижается общая оксидазная активность у Ph. tremulae, H. annosum и F. hepatica. Это, вероятно, определяется воздействием фенольных компонентов субстрата и может быть связано с приуроченностью видов к живым деревьям, древесина которых на на чальных этапах колонизации имеет, небольшое, по сравнению с фаутной, содер жание мономерных фенольных структур.

Пероксидазная активность, как выяснилось, является индивидуальной осо бенностью видов, поскольку ее уровни на изученных субстратах у разных куль тур не поддаются систематизации. На метанолизном субстрате у изученных гри бов белой гнили отмечаются более высокие показатели, чем на нативных. Все возбудители бурой гнили, а также некоторые представители белой при культиви ровании как на нативных, так и на метанолизных опилках показали относительно низкую активность пероксидаз.

О целлюлазной активности судили по утилизации холоцеллюлозы в мате риале опилок и по концентрации глюкозы в вытяжке из субстрата. Практически для всех культур, независимо от типа гнили и субстратной специфичности в при роде, характерна более высокая целлюлазная активность на метанолизном мате риале. Согласно литературным данным, отдельные фенольные компоненты лиг нина способны индуцировать выработку целлюлазных ферментов некоторых грибов (Muller, 1988). Наши результаты подтверждают это положение.

Таблица 2 – Общая оксидазная, проксидазная и целлюлазная активность мицелия изученных видов на нативных (Н) и метанолизных (М) опилках Вид, штамм Ферментативная активность Общая оксидазная, Общая Убыль пероксидазная, холоцеллюлозы, ед.оп.пл.*100/г*сек ед.оп.пл. *100/г*сек % Н М Н М Н М I. obliquus, IO-3 0,65±0,13 0,61±0,12 0,53±0,11 5,8±1,16 8,3±1,66 18,3±3, Ph. tremulae, Pht-3 0,24±0,05* 0,11±0,02 2,64±0,53 1,12±0,22 1,7±0,34 3,6±0, F. pinicola, Fpi-3 14,1±2,82 20,3±4, 0,09±0,02 0,33±0,07 0,26±0,05 0, L. sulphureus, Аh-02 13,7±2,74 17,6±3, 0,11±0,02 0,00 0,13±0,03 0, G. applanatum, G-3 0,09±0,02 0,19±0,04 1,75±0,35 4±0,80 7,8±1,56 18,2±3, G. lucidum, Gl-6 0,38±0,08 0,58±0,12 2,06±0,41 5,9±1,18 8,1±1,62 19,6±3, F. fomentarius, Lp-05 0,15±0,03 0,27±0,05 1,8±0,36 2,9±0,58 5,9±1,18 9,6±1, P. cinnabarinus, PyC-4 0,62±0,12 0,51±0,10 0,53±0,11 0,00 6,9±1,38 14,6±2, H. annosum, Han-3 0,31±0,06 0,13±0,03 0,45±0,09 0,00 10,3±2,06 17,5±3, F. hepatica, Fh-5 15,9±3,18 16,5±3, 0,32±0,06 0,19±0,04 0,47±0,09 0, *жирным отмечены достоверные отличия (р0,05) 4.3 Влияние внесения источников целлюлозы и лигнина в агаризованные среды на рост и развитие культур ксилотрофных базидиомицетов Интерес представляло изучение влияния добавления лигноцеллюлозных ма териалов в состав традиционных сред. При этом создается «эффект разбавления», элиминирующий токсическое действие избытка метоксильных групп и олиго мерных соединений лигнина, устраняются такие лимитирующие развитие факто ры как дефицит легкодоступных сахаров и влаги. Для оценки влияния изученных факторов на развитие того или иного вида был произведен расчет коэффициентов отзывчивости, то есть отношений средних по штаммам показателей скоростей роста на экспериментальных средах к средним скоростям роста в контроле. Об наружено, что лигноцеллюлозные источники, добавленные в низких концентра циях (2% от массы) к агаризованным средам, стимулируют развитие большинст ва изученных видов (рис. 4).

На видовом уровне прослеживается разная степень стимуляции развития ми целия путем добавления к питательному субстрату источников целлюлозы и лиг нина. Причем заметно, что в целях интенсификации роста культур целесообразно использование именно метанолизных опилок. Несомненен факт включения со ставляющих компонентов добавок в метаболизм культур, а «рыхлое» состояние молекул в метанолизном источнике целлюлозы и лигнина делает его более дос тупным для ферментативных систем гриба. Отдельного внимания заслуживает факт оптимизации роста видов-паразитов, обычно слабо развивающихся в куль туре, посредством обогащения питательной среды лигноцеллюлозными компо нентами в низких концентрациях.

2, ициент отзывчивости 1, Коэфф 0, F.pinicola.lucidum G applanatum H annosum entarius P.cinnabarinus ulae I. obliquus F. hepatica L. sulphureus Ph. trem F.fom G.

.

Виды Нативные опилки Метанолизные опилки КО= Рис. 4 – Сравнение значений коэффициентов отзывчивости на внесение в агаризованную питательную среду опилок, подготовленных различным образом (культивирование в течение 7 суток, КГА, три повторности, 26С) 4.3.1 Влияние внесения источников целлюлозы и лигнина в агаризованные среды на дегидрогеназную активность культур Одним из показателей интенсивности энергетических процессов у культур может служить уровень активности ферментов дегидрогеназ. Для получения ил люстрации дегидрогеназной активности мицелия использовали гистохимическую методику качественной оценки с использованием нитросинего тетразолия. Инди катор акцептирует отщепленные дегидрогеназами электроны, и, восстанавлива ясь, превращается в ярко окрашенный формазан. Интенсивность окраски оцени вали с использованием пятибалльной шкалы, описанной в методике.

На примере F. fomentarius показано, что дегидрогеназная активность мице лия выше в присутствии лигноцеллюлозных компонентов (рис.5).

Рис. 5 – Иллюстрация дегидрогеназной активности мицелия F.fomentarius, штамм Nic-02 при помощи индикаторных свойств нитросинего тетразолия:

вариант 1 – добавление нативных опилок, вариант 2 – добавление метанолизных опилок, вариант 3 – контроль В варианте с добавлением в агаризованную среду метанолизных опилок отмечено наиболее интенсивное окрашивание, оцененное на 4 балла. В варианте с нативными опилками интенсивность окрашивания оценена на 3 балла, в кон троле на 1 балл. Такие результаты косвенно подтверждают факт интенсификации обменных процессов мицелия на обогащенных опилками агаризованных субстра тах.

4.3.2 Использование парааминобензойной кислоты в качестве фактора, оптимизирующего развитие мицелия ксилотрофных базидиомицетов на субстратах, содержащих лигноцеллюлозные компоненты Нами изучено воздействие парааминобензойной кислоты на рост и развитие куль тур, в результате чего была установлена концентрация, позитивно влияющая на рост большинства культур – 0,005 г/л. Установлено, что ПАБК оказывает позитивное влия ние на темпы и характер развития мицелия большинства штаммов изученных видов, что особенно заметно на лигноцеллюлозных субстратах (табл. 3).

Таблица 3 – Средние скорости роста мицелия ксилотрофных базидиомицетов на КГА и КГА, обогащенном метанолизными опилками (МО, 2% от массы) и ПАБК (0,005 г/л) (мм/сут, 26С, повторность трехкратная) Вид, штамм Особенности субстрата КГА КГА+МО КГА+ПАБК КГА+ПАБК+МО (контроль) I. obliquus, IO-1 3,1±0,2 3,9±0,4 4,2±0,4 5,0±0, Ph. tremulae, Pht-1 0,2±0,01 0,25±0,03 0,31±0,03 0,49±0, F. pinicola, Fpi-2 8,5±0,9 9,2±1, 12,2±0,8 11,0±1, L. sulphureus, РD-01 8,2±1,2 8,6±2, 11,5±1,4 10,4±1, G. applanatum, G-3 9,8±0,7 12,7±0,5 11,2±2,3 12,7±1, G. lucidum, Gl-6 6,4±1,5 7,7±0, 9,9±1,3 11,5±1, F. fomentarius, AH-96 5,1±1,3 12,3±0,3 8,0±1,1 14,2±1, P. cinnabarinus, PyC-1 5,1±0,9 11,2±0,9 7,4±0,4 12,6±0, H. annosum, Han-3 0,2±0,04 0,5±0,01 0,4±0,01 0,6±0, F. hepatica, Fh-5 4,2±0,8 4,8±0, 8,3±1,0 9,8±0, *жирным показаны достоверные отличия от контроля, Р0,05.

Полученные данные свидетельствуют о целесообразности включения ПАБК в рецептуру сред для культивирования ксилотрофных базидиомицетов, особенно в состав субстратов, содержащих лигноцеллюлозные компоненты.

5 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДЕЛЬНОГО ЛИГНИНА И ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МАТЕРИАЛОВ ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ 5.1 Влияние продуктов перколяции лигнина Классона на накопление биомассы мицелия ксилотрофных базидиомицетов в условиях глубинной культуры На следующем этапе экспериментов нами было изучено влияние лигноцел люлозных компонентов на процесс накопления биомассы мицелия в глубинных условиях. Опилки, как нерастворимый материал, при добавлении в жидкую пита тельную среду будут помехой для отделения биомассы мицелия, поэтому внесе ние их в обычном состоянии нецелесообразно. Решением проблемы может быть предварительная перколяция лигноцеллюлозных субстратов для получения экс трактов. Однако, используя субстрат, подготовленный таким образом, невозмож но судить о влиянии на развитие мицелия целлюлозы, а также гемицеллюлоз, которые в процессе перколяции разрушаются до олигомерных и мономерных компонентов (в основном, целлобиозы, глюкозы, ксилозы и т.д.). Таким образом, можно судить только о влиянии со стороны метоксильных групп лигнанов, пе решедших в раствор. Влияние же олигомерных и мономерных компонентов угле водов учесть сложно, но и исключить нельзя, поскольку их спектр (как качест венный, так и количественный) чрезвычайно широк. В этой связи логично полное удаление углеводной составляющей из лигноцеллюлозного субстрата, то есть получение модельного лигнина (лигнина Классона).

Два варианта лигнинов были получены удалением углеводов из исследован ных лигноцеллюлозных материалов. Затем лигнины подвергнуты перколяции.

Проведенный методом газовой хроматографии анализ содержания метоксильных групп в составе перколятов показал, что их значение, полученное для метанолиз ного лигнина (7,4 мМ/г) почти втрое выше, чем для нативного (2,5 мМ/г). Перко ляты в количестве 2% от массы среды вносили в среду Чапека, до стерилизации.

Как в опытных, так и в контрольных вариантах на видовом уровне сохраня ются особенности морфологии глубинного мицелия. Некоторые виды характери зовались филаментным, а другие – пеллетным ростом. Различия не связаны ни с трофическими стратегиями видов, ни с типами вызываемых грибами гнилей.

Возможно, это своеобразная иллюстрация отношения культуры к концентрации кислорода в среде. Однако для установления каких-либо зависимостей потребу ются дополнительные исследования. Установлено стимулирующее влияние обо их вариантов перколятов лигнина на процесс накопления биомассы мицелия у большинства штаммов изученных видов: F. pinicola, G. applanatum, G. lucidum, F.

fomentarius, F. hepatica, P. cinnabarinus (табл. 4).

Таблица 4 – Накопление биомассы мицелия культурами ксилотрофных базидиомицетов на различных средах (26°С, 7 сут. развития, повторность трехкратная, сухой мицелий, г), в пересчете на 1л питательной среды Вид Штамм Варианты опыта Экстракт лигнина Экстракт лигнина Среда Чапека из нативных из метанолизных модифицирванная опилок* опилок* (контроль) IO-1 2,57±0,10 2,18±0, 2,72±0,02** I. obliquus IO-2 3,11±0,13 3,02±0,10 2,98±0, IO-3 2,38±0,14 2,46±0,02 2,20±0, Pht-1 2,05±0,15 1,91±0, 1,34±0, Ph. tremulae Pht-2 1,80±0,04 1,75±0, 1,19±0, Pht-3 1,02±0,07 1,10±0,11 1,48±0, Fpi-1 5,69±0, 7,53±0,51 8,5±0, F. pinicola Fpi-2 5,24±0,09 4,82±0, 6,2±0, Fpi-3 3,90±0,12 3,47±0, 5,36±0, РD-99 6,11±0,28 5,78±0, 6,83±0, L. sulphureus РD-01 4,12±0,05 4,34±0, 5,69±0, Вид Штамм Варианты опыта Экстракт лигнина Экстракт лигнина Среда Чапека из нативных из метанолизных модифицирванная опилок* опилок* (контроль) Аh-02 4,91±0,17 4,57±0, 6,72±0, G. applanatum G-1 3,10±0, 3,60±0,39 5,28±0, G-2 3,18±0, 4,32±0,22 4,75±0, G-3 3,77±0, 4,26±0,10 5,13±0, Gl-1 2,59±0, 3,21±0,13 3,75±0, G.lucidum Gl-3 3,64±0, 4,29±0,10 5,30±0, Gl-6 3,04±0, 3,10±0,12 6,22±0, F. fomentarius AH-96 2,28±0, 4,51±0,32 4,67±0, Nic-02 3,08±0, 5,83±0,16 4,10±0, Lp-05 3,33±0, 5,76±0,40 5,61±0, P. cinnabarinus PyC-1 3,29±0, 5,06±0,24 3,62±0, PyC-2 3,77±0, 4,43±0,19 4,60±0, PyC-4 3,65±0, 4,60±0,09 4,96±0, Han-1 2,63±0,19 2,01±0,19 2,09±0, H. annosum Han-2 2,77±0,10 2,89±0, 1,65±0, Han-3 3,06±0,01 2,66±0,09 2,63±0, Fh-1 2,89±0, 4,18±0,12 4,61±0, F. hepatica Fh-1а 2,58±0, 4,06±0,26 5,01±0, Fh-5 2,09±0, 3,58±0,13 4,64±0, * Экстракты адаптированы к среде Чапека экзогенными сахарами ** Достоверные (Р0,05) отличия показаны жирным шрифтом Однако для штаммов таких видов как I. obliquus, Ph. tremulae и H. annosum не установлено фактов стимуляции развития. Мы связываем это с особенностями трофики выраженных биотрофов, для которых порог ингибирования роста фе нольными соединениями, содержащимися в древесине, ниже, чем у сапротроф ных видов. Тот факт, что торможение роста обнаружено у паразитных видов (Ph.

tremulae и H. annosum) в вариантах с экстрактами лигнина из метанолизных опи лок, косвенно свидетельствует в пользу этого предположения.

Таким образом, можно рекомендовать подобные приемы для выращивания биомассы мицелия этих видов в глубинных условиях. Стимуляция развития ми целия, более заметная в вариантах с перколятами лигнина метанолизных опилок может объясняться структурой лигнинового компонента последних. Она более рыхлая и доля метоксильных групп, доступных для утилизации мицелием, выше, чем у нативных опилок, где лигнин находится в конденсированном состоянии.

5.2 Влияние экстракта перколированного лигнина на процесс синтеза эргостерина штаммами изученных видов ксилотрофных базидиомицетов Важным показателем метаболизма культуры может служить синтез эрго стерина, участвующего в формировании структуры мембран. Эргостерин также представляет собой исходное вещество для синтеза многих продуктов стероид ной природы, многие из которых рассматриваются как вторичные метаболиты.

Содержание эргостерина выше в образцах мицелия, выращенного на средах с добавлением перколятов лигнина, причем это достоверно отмечено для видов – представителей белой гнили, и, как исключение – для представителя бурой гнили L. sulphureus (табл. 5).

Таблица 5 – Показатели содержания эргостерина в образцах мицелия штаммов исследованных видов ксилотрофных базидиомицетов (26°С, 7 сут. развития, повторность трехкратная) Вид, штамм Среда Чапека Среда с перкалятом из модифицированная метанолизного лигнина (контроль) (опыт) Масса навески, Эргостерин, Масса навески, Эргостерин, (мг) %* (мг) % I. obliquus, IO-2 2983,7±182,1 0,74±0,04 3023,0±104,3 1,31±0,02** Ph. tremulae, Pht-1 1911,2±131,0 0,41±0,01 1339,7±71,3 0,69±0, 5694,0±82,4 0,38±0,03 8506,1±153,8 0,39±0, F. pinicola,Fpi- L. sulphureus, РD-99 5782,1±80,7 0,37±0,01 6832,3±232,1 0,49±0, G. applanatum, G-2 3179,3±102,2 0,70±0,09 4751,1±244,4 1,03±0, G. lucidum, Gl-3 3638,2±274,2 0,87±0,01 5303,2±139,1 1,49±0, F. fomentarius, Nic-02 3081,7±83,7 1,06±0,04 4107,2±112,6 1,42±0, P. cinnabarinus, PyC-1 3292,2±90,3 1,08±0,03 3619,5±172,9 1,50±0, H. annosum, Han-2 2894,3±10,2 0,61±0,01 0,76±0, 1652,3±23, F. hepatica, Fh-5 2093,3±389,6 1,60±0,04 4643,4±184,8 1,56±0, *% эргостерина от воздушно-сухой массы мицелия Отсутствие зависимости между накоплением биомассы и содержанием эрго стерина означает, что помимо затрат на пластический обмен, культуры накапли вают материал для синтеза веществ и образования структур на последующих ста диях развития. Возможно, это резерв для репродуктивных процессов.

5.3 Утилизация мицелием ксилотрофных базидиомицетов различных компонентов питательной среды в условиях глубинного культивирования Настоящий эксперимент был организован с целью изучения темпов утилиза ции мицелием разных видов компонентов среды в глубинных условиях. Для это го в среду Чапека добавляли непосредственно метанолизные опилки. Анализ на копления биомассы в этом случае не предполагался. Темпы утилизации глюкозы из питательной среды различались у разных видов. Максимальными они были у культур-представителей видов с выраженной паразитической стратегией питания в природе, у сапротрофных видов снижение концентрации глюкозы происходило медленнее (рис.6). Однако, начиная с 6-7 суток культивирования, у представите лей грибов бурой гнили была отмечена своеобразная «пульсация» концентраций глюкозы в культуральной жидкости, что мы объясняем процессом гидролиза уг леводов из материала опилок. В связи с этим, нам представилось вероятным об наружение в культуральной жидкости целлобиозы, как промежуточного продукта гидролиза.

Концентрация глюкозы, мМ/л 0 2 4 6 8 10 12 Сутки культивирования Ph. tremulae, Pht-1, К H. annosum,Han-1, К Ph. tremulae, Pht-1, О H. annosum,Han-1, О К н е т а и г ю о, м /л о ц н р ц я л к зы М 0 2 4 6 8 10 12 Сутки культивирования I. obliqus,IO-1, К F. hepatica, Fh-5, К I. obliqus,IO-1, О F. hepatica, Fh-5, О Концентрация глюкозы, мМ л / 0 2 4 6 8 10 12 Сутки культивирования G.lucidum, Gl-1, К F.pinicola, Fpi-1, К G.lucidum, Gl-1, О F.pinicola, Fpi-1, О Рис. 6 – Динамика утилизации глюкозы из питательной среды культурами разных видов при глубинном культивировании (К – контроль, среда без добавления метоксильных опилок, О – опыт, среда с добавлением метанолизных опилок) Действительно, значительные концентрации целлобиозы обнаружены в культуральной жидкости грибов белой гнили I. obliquus и G.lucidum на средах, содержащих источники целлюлозы и лигнина по истечении 7 суток культивиро вания. Максимумы концентраций целлобиозы в культуральной жидкости соста вили соответственно 3,6 мМ/л – на десятые и 3,9 мМ/л – на двенадцатые сутки культивирования. В культуральной жидкости некоторых прочих видов в опыт ных вариантах были обнаружены следовые количества целлобиозы, а в кон трольных вариантах этот углевод отсутствовал полностью. Появление в культу ральной жидкости грибов белой гнили целлобиозы может объясняться только процессом гидролиза целлюлозы опилок. Этот факт, особенно с учетом относи тельно слабой утилизации грибами этой группы глюкозы питательной среды, может свидетельствовать об особой трофической стратегии их в культуре в при сутствии лигноцеллюлозных компонентов.

Затем отделенные от среды опилки были высушены до постоянной массы и проанализированы на остаточное содержание холоцеллюлозы и метоксильных групп. Содержание холоцеллюлозы изменилось незначительно у обоих видов с паразитической стратегией питания в природе. Выявлены достоверные отличия в плане более интенсивной утилизации холоцеллюлозы грибами бурой гнили, что вполне согласуется с особенностями этой группы (табл. 6).

Таблица 6 – Содержание целлюлозы и метоксильных групп в материале метанолизных опилок, извлеченных из среды после глубинного культивирования мицелия разных видов ксилотрофных базидиомицетов Вид, штамм Трофическая Тип гнили Содержание Содержание стратегия видов целлюлозы, % метоксильных в районе от исходного групп, исследований содержания % от исходного содержания Ph. tremulae, Pht-1 белая 97,5 81, Облигатные паразиты H. annosum, Han-1 смешанная 86,5 80, I. obliquus, IO-1 Факультативные белая 69,8 66, паразиты F. hepatica, Fh-5 бурая 55,5 71, G.lucidum, Gl-1 Факультативные белая 62,1 57, сапротрофы F.pinicola, Fpi-1 бурая 48,9 55, Концентрация метоксильных групп почти не изменилась у видов – парази тов. У прочих видов содержание метоксильных групп уменьшилось почти по сравнению с исходным, причем у типичных сапротрофных видов – почти вдвое.

Вопреки ожиданиям, утилизация метоксильных групп, как выяснилось, происхо дит с примерно одинаковой интенсивностью у грибов белой и бурой гнили. Такая парадоксальная ситуация может объясняться тем, что грибы белой гнили утили зируют метоксилы для деградации лигнина, а бурой – для его вторичной моди фикации.

6 ВЛИЯНИЕ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ КОМПОНЕНТОВ СУБСТРАТА НА ПРОЦЕССЫ ПЛОДООБРАЗОВАНИЯ У КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ 6.1 Влияние внесения метанолизных опилок в агаризованные среды на образование зачатков плодовых тел у некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов Отдельным блоком исследований было изучение влияния лигноцеллюлозных компонентов субстратов на процессы формирования зачатков плодовых тел в стерильных условиях. Была проведена 5-суточная холодовая стимуляция плодо образования, после чего культуры выдерживали при комнатной температуре. У ряда культур, причем только у грибов – представителей белой гнили через 12- суток было отмечено формирование примордиев. Появившиеся узелки на мице лии Ph. tremulae в вариантах с добавлением как нативных, так и метанолизных опилок, дальнейшее развитие прекратили. На 20-25 сутки у прочих представите лей белой гнили (I. obliquus, F.fomentarius, G. applanatum, G. lucidum, P.

cinnabarinus)сформировались типичные Примордии (рис.7). В вариантах с мета нолизными опилками, и, реже, в вариантах с нативными у примордиев появилась тенденция к дифференциации.

а б в Рис. 7 – Образование примордиев у некоторых видов: а) I. obliquus, штамм IO-1;

б) F. fomentarius, штамм Nic-02;

в) P. cinnabarinus штамм PyC- Образование примодиев G.lucidum наблюдали и в контрольных вариантах, но в опыте заметна выраженная дифференциация (рис. 8).

Рис. 8 – Дифференцированный примордий на мицелии G.lucidum (штамм Gl-1), сформированный на среде с добавлением метанолизных опилок, 20 сутки Формирование дифференцированных примордиев в варианте с метанолиз ными опилками, обогащенными метоксильными группами, свидетельствует о том, что эти компоненты лигнина (концентрация которых заметно выше в древе сине, уже подвергшейся процессам деструкции в природе) (Фенгел, 1988), могут служить факторами плодоношения не только в искусственных, но и в естествен ных условиях.

6.2 Возможности включения метанолизных источников целлюлозы и лигнина в состав твердофазных органических субстратов для получения плодовых тел Ganoderma lucidum На основании полученных данных по стимуляции плодообразования культур ксилотрофных базидиомицетов на стерильных субстратах внесением в среду ме танолизных опилок было организовано исследование их влияния на процесс пло доношения G.lucidum при культивировании по интенсивной технологии.

В качестве контрольного субстрата использована ржаная солома, в опытах к ней добавлены нативные и метанолизные опилки в количестве 10 % от массы субстрата. В контроле на 20-25 сутки развития мицелия отмечены кожистые уп лотнения, которые со временем приобретали бурую окраску. Мицелиальная кор ка высыхала и отторгалась от субстрата. В опытных вариантах на 38-45 сутки были отмечены тенденции к формированию плодовых тел. В вариантах с исполь зованием метанолизных опилок процессы морфогенеза протекали более интен сивно, на 55-е сутки сформированная на таком субстрате типичная базидиома приступила к спороношению (рис.9). Это подтверждает наше предположение о том, что метоксильные группы могут служить фактором, стимулирующим пере ход культуры к вторичному метаболизму, поскольку одной из иллюстраций этой фазы развития служит плодоношение.

Рис. 9 – Базидиома G. lucidum на твердом органическом субстрате, содержащем метанолизные дубовые опилки в момент начала спороношения Безусловно, на процесс плодообразования в искусственной культуре влияет целый ряд внешних факторов, прежде всего микроклимат, однако определение оптимального субстрата представляется нам существенным моментом. На осно вании полученных данных была разработана рецептура субстрата, который ис пользуется нами для получения плодовых тел G. lucidum.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В заключении подводятся и обсуждаются итоги проделанной работы, дается обоснование целесообразности использования экстрагированных метанолизных источников целлюлозы и лигнина в практике культивирования видов ксилотроф ных базидиомицетов.

ВЫВОДЫ 1. Субстратная приуроченность ксилотрофных базидиомицетов к древесине разной степени разложения определяет особенности их развития в чистой куль туре.

2. Изученные виды ксилотрофных базидиомицетов, несмотря на различную субстратную специализацию в природе (по отношению к древесным породам и степени разложения древесины) с разной интенсивностью развиваются на экстра гированном системой полярных и неполярных растворителей нативном и мета нолизном (обогащенном метоксильными группами) материале дубовых опилок в условиях чистой культуры.

3. Структура лигноцеллюлозного субстрата влияет на ферментативную ак тивность мицелия изученных видов. Метанолизный субстрат ингибирует окси дазную активность большинства видов с паразитной специализацией в природе и стимулирует таковую у большинства сапротрофных видов;

он стимулирует пе роксидазную активность у некоторых видов – представителей белой гнили;

виды – представители бурой гнили на нативном субстрате в культуре интенсивнее раз рушают целлюлозу, чем представители белой;

на метанолизном субстрате эта закономерность сохраняется. Метанолизный лигноцеллюлозный субстрат обес печивает увеличение целлюлазной активности большинства изученных видов.

4. Метанолизный лигноцеллюлозный субстрат в количестве 2% от массы агаризованной питательной среды является фактором, стимулирующим развитие большинства изученных видов ксилотрофных базидиомицетов. Интенсификация обменных процессов косвенно подтверждается повышением активности дегидро геназ у мицелия, развивающегося на агаре, обогащенном метанолизным лигно целлюлозным материалом.

5. Установлена стимуляция накопления биомассы глубинного мицелия большинства изученных видов при внесении в среду перколятов метанолизного лигнина.

6. У видов – представителей белой гнили, и, как исключение у представителя бурой гнили L. sulphureus обогащение глубинной среды метоксильными группа ми стимулирует процесс синтеза эргостерина.

7. Установлено позитивное влияние метанолизных лигноцеллюлозных ис точников на формирование зачатков плодовых тел у видов – представителей бе лой гнили в условиях чистой культуры. Обнаружена стимуляция морфогенетиче ских процессов при развитии базидиом G. lucidum на твердых органических суб стратах с добавлением метанолизных компонентов. Можно рекомендовать вклю чение метанолизных лигноцеллюлозных материалов в субстрат для получения плодовых тел G. lucidum.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Лыков, Ю.С. Особенности роста штаммов ксилотрофных базидиомицетов на плотных питательных средах различного состава / Г.В. Ильина, Ю.С. Лыков // Тезисы докладов II съезда микологов России «Современная микология в России».

– Национальная Акадамия Микологии, Москва, 2008. – С. 509-510.

2. Лыков, Ю.С. Специфика питательных сред для культивирования ксилотроф ных базидиомицетов в лабораторных условиях / Ю.С. Лыков // Материалы Меж дународной научно-практической конференции, посвященной памяти профессора А.Ф. Блинохватова «Образование, наука, практика: инновационный аспект». – Пенза, 2008. – С. 64.

3. Лыков, Ю.С. Роль специфики лигнинсодержащих субстратов при куль тивировании ксилотрофных грибов in vitro / Г.В. Ильина, Д.Ю. Ильин, Ю.С.

Лыков // Микология и Фитопатология, Том 43, Вып. 2, Санкт-Перербург, «Наука», 2009. – С. 135-141.

4. Лыков, Ю.С. Влияние некоторых микроэлементов на развитие мицелия ксило трофных базидиомицетов в искусственной культуре / Ю.С. Лыков // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России». – Пенза, 2009.

– С. 188-189.

5. Лыков, Ю.С. Изучение антимикробной активности местных штаммов Laetiporus sulphureus (FR.) BOND. ET SING / Г.В. Ильина, Ю.С. Лыков, А.А.

Костычев // Международный научно-практический рецензируемый журнал «Иммунопатология, аллергология, инфектология». Труды междисципли нарного микологического форума, № 2. Москва, изд-во «Национальная ака демия микологии», 2009. – С. 178-179.

6. Лыков, Ю.С. Биологические особенности видов ксилотрофных базидио мицетов лесостепи правобережного Поволжья in situ и ex situ / Г.В. Ильина, Ю.С. Лыков // Поволжский экологический журнал, № 3, 2010, С. 263-273.

7. Лыков, Ю.С. Особенности развития мицелиальных культур паразитных видов базидиальных макромицетов EX SITU / Ю.С. Лыков, Г.В. Ильина // Международный научно-практический рецензируемый журнал «Иммунопа тология, аллергология, инфектология» / Труды второго междисциплинарно го микологического форума, № 1. Москва, изд-во «Национальная академия микологии», 2010. – С. 115.

8. Лыков, Ю.С. Возможности стимуляции синтеза эргостерина мицелием ксилотрофных базидиомицетов в условиях глубинной культуры / Ю.С. Лы ков, Г.В. Ильина // Известия Пензенского государственного педагогического университета имени В.Г. Белинского. Естественные науки. № 21 (25), Пенза, 2011 (в печати).

БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает глубокую признательность научному руководителю, Г.В.

Ильиной, за внимательное и чуткое отношение, сотрудникам РЦГЭКиМ по Пен зенской области за помощь в организации исследований. Отдельные слова благо дарности автор выражает профессору кафедры микологии и альгологии МГУ им.

Ломоносова, д.б.н. Л.В. Гарибовой и ведущему научному сотруднику названной кафедры, д.б.н. А.Н. Лихачеву за неоценимую всестороннюю поддержку.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии «Копи-Riso» ИП Попова М.Г.

г. Пенза, ул. Московская, 27.12.2010 г., тираж 100 экз., 1,25 усл. печ. л., заказ