Временная организация биологических свойств патогенных микроорганизмов
На правах рукописи
Тимохина Татьяна Харитоновна ВРЕМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 03.02.03 – «Микробиология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Оренбург – 2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Фе дерации и в Учреждении Российской академии наук Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН
Научный консультант:
Член–корреспондент РАН, академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, Бухарин Олег Валерьевич доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Оренбургская государственная Чайникова Ирина Николаевна медицинская академия Доктор медицинских наук, профессор Тюменская государственная медицинская Жданова Екатерина Васильевна академия Заслуженный деятель науки РФ и РБ, док тор медицинских наук, профессор Башкирский государственный Габидуллин Зайнулла Гайнулинович медицинский университет
Ведущая организация: ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Фе дерации
Защита состоится « » 2011 г. в _ часов на заседании диссер тационного совета Д. 208.066.03. при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, телефон:
(3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, e-mail: [email protected].
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Росздрава.
Автореферат разослан « » 2011 г., автореферат и текст объ явления размещены на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии в се ти Интернет « » 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д. м. н., профессор Немцева Наталия Вячеславовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы На современном этапе уделяется большое внимание изучению законо мерностей осуществления процессов жизнедеятельности различных орга низмов во времени, что является таким же неотъемлемым свойством живой системы, как и их пространственное строение. Временная организация био логической системы определяется как совокупность упорядоченных измене ний во времени, в том числе в виде биологических ритмов, ее структур и функций, иерархически взаимодействующих и согласованных между собой и с колебаниями условий внешней среды. Поэтому жизнедеятельность орга низмов, функционирование органов и систем, обмен веществ, энергии и ин формации в живых системах подчиняется закону биологической структурно функциональной временной дискретности (Агаджанян Н.А. с соавт, 1998;
Комаров Ф.И. с соавт., 2000;
Романов Ю.А., 2000, 2002;
Halberg F., 1994, 2006).
Существование эндогенных циркадианных ритмов, наряду со стабиль но выявляемыми ультрадианными циклическими процессами на всех уров нях организации эукариот не вызывает сомнений (Aschoff J., 1960;
Dunlap J.C., 1999). Очевидно, что ультрадианные и инфрадианные составляющие яв ляются неотъемлемыми в структуре биологических ритмов прокариот. Одна ко результаты исследований ритмических процессов у бактерий остаются единичными, несистематизированными, противоречивыми и требуют более тщательного изучения (Романов Ю.А.,1980;
Загускин С.Л., 2006;
Young M.W., Kay S.A., 2001;
Johnson C.H., 2004;
Min H. et. al., 2005;
Soriano M.I. et.
al., 2010).
В изучении и формировании представлений о пространственно временной организации используют системный подход, позволяющий дать интегративную оценку ритмической структуры организма и выявить меха низмы ее регуляции (Губин Г.Д., 2000;
Романов Ю.А., 2002).
Оптимальный уровень функционирования любой живой системы обу словлен реализацией периодической программы, обеспечивающей необхо димую последовательность физиологических, метаболических и биохимиче ских процессов и оптимальное соотношение ее параметров в каждый момент времени (Aschoff J., 1984). С этой точки зрения хронобиологический подход выступает одновременно и как методологический принцип и как методи ческий прием (Губин Г.Д. с соавт. 2000).
К сожалению, отсутствуют сведения по суточной динамике важнейших физиологических характеристик патогенных свойств прокариот, включая госпитальные и музейные штаммы. Не изучен спектр чувствительности гос питальных изолятов к антимикробным препаратам с учетом индивидуаль ных особенностей их суточной динамики, что могло бы иметь значение для клинической практики. Открытым остается вопрос относительно изменений хроноструктуры физиологической активности биологических характеристик патогенных и условно-патогенных микроорганизмов под действием экзоме таболитов ассоциативной микрофлоры. Не определена пространственно временная организация проявлений биологических свойств патогенов на по пуляционном уровне, что имеет важное значение для понимания механизмов адаптации микроорганизмов. Вышепоставленные вопросы требуют своего разрешения.
Цель и задачи исследования Цель исследования - изучение особенностей временной организации биологических свойств патогенных микроорганизмов и ее изменений под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие за дачи:
Изучить суточную динамику пролиферативной, протеазной, ка 1.
талазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей и ан тилизоцимной активности госпитальных изолятов S. aureus, P. aeruginosa, E.
coli.
Исследовать чувствительность госпитальных изолятов S. aureus, 2.
P. aeruginosa к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных осо бенностей их суточной динамики.
Изучить изменения хроноинфраструктуры физиологической ак 3.
тивности биологических свойств госпитальных изолятов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa под действием экзометаболитов микробов-ассоциантов и антибиотиков в разное время суток.
Охарактеризовать на популяционном уровне фазово 4.
амплитудную стабильность изучаемых показателей у госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa для определения их про странственно-временной организации.
Новизна исследования Впервые проведены многофакторные исследования и представлен ком плексный анализ особенностей хроноинфраструктуры биологических свойств популяций патогенных и условно-патогенных - госпитальных изоля тов и музейных штаммов S. aureus, E. coli и P. aeruginosa в спектре ритмов высокой и средней частоты.
Применен метод косинор-анализа, адаптированный к микробиологиче ским исследованиям, позволяющий выявить спектральный состав ритмов в популяциях изучаемых прокариот и сформировать представление о времен ной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов микроорга низмов (свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932 от 10.09.2009, Бюл. № 4), что отражает стратегию рас пределения патогенных ресурсов микробной популяции во времени.
Доказано наличие как ультрадианных гармоник, так и циркадианных составляющих ритмов биологических свойств патогенных прокариот. У гос питальных изолятов S. aureus, E. coli и P. aeruginosa обнаружены в основном ультрадианные ритмы пролиферативной активности и факторов патогенно сти. Полученные результаты, расширяя теоретические представления о раз личных периодах физиологической активности биологических свойств пато генов в течение суток, позволили разработать способ дифференциации гос питальных изолятов S. aureus (патент РФ на изобретение № 2285258 от 10.10.2006 г., Бюл. № 28) и C. albicans (патент РФ на изобретение № от 20.03.2008, Бюл. № 8) от музейных штаммов.
Обнаружена суточная динамика чувствительности к антимикробным препаратам на модели музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus и P. aeruginosa. Выявлены периоды резистентности к антибиотикам у музей ных (антибиотикочувствительных) штаммов и периоды чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток.
Выявлено модулирующее влияние антимикробных препаратов на су точную динамику пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli и P. aeruginosa (патент РФ на изобрете ние № 2285257 от 10.10.2006, Бюл. № 28). Изменение хроноинфраструктуры их ритмов - свидетельство адаптационных возможностей микроорганизмов к изменяющимся условиям путем координации и регуляции собственных рит мометрических параметров и синхронизации их с внешними циклами.
Экспериментально продемонстрировано влияние экзометаболитов микробов-ассоциантов на суточную динамику показателей физиологической активности патогенов, обусловливающее десинхронизацию их ритмов.
Предложенный методический подход к изучению биологических свойств может быть использован в работе научно-исследовательских и прак тических лабораторий (акт внедрения № 03.1/3068 от 22.12.2010), а также ис пользован в учебно-педагогическом процессе кафедр микробиологии и био логии (акты внедрения результатов диссертационной работы № 03.1/2842 от 16.11.2010 г;
№ 03.1/2884 от 22.11.2010).
Научно-практическая значимость Хронобиологические исследования определили новый методический подход к изучению временной организации проявления биологических свойств, как на уровне популяции, так и на уровне ассоциативных взаимоот ношений прокариот. Выявленные биоритмы пролиферативной, протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, пленкообразующей и анти лизоцимной активности S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, их лабильность под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов, последовательность и синхронность проявления в суточной ди намике расширяют теоретические представления о биологии патогенных прокариот, их способности к адаптации в изменяющихся условиях среды.
Совокупность полученных данных о циркадианных и ультрадианных ритмах биологических свойств возбудителей позволяет обосновать положе ние о временной организации изучаемых патогенов и может быть использо вано не только при определении различных биологических функций микро организмов, но и при обосновании их адаптивных реакций. Временная орга низация биологических свойств возбудителей инфекций, представляющая совокупность упорядоченных во времени изменений биоритмов, взаимодей ствующих и согласованных между собой под воздействием биотических и абиотических факторов, отражает адаптационные возможности патогенов и служит методическим ключом к изучению механизмов их регуляции.
Практическое значение исследований определяется разработкой хро нобиологического метода изучения пролиферативной активности S. aureus и C. albicans, позволяющего дифференцировать госпитальные изоляты микро организмов на основе сравнительного анализа суточной динамики данного показателя возбудителей. Хронобиологические исследования позволили вы явить различные периоды активности S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, C. albi cans и их чувствительность к антибиотикам в течение суток, что представля ет интерес для разработки подходов антимикробных мероприятий.
Положения, выносимые на защиту:
Физиологические функции госпитальных изолятов и музейных 1.
штаммов имеют ультрадианную и циркадианную ритмичность, модифици рующуюся под действием биотических и абиотических факторов среды.
Амплитудно-фазовая оценка суточных ритмов биологических 2.
функций госпитальных изолятов и музейных штаммов – объективная инди видуальная характеристика патогенов.
Временная организация биологических свойств возбудителей 3.
госпитальных инфекций, представляющая совокупность упорядоченных из менений во времени биологических ритмов, взаимодействующих и согласо ванных между собой, как и изменения их спектрального состава под воздей ствием ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов – отраже ние адаптационных возможностей патогенов и методический ключ изучения механизмов их регуляции.
Использование метода косинор-анализа в изучении хронобиоло 4.
гической организации патогенов раскрывает стратегию распределения пато генных ресурсов микробной популяции во времени.
Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на: V Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006);
пятом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва 2007);
науч ной сессии, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН «Медицинская академическая наука – здоровью населения Урала» (Челябинск, 2008);
Всероссийской научно-практической конференции по ме дицинской микологии (Санкт-Петербург, 2008);
совместном заседании Бюро отделения профилактической медицины Российской академии медицинских наук и президиума Южно-Уральского научного центра РАМН «Профилакти ка профессиональных, экологически обусловленных и инфекционных забо леваний в Южно-Уральском регионе» (Челябинск, 2009);
заседании Тюмен ского филиала Всероссийского научно-практического общества эпидемиоло гов, микробиологов, паразитологов (ВНПОЭМП), Тюмень, 2009;
на XVIII Международной научной конференции «Циклы природы и общества» (Став рополь, 2010).
Публикации По теме диссертации опубликовано 38 научных работ, из них 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Получено 4 патента на изобретения и свидетельство на программу для ЭВМ.
Объем и структура диссертационной работы Диссертация изложена на 298 страницах машинописного текста и со держит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий в себя 150 отечественных и 120 зару бежных источников. Иллюстрации представлены 50 таблицами и 72 рисун ками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Для исследования биоритмов пролиферативной активности, факторов патогенности, персистенции и чувствительности бактерий к антибиотикам были использованы 13 моно- и ассоциированных изолятов (S. aureus, E. coli, P. aeruginosa и C. albicans), выделенных из клинического материала раневого отделяемого пациентов ожогового отделения, гнойной хирургии/реанимации ГЛПУ ТО ОКБ г. Тюмени и 7 музейных штаммов (S. aureus, E. coli, P. aerugi nosa и C. albicans), полученных из американской коллекции типовых культур (АТСС) и государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича. Выделение и идентифи кацию возбудителей проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических свойств в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 г. Изоляты S. au reus, E. coli и P. aeruginosa, выделенные из клинического материала, обладали множественной лекарственной устойчивостью.
Биоритмы пролиферативной активности S. aureus, E. coli и P. aeruginosa изучали многократно по разработанной нами методике проведения биорит мологического эксперимента и обработке данных, учитывающих особенно сти работы с микроорганизмами. Пролиферативная активность оценивалась по общему микробному числу (ОМЧ). Для исследований были получены 12 часовые культуры, что соответствовало началу стационарной фазы развития бактерий. Исследования проводили в течение суток с 3-часовым интервалом, начиная с 08.00 часов (патент РФ на изобретение «Способ диагностики гос питальных штаммов» № 2285258 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).
У микроорганизмов были изучены биологические свойства, включаю щие плазмокоагулазную (Меньшиков В.В., 2003), протеазную (Нетрусов А.И., 2005), каталазную (Бухарин О.В. с соавт., 2000), гемолитическую (Бу харин О.В. с соавт., 2006), антилизоцимную -АЛА (Бухарин О.В. с соавт., 1999), биопленкообразующую – БПО (O`Toole G., 2000) активности, а также изучали чувствительность к антибиотикам исследуемых культур с использо ванием тест систем MicroScan “Pos Combo Type 41” («Dade Behring»,USA) на бактериологическом анализаторе «Autoscan» («Baxter», USA).
Влияние антибиотиков на биоритмы пролиферативной активности изу чаемых микроорганизмов определяли, по стандартной методике серийных разведений, используя МПК препаратов (Меньшиков В.В., 2003;
Кирил лов Д.А., 2004).
Исследование биологических свойств изучаемых микроорганизмов в условиях межмикробных взаимодействий проводили при добавлении сте рильных супернатантов микробов-ассоциантов в питательный бульон (Ела гина Н.Н., 2001;
Перунова Н.Б., 2003).
Результаты исследований получены на основе анализа суточной дина мики биологических свойств госпитальных изолятов и музейных штаммов S.
aureus, E. coli, P. aeruginosa и C. albicans.
Статистическую обработку материалов и графическое изображение ре зультатов осуществляли с использованием программ: Primer of Biostatics Ver sion 4.03 by Stanton A. Glantz 1998, Microsoft Office Excel 2003. Определяли М – среднее арифметическое, – среднеквадратичное отклонение, m – сред няя ошибка среднего арифметического, данные представляли по форме М±m или М±. В случае соответствия сравниваемых выборок нормальному закону распределения (по 2) использовали t – критерий Стьюдента.
При определении регулирующего влияния экзометаболитов микросим бионтов и антимикробных препаратов, а также сравнении музейных и госпи тальных изолятов бактерий достоверность различия сравниваемых выборок определяли непараметрическим методом статистической обработки: крите рий Уилкоксона (W) применяли для связанных выборок, критерий Манна Уитни (Т) – для несвязанных выборок. Анализируемые различия считали достоверными при р0,05. Для установления связи между параметрами ис пользовали корреляционный анализ по Спирмену (метод ранговой корреля ции), относящийся к категории непараметрических, что позволило отказаться от предварительной оценки нормальности распределения сравниваемых при знаков (Гланц С., 1999) Хронодизайн исследований подразумевал получение по каждой оцени ваемой функции 8-ми измерений в сутки с 3-5-ти кратным повторением ус ловий эксперимента. Данные были обработаны по методу наименьших квад ратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности p0, (Nelson W. et al., 1979). Для каждого штамма впоследствии определены ос новные параметры ритмов с периодами Т=8, Т=12 и Т=24 часа: МЕЗОР (M) среднее значение гармонической кривой наилучшей аппроксимации функции (косинусоиды), амплитуда ритма (A) – расстояние от экстремума до МЕЗОРа и акрофаза () – момент времени ожидаемого экстремума функции.
Для оценки амплитудно-фазовых характеристик экспериментальных серий была разработана и применена автоматизированная система «Косинор анализ», адаптированная к микробиологическим исследованиям. С помощью прикладной графической программы «Групповой косинор анализ» построе ны доверительные эллипсы (свидетельство РФ о государственной регистра ции программы для ЭВМ № 2009614932 от 10.09.2009, Бюл. № 4).
Результаты исследований и их обсуждение На первом этапе исследований выявлено, что пролиферативная актив ность госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli, P. aeru ginosa имеет суточную динамику, которая подвержена активной регуляции под воздействием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимик робных препаратов.
Ритмометрический анализ временных параметров пролиферативной активности S. aureus показал, что для госпитальных изолятов S. aureus 2888, 2891 и 2305 характерна ультрадианная ритмичность. В доступном анализу спектре основными достоверными гармониками были ритмы с Т=12 и 8 ча сам, которые различались по своему удельному вкладу и основным парамет рам - амплитудам и фазовому положению в суточном цикле (рис. 1). Для S.
aureus 2305, 2891 характерны 12-часовые периоды ритма пролиферативной активности, вклады которых в спектральном составе равны 44,0% и 17,8%, амплитуды - 31,4±3,9 КОЕ/мл и 25,4±8,9 КОЕ/мл, соответственно, (р0,05).
Рис. 1 - Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности S. aureus Примечание: по оси абсцисс – госпитальные изоляты (2305, 2888, 2891) и музейные штаммы (25923, 209);
по оси ординат – вклад ритмов, %;
* – ритм достоверен (р 0,05) Для S. aureus 2888 достоверным был 8-часовой ритм с вкладом 74,6%, амплитудой 41,8±16,4 КОЕ/мл (р0,05). Выявление ультрадианного ритма с различными гармониками в биологических исследованиях предполагает про явление нескольких акрофаз в течение суток. С учетом этого, акрофазы про лиферативной активности у S. aureus 2891 регистрировались в 08.09 и 20. часов, у S. aureus 2305 – в 09.16 и 21.00 часов, а у S. aureus 2888 – в 05.00;
14.00 и 23.00 часа.
Ритмометрический анализ выявил у музейных штаммов S. aureus и 209-Р ведущий циркадианный ритм (околосуточный) пролиферативной ак тивности с вкладом 56,1% и 38,4%, амплитудой 39,8±5,9 КОЕ/мл и 37,8±7, КОЕ/мл, соответственно, (р0,05). Акрофазы обоих штаммов регистрирова лись около 22.30 часов.
Таким образом, пролиферативная активность музейных штаммов S. aureus имеет достоверные циркадианные ритмы с высокой амплитудой и акрофазой в одно и то же время, что свидетельствует о стабильности их свойств.
У госпитальных изолятов ведущим являлся ультрадианный ритм. По всей видимости, ультрадианные ритмы, как ритмы с высокочастотными гар мониками, для госпитальных изолятов наиболее значимы при адаптации к меняющимся условиям макроорганизма. Преобладание тех или иных гармо ник в хроноинфраструктуре явно выражено и, можно сказать, является типо вым признаком изученных временных рядов пролиферативной активности данных штаммов.
Различия ритмометрических параметров пролиферативной активности музейных и госпитальных штаммов S. aureus, включая вклады циркадиан ных, ультрадианных ритмов и амплитуды, имеют значение для дифферен циации госпитальных изолятов S. aureus (патент РФ на изобретение № 2285258 от 10.10.2006, Бюл. № 28).
При оценке временных параметров пролиферативной активности у госпитальных изолятов E. coli (2898, 2364, 2909, 2336) было определено, что ведущими ритмами являлись ультрадианные, а у музейных штаммов E. сoli (35218 и 25922) - циркадианные. Однако, у госпитального изолята 2898 по мимо ультрадианного ритма (вклад 30,0%) дополнительно регистрировался достоверный циркадианный ритм (вклад 47,1%), а у музейного штамма дополнительно проявился ультрадианный ритм равнозначный по вкладу циркадианному ритму, вклад их составлял 20,8% и 21,8%, соответственно, (рис. 2).
Акрофазы ультрадианных ритмов госпитальных изолятов E. coli реги стрировались в дневной и ночной периоды суток. У музейных штаммов ве дущие циркадианные ритмы пролиферативной активности максимально про являлись в вечернее время суток.
Ритмометрический анализ пролиферативной активности P. aeruginosa выявил у госпитальных изолятов и музейных штаммов ведущий ультрадиан ный ритм (р0,05). Однако, в спектральном составе биоритмов P. aeruginosa 2898, 2345 и 9027 отмечался и достоверный циркадианный ритм (рис. 3).
Ультрадианные ритмы пролиферативной активности госпитальных изолятов P. аeruginosa 2364 и 2345 имели стабильные акрофазы в 11.00 и 23.00 часа, у изолятов P. аeruginosa 2889 и 2898 – в 08.00 и 20.00 часов. У му зейных штаммов P. aeruginosa (27853 и 9027) акрофазы ультрадианных рит мов пролиферативной активности приходилось на 03.00 и 17.00 часов.
Таким образом, интегральная оценка хроноинфраструктуры пролифе ративной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. сoli, P. aeruginosa, позволяет сделать ряд обобщений. У госпиталь ных микроорганизмов ведущим ритмом являлся ультрадианный. По всей ви димости, этот ритм c более высокими гармониками для госпитальных изоля тов имеет важное значение в плане их адаптации к меняющимся условиям биотической и абиотической среды. В то же время, наличие циркадианных ритмов в спектральном составе прокариот одновременно с ультрадианными гармониками также усиливает адаптивные возможности популяции (следует Рис. 2. Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов E. coli.
Примечание: по оси абсцисс - госпитальные изоляты (2898, 2364, 2909, 2336) и музейные штаммы (35218, 25922);
по оси ординат – вклад ритмов, % ;
* – ритм достоверен (р 0,05) Рис. 3 - Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов P. aeruginosa Примечание: по оси абсцисс - госпитальные изоляты (2364, 2889, 2898, 2345) и музейные штаммы (27853, 9027);
по оси ординат – вклад ритмов, %;
* – ритм достоверен (р 0,05) учесть, что для макроорганизма циркадианный ритм – ведущий и является единственным генетически обусловленным в рассматриваемом нами спектральном диапазоне). Вот почему, появление околосуточных ритмов, с одной стороны, может быть обусловлено влиянием макроорганизма, как ос новной среды обитания для S. aureus, E. coli, P. aeruginosa. С другой стороны, обсуждается вопрос о циркадианности в проявлении ряда физиологических функций бактерий и формируется доказательная база, объясняющая наличие у прокариот генов, ответственных за околосуточные ритмы (Павлович Н.В. с соавт., 1991;
Rogers L.A. et. al., 1930;
Dvornyk V. et. al., 2005;
Soriano M.I. et.
al., 2010).
Вместе с тем, выявлено, что микроорганизмы, выделенные в ассоциа циях из ожоговой раны, проявляли сходные биологические ритмы. Так, для E. coli 2364 и P. aeruginosa 2364 были характерны 12-часовые ритмы проли феративной активности с акрофазами в 11.00 и 23.00 часа. Для E. coli 2898 и P. aeruginosa 2898 характерны как 12-, так 24-часовые ритмы (р0,05) и сов падение акрофаз. Вероятно, микроорганизмы одного биотопа подвержены одинаковым воздействиям со стороны окружающей среды (макроорганизма, ассоциативной микробиоты, абиотических факторов и др.), что и объясняет сходство их хронобиологических характеристик.
Для подтверждения вышесказанного, нами было изучено влияние мик робных экзометаболитов на ритмические процессы физиологической актив ности биологических свойств возбудителей в бактериально - грибковых ас социациях (рис. 4, 5).
Экспериментально доказано, что на хроноинфраструктуру пролифера тивной активности S. aureus 2888 оказывали влияние метаболиты P.
аeruginosa и E. сoli, которые достоверно снижали мезор (W=30,0;
р 0,05), амплитуду, но не изменяли акрофазу. Вклад ультрадианного 12-часового ритма уменьшился в 3,9 раза, но увеличилась доля высокочастотных ультра дианных 8-часовых гармоник.
На пролиферативную активность E. сoli 2364 более активное воздейст вие оказывали экзометаболиты S. aureus и P. аeruginosa. В результате этого нивелировался циркадианный ритм и появилась дополнительная гармоника 8-часового ультрадианного ритма (вклады ритма 34,3%, 29,9%). Мезор и ам плитуда не изменялись по сравнению с контролем (W=6,0;
р0,05), однако акрофаза смещалась с 10.00 на 05.00 часов.
Экзометаболиты S. aureus, E. coli, C. аlbicans стимулировали появление достоверного циркадианного ритма пролиферативной активности P.
аeruginosa 2364 (р0,05), акрофаза изучаемого показателя смещалась с 01. часа на 11.00 часов, мезор и амплитуда достоверных различий не дали (W= 10,0;
р 0,05).
Таким образом, результаты исследования позволили выявить, что у S.
aureus, E. coli, P. aeruginosa сохранялись ультрадианные ритмы пролифера тивной активности под воздействием экзометаболитов микробов ассоциантов, но дополнительно появлялись циркадианные ритмы изучаемого показателя. Появление дополнительных гармоник, на наш взгляд, способст вует усилению адаптивных возможностей популяции.
S. aureus 2888 E. coli 1 – контроль 1 – контроль 2 – под действием экзометаболитов E. coli 2 – под действием экзометаболитов S. aureus 3 – под действием экзометаболитов P. aeruginosa 3 – под действием экзометаболитов P. aeruginosa 4 – под действием экзометаболитов C. albicans 4 – под действием экзометаболитов C. albicans P. aeruginosa 1 – контроль;
2 – под действием экзометаболитов S. aureus;
3 – под действием экзометаболитов E. coli;
4 – под действием экзометаболитов C. albicans Рис. 4 – Амплитудно-фазовая характеристика стабильности суточных ритмов пролиферативной активности возбудителей под воздействием экзометаболи тов микробов-ассоциантов.
Примечание: местоположения доверительных эллипсов (контуры которых отграничивают область двухмерного пространства – амплитуд и фаз) отра жают временную область проявления ультрадианного ритма по результатам популяционного косинор-анализа. По окружности - время суток, градусная мера суточного цикла, 24 часа = 360°. По радиусу от центра – единицы изме рения амплитуды - КОЕ/мл Рис. 5 - Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности S. aureus (А), E. coli (Б), P. aeruginosa (В) под влиянием экзометаболитов мик робов-ассоциантов.
Примечание: по оси абсцисс- возбудитель;
по оси ординат- вклад ритмов, % -циркадианный ритм;
-ультрадианный 12- часовой ритм;
- ультрадианный 8- часовой ритм;
* - ритм достоверен (p0.05).
Выявленный эффект изменения хроноинфраструктуры пролифератив ной активности прокариот бактериально-грибковыми метаболитами отражает напряженность биологической системы, которая, по всей видимости, неиз бежна в процессе формирования межмикробных взаимоотношений.
Учитывая, что при взаимодействии микроорганизмов с различными стрессовыми факторами возможны изменения численности популяции, стрессоустойчивости, факторов патогенности (Красильников А.П., 1994;
Су зина Н.Е., 2001;
Эль-Регистан Г.И., 2001;
Ильинская О.Н., 2002;
Бухарин О.В.
с соавт., 2002;
Иванова Е.Б., 2004), мы предприняли попытку изучить влия ние антимикробных препаратов на биоритмы пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus и P. aeruginosa.
Под воздействием суббактериостатических концентраций гентамицина у музейного штамма S. aureus (гентамицинчувствительный) изменились ритмометрические параметры пролиферативной активности: уменьшился вклад циркадианного ритма (в 2,5 раза), появился ультрадианный ритм с ак рофазой в 14.00 часов (вклад 16,1%), снизились мезор (в 8 раз) и амплитуда (в 5 раз), т.е. наблюдалась десинхронизация. Изменения биоритмов пролифе ративной активности музейного штамма S. aureus свидетельствуют о сниже нии адаптационных возможностей микроба и, возможно, о необратимых из менениях, в дальнейшем приводящих культуру к гибели.
У госпитального изолята S. aureus (гентамицинрезистентного) достовер ных изменений при таком же режиме воздействия гентамицином не выявле но (р0,05). Отсутствие изменений может быть использовано для дифферен циации госпитальных изолятов от музейных штаммов (Патент РФ на изобре тение № 2285257 от 10.10.2006, Бюл. № 28).
Под действием суббактериостатических концентраций ванкомицина на пролиферативную активность S. aureus (все штаммы ванкомицинчувстви тельные) было установлено изменение ритмометрических показателей, как у музейного штамма, так и у госпитального изолята (W = -34;
-30, соответст венно, р0,05). Увеличивалось среднесуточное значение пролиферативной активности почти в 3 раза (с 107,0±3,2 КОЕ/мл до 298,5±7,4 КОЕ/мл и с 126,4±2,3 КОЕ/мл до 354,5±3,8 КОЕ/мл, соответственно). У музейного штамма появлялся ультрадианный ритм, акрофаза пролиферативной актив ности музейного штамма смещалась с ночного периода на утро, у госпиталь ного изолята акрофаза роста отмечалась в 14.00 и 20.00 часов, в отличие от контроля с максимумами в 5.00;
14.00 и 23.00 часа. У обоих штаммов отме чено сильное увеличение амплитуды циркадианного ритма (у музейного - с 26,6 КОЕ/мл до 87,6 КОЕ/мл;
у госпитального - с 14,2 КОЕ/мл до 130, КОЕ/мл), что свидетельствовало о значительном адаптивном напряжении по сле стрессового воздействия ванкомицина.
У музейного штамма и госпитального изолята P. aeruginosa также было выявлено изменение ритмометрических показателей пролиферативной ак тивности под влиянием суббактериостатических концентраций ципрофлок сацина (W =28,0 и 36,0, соответственно;
р0,05). Уменьшилось среднесуточ ное значение показателя у музейного штамма по сравнению с контролем в раза (с 143,4±4,7 КОЕ/мл до 45,9±9,1 КОЕ/мл) и у госпитального - в 7 раз (с 211,9±14,2 КОЕ/мл до 30,6±1,7 КОЕ/мл). Амплитуды ритмов под воздействи ем антибиотика изменялись значительно. У музейного штамма появился до полнительно циркадианный ритм пролиферативной активности (вклад – 46,0%) и акрофаза сместилась с 02.00 часов на 11.00 часов. У госпитального изолята произошло нивелирование ультрадианного ритма, но увеличился вклад циркадианного ритма на 28% и акрофаза сместилась с 14.08 часов на 17.52 часов. Изменения, зарегистрированные у обоих штаммов P. aeruginosa под воздействием ципрофлоксацина также свидетельствовали об адаптивном напряжении, что, в конечном итоге, может приводить к десинхронозу и гибе ли патогенов. Вышеизложенные результаты свидетельствуют об эффектив ности воздействия на антибиотикочувствительные штаммы патогенов суб бактеристатических концентраций антибиотиков, что может быть рассмотре но как один из подходов рациональной антимикробной терапии.
На следующем этапе работы была изучена суточная динамика функцио нальных показателей, отражающих патогенные свойства S. aureus, P. aerugi nosa и E. coli (плазмокоагулазная, протеазная, каталазная, гемолитическая ак тивность) и влияние на нее экзометаболитов ассоциативной микробиоты.
В результате проведенных исследований обнаружено, что музейные штаммы S. aureus 25923 и 209-Р характеризовались достоверным циркадиан ным ритмом плазмокоагулазной активности с акрофазой в 11.00 часов, ми нимальная активность наблюдалась в вечерние и ночные часы -17.00 и 23. часа. У госпитальных изолятов, напротив, отмечался ультрадианный ритм с акрофазами в 02.00 и 14.00 часов.
У музейного штамма S. aureus 25923 обнаружены циркадианные и ульт радианные ритмы протеазной, каталазной и гемолитической активности с ак рофазами, соответственно, в 05.00;
11.00 и 23.00 часа. Максимальная актив ность изучаемых патогенных факторов равнялась 4,1±0,2 мг/минмл;
6,2±0, мкмоль/мин и 20,1±0,2%, соответственно.
Госпитальный штамм S. aureus 2888 проявлял протеазную активность в циркадианном ритме, максимальные показатели фермента (0,74± 0, мг/минмл) регистрировали в 21.30 час (рис. 6).
Среднесуточное значение показателя равнялось 0,4 ± 0,1 мг/минмл, что было в 6,5 раз ниже среднесуточного значения протеазной активности му зейного штамма (Т= 36,0;
р0,05). Под воздействием экзометаболитов E. coli количество фермента увеличилось в 10 раз (W = -36,0;
р0,05) и в 4 раза – под влиянием экзометаболитов P. aeruginosa (W = - 22,0;
р0,05);
в спек тральном составе появились ультрадианные ритмы.
Активность каталазы S. aureus 2888 проявлялась как в ультрадианных, так и в циркадианных ритмах, максимальные значения фермента (4,48±0, мкмоль/мин) выявляли в 03.52 часа, мезор - 3,1±0,1 мкмоль/мин и не отли чался от показателя музейного штамма (Т=58,0;
р0,05). Под воздействием экзометаболитов P. aeruginosa и C. albicans мезор каталазной активности снизился в 1,7 раза (W = 28,0;
р0,05) и в 2,2 раза (W = 36,0;
р0,05), соответ ственно. Экзометаболиты E. coli сместили акрофазу каталазной активности S.
aureus на 11.00 часов, а экзометаболиты C. albicans – на 20.30 часов.
Протеазная активность Каталазная активность Гемолитическая активность S. aureus E. coli P. aeruginosa Рис. 6 - Амплитудно-фазовая характеристика патогенных свойств госпиталь ных изолятов под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты.
Примечание: 1-контроли;
S. aureus +метаболиты: 2 - E. coli, 3 - P. aeruginosa, 4 - C. albicans;
E. coli+метаболиты: 2 - S. aureus, 3 - P. aeruginosa, 4 - C. albi cans;
P. aeruginosa +метаболиты: 2 - S. aureus, 3 - E. coli, 4 - C. albicans Для гемолитической активности S. aureus 2888 был характерен ведущий ультрадианный ритм с 8-часовым периодом, акрофазы этих ритмов совпада ли с пролиферативной активностью и были зафиксированы около 03.00;
11.00 и 19.00 часов. Среднесуточная активность показателя (4,7±0,6%) в раза ниже по сравнению с гемолитической активностью музейного штамма (Т=96,0;
р0,05). Следует отметить, что хронобиологический подход позво лил выявить динамику гемолитической активности у госпитального изолята S. аureus типированного традиционным бактериологическим методом как негемолитический вариант, что открывает перспективы для выявления не стабильно экспрессируемых биологических свойств атипичных штаммов.
Под влияние метаболитов P. aeruginosa гемолитическая активность S. au reus увеличилась в 2,7 раза (W = - 36,0;
р0,05).
У музейного штамма E. coli 35218 выявлены: циркадианные ритмы про теазной и гемолитической активности с акрофазами в 07.52 и 17.00 часов и среднесуточными значениями – 0,19 ± 0,04 мг/минмл и 10,7±0,3%, соответ ственно. Активность каталазы проявлялась в ультрадианном ритме, мезор 0,7±0,02 мкмоль/мин, акрофаза наблюдалась на 08.04 часов, максимальная активность – 2,32± 0,01 мкмоль/мин.
У госпитального изолята E. coli 2364 активность протеазы проявлялась также в циркадианном ритме с акрофазой в 00.20 часов. Под воздействием экзометаболитов S. aureus и C. albicans циркадианный ритм протеазной ак тивности изменялся на ультрадианный ритм. Акрофаза смещалась на утрен нее и вечернее время.
Ведущий ритм каталазной активности госпитального изолята E. coli – ультрадианный (12-часовой). Среднесуточная активность (2,11±0, мкмоль/мин) в 2,6 раза выше активности музейного штамма, акрофаза реги стрировалась в 10.48 часов. Под воздействием экзометаболитов 12-часовой ритм госпитального изолята сохранялся, но дополнительно формировался более высокочастотный 8-часовой ритм. Среднесуточная активность, ампли туда и акрофаза не изменялись под воздействием бактериальных метаболи тов. Однако, метаболиты C. albicans снижали среднесуточную активность фермента и 1,5 раза (W = 24,0;
р0,05) и способствовали появлению допол нительно циркадианного ритма.
Гемолитическая активность госпитального изолята E. coli без воздейст вия экзометаболитов и под воздействием проявлялась в цирка-, и ультради анном ритмах. Среднесуточный уровень активности гемолизинов (72,1 ± 2,02%) снижался под воздействием экзометаболитов P. aeruginosa на 48,6% (W = 36,0;
р0,05) и на 64% (W = 36,0;
р0,05) под воздействием экзометабо литов C. albicans. Регистрировалось смещение акрофазы гемолитической ак тивности под влиянием всех изучаемых экзометаболитов.
У музейного штамма P. aeruginosa 27853 активность протеазы и катала зы проявлялась в циркадианном ритме с акрофазами в 23.32 и 21.04 час, со среднесуточными значениями ферментов - 0,17±0,03 мг/минмл и 1,64±0, мкмоль/мин. Для гемолитической активности музейного штамма P. aerugino sa характерен ультрадианный ритм с акрофазой в 11.48 часов и среднесуточ ным значением – 5,08 ±0,21%.
У госпитального изолята P. aeruginosa 2364 активность протеазы прояв лялась в циркадианном ритме, как и у S. aureus и E. coli. Среднесуточные по казатели активности фермента находились на уровне 1,16± 0,19 мг/минмл и не отличались от показателей музейных штаммов. Наиболее активное воз действие на суточную динамику протеазы оказывали метаболиты E. coli, ко торые в 2,5 раза повышали ее активность (W = - 36,0;
р0,05). Акрофаза (22.48 часа) не изменялась под воздействием метаболитов. Примечателен факт сходства ритмов активности протеазы P. aeruginosa и E. coli, выделен ных из одного биотопа. Эти возбудители проявляли протеазную активность в едином циркадианном ритме. По всей видимости, согласованность ритмов по этим позициям в условиях пребывания в одном биотопе для них биологиче ски обоснована.
Каталазная активность P. aeruginosa проявлялась в циркадианном ритме, с акрофазой в 07.00 часов. Среднесуточный уровень фермента (4,33 ± 0, мкмоль/мин) в 2,5 раза выше уровня музейного штамма. Под воздействием метаболитов E. coli и C.albicans активность фермента увеличилась в 1,7 раза (W = - 36,0;
р0,05) и в 1,3 раза (W = - 34,0;
р0,05), соответственно, а акро фаза сместилась на ночной период суток. В дополнение к ведущему циркади анному ритму под воздействием метаболитов S. aureus и E. coli появлялись ультрадианные 8-часовые гармоники.
Гемолитическая активность P. aeruginosa проявлялась в циркадианном ритме, вклад которого в спектре ритмов был явно доминирующим (76,3%).
Среднесуточная активность соответствовала 13,58 ± 0,6%. Акрофазу регист рировали в 01.20 час. Под воздействием экзометаболитов E. coli гемолитиче ская активность P. aeruginosa возрастала на 8,1% и на 24,9% - под воздейст вием экзометаболитов C. albicans (W = - 30,0;
р0,05), а также появлялся ультрадианный ритм данного свойства.
Для выявления согласованности различных функций S. aureus, P. aerugi nosa и E. coli, обеспечивающих их приспособление к различным условиям обитания мы провели корреляционный анализ между пролиферативной ак тивностью и патогенными характеристиками. У музейного штамма S. aureus показатели пролиферативной активности положительно коррелировали с ге молитической активностью (r = 0,38;
р0,05), но отрицательно - с каталазной активность (r = - 0,58;
р0,05) и протеазной активностью (r = - 0,60;
р0,05).
Иначе говоря, в период минимальной пролиферативной активности стафило кокков продукция ферментов (протеазы и каталазы) была максимально вы ражена, что может способствовать выживанию патогенов в организме чело века. С увеличением пролиферативной активности максимальных значений достигала продукция повреждающих факторов - гемолизинов. У госпиталь ного изолята S. aureus выявлена положительная корреляция пролифератив ной активности с каталазной активностью (r = 0,57;
р0,05). С протеазной и гемолитической активностью достоверной корреляции нет (r = - 0,07;
р0, и r = - 0,3;
р0,05, соответственно), но в период минимальной пролифератив ной активности наблюдали увеличение продукции протеазы и гемолизинов.
У музейного штамма E. coli обнаружена обратная корреляция показате лей пролиферативной активности с протеолитической активностью (r = - 0,5;
р0,05) и отсутствие связи с каталазной и гемолитической активностью (r = 0,1;
р0,05 и r = - 0,1;
р0,05, соответственно). У госпитального изолята E.
coli выявлена обратная корреляция показателей пролиферативной активности с протеазной и каталазной активностью (r = - 0,4;
р0,05 и r = - 0,6;
р0,05, соответственно) и сильная прямая связь с гемолитической активностью (r = 0,7;
р0,05).
У музейного штамма P. aeruginosa не обнаружена достоверная корреля ция между пролиферативной активностью и факторами патогенности (р0,05). У госпитального изолята выявлена корреляция только с гемолити ческой активностью (r = - 0,4;
р0,05).
Полученные экспериментальные данные подтверждают, что при интен сивном функционировании той или иной системы активность многих других систем снижается: в одной и той же клетке адаптивная интенсификация син теза одних ферментов обязательно сопровождается ингибированием продук ции других. Это означает, что организму свойственна способность экономии материальных и энергетических ресурсов и максимальная концентрация их на главном участке развертывания приспособительной реакции в определен ный временной период (Лукомская К.А., 1987;
Комаров Ф.И., 2000).
Проведенные исследования суточной динамики чувствительности S. aureus к некоторым антибиотикам позволили обнаружить различные МПК (минимальная подавляющая концентрация) антибиотиков в отношении му зейного штамма S. aureus 25923. Максимальная чувствительность к боль шинству изученных антибиотиков (амоксиклав, имипенем, ванкомицин, ген тамицин, рифампицин, тетрациклин, клиндамицин) зарегистрирована в ран нее утреннее время - 05.00 часов и вечернее время – 20.00;
23.00 часа. Были выявлены периоды повышения МПК антибиотиков и приближение этих зна чений к показателям резистентности в утреннее и дневное время – 08.00;
11.00;
14.00 часов.
У госпитального изолята S. aureus 2888 была отмечена динамика чувст вительности только к следующим антибиотикам: линезолид, цефалотин, га тифлоксацин, моксифлоксацин, синерцид. МПК линезолида, цефалотина, выявлена в 02.00 и 05.00 часов, МПК моксифлоксацина наблюдалась в 05.00;
20.00 и 23.00 часа, МПК гатифлоксацина – на всем протяжении суточного ритма, кроме 02.00 и 08.00 часов, МПК синерцида выявлена в 02.00;
05.00 и 23.00 часа. Следовательно, у госпитального изолята, напротив, были отмече ны периоды чувствительности к антибиотикам в течение суток, но только к ванкомицину на всем протяжении суточного периода возбудитель проявлял стабильную чувствительность.
Хронобиологический подход позволил выявить периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов S. au reus и периоды чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистент ных) изолятов в течение суток, что может иметь значение для дальнейших исследований в направлении рационального применения антимикробных препаратов.
Биологические ритмы персистентных свойств S. aureus, E. coli, P. aerugi nosa изучали по их способности формировать биопленки (биопленкообра зующая способность – БПО), проявлять антилизоцимную активность (АЛА), а также изучали влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на су точную динамику этих факторов.
Способность к образованию биопленок S. aureus характеризовалась цир кадианным (вклад ритма - 46,6%, акрофаза - в 17.16 часов) и ультрадианным 8-часовым ритмом (вклад ритма – 46,9%, акрофазы – в 06.00, 14.00 и 23. часов), мезор равнялся 0,33±0,01 ед. OD, амплитуды ритмов были одинаковы (0,08±0,02 ед. OD). Под влиянием экзометаболитов E. coli, P. aeruginosa, C.
albicans сохранился только циркадианный ритм, а экзометаболиты P. aerugi nosa снижали еще и амплитуду в 2 раза. Изменение мезора и акрофазы не от мечалось.
Ведущим ритмом БПО активности E. coli являлся ультрадианный 12 часовой ритм, с акрофазами в 11.00 и 23.00 часа, мезором - 0,28±0,01 ед. OD и амплитудой - 0,05±0,01 ед. OD. Под влиянием экзометаболитов S. aureus, P. aeruginosa, появлялись дополнительно 8-часовые гармоники с акрофа зой в раннее утреннее время (с 04.00 – 05.00 часов).
Ритм БПО активности P. aeruginosa характеризовался ультрадианными 8-часовыми гармониками, мезор равнялся 0,34±0,01ед. OD, амплитуда – 0,03±0,01 ед. OD, акрофаза регистрировалась около 06.00, 14.00 и 23.00 ча сов. Под влиянием экзометаболитов S. aureus, E. coli, C. albicans в спектраль ном составе появился дополнительно стабильный циркадианный ритм с воз растанием амплитуды в 2-3 раза. В то же время экзометаболиты C. albicans нивелировали ультрадианный ритм и достоверно снижали мезор (W = 36,0;
р0,05). Акрофазы изучаемого показателя синхронизированы во времени и проявлялись у циркадианного ритма около 19.00 часов, у ультрадианного – около 06.00, 14.00 и 23.00 часов.
Корреляционный анализ позволил выявить только у P. aeruginosa нали чие отрицательной корреляции между пролиферативной активностью и спо собностью образовывать биопленки (r = - 0,67;
р0,05).
Изучение АЛА показало наличие в спектральном составе всех госпи тальных изолятов циркадианного ритма с акрофазами в утреннее и дневное время. У музейных штаммов наблюдалась гетерогенность ритмов с преобла данием в спектре ультрадианных гармоник и регистрация акрофаз в различ ные периоды суток. Влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на АЛА возбудителей изучали на модели музейных штаммов. Под воздействием экзометаболитов у S. aureus появлялся достоверный циркадианный ритм, но амплитуда не изменялась. Однако под воздействием экзометаболитов P. ae ruginosa и C. albicans акрофаза с ночного периода суток смещалась на утрен нее и дневное время. Мезор показателя увеличивался под влиянием экзоме таболитов E. coli (W = -24,0;
р0,05) и снижался под влиянием экзометаболи тов C. albicans (W = 16,0;
р0,05).
Под влиянием экзометаболитов ультрадианные ритмы АЛА E. сoli изме нялись на циркадианные, акрофазы которых регистрировались в вечернее и ночное время, амплитуда увеличивалась в 2-3 раза, а мезор снижался только при воздействии экзометаболитов C. albicans (W = 26,0;
р0,05).
Для P. aeruginosa была характерна гетерогенность ритмов, однако под влиянием экзометаболитов всех исследуемых штаммов ассоциативных мик роорганизмов ведущим оставался циркадианный ритм, а акрофаза, амплитуда и мезор оставались без изменения (р0,05).
Таким образом, влияние экзометаболитов способствовало появлению у всех музейных штаммов возбудителей 24-часового ритма АЛА, что было свойственно только госпитальным изолятам. По всей видимости, это можно объяснить тем, что лизоцимная активность как один из факторов неспецифи ческой резистентности макроорганизма проявляет циркадианную активность (Матияш И.Н.,1983), а способность микроорганизмов инактивировать лизо цим хозяина сформировалась в результате симбиотических отношений с макроорганизмом (Бухарин О.В.,1999). Из всех изучаемых микроорганизмов только для E. coli характерны изменения ритмометрических параметров АЛА, которые, вероятно, свидетельствовали также о напряжении механизмов адаптации и поиске биосистемой адекватной реакции на изменение условий функционирования.
Для выявления функциональной согласованности пролиферативной и антилизоцимной активности проведен корреляционный анализ, который по казал обратную корреляцию у музейного штамма E. coli (r = - 0,47;
р0,05) и прямую связь этих показателей у госпитального изолята P. aeruginosa (r = 0,44;
р0,05). У остальных возбудителей корреляционная зависимость не вы явлена.
Следовательно, обнаруженные изменения биологических ритмов про лиферативной, протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей, антилизоцимной активности, чувствительности к ан тибиотикам госпитальных изолятов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa под влия нием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препа ратов подтверждают мнение авторов (Агаджанян Н.А., 1998;
Губин Г.Д., 1989;
Смирнов В.М., 2002;
Маркина В.В., Романов Ю.А., 2005), что данный факт отражает адаптационные возможности патогенов, т.к. биологический ритм все время подстраивается к новой среде обитания, чтобы дать организ му максимальную возможность адаптироваться к окружающей среде путем синхронизации его собственных ритмов с внешними циклами.
Состояние временной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa представлено иллюстрацией ампли тудно-фазовой стабильности суточных ритмов биологических свойств возбу дителей (рис. 7).
У музейного штамма S. aureus 25923 в период минимальной пролифера тивной активности – 06.00 – 13.00 часов продукция ферментов (протеазы, ка талазы, плазмокоагулазы) была максимально выражена. Небольшая площадь их эллипсов свидетельствует о значительном постоянстве основных парамет ров ритма. С увеличением пролиферативной активности – 18.30 – 21.30 часов максимальных значений достигала продукция факторов адгезии и вирулент ности – пленкообразующей и гемолитической активности. Показатель АЛА как фактор персистенции - ночного типа с акрофазой около 02.00 часов (с до верительным интервалом от 23.00 до 05.00 часов).
У госпитального изолята S. aureus 2888 зарегистрированы ультрадиан ные ритмы изучаемых показателей в отличие от циркадианных ритмов му зейных штаммов. Учитывая, что у госпитального изолята S. aureus актив ность физиологических функций проявлялась с 12-часовым периодом, можно отметить, что пролиферативная, каталазная, протеазная и плазмокоагулазная активности относятся к ночному и дневному типам активности. АЛА и гемо литическая активность относятся к утреннему и вечернему типам ритмично сти.
Временная организация биологических свойств грамнегативной мик робиоты отличалась от таковой S. aureus. У музейных штаммов E. coli про лиферативная, гемолитическая и каталазная активности синхронизированы между собой и для них характерен дневной тип ритмичности. Их акрофазы отмечены соответственно в 14.30, 15.00 и 16.00 часов. Небольшая площадь эллипсов и относительно узкие доверительные интервалы их акрофаз указы вают на высокую стабильность параметров их циркадианных ритмов.
Акрофаза АЛА была смещена на вечерние часы с максимумом около 20.00 часов. Четкая синхронность АЛА прослеживалась с биопленкообра зующей актив-ностью. Акрофаза показателя протеазной активности имела S. aureus (госпитальный), Т=12 ч. S. aureus (музейный), Т=24 ч.
E. coli (госпитальный), Т=24 ч. E. coli (музейный), Т=24 ч.
P. aeruginosa (госпитальный), Т=24 ч. P. aeruginosa (музейный), Т=24 ч.
Рис. 7 – Сравнительная характеристика амплитудно-фазовой стабильности суточных ритмов биологических свойств возбудителей Примечание: 1 - пролиферация;
2 – протеаза;
3 - каталаза;
4 - гемолиз;
5 АЛА;
6 – биоплнки;
7 – плазмокоагулаза утренний тип ритмичности с максимумом около 08.00 часов и доверитель ным интервалом в пределах ± 90 минут и находилась в полной противофазе к АЛА.
У госпитальных изолятов E. coli показатели пролиферативной и гемоли тической активности сохраняли те же фазовые характеристики, которые при сущи музейному штамму, но стабильность их ритмов несколько слабее, о чем можно судить по большим площадям их доверительных эллипсов. Акрофазы каталазы и протеазы по сравнению с музейными штаммами смещались на ве черние часы, претерпевали фазовую инверсию по отношению друг к другу.
Акрофаза АЛА госпитальных изолятов, напротив, сдвигалась в дневную об ласть - 10.00 часов, тогда как у музейных штаммов пик активности регистри ровался в вечерние часы. При этом в обоих случаях ритмы достаточно ста бильны.
У музейных штаммов P. aeruginosa показатели пролиферативной и гемо литической активности синхронизированы между собой и имеют утренний тип ритмичности, их акрофазы приурочены, соответственно, к 09.00 и 07. часам. Показатели АЛА, биопленкообразующей, каталазной и протеазной ак тивности также были синхронизированы между собой, но имели вечерне ночной тип активности. Их акрофазы отмечались в 20.00 - 23.00 часа.
У госпитальных изолятов P. aeruginosa показатели пролиферативной и гемолитической активности синхронизированы между собой, как и у музей ных штаммов, но акрофазы регистрировались в ночное время (02.00 часа).
Показатели протеазной активности сохраняли те же фазовые характеристики, что присущи музейным штаммам. Существенные различия при сравнитель ном анализе амплитудно-фазовых характеристик госпитальных изолятов и музейных штаммов касаются местоположения акрофаз показателей АЛА и каталазной активности, т.е. произошла смена утреннего типа ритмичности на вечерний.
Анализ амплитудно-фазовой стабильности выявил, что для всех изучае мых вариантов грамнегативной микробиоты, как условно-патогенных микро организмов, характерна синхронизация во времени и пространстве пролифе ративной активности с одним из основных факторов патогенности - гемоли тической активностью. Для них также отмечены значительные временные интервалы отсутствия максимальной активности биологических свойств ме жду временем проявления факторов агрессии и персистенции в суточном диапазоне.
Таким образом, метод косинор-анализа позволил выявить отличия хро ноструктуры биоритмов госпитальных изолятов и музейных штаммов S. au reus, E. coli, P. aeruginosa. Последовательность проявлений биологической активности микроорганизмов в течение суток можно представить в виде сле дующих логических схем (рис. 8, 9, 10).
У музейного варианта S. aureus выявлена четкая последовательность экспрессии факторов адгезии и колонизации, вирулентности и персистенции, тогда как у госпитальных изолятов выявлена иная временная зависимость, которая, возможно, сформировалось под воздействием экзометаболитов мик робов-ассоциантов и макроорганизма в целом.
Выявлено, что временной период проявления максимума пролифератив ной активности и синхронизированного с ней максимума гемолитической ак тивности одинаков, как у госпитальных изолятов, так и музейных штаммов E. coli, P. aeruginosa. Эта особенность отмечается только для грамнегативной микробиоты.
Стабильность акрофазы предопределяет устойчивость ритмического ко лебания во времени, ориентирует направление на разработку эффективных способов микробиологической диагностики и мер антимикробной профилак тики.
Таким образом, анализ амплитудно-фазовых взаимоотношений меж ду изучаемыми показателями выявил определенную последовательность проявления биологических свойств возбудителей и сформировал представле ние о пространственно-временной организации госпитальных изолятов и му зейных штаммов патогенных микроорганизмов.
S. aureus (госпиталь), T=12ч. S. aureus (музей), T=24ч.
Пролиферация ночной тип 00-01.30*-03.00 АЛА Каталаза 23.00-02.00*-05. ночной тип 01.00-02.00*-03. Плазмокоагулаза 01.00-02.00*-03. 01.30ч.
утренний тип Гемолизин 04.30-05.30*-06. АЛА 01.00ч.
05.30-06.00*-06. Каталаза утренне-дневной тип 06.00-09.00*-12. 03.30ч.
Протеаза 11.00-12.00*-13. Протеаза Плазмокоагулаза 10.00-11.00*-12. 09.00-11.00*-13. Пролиферация дневной тип 12.00-13.30*-15. Каталаза 13.00-14.00*-15. Плазмокоагулаза 02.30ч.
13.00-14.00*-15. Биопленка 01.30ч.
15.30-17.30*-19. дневной и вечерний тип вечерний тип Гемолизин Гемолизин 16.30-17.30*-18.30 18.00-19.00*-20. АЛА 17.30-18.00*-18.30 Пролиферация 18.30-20.00*-21. 03.30ч.
ночной тип 01.30ч.
Протеаза 22.00-23.00*-24.00 АЛА Рис. 8 - Временная организация биологических свойств S. aureus Примечание: *- акрофаза показателя E. coli (музей), T=24 ч.
E. coli (госпитальный), T=24 ч.
ночной тип Протеаза 22.30-00.30*-02. 07.00ч.
06.00ч.
дневной тип Протеаза 06.00-08.00*-10. дневной тип АЛА 08.30-10.00*-11. 03.00ч.
01.00ч.
Пролиферация Пролиферация 03.00ч.
13.00-14.30*-16. 12.30-16.00*-19. дневной тип дневной тип Гемолизин 13.30-15.00*-17. Каталаза Гемолизин 14.00-16.00*-18. 15.00-16.00*-17.00 вечерне- ночной тип АЛА 17.00-20.00*-23. вечерне- ночной тип Биопленка Каталаза 21.00-22.00*-23. 19.30-21.30*-23. 01.30ч.
Рис. 9 - Временная организация биологических свойств E. coli Примечание: *- акрофаза показателя P. aeruginosa (госпитальный), Т=24 ч. P. aeruginosa (музей), Т=24 ч.
ночной тип Гемолизин ночной тип 00.30-01.30*-02. Пролиферация 02.00ч.
АЛА 00.00-02.00*-04. 23.00-02.00*-05. 01.30ч.
Гемолизин 03.00-07.00*-11. Каталаза дневной тип 05.30-07.00*-08. утренний тип Пролиферация АЛА 06.00-09.00*-12. 09.00-10.00*-11. 05.00ч.
10.30ч.
АЛА 17.00-20.00*-23. Биопленка 19.00-20.00*-21. вечерний тип Каталаза 20.00-21.00*-22. вечерний тип Протеаза01.30ч.
Протеаза 21.30-22.30*-23. 22.00-23.30*-01. Рис. 10 - Временная организация биологических свойств P. aeruginosa Примечание: *- акрофаза показателя Проведенная работа позволила выделить три основных момента:
- Доказано наличие как циркадианных, так и ультрадианных ритмов биологических свойств у гетерогенных популяций патогенных и условно патогенных прокариот.
- Выявлено модулирующее влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов на ритмические процессы биоло гических свойств патогенных и условно-патогенных прокариот.
- Исследование ритмичности физиологической активности биологиче ских свойств патогенных и условно-патогенных прокариот с применением косинор-анализа позволило составить пространственно-временную характе ристику их последовательности и согласованности.
Выводы:
Доказано наличие в спектральном составе ультрадианных и цир 1.
кадианных ритмов изучаемых биологических свойств у госпитальных изоля тов и музейных штаммов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa.
Присутствие в спектральном составе изучаемых биологических 2.
свойств прокариот циркадианных ритмов одновременно с ультрадианными гармониками имеет важное значение для их адаптации к меняющимся усло виям внешней среды.
Хронобиологический подход позволил выявить периоды рези 3.
стентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов S. aureus и периоды чувствительности у госпитальных (антибио тикорезистентных) изолятов в течение суток.
Изменения хроноструктуры пролиферативной активности прока 4.
риот бактериально-грибковыми метаболитами – показатель межмикробных симбиотических взаимоотношений, отражающих формирование микросим биоценозов.
На основании амплитудно-фазовой характеристики выявлена 5.
стабильность проявления биологических ритмов вирулентных свойств (про теаза, каталаза, гемолитическая активность) патогенных прокариот под влия нием экзометаболитов микробов-ассоциантов, тогда как персистентные свой ства (антилизоцимная и биопленкообразующая активность) проявляли ла бильность в течение суток.
Формирование циркадианного ритма антилизоцимной активно 6.
сти изученных музейных штаммов под влиянием экзометаболитов госпи тальных культур можно рассматривать как результат симбионтных отноше ний патогенов в микросимбиоценозе.
Использование метода косинор-анализа в изучении хронобиоло 7.
гической организации патогенов позволило сформировать представление о временной организации возбудителей (популяций) госпитальных инфекций.
Анализ амплитудно-фазовой стабильности выявил для всех изучаемых вари антов грамнегативной микробиоты синхронизацию во времени и пространст ве пролиферативной активности с гемолитической активностью, а у госпи тальных вариантов грампозитивных микроорганизмов – с плазмокоагулазной активностью.
Отмечены значительные временные интервалы отсутствия мак 8.
симальной активности биологических свойств у грамнегативных патогенов между временем проявления факторов агрессии и персистенции в суточном диапазоне, что отражает перестройку метаболических процессов микробной популяции.
Список работ, опубликованных научных журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Этиология гнойных инфекций в Тюменской области по данным боль ничного стационара/ Т.Х. Тимохина, Р.М. Хохлявина, Л.Б. Козлов, И.В. Ос тапенко и соавт.// Клиническая лабораторная диагностика. – 2003. - №8. – С.
46-49.
2. Биоритмы пролиферативной активности музейных и госпитальных штаммов микроорганизмов/ Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, В.В. Варницы на, Э.А. Кашуба, Д.Г. Губин и соавт. // Журнал микробиологии, эпидемиоло гии и иммунобиологии. – 2007. – №4. - С. 3-5.
3. Суточные биоритмы антибиотикорезистентности, плазмокоагулазной и антилизоцимной активности Staphylococcus aureus/ Н.Б. Перунова, С.Б. Фа деев, Я.И. Паромова, Т.Х. Тимохина, С.Л. Галян, О.В.Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - №3. - С. 6-9.
4. Биоритмы антибиотикорезистентности микроорганизмов/ О.В. Буха рин, Н.Б. Перунова, С.Б. Фадеев, Т.Х. Тимохина и соавт. // Журнал микро биологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2008. - №5. - С. 35-38.
5. Тимохина Т.Х. Динамика в течение суток отдельных факторов пато генности и персистентности Staphylococcus aureus под влиянием экзометабо литов ассоциативной микрофлоры // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. - № 4. - С. 15-18.
6. Биоритмы биологических свойств Staphylococcus aureus как фактор их адаптации при госпитальной инфекции/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.А. Курлович и соавт. // Медицинская наука и образование Урала. - 2009. - № 3. - С. 118-119.
7. Оценка суточной динамики чувствительности к цефтриаксону и меро пенему грамотрицательных возбудителей нозокомиальной хирургической инфекции/ С.Б. Фадеев, Н.Б. Перунова, Т.Х. Тимохина, Я.И. Паромова, О.В.
Бухарин // Медицинская наука и образование Урала. – 2009. - № 3. - С. 16-19.
8. Биологические свойства доминирующих микроорганизмов в отделе ниях хирургического профиля/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, Я.И. Паро мова, А.А. Барадулин // Медицинская наука и образование Урала. - 2010. - № 2. - С. 100-101.
9. Суточная динамика каталазной активности Candida albicans/ Т.Х. Ти мохина, М.В. Николенко, В.В. Леонов, В.В. Варницына // Медицинская нау ка и образование Урала. – 2010. - № 4. – С. 60-62.
10. Суточная динамика темпа роста микроорганизмов в бактериально грибковых ассоциациях/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко // Медицинская наука и образование Урала. – 2010. - № 4. – С. 84-86.
11. Особенности временной организации биологических свойств госпи тальных изолятов и музейных штаммов S.aureus, E. coli, P. aeruginosa/ Т.Х.
Тимохина, Д.Г. Губин// Медицинская наука и образование Урала. – 2011. № 2. – С.
Публикации в других изданиях 12. Хронобиологические особенности Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына//Тезисы докладов научно-практической конференции по медицинской микологии. XI Кашкинские чтения. Санкт Петербург, 2008. Проблемы медицинской микологии. - 2008. – Т.2. – №2. - С.
83.
13. Чувствительность Candida albicans, выделенных из различных био топов, к антимикотическим препаратам/Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына и соавт.// Тезисы докладов научно-практической конферен ции по медицинской микологии. XI Кашкинские чтения. Санкт-Петербург, 2008. Проблемы медицинской микологии. - 2008. – Т.2. – №2. - С. 84.
14. Суточная динамика пролиферативной активности как способ инди кации Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына// Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2009. - №1. – С. 30-31.
15. Влияние экзометаболитов грамотрицательной микрофлоры на фор мирование патогенного потенциала Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В.
Николенко, В.В. Леонов// Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2009. - №1. – С. 31-32.
16. Влияние экзометаболитов на пролиферативную активность Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына, В.В. Леонов// Тезисы докладов научно-практической конференции по медицинской мико логии. XI Кашкинские чтения. Санкт-Петербург, 2009. Проблемы медицин ской микологии.- 2009. – Т.11. – №2. - С. 116.
17. Оценка способности формировать биопленку грибами рода Candida, выделенных из различных источников/ В.В. Леонов, В.В. Варницына, Т.Х.
Тимохина, Я.И. Паромова, М.В. Николенко и соавт.// Тезисы докладов науч но-практической конференции по медицинской микологии. XI Кашкинские чтения. Санкт-Петербург, 2009. Проблемы медицинской микологии.- 2009. – Т.11. – №2. - С. 91.
18. Этиология гнойных инфекций в хирургических стационарах Тюмен ской областной больницы/Т.Х. Тимохина, Р.М. Хохлявина, Л.Б. Козлов и соавт.//Научный вестник Тюменской медицинской академии. Материалы ме ждународного симпозиума. Медицина и охрана здоровья 2002. - Тюмень, 2002. – С. 105.
19. Цикличность пролиферативной активности микроорганизмов в со временных условиях/ Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, В.В. Варницына, Р.М.
Хохлявина и соавт.//Научный вестник Тюменской Государственной меди цинской академии. – 2003. - №5-6. – С. 116-117.
20. Госпитальная инфекция: современные подходы к эпидемиологии, диагностике, лечению, профилактике/ Э.А. Кашуба, Н.А. Курлович, Г.И. Ко зинец, Т.Х. Тимохина и соавт.//Медицинская наука и образование Урала. – 2004. - №3-4. – С. 194.
21. Биоритмы пролиферативной активности микроорганизмов/Т.Х. Ти мохина, В.В. Варницына, Н.А. Курлович, Я.И. Паромова//Материалы меж дународной научной конференции Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на севере. Сургут, 2004. - С. 364-366.
22.Суточная динамика биохимической активности музейных и госпи тальных штаммов микроорганизмов под действием пероксимеда/ Я.И. Паро мова, С.Л. Галян, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович и соавт.//Медицинская наука и образование Урала. – 2005. - №5. – С. 86.
23. Адаптивный потенциал Staphylococcus aureus при госпитальных ин фекциях/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.А. Курлович и соавт.// Медицинская наука и образование Урала. – 2006. - №2. – С. 94-103.
24. Адаптивный потенциал госпитальных штаммов Staphylococcus aureus/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.Б. Перунова и со авт.// Материалы VI всеармейской международной конференции. Инфекции в хирургии мирного и военного времени. – М., 2006. - С. 3.
25. Пролиферативная активность и чувствительность к антимикробным препаратам Pseudomonas aeruginosa/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, В.В. Вар ницына, Я.И. Паромова и соавт.// Итоги и перспективы обеспечения эпиде мического благополучия населения Российской Федерации. IX Съезд ВНПОЭМП. – М., 2007. – Т.2. – С. 242-243.
26. Этиологическая структура и антибиотикорезистентность основных возбудителей гнойно-воспалительных инфекций в хирургических отделениях многопрофильной клиники/ Р.М. Хохлявина, Р.Л. Хохлявин, Т.Х. Тимохина, Э.А. Кашуба и соавт.// Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации. IX Съезд ВНПОЭМП. – М., 2007. – Т.2. – С. 83-84.
27. Хронобиологические особенности адаптивных свойств грибов рода Candida/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына, Н.А. Курлович и соавт.// Материалы V всероссийского конгресса по медицинской микологии.
Успехи медицинской микологии. – М., 2007. – Т.9. – С. 26-27.
28. Суточная динамика антилизоцимной активности грибов рода Candida/ О.В. Бухарин, Т.Х. Тимохина, Н.Б. Перунова, В.В. Варницына и со авт.//Материалы V всероссийского конгресса по медицинской микологии.
Успехи медицинской микологии. – М., 2007. – Т.10. – С. 48-49.
29. Хронобиологическая характеристика чувствительности к оксацилли ну Staphylococcus aureus - возбудителей абсцессов мягких тканей/ Б.С. Фаде ев, Н.Б. Перунова, Т.Х. Тимохина, О.В. Бухарин// Актуальные вопросы про филактики, диагностики и терапии хирургических инфекций. ЦВДО Под московье. – 2007. – С. 139.
30. Особенности биологии грибов рода CANDIDA/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, Н.Б. Перунова и соавт.// Тезисы докладов II съезда по ми кологии. Москва, 2008. Современная микология в России. – 2008. – Т.2. – С.
280-281.
31. Характеристика временной организации штаммов Candida spp., вы деленных из клинического материала/ Н.Б. Перунова, М.В. Николенко, В.В.
Варницына, М.В. Янина, Т.Х. Тимохина// Медицинская наука и образование Урала. – 2008. - №2/52. – С. 58-59.
32. Влияние экзометаболитов ассоциативной микрофлоры на временную организацию музейных штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa/ Т.Х. Тимохина, Я.И. Паромова, В.В. Леонов, Н.Б. Перунова и соавт.// Меди цинская наука и образование Урала. – 2008. - №2/52. – С. 89-90.
33. Временная организация биологических свойств Staphylococcus aureus/Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Н.А. Курлович, Н.Б. Перунова, С.Л.
Галян, Т.Х. Тимохина// Медицинская наука и образование Урала. – 2008. №2/52. – С. 56-57.
34. Вычислительная система «Групповой косинор-анализ»/ А.Г. Санни ков, Т.Х. Тимохина, Н.А. Соколовский// Академический вестник. – Тюмень, 2010. - №2(12). – С. 146-149.
35. К вопросу о циркадианной и ультрадианной ритмичности у нефото синтезирующих бактерий/ Д.Г. Губин, Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко// Материалы XVIII международной конференции. Ставрополь, 2010. Циклы природы и общества. – 2010. – С. 106-108.
Изобретения по теме диссертации 1. Способ диагностики госпитальных штаммов: Патент РФ на изобрете ние № 2285258/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, Я.И. Паромо ва, В.В. Варницына, Р.М. Хохлявина, Д.Г. Губин, Л.Б. Козлов// Бюл., 2006. №28.
2. Способ индикации госпитальных штаммов по биоритмам бактерий:
Патент РФ на изобретение №2285257/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, Н.А.
Курлович, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Р.М. Хохлявина, Д.Г. Губин, Л.Б.
Козлов// Бюл., 2006. - №28.
3. Способ индикации госпитальных штаммов стафилококков: Патент РФ на изобретение №2292398/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Р.М. Хохлявина, Л.Б. Козлов// Бюл., 2007. №3.
4. Способ выявления Candida albicans по биоритмам: Патент РФ на изо бретение №2319747/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, М.В. Ни коленко, В.В. Варницына, Я.И. Паромова Л.Б. Козлов, Н.Б.Перунова, Д.Г.
Губин, О.П.Тверскова// Бюл., 2008. - №8.
5. Автоматизированная система «Косинор-анализа»: Свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932/ Т.Х.Тимохина, А.Г.Санников, В.В.Варницына, Н.А.Соколовский// Бюл., 2009. - №4.
Список сокращений:
АТСС – American Type Culture Collection (американская коллекция ти повых культур) КОЕ – колониеобразующая единица ОМЧ – общее микробное число БПО – биоплнкообразование АЛА – антилизоцимная активность МПК – минимальная подавляющая концентрация r – коэффициент ранговой корреляции Спирмена T – критерий Манна-Уитни W – критерий Уилкоксона ТИМОХИНА ТАТЬЯНА ХАРИТОНОВНА ВРЕМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows Подписано в печать 19. 05. 20011 г.
Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 2,0. Печать оперативная.
Бумага офсетная. Гарнитура Times.
Тираж 100 экз.