Роль клеточных toll-подобных рецепторов в формировании колонизационной резистентности урогенитального тракта при хламидиозе
На правах рукописи
Байракова Александра Львовна РОЛЬ КЛЕТОЧНЫХ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В ФОРМИРОВАНИИ КОЛОНИЗАЦИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА ПРИ ХЛАМИДИОЗЕ 03.00.07 – микробиология 14.00.36 – аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Мос ковский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научные руководители:
Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Станислав Степанович Афанасьев Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Владимир Андрианович Алёшкин
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Олег Витальевич Калюжин доктор биологических наук, профессор Игорь Георгиевич Шемякин
Ведущая организация:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального об разования «Российский государственный медицинский университет Федераль ного агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится « » 2009 г. в 10 часов на заседании диссер тационного совета Д 208.046.01 в Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и мик робиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Мо сква, ул. Адмирала Макарова, д.10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Автореферат разослан « 2009 года.
»
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук О.Ю. Борисова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Масштабность распространения сексуально-трансмиссивных инфекций продолжает оставаться актуальной во всем мире (Хрянин А.А. с соавт., 2006;
Серов В.Н. 1997;
Рищук С.В. с соавт., 2005). Инфекционно-воспалительные за болевания репродуктивной сферы, несмотря на достижения современной меди цины, лидируют в структуре гинекологической заболеваемости и остаются тра диционно значимыми на протяжении последних лет (Гомберг М.А. c соавт., 2006;
Бакулев А.Л. c соавт., 2008). Урогенитальный хламидиоз (УГХ) занимает ведущее место в структуре инфекций передаваемых половым путём (ИППП).
Возбудители хламидиоза – облигатные внутриклеточные паразиты – не отно сятся к патогенам, представляющим особую опасность, но на фоне растущей урбанизации, ухудшения социально-демографической и экологической ситуа ции инфицирование Chlamydia trachomatis способно приводить к формирова нию различных осложнений, оказывающих неблагоприятное влияние как на общее состояние здоровья, так и на репродуктивную функцию населения (Его рова И.Е c соавт., 2003;
Халдин А.А., 2004;
Порсохонова Д.Ф. c соавт., 2005).
Клинические варианты течения хламидийной инфекции в наибольшей степени определяются выраженностью изменений, вызываемых возбудителем в месте своей локализации, и эффективностью колонизационной резистентности слизи стых (способность микрофлоры данного биотопа и макроорганизма, коопера тивно взаимодействуя, защищать экосистему от патогенной микрофлоры) (D. Van der Waaij, 1996;
Клиническая лабораторная аналитика, 2003).
Ключевым звеном в распознавании макроорганизмом патогенов являются образраспознающие рецепторы врожденной иммунной системы – Toll-like ре цепторы (TLR), составляющие основу мембранных комплексов и экспресси рующиеся на всех клеточных элементах, участвующие в формировании рези стентности (включая колонизационную резистентность слизистых) (Werling D.
et al., 2003;
Pioli P.A. et al., 2004;
Богунович М.Д., 2005;
Schnare M. et al., 2006;
Ганковская О.Г. c соавт., 2008). TLR способны распознавать консервативные молекулярные структуры, распространенные среди микроорганизмов и отсут ствующие у человека (Sandor F. et al., 2005;
Janeway C.A. et al., 2002). Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции после взаимодействия патогенов с мембранными TLR, сопровождаю щейся активацией генов цитокинового каскада, ответственных за активацию фагоцитов и других иммунокомпетентных клеток, иммуноглобулинов, что оп ределяет блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление инфек ционного агента из организма (Hertz C.J. et al., 2003;
Claeys S. et al., 2003;
Аба туров А.Э., 2006;
Люк О'Нил, 2005).
Представляется актуальным изучение корреляции уровней экспрессии TLR на поверхности слизистых и иммунологических показателей в секретах урогенитального тракта (УГТ) женщин с различными вариантами клинического течения УГХ.
Цель исследования Установление роли TLR-2 и TLR-4, микрофлоры, основных цитокинов и классов иммуноглобулинов в формировании колонизационной резистентности слизистых и в патогенезе урогенитального хламидиоза.
Задачи исследования 1. Изучение взаимосвязи между экспрессией генов TLR-2 и TLR-4 в со скобном материале слизистых урогенитального тракта и проявлениями уроге нитального хламидиоза у женщин.
2. Установление роли TLR-2 и TLR-4 в регуляции колонизационной рези стентности влагалища, цервикального канала и уретры, стабилизирующей нор мофлору и препятствующей инфицированию хламидиями и условно патогенными микроорганизмами.
3. Оценка взаимозависимости уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в соскобном материале слизистых урогенитального тракта и выраженностью ци токинового профиля секрета цервикального канала женщин с урогенитальной хламидийной инфекцией.
4. Исследование взаимосвязи уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в соскобном материале слизистых урогенитального тракта и особенностей имму ноглобулинового профиля секрета цервикального канала женщин с урогени тальной хламидийной инфекцией.
Научная новизна Впервые установлена определяющая роль TLR-2 и TLR-4 слизистых нижних отделов урогенитального тракта в ответе макроорганизма на инфици рование хламидиями при урогенитальном хламидиозе. Уровни экспрессии ге нов TLR-2 и TLR-4 служат критериями оценки выраженности хламидийной инфекции и наличия воспалительного процесса у больных, а при выздоровле нии их снижение может свидетельствовать об эрадикации возбудителя. Нару шения в экспрессии генов приводят к хроническому течению урогенитального хламидиоза. Низкие уровни TLR-2 и TLR-4 могут указывать на возможность начала хронизации инфекционного процесса. TLR слизистых урогенитального тракта через цитокиновую систему запускают местную воспалительную реак цию, определяют уровни IgG, sIgA и секреторного компонента (sc). Реакция эпителиальных поверхностей урогенитального тракта на условно-патогенную микрофлору и нормофлору зависит от экспрессии генов TLR-2 и TLR-4, что определяет колонизационную резистентность слизистых.
Практическая значимость Разработаны и предложены лабораторные критерии диагностики уроге нитального хламидиоза с установлением острой и хронической рецидивирую щей формы заболевания, защищённые Патентом РФ «Способ диагностики хро нического урогенитального хламидиоза» №2327995. Зарегистрирован 27.06.2008 г.
Апробированный при проведении исследований метод определения уровня экспрессии генов TLR ПЦР в реальном времени, совмещенной с обрат ной транскрипцией с использованием специфических праймеров, может быть востребован при лабораторной верификации возбудителя при урогенитальном хламидиозе и явиться дополнительным критерием диагностической и прогно стической оценки течения урогенитального хламидиоза наряду с ИФА, уточ няющим клинические формы и прогнозирующим исход заболевания. Метод воспроизводится в условиях стандартной клинической лаборатории.
Внедрение результатов работы в практику Результаты исследования используются в научно-практической работе лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Впервые установлена диагностическая и прогностическая значимость оценки уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 при урогенитальном хлами диозе у женщин. Воспалительная реакция и реакция слизистых урогенитально го тракта на условно-патогенную микрофлору и нормофлору, колонизационная резистентность координируются TLR-2 и TLR-4.
2. Передача активационных сигналов от TLR-2 и TLR-4 на клетки уроге нитального тракта может опосредоваться местной цитокиновой системой.
3. Toll-подобные рецепторы слизистых урогенитального тракта могут оп ределять местный иммуноглобулиновый статус.
Апробация работы Диссертация апробирована на заседании секции «Биотехнология» Учёно го совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, прото кол № 2 от 14 мая 2009 г.
Результаты исследований доложены на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 14-18 апреля 2008 г.), IV междуна родной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербурского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2–4 июня 2008 г.), Всероссийской на учно-практической конференции «Современные представления об иммунокор рекции» (Пенза, 2–3 октября 2008 г.), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 6–10 апреля 2009 г.), научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21–22 апреля 2009 г.).
Связь темы исследования с планом научной работы учреждения Диссертационная работа А.Л. Байраковой выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габри чевского Роспотребнадзора. Данное исследование представляет собой раздел темы НИР института «Микроэкология и гуморальный иммунитет слизистых открытых полостей человека в норме и при различных патологических состоя ниях».
Публикации По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 8 – в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации;
7 – в сборниках ма териалов конференций;
один патент на изобретение РФ № 2327995 от 27.06.2008 г.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, гла вы результаты собственных исследований (состоит из четырёх подразделов), обсуждения полученных результатов и выводов. Список литературы включает 184 источника, из которых 102 опубликовано в отечественной и 82 в зарубеж ной литературе. Диссертация иллюстрирована 6 рисунками и 6 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований Клинико-анамнестические и лабораторные данные 228 больных с УГХ позволили отобрать 100 пациенток согласно совпадению положительных ре зультатов лабораторных данных по выявлению маркеров хламидийной инфек ции в УГТ и наличия сходных антител в сыворотке крови. Учитывая, что набо ры для определения IgМ методом ИФА не обладают видовой специфичностью, стадию заболевания (острая или хроническая) и характер инфицирования (пер вичный или повторный) определяли согласно лабораторным данным по содер жанию антител класса А и G в динамике (метод парных образцов). Сбор клини ко-анамнестических данных и лабораторную трактовку результатов анализов проводили совместно с врачами-гинекологами Е.В. Фандеевой, А.В. Леоновой, З.А. Плиевой, к.м.н. Т.А. Скирдой на основании методических пособий для врачей по диагностике и лечению УГХ (Савичева А.М., 2002;
Кудрявцева Л.В., 2001;
Серов В.Н.,1999;
Малышев Н.А., 1999).
Содержание антител (Ат) в сыворотке крови позволило разделить вы бранных пациенток на 4 группы. Группу I составила 41 пациентка. Положи тельные результаты ПИФ, ПЦР и культурального посева подтверждали наличие Ch. trachomatis в УГТ. В сыворотке крови данных больных определялись анти тела класса G в титре 1:50-100. Повторный лабораторный анализ на наличие антител (через 2–3 недели) показал появление иммуноглобулинов класса А (1:50 и выше), что свидетельствовало о первичном инфицировании больных (Савичева А.М., 2002;
Кудрявцева Л.В., 2001). Определяемые антитела позво лили выявить острую стадию инфекционного заболевания. Пациентки также отрицали наличие ранее перенесенного хламидиоза. Группу II составляли пациенток, в клиническом материале которых также обнаруживались маркеры хламидий. В сыворотке крови данных больных определялись стойкие титры иммуноглобулинов А (1:100-1:200) и G (1:100-1:200), концентрация которых не изменялась на протяжении длительного периода. Анамнестические данные по казали, что длительность заболевания составляла от 3 до 5 лет. Положительные результаты РИФ, культурального посева и ПЦР свидетельствовали о лабора торно подтверждённом рецидиве УГХ. Схожесть клинических проявлений и наличие, по крайней мере, двух эпизодов обострения заболевания в течение предшествующих 12 месяцев также свидетельствовало о хроническом течении хламидийной инфекции. Рецидивы отмечались с частотой 1 раз в полгода. Все больные неоднократно получали антибактериальную терапию, однако не на блюдалось стойкого клинического и бактериологического положительного эф фекта. В группу III вошли 30 пациенток, в анамнезе которых ранее диагности ровался урогенитальный хламидиоз. Отсутствие антител класса А и низкие, не меняющиеся во времени титры IgG (1:50), указывали на давно перенесенную хламидийную инфекцию. Aт IgG в титре 1:100-200 также свидетельствовало об остаточной серологии, на что указывало снижение титра антител в течение 12 месяцев. Маркёры хламидий в УГТ не выявлялись ни одним из использо ванных методов диагностики в течение одного года. В группу сравнения (IV, контрольная) включили 32 клинически здоровые женщины. Клинико лабораторное обследование подтвердило отсутствие признаков хламидийной инфекций и ИППП, а также наличия гинекологической патологии.
Пациенткам I и II групп после постановки диагноза УГХ назначалась об щепринятая антибактериальная терапия (азитромицин).
Возраст обследованных пациенток варьировал от 20 до 39 лет (средний возраст 28,1±5,6 года). По возрасту, общему соматическому статусу, репродук тивному состоянию, выраженности клинических проявлений, социальному по ложению и уровню образования пациентки всех групп были сопоставимы.
Клинико-лабораторные методы исследования Сбор материала осуществлялся в первую фазу менструального цикла, в среднем на 11–13 день цикла.
Диагноз УГХ устанавливался на основании результатов стандартных клинико-инструментальных методов обследования (Савичева А.М., 2004;
Во робьев А.А., 2004): исследования клинического мазка из Цк, соскобного мате риала световой микроскопией проб с последующей обработкой флуоресцент ными моноклональными Ат к Ch. trachomatis и методом ПЦР, выделения хла мидий на культуре клеток McCoy. Дополнительным критерием служил анализ уровней титров IgG-Ат, IgA-Ат в сыворотке крови методом ИФА (medac Diag nostika Gmbh, Германия). Обследование проводили на первой и третьей неделе после первичного обращения;
повторные исследования проводились спустя один-два месяца после антибактериальной терапии. Критерием излеченности считали отсутствие маркеров Ch. trachomatis в УГТ.
Инфицированность возбудителями инфекции, передаваемых половым пу тём (ИППП): вирусом папилломы человека (ВПЧ), вирусом простого герпеса (ВПГ), цитомегаловирусом (ЦМВ), микоплазмами, уреаплазмами, токсоплаз мами, кандидами – устанавливалась общепринятыми методами ПЦР, а мико плазмами, уреаплазмами – дополнительно иммуноферментным (ИФА) мето дом. Инфицирование ВПГ, ВПЧ и ЦМВ подтверждали дважды.
Микроскопическое исследование мазков со слизистых УГТ Материалам для микроскопического исследования служили уретральные, вагинальные и цервикальные мазки (Приказ МЗ РФ № 415 от 20.08.2003;
При каз МЗ СССР № 936 от 12.07.1985;
Савичева А.М., 2004) с последующей окра ской по Романовскому–Гимзе для характеристики лейкоцитарной реакции и клеточного состава, а другой – по Граму – для характеристики микрофлоры.
Микробиологические исследования Бактериологическое исследование отделяемого цервикального канала, уретры и влагалища проводили общепринятым методами в соответствии с при казом МЗ СССР № 535 (Приложение 1 к приказу МЗ СССР № 535 от 22.04.1985г).
Молекулярно-генетические методы определения экспрессии генов TLR-2 и TLR- Материалом для исследования служили мазки-соскобы со слизистой со ответствующих участков УГТ, содержащие элементы биотопа (эпителиальные клетки, лейкоциты), являющиеся элементами конституциональной рецепторной системы организма (F. Sandor et al., 2005). В день обследования у женщины за бирали мазки-соскобы со слизистых влагалища (Вл), цервикального канала (Цк) и уретры (Ур) с помощью стерильного урогенитального зонда, позволяю щие получить со слизистой слой поверхностных эпителиальных клеток. Со гласно экспериментальным данным количество исследуемого материала при заборе урогенитальным зондом составляло – 0,2 г. Содержимое зондов тща тельно суспендировали в забуференном физиологическом растворе в пробирках типа «Эппендорф» с последующим определением количества всех клеточных элементов с помощью слайд-планшета (Плива-Лахема, Чехия). Конечная кон центрация клеток в образце составляла не более 1105 клеток в мл. Полученный материал суспендировали в растворе EverFresh RNA (ЗАО «Силекс», г. Санкт Петербург) в соотношении объемов суспензии клеток к раствору, равному 1:5.
Уровень экспрессии генов TLR определялся методом ПЦР в режиме реального времени (РВ), совмещенной с обратной транскрипцией с использованием спе цифических праймеров к TLR-2 (TLR2-F1 – CCTTCACTCAGGAGCAGCAAGC;
TLR2 – R1 и TGGAAACGGTGGCACAGGAC) TLR-4 (TLR4-F6 – GAAGGGGTGCCTCCATTTCAGC;
TLR4-R6 – TGCCTGAGCAGGGTCTTCTCCA). Уровни экспрессии мРНК TLR контроли ровали по гену (стандартизировали) GAPDH (GAPDH-F1 – TGCMTCCTGCACCACCAACT;
GAPDH-F2 – YGCCTGCTTCACCACCTTC) за счет сходной экспрессии этого гена среди тканей человеческого репродуктив ного тракта. Из исследуемого материала выделяли тотальную РНК согласно протоколу к наборам для выделения тотальной РНК на магнитных частицах SiO2 – бесфенольное выделение для микроанализа (ЗАО «Силекс», г. Санкт Петербург). Синтез первой цепи кДНК проводили согласно указаниям инструк ции «Набора для синтеза первой цепи кДНК (базовый)» (ЗАО «Силекс», г.
Санкт-Петербург). Амплификацию с последующим определением уровня экс прессии TLR проводили методом ПЦР с детекцией накопления продуктов ре акции в режиме реального времени (Real-Time PCR, USA) с помощью детекти рующего амплификатора АМК-32 («Синтол», Россия) и специфических прай меров к TLR-2 и TLR-4 («Синтол», Россия). Праймеры для последовательно стей к TLR-2, TLR-4 и были подобраны с помощью программы Vector NTI. По следовательности мРНК TLR-2, TLR-4 и GAPDH взяты в GenBank и синтезиро ваны фирмой Синтол (Москва). Количество исследуемых кДНК в образцах рас считывали путем определения пороговых циклов ПЦР РВ на образцах серий ных разведений очищенного ПЦР-продукта в качестве матрицы. Нормализация количества изучаемых транскриптов к общему количеству кДНК в пробе про водилась с помощью отношений TLR2/GAPDH и TLR4/GAPDH. Экспрессию генов TLR оценивали в относительных единицах (ОЕ).
Иммунологические методы исследования Забор ЦС проводили с помощью стерильного урологического зонда. Зонд немедленно погружали в пробирку типа «Эппендорф», содержащую 0,5 мл фи зиологического раствора. К каждому образцу после взвешивания добавляли равное весовое количество физиологического раствора, после чего смесь тща тельно перемешивали в течение 10 минут на шейкере. Образцы хранили при температуре минус 50°С не более трёх месяцев. Определение общего белка проводили согласно инструкции к «Набору по определению общего белка в мо че ФС» («Диакон Диагностика», Москва).
Определение иммуноглобулинов в ЦС женщин Иммунологическое исследование включало определение концентрации в ЦС IgG, IgМ, IgА, sIgА и свободного sc методом РИД (Фримель Х., 1987).
Определение цитокинов в ЦС женщин Содержание в слизи Цк IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF-, TNF-, ГМ-КСФ цитокинов оценивали методом проточной флюориметрии на двух лучевом лазерном автоматизированном анализаторе («Bio-plex Protein As say System», Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 10 Plex (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.
Статистическая обработка полученных данных Математическую обработку полученных данных проводили в рамках па раметрической и непараметрической базовой статистики с использованием критерия Стьюдента, метода 2, коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при rs 0,7 связь считали сильной;
при 0,5rs0,7 связь являлась средней;
при rs 0,5 связь считали слабой;
при rs=0 – линейная связь отсутствует), применяя стандартный пакет статистических программ Microsoft Excel 2007.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Диагностическое и прогностическое значение оценки уровней экс прессии генов TLR-2 и TLR-4 при УГХ.
Учитывая этиопатогенетическую значимость Ch. trachomatis в развитии инфекционного процесса, было проведено исследование тесноты (полноты) связи между уровнями экспрессии генов TLR-2, TLR-4 и степенью выраженно сти воспалительной реакции, в частности – количеством лейкоцитов (рис.1,2,3).
При световой микроскопии мазков из «трех точек»: Цк, Вл и Ур пациентов вы явлено обилие полиморфноядерных лейкоцитов: 42,8±6,2, 18,2±2,1, 32,4±4, лейкоцитов в поле зрения, соответственно. Причем уровень лейкоцитоза в Цк и Ур коррелировал с высоким уровнем TLR-2 – 57,00±9,95 ОЕ и 37,30±7,02 ОЕ, соответственно (r 0,6). Средний уровень экспрессии генов TLR-2 в Цк и Ур пациентов I группы в 7–8 раз превышал показатели II группы. Средняя корре ляционная зависимость (r 0,5) выявлена между уровнем экспрессии TLR-2 и количеством лейкоцитов во Вл: 37,72±2,40 ОЕ при 18,2±2,1 лейкоцитов в поле зрения.
- I группа - II группа - III группа - IV группа лейкоциты в п/зр Ур Цк Вл Примечание: В Цк достоверные различия выявлены между I и IV группами (p 0,001), II, III группами (p 0,01), II и IV (p 0,01);
в Ур – между I и IV группами (p 0,001), II, III груп пами (p 0,01);
Вл – I и III, IV группами (p 0,05).
Рис. 1. Содержание лейкоцитов в цервикальном канале (Цк), уретре (Ур) и вла галище (Вл) женщин с хламидийной инфекцией и женщин из групп сравнения.
В I группе больных выявлена высокая, по сравнению с контролем, экспрессия генов TLR-4, уровни которого в Цк, Ур и Вл составляли 34,80±1,72 ОЕ (корре ляция с лейкоцитами слабая), 16,28±2,82 ОЕ (корреляция с лейкоцитами силь ная) и 16,68±2,36 ОЕ (корреляция с лейкоцитами сильная), соответственно.
У пациенток группы II практически во всех случаях наблюдается сниже ние показателя воспаления – содержания лейкоцитов, по сравнению с группой I (рис.1,2,3). Количество лейкоцитов в Цк, Ур составляло 14,8±1,4 и 6,7±1,4, со ответственно. Средний уровень TLR-2 в Цк и Ур – 5,71±1,07 ОЕ и 3,45±1, ОЕ, соответственно. Воспалительная реакция соответствовала наличию 15,4±4,3 лейкоцитов в поле зрения. Анализ показателей экспрессии TLR-2 во Вл не выявил существенных отличий от показателей других групп: значение экспрессии TLR-2 и лейкоцитов равно 35,3±6,74 ОЕ и 12,5±1,94 клеток в поле зрения, соответственно. Невысокое содержание лейкоцитов (менее 15) в раз личных отделах УГТ пациентов II группы, наблюдавшееся в 87,2% случаев, свидетельствует о том, что при воспалении шейки матки/уретры более чем у половины женщин с хроническим течением хламидиоза наблюдается снижение лейкоцитарной реакции, связанное с низким уровнем экспрессии генов TLR-2:
максимальный уровень данного рецептора не превышал 16,3 ОЕ, и для группы в целом был равен 5,71±1,1 ОЕ. Максимальный уровень экспрессии генов TLR 4 не превышал 14,47 ОЕ;
составлял для Цк, Ур и Вл 8,0±1,1, 2,0±0,83 и 14,37±1,96 ОЕ, соответственно. Выявленные однотипные изменения показате лей уровня экспрессии TLR-2 и TLR-4 в соскобах из Цк и Ур пациенток с хро нической формой хламидиоза указывают на развитие так называемого «фено мена рецепторной депрессии», свидетельствующего о высоком риске хрониза ции процесса и рецидива заболевания после проведенного лечения.
- I группа - II группа - III группа - IV группа ОЕ ОЕ 60 30 0 Ур Цк Вл Ур Цк Вл Примечание: В Цк достоверные различия Примечание: В Цк достоверные различия выявлены между I и II, III и IV группами выявлены между I и II, III и IV группами (p 0,05), II и III, IV группами (p 0,05);
(p 0,05), II и III, IV группами (p 0,05);
в в Ур – между I и II группами (p 0,001), I Ур – между I и II группами (p 0,001), I и и III, IV группами (p 0,01), II и III, IV III, IV группами (p 0,05), II и III, IV груп группами (p 0,05). пами (p 0,05).
Рис. 2. Уровни экспрессии генов Рис. 3. Уровни экспрессии генов TLR-2 в цервикальном канале TLR-4 в цервикальном канале (Цк), (Цк), уретре (Ур) и влагалище уретре (Ур) и влагалище (Вл) жен (Вл) женщин с хламидийной ин- щин с хламидийной инфекцией и фекцией и женщин из групп женщин из групп сравнения.
сравнения.
При оценке уровней экспрессии TLR-2 и лейкоцитарного ответа в раз личных отделах УГТ обследованных III и IV групп (рис.1,2,3) выявлено незна чительное повышение количества лейкоцитов в группе III по сравнению с кон тролем. Содержание лейкоцитов в Цк, Ур и Вл обследованных III группы со ставляло: 8,1±1,8, 5,2±1,9, 8,6±1,7 клеток в поле зрения, в IV группе – 4,0±1,52, 3,3±1,7 и 5,1±2,0, соответственно. Уровни экспрессии TLR-2 в Цк, Ур и Вл об следованных III группы были сопоставимыми с группой IV и составляли для Цк 17,02±2,1 ОЕ и 13,8±1,9 ОЕ, Ур 11,9±1,8 ОЕ и 7,8±1,03 ОЕ, Вл 36,82±3,56 ОЕ и 12,1±1,63 ОЕ, соответственно. В III и IV группах отмечено достоверное двух кратное уменьшение показателей уровня экспрессии TLR-4 в Цк и Ур по срав нению с показателями больных I группы.
У 32 пациенток из группы I, прошедших курс лечения, установлено дос товерное снижение уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в Цк (24,10±2,9ОЕ и 14,86±3,23 ОЕ, соответственно) и Ур (16,4,8±3,4 ОЕ и 11,25±3,64 ОЕ, соответственно) в 2 и более раз по отношению к исходному уровню. У 15,1% пациенток с высоким уровнем TLR-2 в Цк и Ур (62,4±6,7 ОЕ и 35,1±5,2 ОЕ) снижение уровня наблюдалось уже на первой неделе после начала базисной терапии (39,8±4,7 ОЕ и 24,6±3,6 ОЕ). Исследование TLR-4 в Цк и Ур также выявило понижение уровня с 36,8±3,7 ОЕ и 25,1±4,6 ОЕ до 29,8±4,6 и 22,1±2,64 ОЕ, соответственно. Также в Цк, Ур и Вл больных после лечения ко личество лейкоцитов заметно уменьшилось и соответствовало уровню нормы у 90,9% больных. Отрицательные результаты ПЦР, РИФ и культурального мето да, снижение уровня IgG при отсутствии IgА также свидетельствовали об ус пешной терапии и полной эрадикации возбудителя. При этом у женщин без со путствующей инфекционной патологии наблюдалось более быстрое снижение уровней экспрессии TLR-2 и TLR-4, значения которых к окончанию лечения (3–4 недели) соответствовали показателям женщин IV группы. У пациенток с низким уровнем TLR-2 в Цк после лечения отмечено снижение уровня TLR-2 с 18,21±3,63 ОЕ до 8,5±2,1 ОЕ, при этом уровень TLR-4 практически не менялся.
Количество лейкоцитов также уменьшилось с 11,0±2,3 до 8,6±1,4 клеток в поле зрения.
Инфекционные агенты активизируют TLR УГТ, запускающих воспали тельную реакцию. Естественная или приобретённая супрессия генов TLR-2 и TLR-4 обусловливает хроническое течение УГХ. Уровни TLR-2 и TLR-4 могут служить диагностическими критериями УГХ, характеризовать выраженность инфекционного процесса. Выраженность воспалительной реакции обусловлена и активацией экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в эпителии слизистых УГТ, и дополнительной активации TLR-2 и TLR-4 лейкоцитов. Об эрадикации возбу дителя можно судить по изменению уровня TLR-2 и TLR-4.
2. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями микро биоценоза УГТ при УГХ у женщин У 17,1% I группы выявлена хламидийная моноинфекция, а у 82,9% ( пациенток) – в сочетании с другими возбудителями ИППП: уреаплазмами, ми коплазмами, ВПЧ, ВПГ, ЦМВ, трихомонадами и токсоплазмами. У 34,1% ве рифицирована U. urealyticum. Выявлено одновременное доминирование двух биоваров U. urealyticum Parvo и Т-960, что значительно усугубляло течение УГХ. Микоплазмы выявлены у 24,3% пациенток. У 4,8% (2 пациенток) был ди агностирован токсоплазмоз и трихомониаз. У 31,7% установлено наличие ВПЧ низкой онкогенности (типы 6 и 11), и у 9,8% человек ВПЧ с ЦМВ или сразу не сколько типов ВПЧ (16, 18 и 35) с высокой онкогенной способностью (рис. 4, 5, 6). Наличие УПМ установлено в I группе в Цк у 61,0% пациенток (12 родов микроорганизмов), Ур – у 48,8% (7 родов микроорганизмов), во Вл – у 51,2% пациенток (11 родов микроорганизмов). Причем у большинства больных на блюдался сочетанный характер инфицирования возбудителями ИППП и УПМ (2–7-компонентные ассоциации патогенов). Исследования во II группе на на личие возбудителей ИППП и УПМ в Цк выявили у 37,9% больных хламидий ную моноинфекцию, у остальных – сочетанный характер инфицирования раз личными бактериальными агентами (рис. 4, 5, 6). У 20,7% больных выявлена уреаплазма, у 10,3% больных – микоплазма, у 27,5% – ВПЧ. Частота инфици рования ВПГ составляла 3,4%. УПМ в Цк выявлялись у 37,9% больных (6 ро дов микроорганизмов), в Ур- у 62,1% больных (5 родов микроорганизмов) и во Вл – у 48,3%(5 родов микроорганизмов). При микст-инфекциях регистрирова лись 2–5-компонентные ассоциации инфекционных агентов. В III группе у 30,0% женщин из УГТ выделялись УПМ в Цк (5 родов микроорганизмов), из Ур – у 23,3%обследованных (4 рода микроорганизмов), из Вл – у 36,6% жен щин (4 рода микроорганизмов). Из бактериальных патогенов наиболее часто встречалась уреаплазма – у 13,3% человек, при этом у 9,4% пациенток уреа плазмоз встречался как моноинфекция и сочетанное инфицирование уреа микоплазмой у одной пациентки;
ВПЧ определялся у 26,7% больных. Регист рировалось формирование 2–3 компонентных ассоциаций патогенов (рис. 4, 5, 6).
Уреаплазма % Микоплазма ВПЧ ЦМВ ВПГ Трихомониаз Токсоплазмоз I группа II группа Примечание: Монохламидийная инфекция встречалась у 7 (17,1%) пациентов I группы и у (37,9%) пациентов II группы.
Рис. 4. Возбудители ИППП при сочетанной хламидийной инфекции у пациен тов I – II групп. Процент встречаемости.
I группа КОЕ/мл 8, II группа III группа IV группа 4, 3,7 3, 2,5 2, 2,32,5 3 1, 1, % 48,8 62,1 23,3 6,3 51,2 48,3 36,6 9, 61,0 37,9 30,0 6, Ур Цк Вл Примечание: В Цк достоверные различия выявлены между I и III группами (p 0,01), I и IV группами (p 0,001), II и IV группами (p 0,001), III и IV группами (p 0,01);
в Ур – между I и IV группами (p 0,001), II и III группами (p 0,01), II и IV группами (p 0,001);
во Вл – I и III группами (p 0,001), I и IV группами (p 0,001), II и III группами (p 0,01), II и IV группами (p 0,001), III и IV группами (p 0,01).
Рис. 5. Процент выявления и количественное содержание условно-патогенной микрофлоры КОЕ/мл в биотопах женщин с хламидийной инфекцией и женщин из групп сравнения.
В IV группе ни одним из использованных способов (ПЦР, ИФА) не были вы явлены ИППП. УПМ выявлялись (рис. 4, 5, 6) у двух пациенток в Цк (3 рода микроорганизмов), у трех пациенток – в Ур (3 рода микроорганизмов) и Вл ( рода микроорганизмов), соответственно.
По частоте выявляемости УПМ (рис. 5, 6) в Цк достоверные различия выяв лены между I и III группами (2 = 5,470, р 0,01), I и IV группами (2 = 20,800, р 0,001), II и IV группами (2 = 7,310, р 0,001), III и IV (2=4,460, р 0,01), а между I и II, II и III группами различия не достоверны. При этом имела место в I группе средняя корреляционная связь между УПМ и TLR-2 и приближалась к средней между УПМ и TLR-4 и между TLR-2 и TLR-4;
во II группе между УПМ и TLR-2, УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4- слабая корреляционная связь;
в III группе сильная корреляционная связь между УПМ и TLR-2 и приближалась к средней между УПМ и TLR-4, между TLR-2 и TLR-4- слабая корреляционная связь;
в IV группе между УПМ и TLR-2, УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4- слабая корреляционная связь. По частоте выявляемости УПМ в Ур достоверные различия выявлены между I и IV группами (2 = 13,480, р 0,001), II и III груп пами (2 = 6,670, р 0,01), II и IV группами (2 = 19,050, р 0,001), а между группами I и II, I и III, III и IV различия не достоверны. При этом имела место в I группе средняя обратная корреляционная связь между УПМ и TLR-2, между УПМ и TLR-4 и слабая пряма корреляционная связь между TLR-2 и TLR-4;
во II группе между УПМ и TLR-2, УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4 корреляционной связи не выявлено;
в III группе между УПМ и TLR-2, УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4 корреляционной связи не выявлено;
в IV группе между УПМ и TLR-2 средняя корреляционная связь, а между УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4 корре ляционной связи не выявлено. По частоте выявляемости УПМ во Вл досто верные различия выявлены между I и III группами (2 = 13,240, р 0,001), I и IV группами (2 = 27,010, р 0,001), II и III группами (2 = 4,940, р 0,01), II и IV группами (2 = 20,530, р 0,001), III и IV группами (2 = 5,120, р 0,01), а меж ду группами I и II различия не достоверны. В I группе по сравнению с IV груп пой дополнительно выявлена достоверно высокая инфицированность Candida spp (2 = 3,889, р 0,05), Streptococcus spp (-гемолитический) – I и IV группами 2 = 3,913, р 0,05, Enterococcus spp (2 = 20,557, р 0,001), Esherichia coli (2 = 13,550, р 0,001), Klebsiella spp (2 = 8,460, р 0,001), Enterobacter spp (2 = 5,132, р 0,01). При этом имела место в I группе слабая корреляционная связь между УПМ и TLR-2 и средняя между УПМ и TLR-4, между TLR-2 и TLR-4;
во II группе между УПМ и TLR-2 слабая, между УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4 приближалась к средней корреляционной связи;
в III группе средняя корреляционная связь между УПМ и TLR-2 и между УПМ и TLR-4, между TLR-2 и TLR-4- слабая корреляционная связь;
в IV группе между УПМ и TLR 2, между УПМ и TLR-4 – сильная, между TLR-2 и TLR-4 – средняя корреляци онная связь.
Staphylococcus spp % Streptococcus spp Enterococcus spp 440 Candida spp Esherichia spp Klebsiella spp Enterobacter spp 30 Corynebacterium Citrobacter spp Proteus spp Gardnerella Анаэробы Ур Цк Вл Ур Цк Вл Ур Цк Вл Ур Цк Вл I группа II группа III группа IV группа Рис. 6. Процент встречаемости микрофлоры в уретре (Ур), цервикальном кана ле (Цк) и влагалище у пациенток с хламидийной инфекцией и женщин групп сравнения.
По частоте выявляемости УПМ во II группе установлены различия пока зателей инфицированности между Вл и Ур (2 = 4,150 при р 0,01 и 2 = 4, при р 0,01);
в остальных случаях (I и II группа) наблюдалась корреляционная зависимость выявления УПМ между Вл и Цк, Цк и Ур (r s 0,5).
Оценивалась взаимосвязь уровня экспрессии генов TLR и нормофлоры Вл. Обнаружено достоверное снижение (2 = 16,353, р 0,001) количества лак тобацилл в I группе (выявлялись у 56,1% пациента) по сравнению с IV группой (100%) в пристеночной области (интенсивность колонизации 6,5±1,0 lg КОЕ/г и 7,5±1,5 lg КОЕ/г, соответственно), также достоверно различие по сравнению со II (2 = 4,272, р 0,01), с III группами (2 = 6,200, р 0,01). Бифидобактерии не выявлялись (достоверность различий по сравнению с III – 2 = 9,790, р 0,001 и IV – 2 = 17,580, р 0,001 группами, а со II различия не достоверны). У 72,1% обследованных II группы имело место достоверное снижение (2 = 7,880, р 0,01) количества лактобацилл до 6,2±1,0 lg КОЕ/г по сравнению с IV груп пой. Различия с группой III не достоверны. Бифидобактерии выявлялись у двух пациентов (3,5±1,0 lg КОЕ/г;
различия достоверны по сравнению с III – 2 = 7,364, р 0,01 и IV группами 2 = 7,600, р 0,001). Различия с группой III не достоверны. У пациенток III и IV групп во Вл у 87% (7,2±0,6 lg КОЕ/г) и 100% пациентов (7,5±1,5 lg КОЕ/г), соответственно, выявлены лактобациллы.
Различия между III и IV группами не достоверны. У 26,6% обследованных III группы и у 50% пациентов IV группы бифидобактерии выделялись в количест ве 5,2±0,7 lg КОЕ/г и 6,1±0,9 lg КОЕ/г, соответственно;
различия между груп пами не достоверны.
Во Вл корреляционной связи между УПМ и нормофлорой в группах не выявлено. Обратная корреляционная зависимость между УПМ к и лактобацил лами Вл (rs = –0,7) определялась только во II группе. Не установлено корреля ционной зависимости показателей уровней лактобацилл и бифидобактерий (нормофлора) с показателями уровней экспрессии генов TLR.
Пациентов I и II групп разбили на четыре этиологические подгруппы (рис. 7) согласно бактериологическому посеву и лабораторным исследованиям на наличие ИППП. К первой этиологической подгруппе отнесены пациентки, у которых отсутствовали любые ассоцианты (возбудители ИППП, УПМ).
Отсутствие возбудителей ИППП, присутствие как отдельных видов УПМ ( 10 КОЕ/мл), так и наличие их ассоциаций объединило пациентов во вторую этиологическую подгруппу. Третью этиологическую подгруппу представ ляли пациентки, у которых обнаруживались различные возбудители ИППП, но в различных отделах УГТ не определялись УПМ. В четвертую этиологиче скую подгруппу больных включены пациентки, у которых одновременно оп ределялось как наличие возбудителей ИППП, так и УПМ ( 103 КОЕ/мл). У па циенток группы I с четвёртой этиологической подгруппой выявлены наиболее высокие показатели уровней экспрессии генов TLR-2 в Цк и Ур (94,80±6,11 ОЕ и 30,7±4,5 ОЕ, соответственно), что связано с совокупным воздействием УПМ, ИППП и патологического процесса. Достоверно выше при p0,05 чем у боль ных первой этиологической подгруппы (36,3±4,1ОЕ и 28,0±3,9ОЕ, соответст венно).
Ch. trachomatis + ИППП + УПМ Монохламидийная инфекция Ch. trachomatis + ИППП + УПМ 37,94% 13,81% 14,63% 17,10% 24,12% 31,69% 36,58% 24,12% Ch. trachomatis + ИППП Ch. trachomatis + УПМ II группа trachomatis + ИППП Ch.
I группа Рис. 7. Соотношение моно- и микст-инфицирования пациенток с УГХ.
Сочетание пяти возбудителей инфекций (два биовара уреаплазм, мико плазмы и вирусы) и УПМ способствовало максимальной активации экспрессии генов TLR-2 в Цк и Ур в I группе (96,8 ОЕ и 45,6 ОЕ, соответственно). Уровни экспрессии генов TLR-2 в Цк и Ур во второй этиологической подгруппе (67,9±14,2ОЕ и 19,6±4,5ОЕ, соответственно) и в третьей этиологической под группе (51,8±8,3ОЕ и 20,81±3,6ОЕ, соответственно) достоверно не отличались между собой, но были ниже чем в четвёртой этиологической подгруппе. Уров ни экспрессии генов TLR-2 в Цк во второй и в третьей этиологических под группах достоверно превышали таковые первой этиологической подгруппы.
Уровни экспрессии генов TLR-2 в Ур во второй и в третьей этиологических подгруппах достоверно не отличались от соответствующих уровней первой этиологической подгруппы. Уровень экспрессии гена TLR-2 в Цк и Ур у паци ентов II группы с первой этиологической подгруппой составлял 7,2±1,9 ОЕ и 3,5±0,4 ОЕ, соответственно, со второй этиологической подгруппой-13,0±3,0 ОЕ и 6,2±4,3 ОЕ, соответственно, у пациентов третьей этиологической подгруппы 8,6±2,71 ОЕ и 5,9±2,6 ОЕ, соответственно, и у пациентов четвёртой этиологиче ской подгруппы -10,6±4,4 ОЕ и 8,1±6,7 ОЕ, соответственно. Различия показате лей между этиологическими подгруппами были не достоверны. Однако они достоверно различались по этиологическим подгруппам с соответствующими показателями пациенток группы I. Микробиоценоз влагалища не оказывал влияния на экспрессию генов TLR-2. Не выявлено достоверного влияния мик рофлоры в Цк, Ур и Вл на экспрессию генов TLR-4.
Все пациенты были также разделены на группы в зависимости от преоб ладания грамположительных или грамотрицательных микроорганизмов или ко личественного содержания одного из этих патогенов 106 КОЕ/мл во Вл.
Сравнение уровней экспрессии генов TLR-2 в I, II, III и IV группах с качествен ной характеристикой микрофлоры не выявил достоверных отличий с учётом наличия грамположительной или грамотрицательной микрофлоры. Однако ус тановлен более высокий уровень экспрессии TLR-4 при наличии грамотрица тельных микроорганизмов. Экспрессия генов TLR-4 отражает активность вос палительного процесса. Следовательно, различные уровни активации рецепто ров TLR-2 и TLR-4 зависят от качественного состава микробных сообществ, присутствующих на слизистой оболочке УГТ. Активация экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 происходит более выражено в ответ на УПМ и менее выражено при контакте с нормофлорой.
3. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями цитоки нового профиля УГТ при УГХ у женщин Отмечена сильная положительная корреляционная связь уровней экс прессии генов TLR-2, TLR-4 и IL-8 с характером течения и топики заболевания.
Уровни IL-8 в ЦС у больных группы I (3780,16±421,89 пкг/мг белка) достовер но (р 0,01) выше показателей групп III (511,72±195,44 пкг/мг белка), IV(134,04±31,76 пкг/мг белка);
с группой II (2781,62±676,33 пкг/мг белка) раз личия не достоверны. Показатели уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в группе I сильно коррелировали с высоким содержанием цитокина (r = 0,88 и r = 0,82, соответственно). При микст-хламидийной инфекции содержание IL-8 в ЦС составляло 3801,4±322,3 пкг/мг белка. У пациентов с моно хламидийной инфекцией концентрация ИЛ-8 составляла 2981,62±91,06 пкг/мг белка и была достоверно выше показателей группы IV (р 0,01), но ниже по отношению к содержанию ИЛ-8 у больных группы I с микст-хламидийной инфекцией (р 0,05). Показатели уровней IL-8 определялись продолжительностью заболе вания. Наиболее значительное повышение уровня IL-8 в ЦС наблюдалась у па циентов впервые инфицированных, т.е. с ранним сроком заболевания. В группе II выявлено достоверное повышение уровней IL-8 в 3,8 раза по сравнению с та ковыми пациентов группы IV. Показатели уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в группе II сильно коррелировали с содержанием цитокина (r = 0,71 и r = 0,69, соответственно). Не выявлено зависимости содержания IL-8 у пациен тов с микст- или моно- инфекционной формой УГХ. В группах III и IV показа тели уровней IL-8 достоверно не различались. В группе III установлена средняя корреляционная связь между IL-8 и уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR- (r 0,61 и r = 0,52, соответственно) и слабая корреляционная связь в группе IV (r 0,48 и r = 0,35, соответственно). Во II группе выявлена средняя корреля ционная связь между IL-8 Цк и УПМ Цк (r 0,53), IL-8 Цк и УПМ Вл (r 0,67), а в III группе – только между IL-8 Цк и УПМ Вл (r 0,67). Корреляционных связей между IL-8 ЦС и нормофлорой Вл в сравниваемых группах не установ лено. Следовательно, высокие уровни экспрессии TLR-2, TLR-4 и концентра ции ИЛ-8 в секрете Цк у пациентов группы I можно расценивать как выражен ную воспалительную реакцию организма, направленную на предупреждение распространения инфекции за пределы шейки матки.
У пациенток группы I (141,29±10,30 пкг/мг белка) установлено достовер но более высокое содержание TNF- в ЦС, чем в группах II (25,63±7,75 пкг/мг белка), III (7,24±2,13 пкг/мг белка) и IV (2,63±1,30 пкг/мг белка). Регистрирова лась средняя корреляционная связь уровня цитокина с показателями экспрессии генов TLR-2 (r = 0,69) и (r = 0,62). Выявлено, что показатели содержания TNF (163,82±17,13 пкг/мг белка) в ЦС у 9 больных группы I со сроком заболевания до 2 месяцев статистически достоверно (р 0,05) выше средних показателей по группе I в целом, а также показателей группы IV (р 0,01), что также коррели ровало с клиническими проявлениями заболевания и высокими уровнями экс прессии генов TLR-2 (67,40±2,01 ОЕ) и TLR-4 (37,80±0,19 ОЕ). В группе II уро вень TNF- достоверно выше чем в группе III, в 9 раз превышал значения пока зателей в группе IV и обратно коррелировал с низким уровнем экспрессии ге нов TLR-2 и TLR-4 (r = –0,63 и r = –0,58, соответственно). У пациентов групп III и IV отмечались низкие значения TNF- в ЦС, которые достоверно не разли чались между собой. Установлена слабая корреляционная связь между TLR-2, TLR-4 и уровнем TNF- в ЦС пациенток групп III и IV.
У больных группы I (952,1±149,13 пкг/мг белка) выявлены достоверно высокие концентрации IL-6 по сравнению с группами II (154,82±73,20 пкг/мг белка), III (43,28±12,40 пкг/мг белка) и IV (5,31±2,79 пкг/мг белка). Установле на сильная корреляционная связь уровней IL-6 с уровнями экспрессии генов TLR-2 (r = 0,75) и TLR-4 (r = 0,72). У больных группы II показатель уровня IL- в ЦС достоверно выше такового в группе IV и не отличался от такового группы III. Установлена средняя корреляционная связь уровней IL-6 с уровнями экс прессии генов TLR-2 (r = 0,62) и TLR-4 (r = 0,61). В группе III уровень IL-6 был в 8 раз выше, чем в группе IV при практически равном уровне экспрессии генов TLR-2 и TLR-4. В I группе выявлена средняя корреляционная связь между IL- Цк и УПМ Вл (r 0,49), во II группе – между IL-6 Цк и УПМ Цк (r = 0,49). Про слеживается определенная связь уровня продукции IL-6 с воспалительным про цессом.
Показатели концентраций IL-4 ЦС в группе I (24,83±18,44 пкг/мг белка) достоверно выше показателей у пациенток групп III (6,2±1,56 IV пкг/мг белка) и IV (3,98±1,38 пкг/мг белка);
с группой II различия не достоверны. Достовер ной взаимосвязи между содержанием исследуемого цитокина при различных сочетаниях возбудителей с хламидийной инфекцией, с давностью заболевания, с уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 выявлено не было. Не установлено достоверной динамики показателей уровней экспрессии IL-4 в группах II и III по сравнению с группой IV.
У больных группы I наблюдался достоверно повышенный уровень IL- (1515,9±364,8 пкг/мг белка) по сравнению с пациентками групп II (117,64±69, пкг/мг белка), III (24,67±3,81 пкг/мг белка) и IV (2,18±1,69 пкг/мг белка). Пока затели концентрации IL-1 сильно коррелировали с высоким уровнем экспрес сии генов TLR-2 и TLR-4 (r = 0,78 и r = 0,79, соответственно). Установлена за висимость уровня продукции IL-1 от характера острого хламидийного процес са. В группе II в ЦС наблюдалась относительно невысокая концентрация IL- (достоверно отличалась от показателей пациенток групп III и IV, р 0,05), кор релирующая со сниженным уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r = 0, и r = 0,58, соответственно) и обусловливающая хронический, вялотекущий воспалительный процесс. Корреляционных связей между IL-1 Цк и УПМ Цк, IL-1 Цк и УПМ Вл, IL-1 Цк и нормофлорой Вл в сравниваемых группах не установлено. Активирование экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 хламидиями со провождается наработкой IL-1, который усиливает воспалительный ответ, стимулируя продукцию дополнительных цитокинов соседними неинфициро ванными клетками.
Уровни INF- в ЦС (415,66±159,90 пкг/мг белка) у больных группы I ста тистически значимо (р 0,05) отличались от таковых у пациенток групп II (26,69±9,50 пкг/мг белка), III (4,47±1,61 пкг/мг белка) и IV (3,13±1,35 пкг/мг белка). Установлена средняя корреляционная связь уровней INF- с уровнями экспрессии генов TLR-2 (r = 0,52) и TLR-4 (r = 0,48). В группе II уровни INF были достоверно выше таковых в группах III и IV. Определялась средняя кор реляционная связь уровней INF- с показателями экспрессии генов TLR- (r=48) и слабая с TLR-4 (R = 0,32). Содержание INF- в группах III и IV было на низком уровне и статистически не различалось. Низкий уровень INF- у паци ентов группы IV слабо коррелировал с уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR 4. В I группе выявлена корреляционная связь между INF- Цк и УПМ Цк (r = 0,41), между INF- Цк и УПМ Вл (r = 0,57). Корреляционные связи между INF- Цк и лактобациллами Вл установлены во II группе (r = 0,41).
Не выявлено зависимости и связи между уровнями экспрессии IL-9, IL 10, IL-12 и ГМ-КСФ в изучаемых группах с топикой и выраженностью течения хламидийной инфекции.
Качественно-количественные изменения в уровнях цитокинов могут в равной степени определять как характер иммунологических нарушений, так и их клинико-диагностическое значение при различных вариантах течения УГХ.
Снижение уровня одних цитокинов в ЦС и повышение содержания других ци токинов у больных с УГХ может указывать на дисбаланс регуляторных процес сов, ответственных за поддержание оптимального уровня клеточной активно сти. Наличие провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8 и INF-) в ЦС клинически здоровых женщин (без гинекологической патологии и генитальной инфекции) объясняется постоянным контактом с УПМ, поступающей извне, присутствием собственных отмирающих клеток в секрете Цк. Следовательно, цитокины Цк при УГХ определяют выраженность клинических и лабораторных проявлений, а также исход заболевания (излечение, хронизация).
4. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями имму ноглобулинового профиля УГТ при УГХ у женщин.
У больных группы I средние значения экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в эпителии Цк были достоверно выше аналогичных показателей в группах II, III и IV (табл.1). Уровень белка в I группе ЦС характеризовался достоверно высоки ми значениями по сравнению с группами III и IV;
по сравнению с группой II различий не было. Отличий в содержании белка у женщин группы IV и группы III выявлено не было. Иммунологические нарушения проявлялись в виде по вышения относительного количества IgA, IgG, sIgA и sc, появлением IgM и IgA, содержание которых в ЦС у пациентов группы I было достоверно выше показателей в группах III и IV, а содержимое sIgA и sc в группе I было досто верно выше группы II. Совместное обнаружение IgM и IgA не было зарегист рировано ни у одного пациента. Выявлена достоверная слабая корреляционная связь между уровнем общего белка и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 r = 0,3 (р 0,05). Показана достоверная слабая корреляционная зависи мость между уровнем общего белка и sIgA, sc (r = 0,35 и r = 0,39, соответствен но), более высокая между уровнем общего белка и IgG (r = 0,42), средняя – ме жду уровнем IgG и уровнями экспрессии генов TLR-4 (r = 0,49) и не выявлено прямой корреляционной связи между IgG и TLR-2 (r0,10). Средняя корреля ционная зависимость наблюдалась между TLR-2 и sIgA (r = 0,48). Коэффициент корреляции между содержанием в Цк УПМ и уровнями экспрессии генов со ставлял для TLR-2 r = 0,49, а для TLR-4 r0,10, УПМ и белком – r = 0,67, УПМ и IgG – r = 0,30, УПМ и sIgA- r = 0,37, УПМ и sc- r = 0,47. Нарушение микро биоценоза Цк, сопровождалось снижением рН содержимого ЦС до 5,8 (норма 6,4-8,0), выраженным увеличением количества лейкоцитов. Высокие уровни экспрессии TLR-2, TLR-4, содержания лейкоцитов, белка и Ig у пациентов группы I можно расценивать как выраженную местную иммунологическую ре акцию макроорганизма, отражающую остроту инфекционного процесса. В ЦС нарастание уровней IgG связано с местным синтезом и экссудацией, а выявле ние sIgA и sc обусловлено их синтезом in situ.
У пациенток группы II регистрировалось достоверное снижение уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в 2 и 2,5 раза, соответственно, относительно показателей группы I (табл.1), а также они достоверно ниже таковых в группе IV. Уровень белка в ЦС достоверно выше по сравнению с группами I, III и IV.
Уровни лейкоцитов повышены относительно пациентов групп III и IV. Из 29 у 7 пациенток (длительное течение хронического УГХ с вовлечением в патологи ческий процесс верхних отделов УГТ) регистрировался IgA. По сравнению c пациентами группы I также достоверно уменьшено содержание sIgA, sc и лей коцитов (р 0,05). Однако они были достоверно выше, чем в группе IV. Со держание IgG достоверно увеличилось более чем в 1,3 раза по сравнению с группой I. Показатели sIgA и sc сильно коррелировали с уровнями экспрессии генов TLR-2 (r = 0,77) и слабо с TLR-4 (r = 0,29). Выявлена средняя корреляци онная зависимость между содержанием общего белка и IgG (r = 0,51), отсутст вием корреляционной зависимости с sIgA и sc. Установлена сильная корреля ционная зависимость между содержанием IgG и TLR-2 (r = 0,48), IgG и УПМ (r = 0,73), слабая между IgG и TLR-4 (r = 0,32). Высокие уровни белка в ЦС и IgG, наличие повышенной лейкоцитарной реакции в Цк указывают на хрониче ский воспалительный процесс. В ЦС нарастание уровней IgG связано, в основ ном, с местным синтезом и в меньшей степени с экссудацией через слизистую сыворотки крови, а выявление sIgA и sc обусловлено их пониженным местным синтезом. У пациенток группы III уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR- статистически не отличались от показателей группы IV. Уровни IgG, sIgA и sc в ЦС и лейкоцитов в Цк у пациенток группы III достоверно выше таковых груп пы IV (р 0,05). Установлена корреляционная связь между содержанием обще го белка и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r = 0,40), sIgA (r = 0,49).
После излечения от хламидийной инфекции регистрируются остаточные про явления нарушений местного иммунитета со стороны гуморальных факторов (синтезируются местно) и уровней лейкоцитов.
Таблица 1. Уровни иммуноглобулинов у больных с различными формами УГХ и клинически здоровых женщин.
Параметры иммунитета, (M±mx) Обследованные группы Уровень достоверно IV (n=32) Показатели сти различий показа I ( n=41) II (n=29) III (n=30) Практически телей между группа Острый Хрониче- Переболев здоровые, ми, Р 0, УГХ ский УГХ шие УГХ контроль III и IV;
III и III TLR-2 57,00±9,95 5,71±1,07 18,67±2,39 17,02±2, ОЕ TLR-4 34,80±1,72 8,01±1,08 13,50±0,93 13,8±1,9 III;
IIIV Лейкоциты IV I, II и III 42,8±6,2 14,8±1,4 8,1±1,8 4,00±1, УПМ, I III и IV;
IIIII и IV 3,70±1,56 3,80±0,27 1,36±0,37 1,94±0, Lg КОЕ/мл Белок III, III и IV 1,40±0,92 1,67±0,78 0,41±0,33 0,35±0, г на мл пробы IgM* 31,01±4,07 0 0 0 мкг Ig на I III и IV;
IIIII и IV IgG 32,41±4,41 41,81±3,56 11,30±2,47 6,67±1, г белка IgA** 12,50±3,54 17,39±0,83 0 0 IVI, II и III sIgA 36,30±2,63 22,35±2,66 12,60±1,45 5,64±0, IV I, II и III sc 43,19±5,47 29,25±3,39 16,2±2,48 7,23±0, Примечание: УГХ – урогенитальный хламидиоз;
ОЕ- относительные единицы;
УПМ- услов но-патогенные микроорганизмы;
* – IgМ встречался у 4 из 41 пациентов I группы;
** – IgА встречался у 2 из 41 пациента I группы и 7 из 29 пациентов II группы.
При отсутствии УГХ у пациенток группы IV отмечаются низкие значения содержания Ig (табл. 1). Невысокие концентрации IgG в ЦС клинически здоро вых женщин объясняются антигенной стимуляцией поступающими извне мик роорганизмами. Показатели уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 также характеризовались низкими значениями. Установлена корреляционная связь между содержанием общего белка и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR- (r = 0,40), IgG (r = 0,46).
Таким образом, при УГХ в УГТ взаимосвязь рецепторов врождённого иммунитета TLR-2 и TLR-4 (контролируют запуск цитокинового каскада мест ной антиинфекционной резистентности, через который запускаются иммуног лобулиновое звено и воспалительная реакция) с нормофлорой определяет коло низационную резистентность слизистых (рис. 8) и характеризует течение ин фекционного процесса, выраженность клинических и лабораторных проявле ний и исход заболевания (излечение, хронизация), а оценка их уровней носит диагностический и прогностический характер. При выраженной острой или хронической воспалительной реакции в Цк уровень IgG определяется не только местным синтезом, но проникновением IgG из крови за счёт повышения прони цаемости слизистой Цк. Предлагаемый комплексный подход лабораторной ди агностики УГХ позволит в каждом конкретном случае оценить состояние мест ной врождённой антиинфекционной резистентности эпителия слизистых УГТ, конкретизировать причины хронизации инфекционного процесса и обосновы вает применение дополнительных диагностических и прогностических крите риев при УГХ.
Возбудители TLR Цитокины Воспаление Иммуноглобулины Колонизационная Нормофлора резистентность Освобождение от патогена Рис. 8. Взаимодействие факторов, определяющих колонизационную резистентность ВЫВОДЫ 1. Впервые установлено, что оценка уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR- в соскобном материале из цервикального канала и уретры больных урогени тальной хламидийной инфекцией позволяет различить острую и хроническую форму течения хламидиоза, а также выявить начало хронизации инфекционно го процесса.
2. При остром урогенитальном хламидиозе снижение уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 наряду с прямыми методами детекции возбудителя могут кос венно свидетельствовать об эрадикации хламидий.
3. Реакция TLR на условно-патогенную микрофлору и нормофлору определяет цитокиновый и иммуноглобулиновый профили и колонизационную резистент ность слизистых урогенитального тракта.
4. При урогенитальном хламидиозе Toll-подобные рецепторы запускают мест ную воспалительную реакцию, определяют уровни IgG, sIgA и sc.
5. Цитокиновая система опосредует передачу активационных сигналов от TLR на клетки УГТ макроорганизма.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Байракова А.Л. Уровень экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как прогно стический критерий излеченности при урогенитальном хламидиозе / А.Л. Бай ракова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.И. Кафарская, Б.А.
Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, М.С. Афанась ев, Е.А. Егорова // Человек и лекарство: сборник материалов XV Российского национального конгресса.– М., 2008.С.387-388.
2. Гречишникова О.Г. Лабораторная база диагностики хламидиоза / О.Г.
Гречишникова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, В.А. Метель ская, А.Л. Байракова, В.В. Слободенюк, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова // Чело век и лекарство: сборник материалов XV Российского национального конгрес са.– М., 2008.С.430-431.
3. Байракова А.Л. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как показате ли динамики патогенетических изменений при урогенитальном хламидиозе / А.Л. Байракова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.И. Кафар ская, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, М.С.
Афанасьев, Е.А. Егорова // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Материалы четвертой международной конференции. – СПб, 2008. – С.53.
4. Байракова А.Л. Роль и биологическое значение Толл-подобных ре цепторов в антиинфекционной резистентности организма / А.Л. Байрако ва, Е.А. Воропаева, С.С. Е.А. Егорова, В.А. Метельская, О.Г. Гречишнико ва, М.С. Афанасьев, О.В. Рубальский // Вестн. РАМН. – 2008. – № 1. – С.45 54.
5. Караулов А.В. Прогностическая значимость экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 при урогенитальном хламидиозе у женщин / А.В. Караулов, М.С. Афанасьев, А.Л. Байракова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А.
Алешкин, Л.И. Кафарская, А.Н. Шкопоров, Ю.В. Несвижский, С.А. Лева ков. // Российский иммунологический журнал. – 2008. – Т. 2. – № 2-3. – С.178.
6. Алешкин В.А. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как критерий оценки эффективности алгоритмов терапии при хламидиозе / В.А. Алешкин, Е.А. Воропаева, А.В. Караулов, А.Л., Байракова, С.С. Афанасьев, Л.И. Кафар ская, Ю.В. Несвижский, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г. Гречишникова, С.А. Леваков, В.А. Метельская, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, В.В. Слободе нюк, Е.В. Фандеева // Современные представления об иммунокоррекции. Мате риалы Всероссийской научно-практической конференции. – Пенза, 2008. – С.8– 10.
7. Воропаева Е.А. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями микробиоценоза урогенитального тракта при урогениталь ном хламидиозе у женщин / Е.А. Воропаева, А.В. Караулов, А.Л. Байрако ва, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.И. Кафарская, Ю.В. Несвижский, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г. Гречишникова, С.А. Леваков, В.А. Ме тельская, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, В.В. Слободенюк, Е.В. Фандеева // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. – 2008. – № 2. – С.68-76.
8. Афанасьев С.С. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями цитокинового профиля урогенитального тракта при уроге нитальном хламидиозе у женщин / С.С. Афанасьев, А.Л. Байракова, Е.А.
Воропаева, В.А. Алёшкин, А.В. Караулов, Л.И. Кафарская, Ю.В. Несвиж ский, А.П. Топтыгина, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г. Гречишникова, С.А. Леваков, Кострова О.М., В.А. Метельская, М. С. Афанасьев, Е.А. Его рова, В.В. Слободенюк, Е.В. Фандеева // Естественные науки. – 2008. – № (прил. N 25). – С.57-63.
9. Метельская В.А. Современные методы лабораторной диагностики хламидиозов / В.А. Метельская, В.А. Алешкин, В.В. Зверев, О.Г. Гречиш никова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, Ю.В. Несвижский, М.С. Афанась ев, А.Л. Байракова, Е.А. Егорова // Журн. микробиол. – 2008 – № 4. – С.111-117.
10. Байракова А.Л. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как способ оценки формы и прогноза течения урогенитальной хламидийной инфекции у женщин / А.Л. Байракова, О.Г. Гречишникова, В.А. Алешкин, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Метельская, М.С. Афанасьев // Биологическая безопас ность в современном мире. Материалы науч.-практ. конф. СМУиС– Оболенск, 2009. – С.98-100.
11. Гречишникова О.Г. Сравнительная характеристика методов лабора торной диагностики урогенитального хламидиоза у больных в зависимости от остроты клинических проявлений / О.Г. Гречишникова, В.В. Слободенюк, Е.А.
Воропаева, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова // Человек и лекарство: сборник материалов XVI Росс. Нац. конгресса – М, 2009. – С.76.
12. Афанасьев С.С. Молекулярные механизмы индукции врождённо го иммунитета / С.С. Афанасьев, В.А. Алёшкин, А.Л. Байракова, Е.А. Во ропаева, Ю.В. Несвижский, Л.И. Кафарская, Е.А. Егорова, М.С. Афанась ев, В.А. Метельская, О.Г. Гречишникова, А.А. Куракова // Вестник РАМН.
– 2009. – № 4. – С.42-49.
13. Алешкин В.А. Связь уровней мРНК TLR-2 и TLR-4 с изменения ми иммуноглобулинового профиля урогенитального тракта при урогени тальном хламидиозе у женщин /В.А. Алешкин, А.В. Караулов, А.Л. Байра кова, С.С. Афанасьев, Е.А. Воропаева, Л.И. Кафарская, Ю.В. Несвижский, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, М.С. Афанасьев, О.Г. Гречишникова, С.А.
Леваков, В.А. Метельская, Н.С. Матвеевская, Р.Л. Панурина, Е.А. Егоро ва, В.В. Слободенюк, Е.В. Фандеева // Иммунология. – 2009. – Т. 30 – № 3.
– С.165-170.
14. Байракова А.Л. Экспрессия гена TLR-2 как показатель состояния ло кального иммунитета у женщин с урогенитальной хламидийной инфекцией / А.Л. Байракова, С.С. Афанасьев, Е.А. Воропаева, В.А. Алёшкин, Е.В. Фандеева, М.С. Афанасьев, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, В.В. Слободенюк // На учное обеспечение противоэпидемической защиты населения: сборник мате риалов юбилейной Всероссийской науч.-практ. конференции – Нижний Новгород, 2009. – С.172-173.
15. Топтыгина А.П. Особенности индукции местного иммунного от вета у больных урогенитальным хламидиозом / А.П. Топтыгина, С.С.
Афанасьев, А.Л. Байракова, Е.А. Воропаева, В.А. Алёшкин, М.С. Афанась ев, Е.В. Фандеева // Российский иммунологический журнал. – 2009. – Т. (12) – № 2.– С.171-176.
Патент РФ на изобретение Пат. № 2327995 Российская Федерация. Способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза / А.Л. Байракова, В.А. Алешкин, Е.А. Воро паева, С.С.Афанасьев, Л.И. Кафарская, О.М. Кострова, Ю.В. Несвижский, О.В. Рубальский, О.Г.Гречишникова, В.А. Метельская, А.Н. Шкопоров, Б.А. Ефимов, А.А. Куракова, Е.А. Егорова, К.В. Поздняков, М.С. Афанась ев, А.М. Затевалов, Е.В. Хохлова;
заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфе ре защиты прав потребителей и благополучия человека. – № 2007123483;
заявл. 25.06.2007;
опубл. 27.06.2008., Бюл. № 18.-3 с.
Список сокращений Ат – антитела ВПЧ – вирус папилломы человека ВПГ – вирус простого герпеса Вл – влагалище ГМ-КСФ – гранулоцит макрофаг колониестимулирующий фактор ДК – дендритные клетки ИФА – иммуноферментный анализ ИППП – инфекции, передаваемые половым путём ЛПС – липополисахарид НК – нормальные клетки киллеры ПЦР – полимеразная цепная реакция РИД – радиальная иммунодиффузия по Манчини РИФ – реакция прямой иммунофлуоресценции РТ – ретикулярные тельца Ур – уретра УГТ – урогенитальный тракт УГХ – урогенитальный хламидиоз УПМ – условно-патогенная микрофлора Цк – цервикальный канал ЦС – цервикальный секрет ЦМВ – цитомегаловирус ЭТ – элементарные тельца – клеточные рецепторы CD – иммуноглобулин Ig INF- – интерферон альфа – интерферон гамма INF – интерлейкин IL – образраспознающие рецепторы PRR PAMP – консервативные молекулярные структуры – секреторный иммуноглобулин А sIgA – секреторный компонент sc TLR (Toll-like) – Toll-подобные рецепторы TNF- – фактор некроза опухолей альфа Байракова Александра Львовна РОЛЬ КЛЕТОЧНЫХ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В ФОРМИРОВАНИИ КОЛОНИЗАЦИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ УРОГЕНИ ТАЛЬНОГО ТРАКТА ПРИ ХЛАМИДИОЗЕ 03.00.07 – микробиология 14.00.36 – аллергология и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Формат 60х841/16. Бумага офсетная. Ризография. Тираж 100 экз. Заказ Отпечатано в ООО «Литера-Принт» Москва, ул. Прянишникова, д. 19а, стр. Тел./факс: (495) 771-34- www.litera-print.ru E-mail: [email protected]